KR20180101583A - 혈액 기반 물질로부터 단백질을 추출하기 위한 방법(methods for extracting proteins from a blood-based material) - Google Patents
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Abstract
알파 -1- 프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 알부민 및 다른 단백질을 포함하는 혈액-기반 물질로부터 다중 단백질 생성물을 생산하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 방법은 염 분획화(salt fractionation), 크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 정용여과(diafiltration), 용매-세제(solvent-detergent) 처리 및 무균여과(sterile filtration)의 단계들을 포함한다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 단순하며 그리고 높은 수율로 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 알부민 및 다른 단백질을 생산한다. 상청액(supernatants), 페이스트, 크로마토그래피 통과물(chromatography flow-through) 및 크로마토그래피 세척물(chromatography washes)과 같은 다양한 중간생성물(in-process material)들로부터 다수의 생성물을 수득하기 위해 일련의 공정 단계가 선택될 수 있다.
Description
본 발명은, 알파-1-프로테이나아제 억제제(알파-1 안티 트립신으로도 알려짐), 알부민, 면역 글로불린(면역성 글로불린으로도 칭함), 및 다른 단백질 생성물들(products)과 같은 다중 단백질 생성물들의 순도 및 수율을 증가시키는 향상된 방법에 관한 것이다.
하기 배경 논의는 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
샨브롬(Shanbrom)에게 허여된 미국 특허 번호 제7,297,716호는 동결침전물로부터 혈액 생성물(예컨대, 피브린 글루)을 단리하는 방법을 개시한다. 샨브롬의 방법은 동결침전물의 수율을 증가시키기 위하여 염을 사용한다. 예를 들어, 2 내지 10 중량 퍼센트("중량%") 시트르산 나트륨이 혈액 또는 혈장에 첨가된다. 이 농도의 시트르산 나트륨은 병원성 미생물을 비활성화시키고/거나 억제시키고, 세포 및 단백질이 변성하는 것을 방지하고, (동결이 없어도) 동결침전물의 수율을 증가시키며, 변성된 성분의 제거를 용이하게 한다. 동결침전물 부족 혈장(cryoprecipitate poor plasma)으로부터, 샨브롬은 피브리노겐(fibrinogen), 인자(factor) II, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 및 혈소판을 포함하는 다양한 응고 인자들의 단리를 고려한다. 그러나, 샨브롬은 염이 이전에 동결된 혈액 생성물에 11 중량% 초과의 농도로 첨가될 수 있다는 것을 인식하지 못한다. 또한, 샨브롬은 단백질 생성물들이 11 내지 13 중량%, 21 내지 23 중량% 및 심지어 50 중량% 염을 갖는 중간체들을 제공하는 다중 염 분획화(fractionation) 단계들로부터 형성된 상청액들을 포함한, 임의의 상청액으로부터 추출될 수 있다는 것을 또한 인식하지 못한다.
미국 특허 제7,879,331호; 7,879,332호; 및 제8,293,242호에서, 본 발명자들은 혈액 생성물들로부터 단백질 생성물들을 추출하고 제조하는데 있어서 에탄올의 사용을 생략하는 염석 절차(salting procedure)를 고안하였다. 에탄올 및 다른 알코올류는 바람직한 단백질들을 변성시킬 경향이 있기 때문에 문제가 될 수 있다.
본 발명의 주제에서, 본 발명자들은 동결침전물은 염 침전 단계 전에 동결침전물 부족 혈장(동결-부족 혈장)으로부터 분리될 필요가 없는 간단한 방법을 발견하였다. 추가적으로, 중간생성물들(in-process materials)을 포함하는 다른 혈액 생성물들이 정제된 단백질들의 단리로 이어지는 염 분획화를 위한 기질로서 차용될 수 있다. 또한, 원하는 단백질 생성물이 제 1 페이스트 및 제 2 페이스트 내에 거의 남아있지 않은 경우에, 상기 페이스트들을 재용해시키지 않고 추가 정제 단계들을 수행하지 않고도 상기 원하는 단백질 생성물이 고수율로 유지될 수 있다. 알파-1-프로테이나아제 억제제의 경우, 본 발명자들은 알파-1-프로테이나아제 억제제가 22 중량% 내지 34 중량% 만큼의 높은 염 농도에서 거의 침전하지 않는다는 것을 발견하였다. 이 결과는 높은 염 농도의 알파-1-프로테이나아제 억제제를 교지하는 문헌에 비추어 볼 때 놀라운 것이다. 알파-1-프로테이나아제 억제제가 페이스트들 내에서 거의 손실되지 않기 때문에, 제 2 상청액으로부터 높은 수율들이 획득될 수 있다. 따라서, 공정이 페이스트 처리의 제거에 의해 향상된다. 본원에서 고려된 공정은 단일 염 분획화 단계, 정용여과(diafiltration), 및 단일 정제 단계(예컨대, 크로마토그래피)만 또는 정제된 단백질들을 제공하기 위해 요구되는 바와 같이 복수의 이 단계들과 관련된 공정들을 포함한다.
놀랍게도, 제 2 상청액은 최소한의 사전 처리(예컨대, 바이오버든(bioburden) 여과, 용매/세제 처리, 정용여과 또는 한외여과)가 있는 친화(affinity) 칼럼에 적용되어, 단백질 생성물들의 단리를 더 간단하게 할 수 있다. 또한, 알부민 및 면역 글로불린과 같은 추가적인 단백질 생성물들은 다양한 공정 중간체들로부터 수득될 수 있다.
본원에 논의된 이 자료들 및 다른 모든 외부 자료들은 그대로 참조로 포함된다. 포함된 참조에서의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본원에 제공된 상기 용어의 정의와 상반되는 경우, 본원에 제공된 상기 용어의 정의가 적용되며, 참조에서의 상기 용어의 정의는 적용되지 않는다.
문맥이 반대를 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 모든 범위들은 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하고 제한이 없는 범위들은 상업적으로 실용적인 가치들을 포함하도록 해석되어야 한다. 유사하게는, 문맥이 반대를 지시하지 않는 한, 값의 모든 리스트들은 중간값들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 주제는 혈액 기반 물질(blood-based material)로부터 단백질 생성물을 제조할 수 있는 방법들을 제공한다. 바람직한 방법들은 (1) 제 1 중간체(intermediate)를 제조하기 위하여 혈액 기반 물질에 염을 첨가하는 단계 - 상기 염은 상기 제 1 중간체의 11 내지 20 중량%를 차지함 -; (2) 제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계; (3) 제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 상청액에 염을 첨가하는 단계 - 상기 염은 상기 제 2 중간체의 15 내지 30 중량%를 차지함 -; (4) 제 2 상청액 및 제 2 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계; (5) 적당한 크로마토그래픽 방법(예컨대, 친화 크로마토그래피)에 의해 상기 제 2 상청액으로부터 제 3 중간체를 분리하는 단계; 및 (6) 상기 단백질 생성물을 함유하는 용출물(eluate)을 제조하기 위해 적당한 크로마토그래픽 방법(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피)에 의해 상기 제 3 중간체를 분리하는 단계;를 포함한다. (1) 단계 및 (2) 단계의 조합 또는 (3) 단계 및 (4) 단계의 조합은 본 문서 전체에 걸쳐서 때때로 "염 분획화(fractionation)"로 지칭된다. 단일 염 분획화 단계가 원하는 단백질을 제조하고/하거나 단일 크로마토그래픽 단계가 원하는 단백질을 허용 가능한 순도로 산출하는 것은 본 발명의 주제의 범위 내, 특히, 상기 혈액 기반 물질이 사전 처리를 거치는 경우이다. 크로마토그래피에 의한 단백질 정제가 바람직한 반면에, 당 업계에 알려진 다른 단백질 정제의 방법들은 염 분획화에 의해 수득되는 중간체들로부터 하나 이상의 원하는 단백질들을 단리하기 위하여 크로마토그래피 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 방법들에 포함될 수 있다.
몇몇 유형의 단백질들이 단일 로트의 단백질 기반 물질로부터 선택적으로 추출될 수 있음이 고려된다. 상기 제 1 페이스트, 상기 제 2 페이스트, 본 문서에서 본 발명의 주제에 따라 발생되는 임의의 페이스트, 제 1 크로마토그래피 정제 단계(예컨대, 친화 크로마토그래피 런(run))로부터의 통과물, 제 2 크로마토그래피 정제 단계(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피)로부터의 통과물, 본 문서에 개시된 본 발명의 주제에 따라 수행된 임의의 크로마토그래피 런으로부터의 임의의 분획물, 및 본 발명의 주제의 다른 중간생성물들의 각각은 염 분획화 및/또는 크로마토그래피에 의하여 더 처리될 수 있음을 알아야 한다. 본원에 사용된 "중간생성물"은 개별 공정 단계들에 의해 제조된 물질들을 지칭한다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 상기 참조된 물질의 추가 처리는 상기 혈액 기반 물질로부터 단리된 단백질을 제조한다. 본 발명의 주제의 중간생성물은 다른 분획화 및/또는 정제 공정들(예컨대, 혈장 단백질 정제 계획(Plasma Protein Purification Scheme)을 포함하는 ProMetic Life Sciences 사 공정들, PlasmaCap EBA 공정을 포함하는 Therapure Biopharma 사 공정들, 및/또는 다른 알려진 분획화 공정들)을 위한 출발점으로 사용되는 것도 고려된다.
본원에 사용된 "혈액 기반 물질"은 혈장, 소스 혈장(Source Plasma), 신선 동결 혈장(FFP:Fresh Frozen Plasma), 복원된 혈장(Recovered Plasma), 회수된 혈장(salvaged plasma), 분획화된 혈장, Cohn 분획물(fractions), Nitschmann 및 Kistler 분획물, 및 중간생성물로 정의된다. 본원에 기재된 방법들이 출발 물질로서 동결 혈장 함유 생성물을 반드시 요구하는 것은 아닐지라도, 종래 혈장 함유 생성물들은 통상적으로 동결되며, 추가 처리 및/또는 정제 이전에 해동 단계가 주로 요구되는 것을 알아야 한다.
상기 혈액 기반 물질에 첨가된 상기 염에 대하여, 예를 들어(제한 없이), 시트레이트(citrate), 아세테이트(acetate), 글루코네이트(gluconate) 및/또는 카프릴레이트(caprylate)를 포함하여 사용될 수 있는 다양한 범위의 염들이 있다. 적당한 염들은 수용성이다. 수용성 염들의 사용이 바람직하다고 하더라도, 불용성 염들의 용해도를 향상시키는, 킬레이트제들(예컨대, EDTA)과 수불용성 염들(예컨대, 수중의 시트르산 칼슘 및/또는 낮은 용해도의 다른 염들)과 함께 불용성 염들의 사용이 배제되지 않는다. 통상적으로, 제 1 침전물 및 제 1 상청액이 10.1 내지 25 중량%, 더 통상적으로, 10.1 내지 11, 11 내지 13, 13 내지 15, 및 15 내지 20 중량%의 염 함유량을 갖는 제 1 중간체 내에 형성된다. pH를 3 내지 10의 범위 내의 구체적인 수치로 조절하고/하거나 혼합물의 온도를 0 내지 25℃의 범위 내의 구체적인 수치로 조절함으로써 단백질 분리가 개선될 수 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 단백질들을 안정화시키는(예컨대, 다량체(multimer) 형성을 최소화하는) 환원제들이 상기 혈액 기반 물질, 상기 제 1 중간체, 상기 제 1 상청액, 상기 제 1 페이스트, 상기 제 2 중간체, 상기 제 2 상청액, 또는 상기 제 2 페이?, 및/또는 이들의 임의의 조합(예컨대, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀("TCEP": tris(2-carboxyethyl)phosphine), 디티오트레이톨("DTT": Dithiothreitol), β-메르캅토에탄올("βME": β-mercaptoethanol) 및/또는 이들의 염들)에 첨가된다. 당 업계에 알려진 다른 실용적인 단백질 정제 및/또는 안정화 방법들은 본 발명의 주제의 간헐적인(intermittent) 단계들로서 사용될 수도 있다.
제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위하여 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계는 원심분리(centrifugation) 및/또는 여과(filtration)에 의해 달성될 수 있음을 알아야 한다. 원심분리가 사용되는 경우, 상기 제 1 침전물은 상기 제 1 상청액이 부어지고, 피펫팅되거나 그렇지 않으면 제거될 수 있는 펠릿(즉, 상기 제 1 페이스트)을 형성한다. 상기 펠릿은 또한 본원에서 페이스트로 지칭된다. 더 큰 공정 스케일에서, 여과는 원심분리보다 더 선호된다. 여과가 사용되는 경우, 상기 제 1 상청액은 여과액(filtrate)이며, 상기 제 1 침전물이 필터 케이크(즉, 상기 제 1 페이스트/침전물)를 형성한다. 페이스트 및 침전물이라는 용어는 본 문서에서 교환 가능하게 사용되며, 페이스트들은 상청액으로부터 침전물의 분리를 위해 (예를 들어) 원심분리에 의하여 통상적으로 획득된다.
상기 제 2 상청액에 대하여, 15 및 50 중량% 사이, 더 통상적으로는, 15 내지 21, 21 내지 23, 23 내지 25, 25 내지 27, 27 내지 30, 30 내지 33, 33 내지 37, 37 내지 40, 40 내지 43, 43 내지 47, 및 47 내지 50 중량%의 통상적 염 함유량들이 고려된다. 상기 제 1 상청액에 염이 첨가되기 때문에, 상기 제 2 중간체의 염 농도는 상기 제 1 중간체의 염 농도보다 더 클 것이다. pH를 3 내지 10의 범위 내의 구체적인 수치로 조절하고/하거나 혼합물의 온도를 0 내지 25℃의 범위 내의 구체적인 수치로 조절함으로써 단백질 분리가 개선될 수 있다. 상기 제 1 상청액 및 상기 제 1 침전물의 분리에 적용되는 바와 같이, 상기 제 2 침전물로부터 상기 제 2 상청액의 분리에 동일한 고려사항들이 적용된다. 단일 염 분획화 단계를 포함하는 공정들에 있어서, 15 및 50 중량% 사이의 통상적인 염 함유량들이 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 염 농도가 제 1 슬랫(slat) 분획 단계의 염 농도보다 작거나 클 수 있는, 재용해된 제 2 페이스트에 대하여 염 분획화가 수행될 수 있음도 고려된다.
혈액 물질은 도 6에 도시된 바와 같이, 제 1 통과물 및 제 1 용출물(eluate)을 제조하기 위해 크로마토그래피에 의해 우선 처리될 수 있음이 고려된다. 크로마토그래피가 하나 초과하는 개별 용출물을 제조할 수 있고 동일한 단백질 또는 상이한 단백질들을 산출하기 위하여 각각의 용출물이 독립적으로 처리될 수 있음을 알아야 한다. 이후, 본 문서 전체에 걸쳐서 기재된 방식으로 상기 제 1 통과물에 염이 첨가되어 제 1 중간체를 발생시킨다. 상기 제 1 중간체는 제 1 상청액 및 제 1 페이스트로 분리된다. 본 문서 전체에 걸쳐서 기재된 바와 같이, 단일 크로마토그래피 공정이 사용될 수 있고(예컨대, 친화 크로마토그래피), 일련의 동일한 크로마토그래피 공정이 순서대로 사용될 수 있고(예컨대, 2 가지 이온 교환 크로마토그래피 런들이 순서대로), 중간 공정들이 있는 일련의 동일한 크로마토그래피 공정이 사용될 수 있고(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피 런 이후 염 분획화 이후 이온 교환 크로마토그래피 런), 일련의 상이한 크로마토그래피 공정들이 순서대로 사용될 수 있고(예컨대, 친화 크로마토그래피 런 이후 이온 교환 크로마토그래피 런), 중간 공정들이 있는 일련의 상이한 크로마토그래피 공정들이 사용될 수 있다(예컨대, 친화 크로마토그래피 런 이후 염 분획화 이후 이온 교환 크로마토그래피 런), 또는 이들 계획들 중 임의의 것의 조합이 사용될 수 있음이 고려된다. 친화 및 이온 교환 크로마토그래피가 바람직한 반면에, 본 발명의 주제는 겔 침투(gel permeation), 사이즈 배제(size exclusion), 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호 작용(hydrophobic interaction), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 플루오로아파타이트(fluoroapatite), 팽창층 흡수(expanded bed absorption), 또는 고정화 금속 이온 친화 (immobilized metal ion affinity) 크로마토그래피에 의해 처리된 혈액 기반 물질을 고려한다는 것을 알아야 한다.
본원에 사용된 정용여과는 상기 단백질 생성물을 함유하는 용액/완충액을 교환하는데 사용되는 연속적인 여과를 의미한다. 본원에 사용된 한외여과는 상기 단백질 생성물의 희석 용액을 농축시키는 연속적인 여과 공정이다. 정용여과 및 한외여과의 경우, 수직 및 접선 유동 구성 모두가 고려된다. 유리하게는, 정용여과 및/또는 한외여과는 염, 저 분자량 종 및/또는 가공제를 제거한다. 정용여과 또는 한외여과는 염 분획화 단계들 및/또는 크로마토그래피 단계들 사이, 및/또는 본 발명의 주제의 염 분획화 단계 및 크로마토그래피 단계 사이에 사용될 수 있다는 것을 알아야 한다. 본 발명의 방법들의 일부 실시형태들에 있어서, 상청액 또는 재용해된 페이스트를 친화 크로마토그래피 대상이 되게 하기 전에, 상기 상청액 또는 재용해된 페이스트는 바이오버든을 제거하기 위해 여과될 수 있고, 상기 상청액/재용해된 페이스트 내에서 임의의 외피 바이러스를 비활성화시키기 위하여 용매 및 세제로 처리될 수 있고/있거나 (예컨대, 정용여과 및/또는 한외여과에 의해) 탈염될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태들에 있어서, 친화 크로마토그래피에 의해 상청액 또는 재용해된 페이스트로부터 중간체를 분리하는 단계에서 적절한 친화 수지가 사용된다. 친화 수지들은 바이오-래드(Bio-Rad), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 머크 밀리포어(Merck Millipore), 젠스크립트(GenScript), 및 프로메틱 라이프 사이언시스(ProMetic Life Sciences)와 같은 공급자들로부터 구입할 수 있다.
알파-1-프로테이나아제 억제제의 제조에 사용되는 하나의 공정에서, 예를 들어, 알파-1-프로테이나아제 억제제 특이적 친화 수지는 알파-1-프로테이나아제 억제제를 함유하는 제 3 중간체를 제조하는데 사용된다. 유사하게는, 알부민 특이적 친화 수지는 상기 제 2 상청액으로부터 알부민을 단리하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 제 2 상청액은 상이한 단백질들을 추출하기 위해 수많은 연속적인 친화 크로마토그래피 칼럼들에 적용될 수 있음이 명백하다. 예를 들어, 알파-1-프로테이나아제 억제제의 제조에서 친화 크로마토그래피 단계는 통과물 및 세척물(wash)을 제조한다. 상기 통과물 및/또는 세척물은 알부민-특이적 친화 칼럼에 적용될 수 있다. 이후, 상기 알부민 특이적 친화 칼럼으로부터 상기 통과물 및/또는 세척물은 동일 또는 상이한 단백질에 특이적인 제 3 친화 칼럼에 적용될 수 있다.
상기 단백질 생성물로부터 바이러스를 비활성화시키고/거나 제거하기 위하여, 상기 용출물은 용매 세제로 처리되고, 나노여과되고, 저온살균되거나 그렇지 않으면 바이러스를 비활성화시키거나 제거하기 위해 나타낸 방법으로 처리될 수 있다. 본 발명의 주제에 따른 방법들은 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 알부민, 및/또는 다른 단백질들을 포함하는 단백질 생성물들의 제조에 특히 적합하다.
다른 양태들에 있어서, 본 발명의 방법들은 상기 제 1 페이스트 또는 상기 제 2 페이스트로부터 제 2 단백질 생성물을 단리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가적으로, 제 2 단백질 생성물은 상기 친화 크로마토그래피 단계 도중에 제조되는 통과물 및/또는 세척물로부터 단리될 수 있다. 그러므로, 상기 제 2 단백질 생성물은 상기 제 1 단백질 생성물과 상이할 수 있으며, 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 알부민, 및/또는 다른 단백질들을 포함할 수 있음은 명백하다.
본 발명의 주제의 또 다른 양태들에 있어서, 감마 글로불린을 제조하는 방법들은 상기 제 2 페이스트로부터 감마 글로불린을 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러므로, IgG 특이적 친화 수지는 상기 제 2 페이스트로부터 IgG를 단리하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 다른 친화 수지는 (예컨대, 상청액들, 침전물들(페이스트들), 및 크로마토그래피 분획들을 포함하는) 특이적 중간체로부터 원하는 단백질을 단리하는데 사용될 수 있다.
일부 양태들에 있어서, 본 발명의 주제는 공정 모듈들을 포함하는, 혈액 기반 물질들로부터 생성물들을 제조하는 방법들로서, 각각의 모듈은 투입물(input material)을 받아들일 수 있고 적어도 하나의 산출물(output material)을 제조하는 방법들을 고려한다. 각각의 모듈은 분획화 모듈, 크로마토그래피 모듈, 정용여과 모듈, 또는 한외여과 모듈을 포함할 수 있다. 모듈들의 유형은 혈액 기반 물질로부터 다양한 단백질 생성물들을 제조하기 위하여 다양한 순서들로 구성될 수 있다. 일부 실시형태들은 두 가지 모듈들을 포함하지만, 본 발명의 주제의 방법들은 3, 4, 또는 5 개의 모듈들 또는 원하는 생성물을 제조하기에 필요한 수만큼의 모듈들을 포함할 수 있다. 최소한으로는, 공정은 염 분획화 모듈 및 정용여과/한외여과 모듈을 포함할 것이다.
분획화 모듈들은 염 분획화, Cohn 분획화, Nitschmann 및 Kistler 분획화, 카프릴레이트 분획화, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 또는 이들의 변형들을 사용하여 투입물들을 상청액 및 페이스트로 변환할 수 있다. 적합한 투입물들은 혈액 기반 물질들, 분획화된 혈장, 크로마토그래피 통과물, 용출물, 세척물, 또는 이들의 하위-분획물(sub-fractions)을 포함한다. 하나 이상의 분획화 모듈들은 또한 본원에 토의된 바와 같이 염 분획화 단계들을 포함할 수 있고, 적어도 상청액 및 페이스트를 제조한다.
고려된 크로마토그래피 모듈들은 친화 크로마토그래피, 겔 침투, 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호 작용, 하이드록시아파타이트, 플루오로아파타이트, 팽창층 흡수 또는 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피와 같은 공정들을 채용한다. 크로마토그래피 모듈들은 투입물들을 통과물, 용출물, 세척물 및 이들의 하위-분획물로 분리시키는 것을 알아야 한다. 각각의 모듈에 대한 투입물은 상기 혈액 기반 물질을 포함하거나 임의의 다른 모듈의 통과물, 용출물, 상청액, 또는 페이스트를 포함하는 것도 고려된다.
본 발명의 주제의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 첨부된 도면과 함께 바람직한 실시형태의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이며, 도면에서 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 나타낸다.
도 1은 혈장-함유 혈액 생성물로부터 단백질 생성물을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 2는 혈장-함유 혈액 생성물로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 3은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 4는 혈액 기반 물질의 단일 로트(lot)로부터 다중 단백질 생성물들을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 5는 혈액 기반 물질의 단일 로트로부터 면역 글로불린 G 및 다른 단백질 생성물들을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 6은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 7은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 8은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 9는 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 10은 단백질 생성물들을 제조하기 위한 예시적인 공정 모듈들의 모식도이다.
도 11은 단백질 생성물들을 제조하기 위한 3 가지 예시적인 모듈 공정들의 모식도이다.
도 2는 혈장-함유 혈액 생성물로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 3은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 4는 혈액 기반 물질의 단일 로트(lot)로부터 다중 단백질 생성물들을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 5는 혈액 기반 물질의 단일 로트로부터 면역 글로불린 G 및 다른 단백질 생성물들을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 6은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 7은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 8은 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 9는 혈액 기반 물질로부터 단백질 생성물을 제조하는 다른 방법의 모식도이다.
도 10은 단백질 생성물들을 제조하기 위한 예시적인 공정 모듈들의 모식도이다.
도 11은 단백질 생성물들을 제조하기 위한 3 가지 예시적인 모듈 공정들의 모식도이다.
본 출원은 2016년 2월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/290638호의 우선권을 주장한다.
본 발명의 주제는 혈장 함유 생성물로부터 고수율의 다중 단백질 생성물들의 개선된 제조 방법들을 제공한다. 혈장은 유용한 치료제들인 수많은 단백질들 및 응고 인자들을 함유한다. 예를 들어, 알파-1-프로테이나아제 억제제는 폐 조직 내에 쇠약을 유발할 수 있는 알파-1-프로테이나아제 억제제 결핍을 갖는 사람들을 치료하는데 사용된다. 혈장 단백질들의 다른 클래스는 면역 결핍 및 질환을 치료하는데 사용되는 감마 글로불린류이다. 알부민 및 다른 단백질들(예컨대, 피브리노겐, 프로트롬빈, 알파-1-산 당단백질(alpha-1-acid glycoprotein), 알파-1-태아단백질(alpha-1-fetoprotein), 알파-2-매크로글로불린(alpha-2-macroglobulin), 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin), 합토글로빈(haptoglobin), 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 보체 성분 3(complement component 3), 보체 성분 4(complement component 4), C-반응 단백질(C-reactive protein), 트랜스페린(transferrin), 만노오스-결합 렉틴(mannose-binding lectin), 등)은 본 발명의 주제에 따른 방법들에 의해 혈장으로부터 단리될 수도 있다.
바람직한 실시형태들에 있어서, 상기 혈액 기반 물질은 복원된 혈장 또는 회수된 혈장, 및 더 바람직하게는 신선 동결 혈장 및 더욱 더 바람직하게는 소스 혈장을 포함한다. 다른 혈액 기반 물질들, 예를 들어, 분획화된 혈액, 분획화된 혈액 기반 물질, 분획화된 혈장, 카프릴레이트 분획화된 혈장, 폴리에틸렌 글리콜-분획화된 혈장, Cohn 분획물, Nitschmann 및 Kistler 분획물, 및 임의의 중간생성물, 또는 혈장 분획화에 의해 얻어지는 다른 물질이 사용될 수 있다. 혈장 함유 생성물들은 통상적으로 동결 상태로 저장 및 운송되며, 더 처리 또는 정제되기 전에 해동된다는 것을 알아야 한다. 해동 공정에서, 혈장은 동결침전물 및 동결침전물 부족 혈장인 "동결-부족" 혈장으로 분리될 수 있다. 본원에 사용된 "동결-부족" 혈장은 동결 혈장을 해동하고 동결침전물과 혈장을 분리함으로써 결과로 발생하며 동결침전물을 포함하지 않는 액체 상청액을 지칭한다. 후속 처리 단계들에서 동결-부족 혈장만의 사용이 배제되지 않음에도 불구하고, 바람직하게는, 전혈장, 즉, 동결-부족 혈장 및 동결침전물이 추가적인 처리 단계들을 통해 운반된다. 선택적으로, 동결침전물은 단백질 생성물 제조 이전 또는 단백질 생성물 제조의 일부로서 (예컨대, 혼합에 의해) 동결-부족 혈장 내로 재혼입(reincorporate)될 수 있다.
도 1에서, 본 발명의 주제의 일 실시형태의 흐름도가 도시되어 있다. 신선 또는 해동 혈장 함유 생성물 및 염이 혼합되어, 통상적으로 10.1 내지 25 중량%의 첨가된 염, 더 통상적으로는 10.1 내지 11, 11 내지 13, 13 내지 15 및 15 내지 20 중량%의 첨가된 염, 바람직하게는, 11 내지 13 중량%, 및 더 바람직하게는 12 중량%의 첨가된 염인 상기 제 1 중간체를 형성한다. 염 농도에 대한 통상적인 허용 오차는 ±1 중량%이다. 본 발명의 방법들에서의 사용에 적합한 염들은 시트레이트, 아세테이트, 글루코네이트 및 카프릴레이트를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 혈장 생성물에 고체 염이 첨가될 수 있다 하더라도, 바람직한 방법들에서, 농축된 pH-조절된 염 용액들이 상기 혈장 생성물에 첨가된다. 원하는 단백질 생성물에 따라, 단백질 분획화를 최적화하기 위해 염 용액들의 pH는 약 pH 3 내지 pH 8로 조절될 수 있다.
예를 들어, 50 중량% 시트르산 저장 용액은 물(예컨대, 주사용 물) 600 mL에 시트르산 500 g을 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이후, 상기 용액의 부피는 물을 추가하여 1,000 mL로 된다. 50% 시트르산 나트륨 용액은 물 600 mL에 트리시트르산 나트륨 500 g을 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 약 7의 pH를 갖는 용액을 획득하기 위해 상기 시트르산 나트륨 용액에 충분한 시트르산 용액이 첨가된 이후, 부피를 1,000 mL로 하기 위해 충분한 물이 첨가된다.
혈장, 중간체들 및 상청액들은 용액의 동결점 및 주위 온도 사이, 일반적으로, 0 내지 25℃ 사이의 온도에서 처리될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 혈장 생성물은 20℃에서 유지되며, 실온 시트르산/시트레이트 용액은 상기 시트르산/시트레이트가 그렇게 획득된 상기 제 1 중간체의 11 내지 13 중량%, 및 바람직하게는 12 중량%를 포함할 때까지 상기 혈장에 첨가된다. 염의 첨가는 상기 제 1 중간체를 제 1 침전물 및 제 1 상청액으로 분리하도록 유도할 것이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 제 1 중간체는 교반되고 2 내지 8℃ 사이로 냉각되어 침전물을 생성하게 된다. 상기 제 1 침전물은 고 분자량 단백질들 및 대부분의 지질들을 함유한다. 바람직하게는, 상기 제 1 중간체는 침전이 완료될 때까지(통상적으로 60 분 이상 동안) 교반된다.
상기 제 1 상청액 및 상기 제 1 침전물은 상기 기재된 바와 같이 원심분리 또는 여과에 의하여 상기 제 1 상청액 및 상기 페이스트로 분리될 수 있다. 이후, 상기 제 1 페이스트는 용해되고 본 문서에서 토의된 바와 같이, 염 분획화, 크로마토그래피 공정들, 다른 종래 단백질 정제 방법들 또는 이들의 조합들과 같은 추가적인 공정들의 대상이 될 수 있다.
예시적인 일 실시형태에 있어서, 상기 제 1 상청액은 2 내지 8℃로 냉각되며, 추가적인 시트르산/시트레이트 용액은 15 내지 21, 21 내지 23, 23 내지 25, 25 내지 27, 및 27 내지 30 중량% 시트르산/시트레이트, 바람직하게는 21 내지 23 중량% 시트르산/시트레이트, 및 더 바람직하게는 22 중량% 시트르산/시트레이트를 포함하는 상기 제 2 중가체를 제조하는 상기 제 1 상청액에 첨가된다. 시트르산/시트레이트가 아닌 염/완충액 조합들의 사용도 고려된다. 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 제 2 중간체 내의 염의 농도가 상기 제 1 중간체 내의 염의 농도보다 더 큰 것을 이해한다. 바람직하게는, 상기 제 2 중간체는 상기 제 2 침전의 형성이 완료될 때까지, 예를 들어, 하룻밤 동안 교반된다. 면역성 글로불린들은 상기 제 2 침전물 내에서 발견될 수 있다.
상기 제 1 중간체와 같이, 상기 제 2 중간체는 원심분리 및/또는 여과에 의해 제 2 상청액 및 제 2 페이스트로 분리될 수 있다. 원심분리가 사용되는 경우, 상기 제 2 페이스트는 상기 제 2 침전물로부터 형성된 펠릿이며, 상기 제 2 상청액은 상기 펠릿으로부터 부어지고, 피펫팅되거나 그렇지 않으면 제거될 수 있다. 여과가 사용되는 경우, 상기 제 2 페이스트는 상기 제 2 침전물에 의해 형성된 필터 케이크이며, 상기 제 2 상청액은 여과액이다.
이온 교환 크로마토그래피의 용출물은 바람직하게는 하나 이상의 혈장 단백질들을 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 용출물은 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 알부민, 피브리노겐, 프로트롬빈, 알파-1-산 당단백질, 알파-1-태아단백질, 알파-2-매크로글로불린, 베타-2-마이크로글로불린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C-반응 단백질, 트랜스페린, 및 만노오스-결합 렉틴 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 용출물은 상기 단백질들 중 적어도 2 개의 조합을 포함한다.
선택적으로, 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 제 2 상청액은 바이오버든 감소 필터들을 사용하여 박테리아, 진균성 포자들(fungal spores), 균사, 및 다른 "바이오버든"을 제거하기 위해 여과될 수 있다. 예시적인 바이오버든 감소 필터들은 Sartorius, Pall, 및 EMD Millpore 브랜드들(예컨대, Sartopore 2XLG 0.8/0.2, Supra EK1P/EAV1.5/0.2, Milligard®, Polysep® II, LifegardTM, Clarigard®, Polygard®-CN, Polygard®-CR, Polygard®-CT) 하에서 제작된 필터들을 포함한다.
다른 선택적인 단계는 정용여과 및/또는 한외여과에 의해 시트레이트 농도를 감소시키는 것이다. 상기 필터의 크기는 관심 대상의 단백질이 여과액과 함께 필터를 통과하는 것을 방지하면서 유량(예컨대, 3 내지 6 L/h)을 최대화하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 30 kD 멤브레인들(membranes)은 알파-1-프로테이나아제 억제제를 유지하지만, 상기 멤브레인을 통해 액체가 상대적으로 빠르게 흐르도록 한다. 시트레이트 농도의 감소는 약 55 내지 60 mS/㎝ 내지 약 10 mS/㎝, 및 가장 바람직하게는 5 mS/㎝ 이하로의 전도도의 감소와 연관될 수 있다.
외피 바이러스 및 일부 비-외피 바이러스의 비활성화는 바이러스성 외피 멤브레인 지질들을 변성시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 용매/세제(예컨대, 트리-n-부틸 포스페이트(tri-n-butyl phosphate) 및 폴리소르베이트(polysorbate) 80; 트리-n-부틸 포스페이트 및 트리톤(Triton) X-100)가 상기 제 2 상청액을 처리하는데 사용될 수 있다. 유리하게는, 용매/세제 처리는 또한 박테리아 및 진균 오염을 제거하고 내독소들을 세척할 수도 있다. 본 발명의 주제의 바람직한 일 실시형태에 있어서, 상기 제 2 상청액의 ㎏ 당 트리-n-부틸 포스페이트 및 폴리소르베이트 80의 23.09 : 76.91 혼합물 13.2 g이 상기 제 2 상청액에 첨가된다.
본 발명자들은 친화 수지들이 단백질 생성물들의 개별 성분들을 단리하는데 사용될 수 있음을 고려하였다. 예로서, 프로메틱 바이오사이언시스(ProMetic BioSciences) 사(社) 및 프로메틱 바이오쎄라퓨틱스(ProMetic BioTherapeutics)는 응고 인자들(coagulating factors), 플라스미노겐(plasminogen), 피브리노겐, 면역성 글로불린들, 알부민, 알파-1-프로테이나아제 억제제를 특이적으로 결합하는 친화 수지들을 제조한다. 지이 헬스케어는 알파-1-프로테이나아제 억제제를 결합하는 단일-도메인 항체를 함유하는 교차-결합된 아가로오스 수지를 제조한다. 수지 필요량은 상기 제 2 상청액 내 단백질의 양 및 상기 수지의 부하 용량에 의존한다. 통상적으로, 상기 제 2 상청액을 적용한 이후, 상기 친화 수지는 비-특이적 정전기적 상호 작용에 의해 상기 수지에 흡착된 단백질들을 제거하는 염 용액(예컨대, 100 mM NaCl)으로 세척된다. 이후, 다른 용출 프로토콜들의 사용이 배제되지 않는다고 하더라도, 원하는 단백질은 수지 제조자에 의해 추천된, 용출물을 사용하는 친화 칼럼으로부터 용출된다. 알파-1-프로테이나아제 억제제 및 지이 헬스케어 알파-1 안티 트립신 셀렉트(Select) 수지의 경우, 상기 단백질 생성물은 완충된 염화 마그네슘 용액(예컨대, 50 mM 트리스-HCl 내 2 M MgCl2, pH=7.40)을 사용하는 친화 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 친화 크로마토그래피 단계 이후 통상적인 단백질 생성물 수율은 70 내지 98% 사이의 범위에 이른다.
염 농도를 감소시키기 위해 상기 제 3 중간체는 통상적으로 정용여과/한외여과의 대상이 된다. 정용여과/한외여과 후, 전도도는 약 120 mS/㎝ 내지 10 mS/㎝ 미만, 및 바람직하게는 5 mS/㎝ 이하로 감소한다.
본 발명자들은 수지로부터 제 3 중간체로 여과되는 임의의 친화 리간드는 이온 교환 크로마토그래피 단계 이후 상기 단백질 생성물로부터 분리될 수 있음을 예상한다. 적합한 수지들은 바이오-래드, 시그마-알드리치 및 아사히 케미칼 앤드 인더스트리얼 사(Asahi Chemical & Industrial Co. Ltd.)(예컨대, Asahi Q500 음이온 교환 수지는 수지 밀리리터 당 알파-1 프로테이나아제 억제제 26.5 ㎎의 동적 결합 용량을 발휘하였다)에 의해 공급된다. 고려된 방법들에 있어서, Q500 수지의 500 ml 칼럼은 50 mM 트리스-HCl, pH 7.40에서 평형이 된다. 상기 제 3 중간체는 상기 칼럼 상에 로딩되고 50 mM 트리스-HCl, pH 7.40 완충액 내에서 0 mM 내지 350 mM NaCl의 단계적 구배(step gradient)로 용출된다.
본 발명의 방법들은 20 ㎚ 포어 필터를 사용하여 소형 비-외피 바이러스들(예컨대, 아데노바이러스, 파르보바이러스, 파포바바이러스들, 인간 파필로마바이러스들)을 제거하는 나노여과의 단계를 더 포함할 수 있다. 이후, 나노여과된 단백질 생성물은 원하는 제형에 따라 더 처리될 수 있다. 추가적인 처리 단계들은 한외여과 및/또는 정용여과, 포뮬레이션(formulation), 무균여과, 충진(filling), 및 동결건조 중 하나 이상을 포함한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 통과물, 세척물 및 제 2 침전물 각각은 본원에 참조된 혈장 단백질들 중 하나 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 도 2의 무균여과된 단백질 생성물은 단일 유형의 혈장 단백질을 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 제 2 침전물 및 통과물 및 세척물로부터 다른 단백질들의 단리는 본원에 기재된 바와 같이 염 분획화 및 크로마토그래피 공정들을 포함한다.
도 3은 도 1과 유사한 흐름도를 도시한다. 그러나, 도 3의 출발 물질은 혈액 기반 물질이다. 본 문서에 기재된 바와 같이, 혈액 기반 물질은 소스 혈장, 신선 동결 혈장, 복원된 혈장, 회수된 혈장, 분획화된 혈액, 분획화된 혈액 기반 물질, 분획화된 혈장, Cohn 분획물, Nitschmann 및 Kistler 분획물, 및 분획화된 물질의 임의의 중간생성물을 포함한다. Cohn 분획물 또는 Nitschmann 및 Kistler 분획물과 같은, 다른 분획화 공정들로부터의 중간생성물들은 도 3의 방법에 대한 출발 물질로서 사용될 수 있음이 고려된다. 또한, 적어도 도 1 내지 도 8을 포함하는, 본 발명의 주제의 방법들 중 임의의 것으로부터의 중간생성물은 도 3의 방법을 위한 출발점으로 사용될 수 있음이 예측된다.
도 3의 제 1 염 및 제 2 염은 본 문서에 개시된 염들 중 임의의 것일 수 있음에 주목해야 한다. 또한, 제 1 염 및 제 2 염은 동일할 수 있음이 고려된다. 도 3의 흐름도는 또한 제 1 및 제 2 크로마토그래피 단계들을 포함한다. 제 1 및 제 2 크로마토그래피 단계들은 적어도 부분적으로, 친화, 겔 침투, 양이온 교환, 음이온 교환, 크기 배제, 소수성 상호 작용, 하이드록시아파타이트, 플루오로아파타이트 또는 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피를 포함할 수 있음이 고려된다. 상기 제 1 및 제 2 크로마토그래픽 단계들은 충전층 또는 팽창층 흡착 모드 중 어느 하나일 수 있다. 제 1 및 제 2 크로마토그래피 단계들은 또한 동일한 유형의 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 일부 공정들은 단일 크로마토그래픽 단계를 필요로 할 수 있는 반면에, 다른 공정들은 2 단계들을 초과하는 단계들을 필요로 할 수 있음이 고려된다. 본원에 기재된 바와 같이 염들을 사용하여 획득된 단백질 분획물로부터의 단백질 정제는 크로마토그래피에 더하여 단백질 정제/안정화 단계들을 필요로 할 수 있거나 크로마토그래피 이외의 단백질 정제/안정화 단계들을 필요로 할 수 있음이 더 고려된다.
상기에 기재된 바와 같이, 제 2 크로마토그래피 공정으로부터 용출물은 본원에 참조된 혈장 단백질들 중 적어도 하나를 포함하는 것을 알아야 한다.
도 4는 도 3과 유사한 흐름도를 도시한다. 그러나, 도 4는 단일 로트의 혈액 기반 물질로부터 다중 생성물들을 제조하는, 제 1 및 제 2 침전물들 및 제 1 및 제 2 통과물들의 추가적인 처리를 포함한다. 제 1 침전물은 용해될 수 있고, 본 문서에서 참조된 바와 같이 염 분획화 및/또는 크로마토그래피 공정들에 의해 더 처리될 수 있음을 알아야 한다. 도시된 바와 같이, 제 2 내지 제 6 크로마토그래피 단계들의 생성물 각각은 본원에 기재된 바와 같이 단리된 혈장 단백질인 것이 바람직하다. 일부 실시형태들에 있어서, 제 1 내지 제 6 크로마토그래피 단계들은 각각 서로 상이하다. 일부 단백질 배치들(batches)은 적어도 부분적으로 동일한 단백질을 함유하는 것일 수 있다고 하더라도, 제 1 내지 제 5 단백질들은 서로 별개의 혈장 단백질들임이 고려된다.
도 5는 단일 로트의 혈액 기반 물질로부터 면역 글로불린 G("IgG") 및 다른 단백질들을 단리하기 위한 흐름도를 도시한다. 제 1 및 제 2 중간체의 제조는 동일하거나 도 1 내지 도 4에 대해 상기 기재된 방법들과 유사할 수 있다. 도 4의 흐름도에서와 같이, 상기 제 2 침전물은 IgG를 제조하기 위하여 제 1 크로마토그래피 단계에 의해 더 처리된다. 제 1 크로마토그래피 단계가 IgG 특이적 친화 수지를 통하여 친화 크로마토그래피를 포함하는 것이 고려되는 반면에, 제 1 크로마토그래피 단계는 당 업계에 알려진 바와 같은 다른 유형의 크로마토그래피를 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한, 제 1 통과물은 본원에 기재된 혈장 단백질들과 같이, 다른 단백질 생성물들을 제조하기 위하여 제 2 크로마토그래피 단계에 의해 더 처리된다. 후속 크로마토그래피 및 염 분획화 단계들이 원하는 단리된 단백질 생성물들 및 조합들을 산출하기 위해 수행될 수 있음을 알아야 한다.
도 6은 혈액 기반 물질로부터 원하는 생성물들을 유도하는 다른 방법에 대한 흐름도를 도시한다. 도 6의 흐름도는 제 1 크로마토그래피 단계를 통한 혈액 기반 물질의 처리로 시작한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 혈액 기반 물질은 다른 분획화 공정들로부터의 중간생성물 또는 그 외의 분획화된 혈액 기반 물질이다. 도 6의 제 1 통과물은 이후 도 1 및 도 3에 기재된 바와 같이 염 분획되며, 제 2 상청액을 제 2 크로마토그래피 단계로 처리함으로써 제 2 용출물이 제조된다. 제 1 및 제 2 용출물들은 본원에 기재된 바와 같이 혈장 단백질들을 포함한다는 것을 알아야 한다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 상기 제 2 용출물은 단리된 유형의 혈장 단백질을 포함한다.
도 7은 도 3과 유사한 흐름도를 도시한다. 그러나, 도 7은 제 3 크로마토그래피 단계를 포함하는 일 실시형태를 개시한다. 제 3 크로마토그래피 단계는 이전에 토의되거나 당 업계에 알려진 크로마토그래피 단계들 중 임의의 것을 포함할 수 있음을 알아야 한다. 일부 실시형태들에 있어서, 제 1 내지 제 3 크로마토그래피 단계들은 동일한 유형의 크로마토그래피를 포함한다. 상기 제 3 크로마토그래피 단계의 전후의 추가적인 크로마토그래피 단계들도 고려된다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 제 3 크로마토그래피 단계의 용출물은 본원에 기재된 혈장 단백질들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 용출물은 단리된 유형의 혈장 단백질을 포함한다.
도 8은 도 3과 유사한 흐름도를 도시한다. 그러나, 도 8은 제 3 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 2 상청액에 TCEP를 첨가하는 추가적인 단계를 포함한다. TCEP는 상기 제 2 상청액 내에 적어도 일부 단백질들의 다량체 형성을 감소시키는 것이 고려된다. 추가적 또는 대안적인 환원제들이 도 8의 단계들 전체에 걸쳐서 단백질들의 다량체 형성을 최소화하는데 사용될 수 있음이 또한 고려된다(예컨대, DTT 및 βME). 일부 실시형태들에 있어서, 상기 제 2 크로마토그래피 단계의 용출물은 본원에 기재된 혈장 단백질들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 상기 용출물은 단리된 유형의 혈장 단백질을 포함한다.
도 9는 도 3과 유사한 다른 흐름도를 도시한다. 도 8에서, 제 3 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 2 상청액에 침전제를 첨가함으로써 추가적인 침전 단계가 수행된다. 상기 침전제는 상기 제 1 또는 제 2 염(예컨대, 시트레이트, 아세테이트 및 글루코네이트), 상이한 염(예컨대, 염화 나트륨, 황화 암모늄, 카프릴레이트 염 등), 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 또는 다른 침전제를 포함할 수 있다. 이후, 원심분리 및/또는 여과에 의하여 제 3 상청액 및 제 3 침전물을 제조하기 위하여 상기 제 3 중간체가 분리될 수 있다. 상기 제 3 상청액 및 제 3 침전물은 각각 제 1 및 제 2 단백질들을 제조하기 위하여, 선택적인 정제 단계들(예컨대, 상기에 기재된 바와 같이, 크로마토그래피, 용매/세제 처리, 바이오버든 여과, 및/또는 농축 단계(들))의 각각 대상이 될 수 있다. 다중 단백질 생성물들은 제 3 상청액 및 제 3 침전물 중 어느 하나 또는 모두로부터 정제될 수 있음을 알아야 한다.
실시예
인간 혈장은 미국 특허 번호 제7,879,331호에 기재된 바와 같이 순차적인 12% 시트레이트 및 22% 시트레이트 단백질 침전 단계들의 대상이 되었다. 22% 시트레이트에서 분획화로 인한 상청액의 시트레이트 농도가 개별 연구들에서 26%, 30% 또는 34%로 증가하였다. 얻어진 중간체를 교반하면서 5℃ 미만으로 냉각하였으며, 이 온도에서 60 분 동안 교반하였다. 침전물을 원심분리에 의하여 분리하였으며(미국 특허 번호 제7,879,331호에 기재된 바와 같이) 분획물을 비탁법(nephelometry)에 의해 알파-1-프로테이나아제 억제제(A1PI), 알부민, 및 총단백질에 대하여 분석하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다. 수치들은 100%(상청액 및 침전물의 합)로 정규화된, 상청액(super) 및 침전물(ppt)의 각각에서 발견된 백분율이다.
| 표본 | A1PI | 총 단백질 | 알부민 |
| 26% Cit super | 99 | 94 | 98 |
| 26% Cit ppt | BDL | 6 | 2 |
| 30% Cit super | 97 | 89 | 96 |
| 30% Cit ppt | 3 | 10 | 4 |
| 34% Cit super | 97 | 92 | 97 |
| 34% Cit ppt | 3 | 8 | 3 |
유리하게는, 시트레이트 농도를 증가시키면 알파-1-프로테이나아제 억제제 및 알부민의 작은 분획만이 침전되면서, 얻어진 상청액으로부터 추가적인 단백질들이 제거되었다. 그러므로, 제 3 침전 단계를 수행하는 것은 상기 단백질 생성물(들)의 작은 분획만을 손실하면서 얻어진 상청액으로부터 비-생성물 단백질들을 제거하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 주제에 있어서, 혈액 기반 물질들로부터 생성물들을 제조하는 공정은 제 1 및 제 2 모듈들을 포함할 수 있다. 각각의 모듈은 투입물을 수취하고 적어도 하나의 산출물을 산출하도록 구성된다. 제 1 및 제 2 모듈들은 각각 분획화 모듈, 크로마토그래피 모듈, 여과 모듈, 분리 모듈, 또는 무균화 모듈을 포함할 수 있다. 하나의 모듈의 투입은 다른 모듈의 산출을 포함할 수 있다.
도 10은 본 발명의 주제에 의해 고려된 몇몇 모듈들을 도시한다. 분획화 모듈들에 있어서, 상기 투입물은 염 분획화, Cohn 분획화, 또는 Nitschmann 및 Kistler 분획물, 카프릴레이트 분획물 또는 이들의 변형에 의해 분획화된다. 염은 상기 투입물에 첨가되어, 중간체를 생성하게 된다. 모듈이 본원에 논의된 바와 같이 염 분획화 단계를 채용하는 경우, 상기 산출물은 적어도 상청액 및 페이스트 또는 침전물을 포함한다.
크로토마그래피 모듈들에 대하여, 투입물은 크로마토그래피 공정들에 의하여 통과물, 세척물, 및 하나 이상의 용출물들로 분리된다. 적합한 크로마토그래피 공정들은 친화 크로마토그래피, 겔 침투, 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호 작용, 하이드록시아파타이트, 플루오로아파타이트, 팽창층 흡수 또는 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피를 포함한다. 상기 크로마토그래피 모듈들의 산출물은 적어도 통과물 및 용출물을 포함하며, 세척물을 포함할 수 있다.
한외여과 및 정용여과 모듈들도 고려된다. 정용여과 또는 한외여과 모듈들은 투입물들을 각각 탈염하고 농축하는 적합한 여과 방법들임을 알아야 한다. 추가적으로, (예컨대, 본원에 기재된 나노여과 또는 다른 것을 통한) 바이러스성 환원 모듈들(viral reduction modules) 및 (예컨대, 본원에 기재된 용매/세제 처리 또는 다른 것을 통한) 바이러스성 비활성화 모듈들도 고려된다. 또한, (예컨대, TCEP, DTT, βME, 또는 다른 적합한 환원제들로의 처리를 통한) 환원제/안정화 모듈들은 본 발명의 주제에 의하여 고려된다.
모듈들의 순서는 혈액 기반 물질로부터 다양한 생성물을 제조하도록 구성될 수 있다. 본 발명의 공정들에서 채용되는 모듈들의 수에 대하여, 본 발명자들은 필요한 모듈들의 수는 원하는 생성물을 제조하는데 필요한 모듈 공정 단계들의 수에 의존한다는 것을 고려한다. 일부 실시형태들은 하나 또는 두 개의 모듈들을 포함한다. 본 발명의 주제의 바람직한 방법들은 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 또는 이상의 모듈들을 포함한다.
도 11은 도 10의 모듈들을 채용하는 본 발명의 주제의 표본 모듈 공정들의 수를 도시한다. 하나의 모듈로부터의 산출은 다른 모듈의 투입으로 사용된다는 것을 알아야 한다. 도 11의 공정 A에서 도시된 바와 같이, 혈액 기반 물질은 분획화 모듈의 투입물로서 사용된다. 상기 분획화 모듈의 산출들(상청액 및 페이스트)의 적어도 하나는 정용여과 모듈용 투입물로서 사용된다. 이후, 정용여과 모듈의 산출은 하류 공정들에서 투입물로서 더 사용된다.
도 11의 공정 B는 분획화 모듈에서 상기 투입물로서 혈액 기반 물질을 사용한다. 상기 분획화 모듈의 산출들(상청액 및 페이스트)의 적어도 하나는 정용여과 모듈용 투입물로서 사용된다. 상기 정용여과 모듈의 산출은 이후 크로마토그래피 모듈 1에서 투입물로서 사용된다. 크로마토그래피 모듈 1의 산출들(통과물, 세척물, 및 용출물)의 적어도 하나는 크로마토그래피 모듈 2에서 투입물로서 사용된다. 크로마토그래피 모듈 1 및 2는 동일한 유형의 크로마토그래피일 수 있거나 상이한 유형들의 크로마토그래피일 수 있음을 알아야 한다. 크로마토그래피 모듈 2의 산출들의 적어도 하나는 바이러스성 비활성화 모듈에서 투입물로 사용된다. 상기 바이러스성 비활성화 모듈의 산출은 바이러스성 환원 모듈에서 투입물로서 사용된다. 바이러스성 환원 모듈의 산출은 혈액 기반 단백질(예컨대, 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 면역 글로불린, 알부민, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 단백질 C, 안티 트롬빈 III, 피브리노겐, 및 C1 에스테라아제 억제제 중 적어도 하나)을 포함한다.
도 11의 공정 C는 분획화 모듈 1에서 투입물로서 혈장을 사용한다. 분획화 모듈 1의 산출들(상청액 및 페이스트)의 적어도 하나는 분획화 모듈 2용 투입물로서 사용된다. 분획화 모듈 1 및 2는 동일한 유형의 분획화일 수 있거나 상이한 유형들의 분획화일 수 있음을 알아야 한다. 분획화 모듈 2의 산출들의 적어도 하나는 바이러스성 비활성화 모듈용 투입물로 사용된다. 상기 바이러스성 비활성화 모듈의 산출은 정용여과 모듈의 투입물로서 사용된다. 이후, 상기 정용여과 모듈의 산출은 크로마토그래피 모듈 1에서 투입물로 사용된다. 크로마토그래피 모듈 1의 산출들(통과물, 세척물, 및 용출물)의 적어도 하나는 환원제 모듈에서 투입물로 사용된다. 이후, 상기 환원제 모듈의 산출은 크로마토그래피 모듈 2의 투입물로 사용된다. 크로마토그래피 모듈 1 및 2는 동일한 유형의 크로마토그래피일 수 있거나 상이한 유형들의 크로마토그래피일 수 있음을 알아야 한다. 크로마토그래피 모듈 2의 산출들의 적어도 하나는 바이러스성 환원 모듈에서 투입물로 사용된다. 바이러스성 환원 모듈의 산출은 혈액 기반 단백질(예컨대, 알파-1-프로테이나아제 억제제, 감마 글로불린, 면역 글로불린, 알부민, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 단백질 C, 안티 트롬빈 III, 피브리노겐, 및 C1 에스테라아제 억제제 중 적어도 하나)을 포함한다.
상기 제 1 모듈용 투입물은 혈액 기반 물질 및 임의의 다른 모듈로부터의 산출물, 예컨대, 통과물, 용출물, 상청액, 페이스트, 또는 용해된 페이스트 중 적어도 하나를 포함할 수 있음이 더 고려된다. 하나의 모듈로부터 다시 동일한 모듈로의 산출물들의 리사이클링은 배제되지 않는다.
본 발명의 특정 실시형태들을 기재하고 청구하는데 사용된, 성분들의 양들을 표시하는 숫자들, 농도와 같은 성질, 반응 조건 등은 일부 경우들에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 서술된 설명 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 파라미터들은 특정 실시형태예에 의해 수득될 수 있는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 수치 파라미터들은 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어 그리고 일반적인 반올림 기법들을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 실시형태들의 광범위한 범위를 설정하는 수치 범위들 및 파라미터들이 근사치 임에도 불구하고, 특정 실시예들에 기재된 수치들은 실행 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 실시형태들에 제시된 수치들은 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 기인하는 일정한 오차들을 포함할 수 있다.
본원의 설명 및 후속하는 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 그리고 "the")의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 바와 같이, "내(in)"의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않으면 "내" 및 "상(on)"을 포함한다.
본원에서의 수치들의 범위의 설명은 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 수치를 개별적으로 참조하는 약식 방법으로서 작용하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 수치는 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시하지 않거나 달리 문맥에 의해 명백하게 부인되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원의 특정 실시형태에 대하여 제공되는 임의의 그리고 모든 예 또는 예시적인 언어 (예컨대, "~ 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하려는 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위에 제한을 가하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹은 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 멤버는 개별적으로 또는 본원에서 발견되는 그룹 또는 다른 요소의 다른 멤버와 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버는 편의 및/또는 특허 가능성의 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 본 명세서는 그룹을 수정되어 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹의 서술된 설명을 이행하는 그룹을 포함하는 것으로 본원에서 간주된다.
본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 이미 기재된 것들 이외의 더 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명의 주제는 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, "포함한다" 및 "포함하는"이라는 용어는 참조된 구성 요소, 성분 또는 단계가 존재할 수 있거나 활용될 수 있거나 명시적으로 참조되지 않은 다른 구성 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있다는 것을 나타내는 비-배타적인 방식으로 구성 요소, 성분 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것의 적어도 하나를 언급하는 경우. 텍스트(text)는 A와 N 또는 B와 N, 등이 아닌 그룹으로부터의 구성 요소 하나만 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 토의는 본 발명의 주제의 많은 예의 실시형태들을 제공한다. 각각의 실시형태가 발명의 요소들의 단일 조합을 제시한다고 하더라도, 본 발명의 주제는 개시된 요소들의 모든 가능한 조합들을 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 일 실시형태가 A, B 및 C 요소들을 포함하며 제2 실시형태가 B 및 D 요소들을 포함한다면, 본 발명의 주제는 명백히 개시되지 않는다고 하더라도, A, B, C, 또는 D의 다른 잔존 조합들을 포함하는 것으로도 간주된다.
Claims (50)
- 혈액 기반 물질(blood-based material)로부터 단백질 생성물(product)을 제조하는 방법으로서,
제 1 중간체(intermediate)를 제조하기 위하여 혈액 기반 물질에 제 1 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염은 상기 제 1 중간체의 11 내지 20 중량% 를 차지함 ―;
제 1 상청액(supernatant) 및 제 1 페이스트(paste)를 제조하기 위해 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계;
제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 상청액에 제 2 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 2 염은 상기 제 2 중간체의 15 내지 30 중량%를 차지함 ―;
제 2 상청액 및 제 2 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계;
제 1 통과물(flow-through) 및 제 3 중간체를 제조하기 위해 제 1 크로마토그래피 공정에 의해 상기 제 2 상청액을 분리하는 단계; 및
상기 단백질 생성물을 함유하는 용출물(eluate) 및 제 2 통과물을 제조하기 위하여 제 2 크로마토그래피 공정에 의해 상기 제 3 중간체를 분리하는 단계;
를 포함하며,
상기 단백질 생성물은 상기 제 2 중간체로부터 단독으로 유도되고 그리고 상기 단백질 생성물의 수율은 70% 이상인,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은 소스 혈장(Source Plasma), 신선 동결 혈장(FFP:Fresh Frozen Plasma), 복원된 혈장(Recovered Plasma) 및 회수된 혈장(salvaged plasma) 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은,
분획화된(fractionated) 혈액, 분획화된 혈장, Cohn 분획물(fractions), Nitschmann 및 Kistler 분획물, Cohn 공정으로부터의 중간생성물(in-process material), Nitschmann 및 Kistler 공정으로부터의 중간생성물, 폴리에틸렌 글리콜 분획화(fractionation)로부터의 중간생성물, 및 카프릴레이트 분획화로부터의 중간생성물 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 염은, 시트레이트(citrate), 아세테이트(acetate) 및 글루코네이트(gluconate) 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 염은 상기 제 2 염과 동일한,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계는, 상기 제 1 중간체를 원심분리(centrifuging)하는 단계를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계는, 상기 제 1 중간체를 여과(filtering)하는 단계를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 통과물 및 제 3 중간체를 제조하기 위해 상기 제 1 크로마토그래피 공정에 의해 상기 제 2 상청액을 분리하기 전에 상기 제 2 상청액을 탈염하는 단계;
를 더 포함하는
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 상청액 및 상기 제 2 상청액 중 적어도 하나는 여과 공정에 대상이되는,
방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 여과 공정은 한외여과(ultrafiltration) 또는 정용여과(diafiltration)를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2 상청액에 환원제를 첨가하는 단계;
를 더 포함하는,
방법. - 제 11 항에 있어서,
상기 환원제는 TCEP, DTT 및 βME 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 크로마토그래피 공정은 겔 침투(gel permeation), 사이즈 배제(size exclusion), 및 팽창층 흡수(expanded bed absorption) 크로마토그래피 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 크로마토그래피 공정은,
양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호 작용(hydrophobic interaction), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 플루오라파타이트(fluorapatite) 또는 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 크로마토그래피 공정 및 상기 제 2 크로마토그래피 공정은 상이한,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 용출물을 무균여과(sterile filtering)하는 단계;
를 더 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단백질 생성물은, 인자(factor) VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 단백질 C, 안티 트롬빈(antithrombin) III 및 피브리노겐(fibrinogen) 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단백질 생성물은, C1 에스테라아제 억제제(C1 esterase inhibitor) 및 알파-1-프로테이나아제 억제제(alpha-1-proteinase inhibitor) 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단백질 생성물은, 감마 글로불린, 면역 글로불린 및 알부민 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 페이스트, 상기 제 2 페이스트, 상기 제 1 통과물 및 상기 제 2 통과물 중 적어도 하나로부터 제 2 단백질 생성물을 분리시키는 단계를 더 포함하는,
방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 제 2 단백질 생성물은, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 단백질 C, 안티 트롬빈 III 및 피브리노겐 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 제 2 단백질 생성물은, C1 에스테라아제 억제제 및 알파-1-프로테이나아제 억제제 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 제 2 단백질 생성물은, 감마 글로불린, 면역 글로불린 및 알부민 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 혈액 기반 물질로부터 생성물을 추출하는 방법으로서,
혈액 기반 물질을 획득하는 단계;
제 1 중간체를 제조하기 위하여 상기 혈액 기반 물질에 제 1 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염은 상기 제 1 중간체의 11 내지 13 중량 % 를 차지함 ―;
제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위해 제 1 중간체를 분리하는 단계;
제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 중간체에 제 2 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염 및 상기 제 2 염은 상기 제 2 중간체의 21 내지 23 중량 % 를 차지함 ―;
제 2 상청액 및 제 2 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계;
용해된 제 2 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 2 페이스트를 용해시키는 단계;
제 1 통과물 및 제 3 중간체를 제조하기 위해 제 1 크로마토그래피 공정에 의해 상기 용해된 제 2 페이스트를 분리하는 단계; 및
상기 생성물을 함유하는 용출물 및 제 2 통과물을 제조하기 위하여 제 2 크로마토그래피 공정에 의해 상기 제 3 중간체를 분리하는 단계;
를 포함하는,
방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은, 소스 혈장, 신선 동결 혈장, 복원된 혈장, 및 회수된 혈장 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은,
분획화된 혈액, 분획화된 혈장, Cohn 분획물, Nitschmann 및 Kistler 분획물, Cohn 공정으로부터의 중간생성물, Nitschmann 및 Kistler 공정으로부터의 중간생성물, 폴리에틸렌 글리콜 분획화로부터의 중간생성물, 및 카프릴레이트 분획화로부터의 중간생성물 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 생성물은 알파-1-프로테이나아제 억제제를 포함하는,
방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 제 1 페이스트, 상기 제 1 상청액, 상기 제 2 상청액, 상기 제 1 통과물 및 상기 제 2 통과물 중 적어도 하나로부터 제 2 단백질 생성물을 분리시키는 단계를 더 포함하는,
방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 제 1 크로마토그래피 공정은, 친화(affinity) 크로마토그래피 공정을 포함하는,
방법. - 제 29 항에 있어서,
상기 친화 크로마토그래피 공정은 알파-1-프로테이나아제 억제제 특이적 친화 레진(resin)을 사용하는,
방법. - 혈액 기반 물질로부터 생성물을 추출하는 방법으로서,
혈액 기반 물질을 획득하는 단계;
제 1 통과물 및 제 1 중간체를 제조하기 위해 제 1 크로마토그래피 공정에 의해 상기 혈액 기반 물질을 분리하는 단계;
제 2 중간체를 제조하기 위하여 제 1 중간체에 제 1 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염은 상기 제 2 중간체의 11 내지 13 중량 % 를 차지함 ―;
제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위하여 제 2 중간체를 분리하는 단계;
제 3 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 상청액에 제 2 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염 및 상기 제 2 염은 상기 제 3 중간체의 21 내지 23 중량 % 를 차지함 ―;
제 2 상청액 및 제 2 페이스트를 제조하기 위하여 제 3 중간체를 분리하는 단계 및;
상기 생성물을 함유하는 용출물 및 제 2 통과물을 제조하기 위하여 제 2 크로마토그래피 공정에 의해 상기 제 2 상청액을 분리하는 단계;
를 포함하는,
방법. - 혈액 기반 물질로부터 생성물을 제조하는 방법으로서,
제 1 모듈 및 제 2 모듈을 포함하는 복수의 모듈들을 획득하는 단계;
상기 혈액 기반 물질을 제 1 산출물(output material) 및 제 2 산출물로 분리시키기 위하여 상기 제 1 모듈을 사용하는 단계; 및
상기 제 1 산출물 및 상기 제 2 산출물 중 적어도 하나를 제 3 산출물로 분리시키기 위하여 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계;
를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분리시키기 위하여 상기 제 1 모듈을 사용하는 단계는 상기 혈액 기반 물질을 분획화하는 단계를 포함하며, 그리고
상기 제 1 산출물은 페이스트를 포함하고 그리고 상기 제 2 산출물은 상청액을 포함하는,
방법. - 제 33 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분획화하는 단계는:
(a) 제 1 중간체를 제조하기 위하여 상기 혈액 기반 물질에 염을 첨가하는 단계 ― 상기 염은 상기 제 1 중간체의 11 내지 20 중량 % 를 차지함 ―; 및
(b) 상기 제 1 산출물 및 상기 제 2 산출물을 제조하기 위하여 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계 ― 상기 제 1 산출물은 제 1 상청액을 포함하고 그리고 상기 제 2 산출물은 제 1 페이스트를 포함함 ―;
를 포함하는,
방법. - 제 33 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분획화하는 단계는 :
(a) 제 1 중간체를 제조하기 위하여 상기 혈액 기반 물질에 염을 첨가하는 단계 ― 상기 염은 상기 제 1 중간체의 15 내지 30 중량 % 를 차지함 ―; 및
(b) 상기 제 1 산출물 및 상기 제 2 산출물을 제조하기 위하여 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계 ― 상기 제 1 산출물은 제 1 상청액을 포함하고 그리고 상기 제 2 산출물은 제 1 페이스트를 포함함 ―;
를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분리하기 위하여 상기 제 1 모듈을 사용하는 단계는 크로마토그래피를 사용하여 상기 혈액 기반 물질을 분리하는 단계를 포함하고, 그리고
상기 제 1 산출물은 통과물 및 세척물(wash) 중 적어도 하나를 포함하고 그리고 상기 제 2 산출물은 용출물을 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분리하기 위하여 상기 제 1 모듈을 사용하는 단계는, 한외여과에 의해 상기 혈액 기반 물질을 탈염시키는 단계 및 상기 혈액 기반 물질을 정용여과에 의해 농축시키는 단계 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질을 분리하기 위하여 상기 제 1 모듈을 사용하는 단계는, 무균여과에 의해 상기 혈액 기반 물질의 바이오버든(bioburden)을 감소시키는 단계, 용매-세제(solvent-detergent) 처리에 의해 바이러스를 비활성화시키는 단계, 및 나노여과에 의해 바이러스를 제거하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 1 모듈을 사용하는 단계 이전에 또는 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계 이전에 환원제를 첨가하는 단계를 더 포함하는,
방법. - 제 39 항에 있어서,
상기 환원제는 TECP, DTT 및 βME 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은, 소스 혈장, 신선 동결 혈장, 복원된 혈장 및 회수된 혈장 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈액 기반 물질은,
분획화된 혈액, 분획화된 혈장, Cohn 분획물, Nitschmann 및 Kistler 분획물, Cohn 방법으로부터의 중간생성물, Nitschmann 및 Kistler 방법으로부터의 중간생성물, 폴리에틸렌 글리콜 분획화로부터의 중간생성물, 및 카프릴레이트 분획화로부터의 중간생성물 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 1 산출물 및 제 2 산출물 중 적어도 하나를 분리하기 위하여 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계는, 상기 제 1 산출물을 분획화하는 단계를 포함하고, 그리고 상기 제 3 산출물은 페이스트 또는 상청액을 포함하는,
방법. - 제 43 항에 있어서,
상기 제 1 산출물을 분획화하는 단계는,
(a) 제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 산출물에 염을 첨가하는 단계 ― 상기 염은 상기 제 2 중간체의 15 내지 40 중량 % 를 차지함 ―; 및
(b) 상기 제 3 산출물을 제조하기 위하여 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계 ― 상기 제 3 산출물은 제 2 상청액 또는 제 2 페이스트를 포함함 ―;
를 포함하는,
방법. - 제 43 항에 있어서,
상기 제 1 산출물을 분획화하는 단계는,
(a) 제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 산출물에 염을 첨가하는 단계 ― 상기 염은 상기 제 2 중간체의 11 내지 20 중량 % 를 차지함 ―; 및
(b) 상기 제 3 산출물을 제조하기 위하여 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계 ― 상기 제 3 산출물은 제 2 상청액 또는 제 2 페이스트를 포함함 ―;
를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 1 산출물 및 제 2 산출물 중 적어도 하나를 분리하기 위하여 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계는, 크로마토그래피에 의해 상기 제 1 산출물을 분리하는 단계를 포함하고, 그리고 상기 제 3 산출물은 통과물, 세척물 및 용출물 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 1 산출물 및 제 2 산출물 중 적어도 하나를 분리하기 위하여 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계는, 한외여과에 의해 상기 제 1 산출물을 탈염시키는 단계 또는 정용여과에 의해 상기 제 1 산출물을 농축시키는 단계를 포함하고, 그리고 상기 제 3 산출물은 각각에서 탈염된 또는 농축된 산출물인,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 1 산출물 및 제 2 산출물 중 적어도 하나를 분리하기 위하여 상기 제 2 모듈을 사용하는 단계는, 무균여과에 의해 상기 제 1 산출물의 바이오버든을 감소시키는 단계, 용매-세제 처리에 의해 바이러스를 비활성화시키는 단계, 및 나노여과에 의해 바이러스를 제거하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는,
방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 제 3 산출물을 제 4 산출물로 분리시키기 위하여 제 3 모듈을 사용하는 단계;
를 더 포함하는,
방법. - 혈액 기반 물질로부터 생성물을 제조하는 방법으로서,
제 1 중간체를 제조하기 위하여 혈액 기반 물질에 제 1 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 1 염은 상기 제 1 중간체의 20 내지 50 중량 % 를 차지함 ―;
제 1 상청액 및 제 1 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 1 중간체를 분리하는 단계;
제 2 중간체를 제조하기 위하여 상기 제 1 페이스트를 재용해시키고 그리고 상기 재용해된 제 1 페이스트에 제 2 염을 첨가하는 단계 ― 상기 제 2 염은 상기 제 2 중간체의 5 내지 50 중량% 를 차지하고 그리고 상기 제 1 중간체의 염 농도보다 적은 양을 함유함 ―;
제 2 상청액 및 제 2 페이스트를 제조하기 위해 상기 제 2 중간체를 분리하는 단계;
친화 크로마토그래피에 의해 상기 제 2 상청액으로부터 제 3 중간체를 분리하는 단계; 및
상기 생성물을 함유하는 용출물을 제조하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 제 3 중간체를 분리하는 단계;
를 포함하는,
방법.
Applications Claiming Priority (3)
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