MXPA03007069A

MXPA03007069A - Acido carboxilico tal como acido citrico para desinfectar o mejorar la produccion de productos sanguineos tales como el plasma, crioprecipitado y/o plaqueta.

Info

Publication number: MXPA03007069A
Application number: MXPA03007069A
Authority: MX
Inventors: Shanbrom Edward
Original assignee: Shanbrom Tech Llc
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2004-10-15
Also published as: WO2002087560A1; CA2438223A1; EP1363616A1; AU2002248415B2; AU2002248415B8; BR0207058A

Abstract

Se proporciona la colecta de, sangre, procesamiento y transferencia por separacion de componentes discretos que contienen citrato adicional en uno u otra bolsa de procesamiento o colecta para la impureza de produccion mejorada de crioprecipitado. Se logra inhibir la activacion o desnaturalizacion de las componentes sanguineos que incluyen celulas sanguineas y proteinas de plasma y con la eliminacion de los componentes desnaturalizados y activados se mejora de tal modo la seguridad y eficacia de los productos finales, los cuales incluyen pegamento de fibrina.

Description

ÁCIDO CARBOXÍLICO TAL COMO ÁCIDO CÍTRICO PARA DESINFECTAR O MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS SANGUÍNEOS TALES COMO EL PLASMA, CRIOPRECIPITADO Y/O PLAQUETA Solicitudes Relacionadas La presente solicitud es una continuapión en parte de la Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 09/694, 178 presentada el 23 de Octubre del 2000, y la Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 09/778, 681 presentada el 7 de Febrero del 2001 y la Solicitud de Patente de E.U. No. de Serie 60/278,496 presentada el 23 de marzo del 2001 y reivindica la prioridad de las últimas dos solicitudes. Todas estas solicitudes se incorporan para referencia en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Área de la Técnica La presente invención se refiere a un método mejorado para producir cantidades en aumento de concentrados de factor de coagulación seguro del plasma sanguíneo. La invención también se dirige a mejorar la producción y pureza de los componentes sanguíneos e inhibir la activación o desnaturalización de ciertos componentes sanguíneos, células sanguíneas y proteínas de plasma, y a la eliminación de los componentes desnaturalizados y activados, mejorando de tal modo la segundad y eficacia de los productos finales.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR Existe un número de indicaciones rhédicas pára la administración de factores de "coagulación" o "agrumación" de la sangre humana. Estos factorés son proteínas que originan la coagulación sanguínea para estancar el sangrado de las heridas, etc. Los individuos con cualquiera de una serie de anormalidades genéticas que afectan a las proteínas responsables de la coagulación sanguínea padecen de una enfermedad (hemofilia) en donde la sangra falla en coagular normalmente, sometiendo al individuo al daño de sangrado incontrolado. Por varios años, esta condición se ha tratado al administrar los concentrados de las proteínas defectuosas o faltantes. Diversos factores de coagulación se sintetizan en el hígado de tal forma que las víctimas de enfermedad del hígado también se encuentran en necesidad de un aumento de sus factores de coagulación. Adicionalmente, existen otros importantes usos médicos para los factores relacionados a la coagulación incluyendo el uso de fibrina para producir "líquido obturante de fibrina" o "pegamento de fibrina". Mientras que algunos de los factores de coagulación se producen actualmente a través de la biotecnología, en este momento no existe todavía un método eficaz en costo para elaborar artificialmente todas estas proteínas o estas proteínas en suficientes cantidades. Además, los factores "artificialmente producidos" elaborados mediante las tecnologías relacionadas y recombinantes tienden a ser más caros. Varios de los factores "menores" todavía no se encuentran disponibles (y quizás nunca lo estén) de las fuentes de biotecnología y por lo tanto deben purificarse de la sangre humana donada. Esto es especialmente cierto en los países del Tercer Mundo en donde los productos de la biotecnología no se encuentran generalmente disponibles o suministrables. Por lo tanto, mucho del suministro de factor anti-^hemofilia (AHF, también conocido como Factor VIII), y otros factores de coagulación sanguínea se preparan del plasma sanguíneo agrupado. Un hemofiliaco requiere el tratamiento por un tiempo de vida completo. Las víctimas d^ enfermedad del hígado y otros usuarios de factores de coagulación también pueden requerir de tratamiento prolongado. Por lo tanto, estos pacientes se exponen a los productos sanguíneos producidos de la sangre de un gran número de donadores. La presencia del virus de SIDA (Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida) o HIV en el suministro sanguíneo significa que los hemofílicos y otros usuarios de factores de coagulación han llegado a infectarse con esta terrible enfermedad. A pesar de que las pruebas para seleccionar la sangre manchada de SIDA se han mejorado, algo de la sangre infectada si se desliza. Aún si el problema del SIDA se resuelve, el daño de otras enfermedades soportadas por la sangre, tales como los diversos tipos de hepatitis y otras, hasta ahora desconocidas, agentes infecciosos, hace deseable reducir o eliminar el virus y otros organismos de la enfermedad del plasma utilizado para preparar los factores de coagulación. Una manera de lograr esta meta es reemplazar los productos de plasma agrupado con productos de un donador único ya que con los productos agrupados "una manzana podrida hecha a perder el barril completo". Sin embargó, aún con el uso de los factores de coagulación derivados de un donador único, todavía existe peligro. A pesar de que las pruebas pueden mostrar que el donador se encuentra libre de la enfermedad conocida, el donador puede estar incubando una enfermedad que posteriormente se mostrará en las pruebas, o el donador puede albergar una enfermedad todavía desconocida o una cepa todavía desconocida de una enfermedad conocida. Estos peligros se han disminuido por el uso de pre-tratamientos de plasma que inactivan los organismos de la enfermedad. Desafortunadamente, los mejores tratamientos comúnmente utilizados ya sea que no inactiven todos los tipos de los organismos de la enfermedad o dañen los factores de coagulación inestables durante el proceso de inactivación de los organismos de la enfermedad. Los métodos básicos para preparar los concentrados de factor de coagulación de la sangre no han cambiado mayormente durante las últimas décadas. Generalmente, un concentrado de factores de coagulación se deriva del plasma agrupado mediante una etapa de crioprecipitación. Diversos aditivos tales como el etanol o glicol de polietileno, se agregan usualmente para mejorar la eficacia de la etapa de crioprecipitación. Siguiente a la crioprecipitación, los factores parcialmente purificados pueden además purificarse mediante las etapas de precipitación adicionales o mediante métodos cromatográficos, y más recientemente mediante métodos que utilizan anticuerpos monoclonales. Para información adicional sobre las técnicas básicas de la purificación del factor de coagulación y la historia del desarrollo de estos métodos, el lector se dirige a las Pat. de E.U. Nos. 3,560,475, ¿,631 ,018, 3,682,881 , 4,069,216, y 4,305,871 y 5,770,704 por el presente inventor, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia, y las referencias se citan en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es mejorar la producción y pureza de crioprecipitado. Un objeto más de la presente invención es inactivar y/o mejorar la inactivación de los organismos de la enfermedad dentro del plasma al mismo tiempo que la producción de crioprecipitado se mejora y el crioprecipitado además se purifica. Un objeto más de la presente invención es inhibir la inactivación o desnaturalización de los componentes sanguíneos, incluyendo las células sanguíneas y proteínas de plasma, y/o remover estos componentes desnaturalizados o activados, mejorando de tal modo la seguridad y eficacia del producto final. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método mejorado para la fraccipnación de la sangre. Los derivados de ácidos carboxílicos simples, particularmente citrato de trisodio y otras sales de ácido cítrico (de aquí en adelante "citrato"), se muestra que son agentes inesperadamente eficaces para mejorar la producción de los factores de coagulación sanguínea. Se cree que otros pequeños ácidos carbo ílicos, ácido isocítrico en particular, puede mostrar propiedades similares. Sin embargo, a la fedia, la mayoría de las pruebas se han hecho con ácido cítrico y sus sales. La adición de citrato al plasma, especialmente en concentraciones entre 2 y 10% en peso, no desnaturaliza apreciablemente las proteínas inestables. Sin embargo, en este rango de concentración el citrato es eficaz en la inactivación o inhibición de una variedad de microorganismos patogénicos. Además, el cítrato agregado potencializa o mejora la muerte de los microorganismos por tratamiento de calor. Es decir, el calentamiento del material a temperaturas relativamente bajas (es decir, arriba de 45°C) las cuales no desnaturalizan las proteínas, mejora la muerte de los microorganismos en la presencia de citrato. Más significativamente, el citrato agregado origina un aumento dramático en el peso de crioprecipitado que puede producirse de plasma mediante los procedimientos usuales. La mayoría de los factores de coagulación significativos se concentran mayormente en el crioprecipitado resultante. El sobrenadante contiene pocos, si los hubiere, de estos factores de coagulación. Es aparente que al aumentar la cantidad de citrato en las bolsas de sangre de tal forma que la concentración final será al menos 2% en peso se da como resultado el plasma que puede utilizarse para producir concentrados de plaqueta mejorados y crioprecipitado enriquecido. El citrato agregado puede ayudar a eliminar o suprimir los microorganismos contaminantes y puede por sí mismo removerse posteriormente mediante intercambio de iones o métodos similares bien conocidos en la materia. Otro aspecto de la invención es el uso de citrato para mejorar la producción y pureza de crioprecipitado. Además, el citrato agregado puede inhibir la activación o desnaturalización de los componentes sanguíneos incluyendo las células sanguíneas y proteínas de plasma y/o facilitar la eliminación de los componentes desnaturalizados o activados y mejora la seguridad y eficacia de los productos finales. De acuerdo a la invención, se proporciona un método para reducir la enfermedad asociada a la transfusión y los efectos secundarios en el plasma y para mejorar la pureza y seguridad de múltiples componentes derivados de la sangre incluyendo células sanguíneas y plasma. En este método, existe la etapa de agregar al menos aproximadamente 2% en peso de sal de ácido carboxílico o peso equivalente de ácido carboxílico a la sangre o plasma. Además, la invención se dirige a mejorar la producción de otros componentes sanguíneos derivados incluyendo células sanguíneas y proteínas de plasma. La invención se incluye para reducir la enfermedad asociada a la transfusión y ios efectos secundarios en el plasma y para mejorar la pureza y seguridad de los múltiples componentes derivados de la sangre incluyendo células sanguíneas y el plasma del plasma. Los derivados comprenden ál menos un producto del grupo de Crioprecipitado Enriquecido, Plasma Crio-Agotado, Fibrinogen, Líquido obturante o Pegamento de Fibrina, vWF (factor von Willdebrand), Fibronectina, Factor VIII, Complejo de Protrombina, una Serpina, Albúmina, y una Globulina de plasma. Al menos 2% en peso de una sal de ácido cítrico (o peso equivalente de ácido cítrico) se agrega al plasma. El plasma puede colectarse en una bolsa de sangre que contiene el ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico. Esta bolsa de sangre puede ser diferente de una - d -bolsa o contenedor utilizado para colectar la sangre completa. Alternativamente o adicionalmente, una cantidad de ácido carboxílico adicional o la sal del mismo puede agregarse directamente a la bolsa utilizada para colectar la sangre completa. En una forma más preferida de la invención, el citrato se utiliza adecuadamente en la colecta de sangre, en el procesamiento y transferencia de sangre en una separación de componentes sanguíneos discretos. El citrato se utiliza en cantidades aumentadas, principalmente, adicionales, sobre el nivel tradicionalmente empleado para la anticoagulación en una u otra colecta o bolsa de procesamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 es una representación gráfica de la mejora en la producción de crioprecipitado que se da como resultado de la presente invención. La FIGURA 2 es una representación del esquema de fraccionación de plasma y sangre que utiliza la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporciona la siguiente descripción para permitir a cualquier experto en la materia hacer y utilizar la invención y establecer los mejores modos contemplados por eí inventor para llevar a cabo su invención. Sin embargo, diversas modificaciones permanecerán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la materia, ya que los principios generales dé la presente invención se han definido en la presente específicamente para proporcionar la producción mejorada de proteínas de plasma junto con la inactivación de los organismos de la enfermedad soportada de la sangre. El método tradicional para producir factores de coagulación, así como también varios de los métodos actualmente utilizados, operan debido a varias proteínas de plasma responsables del precipitado de coagulación (es decir, de crioprecipitado) de la solución a temperaturas bajas cuando se concentran lo suficiente. Cuando una solución de proteína se congela, la forma de cristales de hielo y moléculas de proteína, que se excluyen de los cristales llegan a concentrarse en aumento. Al enfriar o congelar el agua también se disminuye la actividad química del agua. Dependiendo de las proteínas en particular, las proteínas pueden actualmente caer de la solución, es decir, formar un precipitado, si la proteína interactúa más fácilmente consigo misma o con otras proteínas diferentes al agua. Cuando la actividad química del agua se disminuye, tal precipitación se favorece. Este proceso puede desnaturalizar las proteínas (hacerlas irreversiblemente insolubles), de modo que es usual congelar las soluciones de proteína fácilmente y a una temperatura baja (es decir, -20°C o menos) para minimizar la formación de cristales de hielo y prevenir el crecimiento de aquellos cristales que se forman. Esto se hace para limitar la desnaturalización de la proteína sobre Jas superficies de cristal de hielo. S>in embargo, aún cuando se lleva a cabo la congelación con mucho cuidado, los cristales de hielo pueden originar la "activación" del complejo de protrombina, dando como resultado la formación de coágulo espontáneo después de que el plasma se descongela.

La primera etapa ep el procedimiento típico para producir el crioprecipitado de plasma es centrifugar la sangre completa para separar el plasma de los glóbulos rójos. Este procedimiento se conoce bien en la materia y frecuentemente se logra en centrífugos especiales que rriantienen las bolsas de sangre del individuo de tal forma que la separación de plasma/glópulo rojo ocurre sin abrir aún la bolsa de sangre. Siguiente a la centrifugación , es de práctica común expresar el plasma de sobrenadante en una bolsa de sangre "satélite" para mayor procesamiento. Una vez que el plasma se separa de los glóbulos blancos y rojos, el procedimiento típico es congelar rápidamente el plasma para así descongelar lentamente el plasma congelado a aproximadamente 4°C, durante lo cual la descongelación dé los factores de coagulación y otras proteínas forman un crioprecipitado que puede recolectársé rápidamente mediante filtración o centrifugación. Este crioprecipitado no se vuelve irreversiblemente insoluble y puede volverse a disolver fácilmente en un regulador de resistencia iónica baja, o aún en agua, así como se conoce en la materia. La crioprecipitación generalmente se cree que se da como resultado cuando la eliminación de agua de la proximidad inmediata de las moléculas de prpteína origina que las moléculas dé proteína se asocien preferentemente entre sí a diferencia de con el agua. Esta "eliminación" de agua puede representar cambios en la solubilidad de las proteínas con cambios en la temperatura (¾s decir, el agua |lega a ser menos eficaz al disolver las proteínas). El proceso también puede lograrse o mejorarse al utilizar aditivos que "inmovilizan" el agua y originan que interactúe con las proteínas a un grado inferior. Estas sustancias aditivas pueden ser cualquier número de materiales hidrofílicos tales como etanol, glicol de polietileno, heparina, polímeros de poliol RTM Plurónico y diversas "sales" tales como sulfato de amonio o acetato de amonio. El "desalado" de las proteínas de la solución es un procedimiento bioquímico clásico. Estos y otros materiales utilizados para aumentar la producción de crioprecipitado generalmente operan para reducir la actividad eficaz de agua en la mezcla. Es decir, las moléculas de agua interactúan preferentemente con el material hidrofílico agregado en lugar de con las proteínas. Esto permite a las proteínas interactuar entre sí y, por lo tanto, precipitarse de la solución. De igual forma, la disminución de la temperatura también reduce la actividad de agua, permitiendo a las interacciones de proteína-proteína predominar. Los aditivos hidrofílicos ya mencionados tienen la ventaja de ser relativamente baratos y fáciles de utilizar. Sin embargo, su uso necesita usualmente etapas de lavado adicionales para asegurar que los aditivos no se lleven a cabo sobre el producto final. Algunos aditivos también pueden dañar o desnaturalizar los factores de coagulación inestables que uno busca purificar. El presente inventor ha descubierto que uno de los agentes frecuentemente utilizados como un anticoagulante en la fraccionación de sangre inesperadamente sirve para mejorar la formación de crioprecipitado. El citrato (citrato de trisodio o sales similares así como también derivados de otros ácidos carboxilicos de bajo peso molecular tales como ácido isocítrico) tiene propiedades no usualmente favorables cuando se utiliza en los procedimientos de fraccionación de sangre a niveles significativamente más altos que aquellos tradicionalmente utilizados como un ánticoagulante. El citrato es un quélador casi eficaz de iones de calcio. Al disminuir eficazmente el nivel de ión de calqio, el citrato inhibe una variedad considerable de trayectorias de coagulación sanguínea que dependen de la presencia de iones de calcio. Sjn embargo, el citrato no sé ha empleado como un agente para mejorar la preparación de proteínas de crioprecipitado de plasma y otras fracciones de sangre. La siguiente tabla muestra la producción mejorada de crioprecipitado originada al aumentar el nivel de citrato de trisodio en el plasma. A medida que el citrato se aumenta, el peso de crioprecipitado recuperado se aumenta. Cuando el crioprecipitado se vuelve a disolver en una cantidad fija de regulador o agua, la cantidad en aumento de crioprecipitado produce cantidades en aumento del Factor VIH y fibrinogen segúri sé compara al plasma original. Sin embargo, parece razonable especular que una acción de citrato puede ser inhibir la activación de los factores de coagulación. Ya que varios de estos factores actúan como proteasas cuándo se activan , la activación naturalmente digiere las proteínas de coagulación reduciendo de esta manera la producción de estas proteínas. Sin embargo, la falta de inactivación no parece ser suficiente para contar por el aumento entero en la producción de crioprecipitado. Tratamiento Crioprecipitado Factor VIII Fibrinogen control 0.1 g 1 20% 46 mg/dl 2% de citrato 0.3 g 1 80% 53 mg/dl 5% de citrato 0.9 g 247% 105 mg/di 10% de citrato 3.0 g 622% 152 mg/dl Estos datos se representan gráficamente en la Fig. 1 . Estos resultados indican que á medida que la concentración de citrato aumenta la cantidad de factores de coagulación recuperados aumenta lipealmente. Sin embargo, en la concentración más alta de citrato podría parecer que puede existir un aumento en la precipitación de otras proteínas. Puede ser posible ajusfar la concentración de citrato para favorecer la precipitación de diferentes proteínas. Las pruebas han mostrado que además de más del 95% del Factor VIH y Fibrinogén, virtualmente toda la Fibronectina y el factor von Willdebrand llegan a concentrarse én el críoprecipitado mejorado por citrato. Se emprendieron experimentos adicionales para determinar si las metaloproteínas u otros factores se concentran preferentemente en el criQprecipitado de citrato. Los resultados iniciales no muestran otras proteínas que se concentren fuertemente tanto como aquellas ya mencionadas. Sin embargo, existe alguna indicación de que la ceruloplasmina y el total de †3 en cierta forma se concentran en el críoprecipitado. Sobre la superficie, uno podría esperar que el citrato sea más eficaz que cualquier sal hidrofílica. Én términos de desalar las proteínas de la solución, uno podría esperar que diversos agentes operen en base a sus propiedades coligativas. Es decir, uno podría esperar qué las concentraciones equimolares de diversos agentes se comporten de manera similar. Esto no parece ser el caso con la formación de críoprecipitado y citrato. Las siguientes cantidades de cualquier sal (NaCI) o citrato (citrato de sodio) se agregaron a 40 mi de alícuotas de plasma humano fresco. Después de mezclar completamente las muestras se congelaron durante la noche a -70°C y después se descongelaron completamente a 4°C. Las muestras se centrifugaron así a 4000 RPM por 20 min. para recolectar el crioprecipitado. Se hizo cualquier intento por igualar la concentración de sodio eficaz entre el cloruro de sodio y el citrato de sodio sobre la base de que cada molécula de citrato de trisodio podría proporcionar tres iones de sodio mientras que cada molécula de cloruro de sodio podría proporcionar solamente un ión de sodio único. Este intento en compensación fue inexacto debido a que la igualación debió hacerse sobre un molar en lugar de un por ciento de base. Sin embargo, este experimento fallido señala ia superioridad increíble de citrato de sodio sobre el cloruro de sodio para producir el crioprecipitado. En ia siguiente tabla, se muestran el citrato (citrato dé trisodio) o sal (cloruro de sodio), primero como porcentajes en peso y después como molaridades. La tercer columna muestra el efecto osmótico eficaz dé las soluciones, el cual es dos veces mayor sobre una base molar para citrato que para cloruro de sodio. Esto se debe a que cada molécula de cloruro de sodio libera solamente dos, partículas (un ión de sodio y un ión de cloruro) mientras que cada molécula de citrato de sodio libera cuatro partículas (tres iones de sodio y un ión de citrato). Debido a que el peso molecular de citrato de trisodio es casi 5 veces mayor que aquél de la sal, para obtener efectos osmóticos iguales uno debe utilizar aproximadamente 2.5X (sobre una base en peso) tanto citrato de trísodio como cloruro de sodio. Es decir, para una igualación exacta deberían haberse utriizadp rnás citrato en lugar de más sal.

Estos resultados muestran que el efecto de citrato sobre la producción de crioprecipitado no se relaciona fuertemente a las propiedades osmóticas o qoligativas del citrato. El cloruro de sodio parece no mejorar la formación de crioprecipitado. Solamente a niveles osmóticos que se encuentran mayormente arriba de aquellos de la concentración de citrato máxima, la formación de crioprecipitado comienza a alcanzar aquella del plasma de control. Además, el crioprecipitado resultante nó parece tan puro (es decir, se incluyen cantidades más grandes de otras proteínas de no coagulación). Siguiente al experimento, lós sobrenadantes y el plasma original (control) se enviaron al laboratorio de química clínico para determinar la presencia de diversas proteínas sanguíneas que incluyen los factores de coagulación. Estos resultados se muestran en la siguiente tabla.

A medida que la cantidad de citrato aumenta, los niveles de fibrinogen y el Factor VIII en el sobrenadante se reducen dramáticamente. Al mismo tiempo, el nivel de albúmina (la proteína de plasma principal) se encuentran esencialmente sin afectar. En otras palabras, la mayoría de los factores de coagulación se precipitan y se encuentran en el crioprecipitado, pero poca o nada de albúmina se precipita. En el caso de cloruro de sodio, las concentraciones equimolares son mucho menos eficaces en la precipitación de los factores de coagulación. Uno tiene que ir hasta 30% de cloruro de sodio para ver una precipitación significativa de los factores de coagulación. Sin embargo, a este nivel, la albúmina también comienza a precipitarse. El citrato es más eficaz al precipitar selectivamente los factores de coagulación. Además se junta la perspicacia en el efecto de citrato al analizar la distribución de citrato en un experimento de crioprecipitado típico. Para este experimento, una unidad (aproximadamente 200 mi) de plasma se produjo un 10% de p/vol. de citrato de sodio. En todos los experimentos, las medidas de pH mostraron que la regulación natural del plasma previno los cambios significativos en pH . Esta plasma tratado por citrato se congelo y el crioprécipitado se colectó en la manera usual. Como un apartado en la producción de crioprécipitado de citrato se prefiere agregar el citrato antes de la congelación , pero es logran buenos resultados al agregar el citrato durarite el proceso de descongelación. El volumen de precipitado formado de la unidad de plasma fue aproximadamente 20 mi, es decir, 1 0% del volumen total. Sorprendentemente, un análisis del crioprécipitado y el plasma de sobrenadante mostraron que aproximadamente 12 g (60%) del citrato se concentró en el crioprécipitado con solamente 30% dejándose en el sobrenadante. Esto indica que existe una fuerte interacción entre las proteínas de crioprécipitado y el citrato. Además, mientras que el crioprécipitado normal puede volver a disolverse en agua o regulador a temperatura ambiente, el crioprécipitado de citrato es casi insoluble en el agua a temperatura ambiente. Sin embargo, es soluble en regulador de salina a temperatura ambiente y más soluble cuando el regulador contiene citrato. Una forma de explicar estos fenómenos es asumir que las múltiples cargas negativas sobre la molécula de citrato interactúan con las cargas positivas sobre las proteínas de crioprécipitado para degradarlas. El citrato agregado "satisface" estas cargas positivas de tal forma que se evita la degradación. Debido a la concentración de las proteínas de coagulación en el crioprécipitado, se induce a especular que todas las proteínas de coagulación comparten algún tipo de motivo de carga positiva que interactúa con las moléculas de citrato. En resumen, en comparación al crioprecipitado "normal", el crioprecipitado de citrato contiene esencialmente todo el Fibrinogen, Fibronectina, Factor VII I y el factor von Willdebrand encontrado en una alícuota tratada de plasma. El crioprecipitado de citrato también puede contener otros factores menores (como el Factor VIII) todavía no ensayado en estos experimentos. Lo que puede ser significativo es lo que el crioprecipitado de citrato no contiene. Tiene significativamente menos albúmina, globulinas y otras proteínas menores que el crioprecipitado "normal". Los experimentos continúan caracterizando estas diferencias. A pesar de que el citrato parece influenciar fuertemente la precipitación de los factores de coagulación, no parece desnaturalizar estas proteínas. El citrato a 2% en peso se agregó a una alícuota de plasma que se almacenó a temperatura ambiente por seis días. Los factores de coagulaciorr y plaquetas se contaron al inicio y al final del período de tiempo. ¡Según se compara al plasma de control, la adición de citrato no pareció dañar los factores de coagulación. Actualmente, existe alguna sugerencia de que el citrato puede ayudar en la actualidad a conservar las plaquetas. Esto podría ser consistente con la hipótesis de que el citrato inhibe algunas de las proteasas. 2% de Plasma de Citrato Medida Día 1 Día 6 Fibrinogen (mg/dl) 243 239 Factor I I (%) 104 91 Factor V 49 22 Factor VII (%) 81 72 Factor VIII (%) 103 92 Factor IX (%) 106 95 Factor X (%) 92 97 Plaquetas (103/10- L) 31 1 239 PT (seg) 14.1 16.2 PTT (seg) 31 .4 47.9 Plasma de Control Medida Día 1 Día 6 Fibririogen (mg/dl) 241 239 Factor I I (%) 103 93 Factor V 58 25 Factor VII (%) 86 69 Factor VII I (%) 100 89 Factor IX (%) 106 92 Factor X (%) 93 85 Plaquetas (103/10-tíL) 317 192 PT (seg) 13.5 19.5 PTT (seg) 32.5 50.2 Significativamente, los experimentos de bacteriología mostraron que e 2% de citrato de sodio inhibe fuertemente el crecimiento de Escheríchia coli e inhibe completamente el crecimiento de Staphylococcus epidertnidis. El crecimientp de la bacteria (principalmente la bacteria de piel de la desinfección dé superficie inadecuada) en los concentrados de plaqueta disminuye significativamente la vida útil de las soluciones ricas en plaqueta. La adición de citrato inhibe el crecimiento bacteriano extendiendo de tal modo potenciaimente la vida de tales concentrados. Según se ha demostrado anteriormente, la adición de citrato no daña los constituyentes de plasma y actualmente mejora significativamente la producción de crioprecipitado. Por lo tanto, se propone aumentar significativamente el nivel de citrato en las bolsas de colecta de sangre del 0.4% actualmente utilizado para la anticoagulación hasta al menos 2% de citrato de sodio en peso. Este nivel podría inhibir o matar varios microorganismos contaminantes y podrían volver el plasma más adecuado para la producción de crioprecipitado. Un simple interés también es agregar citrato de sodio justo antes de la producción de crioprecipitado en donde se necesitan niveles más allá del 2%. El citrato agregado parece mejorar la susceptibilidad de los microorganismús a una variedad de "agentes desinfectantes" incluyendo calor. En un experimento de 2%, el citrato de sodio se agregó a un brote de crecimiento bacteriano típico. Veinticinco mi de alícuotas del brote se perforaron con 1 x 104 organismos ya sea de Esgherichia coli o Staphylococcus epidermidis. Las muestras del brote produjeron 2% en peso de citrato de sodio y después se sometieron a la "pasteurización" a 65°C ya sea por 5 o 10 min. , después de lo cual las muestras se laminaron en medio de crecimiento y se incubaron. El tratamiento de citrato de 10 min. originó la destrucción total de las bacterias. A los 10 min. , las bacterias de control se encontraron esencialmente sin afectar. Sin embargo, el citrato de tratamiento de 5 min. no mató toda la bacteria E. coli (aproximadamente upa muerte 3-log.). La Staphylococcus epidermidis fue más sensible y se mató completamenté en la presencia de citrato. La adición de citrato mejora claramente la habilidad del calor de matar los microorganismos. Además, el citrato agregado parece estabilizar las proteínas inestables contra la desnaturalización de calor. Estos resultados indican que la adición de citrato aumentado hace posible el tratamiento de calor eficaz del plasma. Un problema con los concentrados de plaqueta y con el plasma es el crecimiento extra de las bacterias que se presentan originalmente en números muy bajos. Algunas de las bacterias contaminantes aparentemente vjenen de la superficié de piel cuando la sangre se obtiene por venipuntura. Además, existe evidencia creciente de que la sangre no es completamente séptica. Es decir, normalmente existen un número de bacterias que circulan en la corriente sanguínea humana. La inmunidad normal previene el sobre crecimiento de estaá bacterias. Para estimular esta situación, 10 mi de muestras de plasma humano se inocularon a niveles muy bajos (10 organismos por mi) con las bacterias listadas en la siguiente tabla. Se empleó ya sea plasma normal (N) o plasma con 2% en peso de citrato (C). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente por siete días con upa muestra laminada sobre el ágar de crecimiento en cada punto de tiempo. Se utilizaron tres plasmas humanos diferentes, pero todos produjeron resultados idénticos. En la tabla "nc" = "no crecimiento" mientras "+" indica algo de crecimiento bacteriano y "++ " indica crecimiento más largo. (a) Escherichia coli (b) Klebsiella pnéutnoniae (c) Staphylococcus epidermidis (d) Staphylococcus airreus (e) Pseudomonas fluorescens (f) Yersinia enterocolitica (g) Serratia marcescens En los días seis y siete, el plasma normal mostró crecimiento de todas las especies de bacteria inoculadas excepto para Serratia. Por el otro lado, ningunas de las muestras de plasma que contienen citrato demostraron algo de crecimiento bacteriano. Esto indica que el 2% en peso de citrato es capaz de inhibir fuertemente el crecimiento de un amplio rango de bacterias. Al combinar estos resultados con los resultados de la plaqueta favorable se demuestra que la adición de 2% o más de citrato a concentrados de plaqueta puede conservar los concentrados contra el crecimiento bacteriano sin dañar las plaquetas. Si existe algún interés acerca del citrato en exceso en las plaquetas, este puede removerse fácilmente por tratamiento con una resina de intercambio de aniones o material similar. Se sospechó que la falla de observar Serratia se debió a la velocidad de crecimiento lento de este organismo. Por lo tanto, el experimento se repitió utilizando Serratia marcescens y Staphylococcus epidermidis para inocular las muestras de plasma en el nivel de 100 organismos por mi. En este caso, el día uno el punto de tiempo para Serratia mostró 92 colonias mientras que Staphylococcus mostró 101 colonias para el plasma normal. De esta manera, no se observó crecimiento en cualquier caso para el plasma que contiene citrato. El mecanismo preciso mediante el cual el citrato y las moléculas similares actúan, no se conoce. Los múltiples grupos carboxilo parecen importantes particularmente en el caso de crioprecipitado. Los ácidos, láctico y oxálico, son menos eficaces. Parece que es posible que algún tipo de interacción de carga favorezca la precipitación de los factores de coagulación. Según se menciona anteriormente, parece ser que es buena información apoyar la hipótesis de que el citratp degrada preferentemente las proteínas de crioprecipitado. Mientras que la habilidad quelante es claramente importante para los efectos de anticoagulación bien conocidos de citrato, la quelación puede no ser central para la presente invención a medida que el isocitrato se cree que es un agente quelante más escaso que el citrato. También puede ser que la participación de varjas de las moléculas eficaz en el ciclo de ácido tricarboxílico también puedan relacionarse a sus efectos -particularmente aquellos sobre el crecimiento bacteriano. Es decir, parece probable que el fenómeno de crioprecipitadd y el fenómeno de crecimiento bacteriano tienen explicaciones por separado. La invención se ha descrito principalmente con respecto al crioprecipitado. Existen otras características, y componentes sanguíneos, y productos que forman la materia de la invención. Éstos se ilustran en la FIGURA 2 anexa que muestra un Esquema de Fraccionación, y diferentes componentes sanguíneos y proteínas de plasma, que se obtienen del sistema y a los cuales se aplica la tecnología de citrato. El punto de inicio es la sangre colectada -aquí una bolsa de sangre tratada por CPDA (citrato-fosfáto-dextrosa-adenina). El citrato extra podría agregarse a esta primer bolsa o podría agregarse, por ejemplo, en la etapa de la segunda bolsa vacía con aquella bolsa que contiene citrato en una concentración eficaz de más de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 1 fj% en peso o por volumen de citrato de trisodio. Según se menciona anteriormente, el citrato aún puede agregarse en la etapa de congelación/descongelación. Debido a esta adición adicional de citrato, se obtienen nuevos productos diferentes. Este proceso relacionado al citrato tiene las siguientes características que se relacionan a la FIGURA 2: 1 . Los productos y procesos que comienzan desde la Segunda Bolsa Vacía hacia delante muestran mejoras en la pureza y seguridad sobre el plasma normalmente fraccionado. El crioprecipitado enriquecido 1 se encuentra en una producción más alta que en la técnica anterior. El crioprebipitado enriquecido 1 tiene proteínas de suero ajenas "contaminantes" inferiores según se compara al crioprecipitado "normal". Sí se producé pegamento de fibrina 4 crudo directamente del crioprecipitado enriquecido por la adición de complejo de trombina o protrombina (Factores II, Vil, IX, y X), el pegamento resultante es superior en resistencia para el pégamento de fibrina crudo producido en la misma manera del crioprecipitado "normal". Se compara favorablemente, y puede actualmente ser superior, al pegamento de fibrina altamente refinada. El producto es más seguro debido a que el citrato inhibe el crecimiento bacteriano y debido a que el citrato puede facilitar una etapa de "pasteurización" para destruir más los patógenos. Además, debido a la producción mayor de crioprecipitado enriquecido, y mayor resistencia del pegamento de fibrina crudo, el pegamento de fibrina derivado de sí mismo llega a ser más servible. Los productos derivados de sí mismos son inherenteménte más seguros. Además, debido a la producción mayor de fibrinogen con crioprecipitado enriquecido, es servible producir líquido obturante o pegamento de fibrina "refinado", el cual es fibrinogen principalmente puro más trombind (agregada durante la aplicación) a pesar de que pueden incluirse Factor VIII y otros ingredientes. El plasma crio-agotado 3 es más seguro por las razones anteriormente mencionadas. También es inherentemente más seguro debido a que contiene fibrinogen menor al plasma normalmente procesado. Esto significa que virtuálmente es imposible para este material desarrollar microcoagulaciones debido a la activación del complejo de protrombina -tales microcoagulaciones pueden originar la coagulación intravascular y problemas de, transfusión relacionados. También, el nivel de citrato elevado reduce la probabilidad de activación del complejo de protrombina. Una segunda bolsa con el ácido carboxílico aumentado y/o derivado de citrato (u otro uso de niveles superiores de citrato) es una característica que anterior a la presente invención nunca ha sido parte de un proceso de fraccionación de sangre o parte de la producción de componentes sanguíneos para uso clínico. Existen ventajas significativas para utilizar citrato aumentado (o ácidos carboxílicos relacionados). 2. Fibrinogen 3, Pegamento de Fibrina 4, factor von Willdebrand 5, Fibronectina 6 y Factor VIII 7 pueden producirse mediante métodos cromatográficos estándares, pero el uso de extracción diferencial simplifica el proceso. Según se menciona anteriormente, el crioprecipitado de citrato enriquecido 1 es mayormente insoluble en agua. Es soluble en salina normal y muy soluble como salina a la cual se agrega citrato. Por lo tanto, la extracción con reguladores que tienen cantidades diferentes de citrato dá como resultado la solubilidad preferencial de los diferentes productos. 3. Los productos 8, 9 & 10 pueden producirse de Donador Único o de Plasma Agrupado (preferentemente en combinación con desinfección de yodo -según se detalla, por ejemplo, en la Patenté de E.U. No. 6,045,787). 4. También es posible utilizar desinfección de yodo antes de la etapa de crioprecipitado. Una solicitud co-pendiente demuestra que el citrato mejora el tratamiento de yodo. Sin embargo, las columnas utilizadas en la patente referencia remueven el citrato. Por lo tanto, después de la desinfección de yodo¡ el citrato adicional puede agregarse a la segunda etapa de bolsa vacía de sangre pero antes del procedimiento de congelación/descongelación. La Albúmina & Globulinas (producto 10) puede además fraccionarse para producir albúmina y glqbulina gamma separada. Generalmente, se utilizan técnicas de fraccionacióri bien conocidas. El intercambio de aniones (DEAE) se utiliza para purificar el complejo de protrombina. El DEAE/sephadex puede utilizarse en un proceso de donador único tanto para purificar la protrombina como para deshidratarla. Las Serpinas 9 se purifican mediante métodos estándares. Las producciones se mejoran debido a la proteasa que inhibe las propiedades del citrato agregado. Nuevamente, estos productos son más seguros debido á que el citrato, debido a que la etapa de yodo, debido a que los productos de donador único pueden prepararse fácilmente y debido a que se facilita la pasteurización. La invención cubre el proceso y los productos obtenidos por el proceso. Se entiende de esta manera que las siguientes reivindicaciones incluyen lo que se ilustra específicamente y se describe anteriormente, lo que puede sustituirse obviamente y también lo que incorpora la idea esencial de la invención. La modalidad ilustrada se ha establecido solamente para los propósitos de ejemplo y no deberá tomarse como limitante de la invención. Pór lo tanto, se entiende que, dentro del alcance de las reivindicaciones ahexas, la invención puede practicarse diferente a lo específicamente descrito en la presente.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método para reducir la enfermedad asociada a la transfusión y los efectos secundarios en el plasma y para mejorar la pureza y seguridad de los múltiples componentes derivados de la sangre incluyendo células sanguíneas y plasma comprendiendo la etapa de agregar al menos aproximadamente 2% en peso de ácido carboxílico o una sal de ácido carboxílico a la sangre o plasma. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el ácido carboxílico es ácido cítrico. 3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque una sal de trisodio de ácido cítrico se agrega al plasma. 4. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el plasma es un concentrado de plaqueta. 5. El método según la reivindicación 1 , comprendiendo además la etapa de calentar el plasma arriba de 45°C. 6. El método según la reivindicación 1 , comprendiendo además la etapa de remover el ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico por medio de cromatografía de intercambio de iones. 7. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el plasma se coloca en una bolsa de sangre que contiene el ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque la bolsa de sangre es una diferente de una bolsá o contenedor utilizado para colectar la sangre completa. 9. Un método para reducir la enfermedad asociada a la transfusión y los efectos secundarios en el plasma y para mejorar la pureza y seguridad de los múltiples componentes derivados de la sangre incluyendo, células sanguíneas y plasma del plasma, comprendiendo la etapa de agregar al menos aproximadamente 2% en peso de ácido cítrico o una sal de ácido cítrico al plasma. 1 0. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el plasma se colecta en una bolsa de sangre que contiene el ácido cítrico o la sal de ácido cítrico. 1 1 . El métpdo según la reivindicación 9, caracterizado porque una sal de trisodio de ácido cítrico se agrega al plasma. 12. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el plasma es un concentrado de plaqueta. 1 3. El método según la reivindicación 9, comprendiendo además la etapa de remover el ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico por medio de cromatografía de intercambio de iones. 14. El método según la reivindicación 9, comprendiendo además la etapa de calentar el plasma arriba de 45°C. 15. Un método para reducir la enfermedad asociada a la transfusión y los efectos secundarios en el plasma y para mejorar la pureza y seguridad de los múltiples componentes derivados de la sangre a través de la fraccionación de plasma comprendiendo las etapas de: agregar al menos aproximadamente 2% en peso de ácido carboxílico o una sal de ácido carboxílico al plasma; y someter el plasma a una etapa de congelación/descongelación para producir un crioprecipitado enriquecido y plasma crio-agotado; y separar el crioprecipitádo enriquecido del plasma crio-agotado. 16. Un crioprecipitádo enriquecido producido según el método de ia reivindicación 15. 17. Un plasma crio-agotado producido según el método de la reivindicación 15. 18. El método Según la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido carboxílico o sal del ácido carboxílico se agrega durante la parte de descongelación de la etapa de congelación/descongelación. 19. El método según la reivindicación 15, comprendiendo además la etapa de fraccionar el crioprecipitádo enriquecido para producir al menos un fibrinogen, factor von Willdebrand, fibronectina y Factor VIII. 20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque el fibrinogen se utiliza para producir pegamento de fibrina. 21 . El método según la reivindicación 20, caracterizado porque el pegamento dé fibrina comprende además al menos un complejo de protrombina y trombina. 22. Un pegamento de fibrina producido según el método de la reivindicación 20 o 21 . 23. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa de fraccionación incluye extracción diferencial. 24. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el crioprecipitádo enriquecido se utiliza para producir pegamento de fibrina. 25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el pegamento de fibrina comprende además al menos un complejo de protrombina y trombina. 26. Un pegamento de fibrina producido según el método de la reivindicación 24 o 25. 27. El método según ja reivindicación 15, comprendiendo además la etapa de fraccionar el plasma crio-agotado para producir al menos un complejo de protrombina, serpina, albúmina y globulina. 28. El método según la reivindicación 1 5, caracterizado porque el plasma se somete a una etapa de desinfección de yodo. 29. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido carboxílico es ácido cítrico. 30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque una sal de trisodio de ácido cítrico se agrega al plasma. 31 . El método según la reivindicación 15, comprendiendo además la etapa de calentar el plasma arriba de 45°C. 32. El método según la reivindicación ?5, comprendiendo además la etapa de remover el ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico por medio de cromatografía de intercambio de iones. 33. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el plasma se coloca en una bolsa de sangre que contiene ácido carboxílico o la sal de ácido carboxílico. 34. El método segú la reivindicación 33, caracterizado porque la bolsa de sangre es diferente de uña bolsa o contenedor utilizado para colectar la sangre completa.