KR20040015053A

KR20040015053A - 혈장, 동결침전물 또는/및 혈소판을 포함하는 혈액생성물의 살균 또는 제조 향상용 시트르산을 포함하는카복실산

Info

Publication number: KR20040015053A
Application number: KR10-2003-7010378A
Authority: KR
Inventors: 샨브롬에드워드
Original assignee: 샨브롬 테크놀로지즈, 엘엘씨
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2004-02-18

Abstract

하나 또는 다른 수집 또는 가공 백 속의 추가의 시트레이트를 함유하는 개별 성분들을 분리함으로써 채혈, 가공 및 운반은 동결침전물의 향상된 수율을 제공한다. 혈구 및 혈장 단백질을 포함하는 혈액 성분의 활성화 또는 변성을 억제하고 활성화된 성분 및 변성된 성분을 제거함으로써 피브린 아교를 포함하는 최종 생성물의 안전성 및 효능을 향상시킨다.

Description

혈장, 동결침전물 또는/및 혈소판을 포함하는 혈액 생성물의 살균 또는 제조 향상용 시트르산을 포함하는 카복실산{Carboxylic acid such as citric acid for desinfecting or enhancing the production of blood products such as plasma, cryoprecipitate or/and platelet}

관련된 특허원

본원은 2000년 10월 23일자로 출원된 미국 특허원 제09/694,178호, 및 2001년 2월 7일자로 출원된 미국 특허원 제09/778,681호 및 2001년 3월 23일자로 출원된 미국 특허원 제60/278,496호의 일부 계속 출원이며, 후자의 2개의 특허원을 우선권으로 주장한다. 이들 3개의 특허원은 본 명세서 내에서 참조문헌으로 인용된다.

발명의 배경

본 발명은 혈장으로부터 증가된 양의 안전한 응고 인자 농축물을 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈액 성분의 수율 및 순도를 증진시키고 특정 혈액 성분, 혈구 및 혈장 단백질의 활성화 또는 변성을 억제하는 방법에 관한 것이며, 활성화되고 변성된 성분을 제거하여 최종 생성물의 안전성 및 효율성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

선행 기술의 설명

사람의 혈액으로부터 "응고(clotting 또는 coagulation)" 인자의 투여에 대한 다수의 의약적 조치가 존재한다. 이들 인자는 상처로부터 출혈을 멎게 하기 위해 혈액의 응고를 야기하는 단백질이다. 혈액 응고에 반응하는 단백질에 영향을 주는 다수의 유전학적 이상 중의 하나를 갖는 개체는 질병(혈우병)으로 고생하며, 혈액이 정상적으로 응고되지 않아 개체는 조절되지 않은 출혈 위험을 당한다. 수년간, 이러한 상태는 분실 또는 결손 단백질의 농축물을 투여하여 처리하였다. 많은 응고 인자는 간 질환이 있는 사람이 이들 응고 인자의 증대를 필요로 하므로 간 내에서 합성된다. 추가로, "피브린 실란트(fibrin sealant)" 또는 "피브린 아교(fibrin glue)"를 생성시키기 위한 피브린의 사용을 포함하는 응고 관련 인자에 대한 기타 중요한 의약적 용도가 존재한다.

일부의 응고 인자는 현재 생물 공학을 통해 제조되나, 현재, 충분한 양으로 이들 단백질의 모두 또는 이들 단백질을 인위적으로 제조할 수 있는 비용면에서 효과적인 방법은 지금까지 존재하지 않는다. 또한, 재조합 및 관련된 기술에 의해 제조된 "인위적으로 제조된" 인자는 보다 값비싸다. 대부분의 "소형" 인자는 생물 공학 공급원으로부터 입수할 수 없고 헌혈된 사람 혈액으로부터 정제해야만 한다. 이는 특히 생물 공학 생성물을 일반적으로 입수할 없는 제3 국가에서 특히 그러하다. 따라서, 대부분의 항-혈우병 인자(AHF, 또한 인자 VIII으로서 공지) 및 기타 혈액 응고 인자의 공급물은 혼주 사람 혈장으로 제조한다. 혈우병 환자는 평생 동안의 치료를 필요로 한다. 간 질환이 있는 사람 및 기타 응고 인자의 사용자는 연장된 치료를 또한 필요로 할 수 있다. 따라서, 이들 환자는 다수의 헌혈자의 혈액으로부터 제조된 혈액 생성물에 노출된다.

혈액 공급물에서 AIDS(후천성 면역 결핍증) 바이러스 또는 HIV의 존재는 혈우병 환자 및 기타 응고 인자의 사용자가 이러한 무서운 질환에 감염될 수 있음을 의미한다. AIDS 감염 혈액을 스크리닝하기 위한 시험이 개선되었지만, 몇몇 감염된 혈액이 실수로 들어갈 수 있다. AIDS 문제가 해결되는 경우라도, 기타 혈액 기원 질환의 위험, 예를 들면, 각종 형태의 간염 및 아직 공지되지 않은 기타 전염성 제제는 응고 인자를 제조하기 위해 사용된 혈장으로부터 바이러스 및 기타 질환 유기체를 제거하는 것이 바람직하다. 이러한 목표를 달성하기 위한 한 방법은 혼주 생성물을 사용하는 경우 "하나의 나쁜 것이 전체 통을 상하게 하므로" 혼주 혈장 생성물을 단일 헌혈자로부터의 생성물로 대체시키는 것이다. 그러나, 단일 헌혈자로부터 유도된 응고 인자의 사용에서도, 여전히 위험이 존재한다. 시험이 헌혈자가 공지된 질환이 부재한다는 것을 나타낼지라도, 헌혈자는 시험 이후에 나타나는 잠복 질환을 갖거나 헌혈자는 아직 공지되지 않은 질환 또는 공지된 질환의 아직 공지되지 않은 균주를 가질 수 있다. 이들 위험은 질환 유기체를 불활성화시키는 혈장 전-처리의 사용으로 줄일 수 있다. 불행하게도, 통상 사용되는 최상의 처리는 모든 형태의 질환 유기체를 불활성화시키지 못하거나 질환 유기체의 불활성 공정 동안 불안정한 응고 인자를 손상시킨다.

혈액으로부터 응고 인자 농축물을 제조하는 기본적인 방법은 지난 수 십년동안에 걸쳐 크게 변하지 않았다. 일반적으로, 응고 인자의 농축물은 혼주 혈장으로부터 동결침전 단계에 의해 유도된다. 각종 첨가제, 예를 들면, 에탄올 또는 폴리에틸렌 글리콜이 일반적으로 첨가되어 동결침전 단계의 효율을 증가시킨다. 동결침전 후에, 부분 정제된 인자를 추가의 침전 단계 또는 크로마토그래피 방법 및 가장 최근에는 모노클로날 항체를 사용한 방법에 의해 추가로 정제할 수 있다. 응고 인자 정제의 기본적인 기술 및 이들 방법의 개발 역사에 대한 추가의 정보는 본 발명자들에 의한 미국 특허 제3,560,475호, 제3,631,018호, 제3,682,881호, 제4,069,216호, 제4,305,871호 및 제5,770,704호를 참조하며, 이들의 내용은 본 명세서 내에서 참조문헌으로 인용된다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 동결침전물의 수율 및 순도를 향상시키는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 혈장 내의 질환 유기체를 불활성화시키고/시키거나 질환 유기체의 불활성화를 증진시키고 동시에 동결침전물 제조를 향상시키고, 동결침전물을 추가로 정제하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 혈구 및 혈장 단백질을 포함하는 혈액 성분의 활성화 또는 변성을 억제하고/하거나 이들 활성화되거나 변성된 성분을 제거하여 최종 생성물의 안전성 및 효능을 개선시키는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 혈액 분별화의 개선된 방법을 제공하는 것이다.

간단한 카복실산의 유도체, 특히 삼나트륨 시트레이트 및 기타 시트르산 염(이후, "시트레이트")은 혈액 응고 인자의 제조를 향상시키는 예기치 않게 효과적인 제제인 것으로 밝혀졌다. 다른 소형 카복실산, 특히 이소시트르산은 유사한 특성을 나타낼 수 있다. 그러나, 현재의 대부분의 시험은 시트르산 및 이의 염을 사용하여 이루어졌다. 특히 2 내지 10중량%의 농도로 혈장에 시트레이트를 첨가하면 불안정 단백질을 적절하게 변성시키지 못한다. 그러나, 이러한 농도 범위에서 시트레이트는 각종 병원성 미생물을 불활성화 또는 억제시키는데 효과적이다. 추가로, 첨가된 시트레이트는 열 처리에 의해 미생물의 소멸을 증가 또는 증진시킨다. 즉, 단백질을 변성시키지 않는 비교적 저온(즉, 45℃ 이상)으로 물질을 가열하면 시트레이트의 존재하에 미생물의 소멸을 증진시킨다. 가장 유의적으로, 첨가된 시트레이트는 통상의 방법으로 혈장으로부터 제조할 수 있는 동결침전물의 중량을 매우 증가시킨다. 대다수의 유의한 응고 인자는 생성된 동결침전물에서 크게 농축된다. 상청액은 이들 응고 인자를 조금 함유한다. 최종 농도가 2중량% 이상이도록 블러드 백(blood bag)에서 시트레이트 양의 증가는 개선된 혈소판 농축물 및 풍부한 동결침전물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 혈장을 생성시킨다. 첨가된 시트레이트는 오염 미생물 제거 또는 억제를 도울 수 있으며 그 자체가 이온 교환 또는 당해 분야에 널리 공지된 유사한 방법에 의해 나중에 제거될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 동결침전물의 수율 및 순도를 향상시키기 위한 시트레이트의 용도이다. 또한, 첨가된 시트레이트는 혈구 및 혈장 단백질을 포함하는혈액 성분의 활성화 또는 변성을 억제하고/하거나 활성화되거나 변성된 성분의 제거를 촉진시키고 최종 생성물의 안전성 및 효능을 개선시킨다.

본 발명에 따라, 혈장에서의 수혈 관련 질환 및 부작용을 감소시키고 혈구 및 혈장을 포함하는 혈액의 다중 유도체 성분의 순도 및 안전성을 증진시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 카복실산 염 약 2중량% 이상 또는 상당하는 중량의 카복실산을 혈액 또는 혈장에 가하는 단계가 존재한다.

더우기, 본 발명은 혈구 및 혈장 단백질을 포함하는 기타 유도체 혈액 성분의 제조를 증진시키는 것에 관한 것이다.

본 발명은 혈장에서의 수혈 관련 질환 및 부작용을 감소시키고 혈장으로부터 혈구 및 혈장을 포함하는 혈액의 다중 유도체 성분의 순도 및 안전성을 증진시키는 것을 포함한다. 유도체는 혈장으로부터 풍부한 동결침전물, 저온 제거 혈장, 피브리노겐, 피브린 아교 또는 실란트, vWF[폰 빌데브란트(von Willdebrand's) 인자], 피브리넥틴, 인자 VIII, 프로트롬빈 복합체, 세르핀, 알부민 및 글로불린으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 생성물을 포함한다. 시트르산의 염 2중량% 이상(또는 상응하는 중량의 시트르산)을 혈장에 가한다. 혈장을 카복실산 또는 카복실산 염을 함유하는 블러드 백에서 수집할 수 잇다. 이러한 블러드 백은 전혈을 수집하기 위해 사용되는 가방 또는 용기와 상이할 수 있다. 또는, 추가의 카복실산 또는 이의 염의 양을 전혈을 수집하기 위해 사용되는 가방에 직접 가할 수 있다.

본 발명의 추가의 바람직한 형태에서, 시트레이트는 적절하게는 혈액 수집,별개의 혈액 성분의 분리에서 혈액의 가공 및 이송에 사용된다. 시트레이트는 증가량으로, 즉 하나 또는 기타 수집 또는 가공 백에 항응고를 위해 전통적으로 사용되는 수준 이상의 추가의 양으로 사용된다.

도 1은 본 발명으로부터 수득한 동결침전물의 개선을 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명을 사용한 혈액 및 혈장 분별화 도식을 나타낸다.

다음 설명은 당해 기술분야의 숙련가가 본 발명을 제조하고 사용할 수 있고 발명자에 의해 예상된 본 발명을 수행하는 최상의 양태를 설명하기 위하여 제공된 것이다. 그러나, 본 발명의 일반적인 원리가 본원에서 구체적으로는 혈중 질환 유기체를 불활성화시키면서 혈장 단백질의 제조를 향상시키는 것으로 정의되었으므로, 당해 기술분야의 숙련가에게는 다양한 개질이 명백하게 잔존할 것이다.

충분히 농축되는 경우 응고의 원인이 되는 다수의 혈장 단백질이 저온에서 용액으로부터 응고(즉, 동결침전물 형성)하기 때문에, 응고 인자를 제조하는 전통적인 방법 뿐만 아니라 현재 사용되는 다수의 방법이 사용된다. 단백질 용액이 냉동되는 경우, 결정으로부터 제외된 빙정 형태 및 단백질 분자가 더욱 농축된다. 물을 냉각 또는 냉동시키면 물의 화학 활성이 저하된다. 특정한 단백질에 따라, 단백질이 물 자체 또는 물 이외의 다른 단백질과 보다 신속하게 상호작용하는 경우, 단백질은 사실상 용액에서 떨어져, 즉 단백질을 형성할 수 있다. 물의 화학 활성이 저하되는 경우 이러한 침전이 선호된다. 당해 방법은 단백질을 변성시킬 수 있어(단백질을 비가역적으로 불용성이 되도록 할 수 있어), 단백질 용액을 빙정의 형성을 최소화시키는 저온(즉 -20℃ 이하)으로 냉동시키고 형성된 결정의 성장을 방지하는 것이 통상적이다. 이는 빙정 표면에서 단백질 변성을 제한하도록 이루어진다. 그러나, 냉동이 매우 조심스럽게 수행되는 경우에도, 빙정은 프로트롬빈 복합체의 "활성화"를 유발하여 혈장이 해빙된 후에 자발적으로 응고가 형성될 수 있다.

혈장 동결침전물을 제조하는 통상적인 공정의 제1 단계는 전체 혈액을 원심분리하여 적혈구로부터 혈장을 분리하는 것이다. 당해 공정은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있으며 개별적인 블러드 백을 유지하여 혈장/적혈구 분리가 블러드 백을 개방하지 않고도 발생하도록 하는 특수한 원심분리기에서 종종 달성된다. 원심분리 후, 상청액 혈장을 추가의 가공을 위하여 "위성" 블러드 백으로 전달하는 것이 통상적으로 실시된다. 일단 혈장이 적혈구 및 백혈구로부터 분리되면, 통상적인 공정은 혈장을 신속하게 냉동시킨 다음, 냉동된 혈장을 약 4℃에서 서서히 해빙시키고, 그 동안 응고 인자 및 기타의 단백질을 해빙시켜 여과 또는 원심분리에 의해 신속하게 회수할 수 있는 동결침전물을 형성하는 것이다. 이러한 동결침전물은 비가역적으로 불용성이 되지 않고 당해 기술분야에 익히 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도의 완충액 또는 물에서도 용이하게 재용해될 수 있다.

동결침전물은 일반적으로, 단백질 분자의 인접한 부근에서 물이 제거되어 단백질 분자가 물과 결합하기 보다는 서로 우선적으로 결합하게 되는 경우 발생하는 것으로 여겨진다. 이러한 물의 "제거"는 온도 변화로 인한 단백질의 용해도 변화를 나타낼 수 있다(즉 물이 단백질을 용해시키는 데 덜 유효하게 된다). 당해 공정은 또한 물을 "묶고" 이를 단백질과 낮은 정도로 상호작용시키도록 하는 첨가제를 사용하여 달성되거나 강화시킬 수도 있다. 이러한 첨가제 물질은 에탄올, 폴리에틸렌, 글리콜, 헤파린, 플루로닉 RTM 폴리올 중합체 및 다양한 "염"(예: 황산암모늄 또는 아세트산암모늄) 등의 어떠한 다수의 친수성 물질이 될 수 있다. 용액으로부터의 단백질의 "염석"은 고전적인 생화학 공정이다. 동결침전물의 수율을 증가시키는 데 사용되는 이들 물질 및 기타 물질은 일반적으로 혼합물 중의 물의 유효 활성을 감소시키도록 작동한다. 즉, 물 분자는 단백질 대신 첨가된 친수성 물질과 우선적으로 상호작용한다. 이는 단백질이 서로 상호작용하도록 하여, 용액으로부터 침전된다. 유사하게, 온도를 강하시키면 또한 물의 활성이 감소되어 단백질-단백질 인력이 우세하게 된다.

바로 위에 언급한 친수성 첨가제는 비교적 저렴하고 사용하기에 용이하다는 이점이 있다. 그러나, 이를 사용하면 통상적으로 첨가제가 최종 생성물로 운반되지 않도록 보장하기 위한 추가의 세척 단계가 필요하다. 일부 첨가제는 정제하고자 하는 불안정한 응고 인자를 손상시키거나 변성시킬 수도 있다. 본 발명자들은 혈액 분별에서 항응고제로서 종종 사용되는 제제 중의 하나가 예상외로 동결침전물 형성을 강화시키는 작용을 함을 발견하였다. 시트레이트(삼나트륨 시트레이트 또는 유사한 염 뿐만 아니라 이소시트르산 등의 기타 저분자량 카복실산의 유도체)는통상적으로 항응고제로서 전통적으로 사용되는 것보다 현저히 높은 수준으로 혈액 분별 공정에서 사용되는 경우 바람직한 특성을 갖는다. 시트레이트는 칼슘 이온의 매우 유효한 킬레이터이다. 칼슘 이온 수준을 유효하게 강하시킴으로써 시트레이트는 칼슘 이온의 존재에 좌우되는 매우 다양한 혈액 응고 경로를 억제한다. 그러나, 시트레이트는 혈장 및 기타 혈액 분획으로부터 동결침전물 단백질의 침전을 강화시키는 제제로서 사용되지 않았다.

다음 표는 혈장 중의 삼나트륨 시트레이트의 농도를 증가시킴으로 인하여 동결침전물의 생성이 강화되었음을 나타낸다. 시트레이트가 증가됨에 따라, 회수된 동결침전물의 중량이 증가한다. 동결침전물이 고정량의 완충액 또는 물에 재용해되는 경우, 동결침전물의 양이 증가하면 원래의 혈장과 비교하여 증가량의 인자 VIII 및 피브리노겐이 수득된다. 이러한 수율 증가의 정확한 이유는 밝혀지지 않았다. 그러나, 시트레이트의 한가지 작용이 응고 인자의 활성을 억제하는 것일 수 있다고 추정하는 것이 타당해 보인다. 다수의 이들 인자는 활성화되는 경우 프로테아제로서 작용하므로, 활성화는 당연히 응고 단백질을 소화시켜 단백질의 수율을 감소시킨다. 그러나, 불활성화는 동결침전물 수율의 전체 증가를 충분히 설명하는 것으로 보이지 않는다.

처리	동결침전물	인자 VIII	피브리노겐
대조군	0.1g	120%	46mg/㎗
2% 시트레이트	0.3g	180%	53mg/㎗
5% 시트레이트	0.9g	247%	105mg/㎗
10% 시트레이트	3.0g	622%	152mg/㎗

이 데이터는 도 1에 그래프로 나타낸다. 이러한 결과는 시트레이트 농도가증가함에 따라 회수된 응고 인자량이 선형으로 증가함을 나타낸다. 그러나, 시트레이트의 최고 농도에서는 기타 단백질의 침전물이 증가될 것이다. 시트레이트 농도를 상이한 단백질의 침전이 우세하도록 조정할 수 있다. 시험은 인자 VIII 및 피브리노겐 95% 초과 외에도, 실질적으로 모든 피브로넥틴 및 폰 빌데브란트 인자가 시트레이트 강화된 동결침전물에 농축됨을 나타낸다. 금속단백질 또는 기타의 인자가 시트레이트 동결침전물에 농축되는지를 측정하기 위하여 추가의 실험을 수행한다. 초기의 결과는 어떠한 기타의 단백질도 이미 언급한 것과 같이 강하게 농축된 것으로 나타나지 않는다. 그러나, 세룰로플라스민 및 전체 T3은 동결침전물에 다소 농축되어 있다고 일부 나타난다.

표면에서는, 어떠한 친수성 염보다도 시트레이트가 더 유효하다고 기대할 수 없었다. 용액으로부터의 염석 단백질과 관련하여, 이의 총괄 특성을 기본으로 하여 작용하는 다양한 제제가 예상될 것이다. 즉, 유사하게 거동하는 다양한 제제의 등몰 농도가 예상될 것이다. 이는 시트레이트와 동결침전물 형성의 경우에는 나타나지 않는다.

염(NaCl) 또는 시트레이트(삼나트륨 시트레이트)의 다음 양을 갓 채취한 사람 혈장 40㎖ 분액에 가한다. 샘플을 혼합한 후 -70℃에서 밤새 냉동시킨 다음, 4℃에서 완전히 해빙시킨다. 이어서, 샘플을 4000rpm에서 20분 동안 원심분리시켜 동결침전물을 회수한다. 삼나트륨 시트레이트의 각각의 분자는 세 개의 나트륨 이온을 제공하는 반면, 염화나트륨의 각각의 분자는 단일 나트륨 이온만을 제공함을 기초로 하여 염화나트륨과 나트륨 시트레이트 사이의 유효한 나트륨 농도를 매칭시키는 시도를 한다. 보상하의 이러한 시도는 매칭이 백분율 기준보다는 몰 기준으로 이루어져야 하기 때문에 부정확하다. 그러나, 이러한 실패한 실험으로 동결침전물을 생성하는 데 염화나트륨보다 나트륨 시트레이트가 훨씬 우월하다는 점이 지적된다. 다음 표에서는 첫 번째는 중량%이고 그 다음은 몰농도로서 시트레이트(삼나트륨 시트레이트) 또는 염(염화나트륨)이 나타나 있다. 세 번째 컬럼은 용액의 유효한 삼투 효과를 나타내며, 이는 염화나트륨보다는 시트레이트에 대한 몰 기준의 경우 2배 높다. 이는 염화나트륨의 각각의 분자는 두 개의 입자(한 개의 나트륨 이온 및 한 개의 염화 이온)만을 방출하지만, 삼나트륨 시트레이트의 분자는 네 개의 입자(세 개의 나트룸 이온 및 한 개의 시트레이트 이온)를 방출하기 때문이다. 삼나트륨 시트레이트의 분자량은 동일한 삼투 효과를 수득하는 염의 분자량보다 거의 5배 크기 때문에, 염화나트륨의 약 2.5배(중량 기준)의 삼나트륨 시트레이트를 사용하여야 한다. 즉, 정확한 매칭을 위해서는 더 많은 염보다는 더 많은 시트레이트를 사용하여야 한다.

중량%	몰농도	삼투압 효과	동결침전물
대조군	--	--	0.18g
2% 시트레이트	0.07	0.28	0.52g
5% 시트레이트	0.17	0.68	1.3g
10% 시트레이트	0.34	1.36	3.6g
6% 염화나트륨	1.02	2.04	0.12g
15% 염화나트륨	2.56	5.13	0.14g
30% 염화나트륨	5.13	10.26	0.15g

이 결과는 동결침전물 생성에 대한 시트레이트의 효과가 시트레이트의 총괄 특성 또는 삼투 특성에 강하게 연관되지 않음을 나타낸다. 염화나트륨은 동결침전물 형성을 강화시키는 것으로 보이지 않는다. 최대 시트레이트 농도 수준을 한참초과하는 삼투 수준에서만이 동결침전물 형성이 대조 혈장에 근접하기 시작한다. 추가로, 수득한 동결침전물은 순수한 것으로 나타나지 않는다(즉, 기타 비응고 단백질의 더 큰 양이 포함되어 있다).

실험 후, 상청액 및 원래의 혈장(대조군)은 임상 화학 실험실로 보내어져 응고 인자를 포함한 다양한 혈액 단백질의 존재를 측정한다. 이 결과를 다음 표에 나타낸다.

중량%	피브리노겐(mg/㎗)	인자 VIII(%)	알부민(g/㎗)
대조군	287	24	3.2
2% 시트레이트	216	6	3.1
5% 시트레이트	114	< 3	3.2g
10% 시트레이트	< 40	< 3	3.2g
5% NaCl	298	30	3.1g
15% NaCl	229	24	3.0g
30% NaCl	97	9	2.9g

시트레이트의 양이 증가함에 따라 상청액 중의 피브리노겐 및 인자 VIII의 수준은 매우 감소한다. 동시에, 알부민(주요 혈장 단백질)의 수준은 실질적으로 영향받지 않는다. 즉, 대부분의 응고 인자가 침전되어 동결침전물 중에서 발견되지만, 알부민은 거의 또는 전혀 침전되지 않는다. 염화나트륨의 경우, 등몰 농도가 응고 인자를 침전시키는 데 훨씬 덜 유효하다. 응고 인자의 현저한 침전을 확인하기 위해서는 염화나트륨을 30%까지 증가시켜야 한다. 그러나, 이 수준에서는 알부민 또한 침전하기 시작한다. 시트레이트는 응고 인자를 선택적으로 침전시키는데 훨씬 더 유효하다.

시트레이트 효과는 통상적인 동결침전물 실험에서 시트레이트의 분포를 분석함으로써 추가로 통찰한다. 이러한 실험을 위하여 혈장 1단위(약 200㎖)를 삼나트륨 시트레이트 10%wt/vol이 되도록 한다. 모든 실험에서 pH 측정은 혈장의 고유의 완충이 현저한 pH 변화를 방지함을 나타내었다. 이러한 시트레이트화 혈장을 냉동시키고 동결침전물을 통상적인 방법으로 회수하였다. 별도로, 시트레이트 동결침전물을 제조하는 데 있어서, 냉동 전에 시트레이트를 가하는 것이 바람직하지만, 우수한 결과가 해빙 공정 동안 시트레이트를 가하여 달성된다.

혈장 단위로부터 형성된 동결침전물의 용적은 약 20㎖, 즉 총 용적의 10%였다. 놀랍게도, 동결침전물 및 상청액 혈장을 분석하면 시트레이트 약 12g(60%)이 동결침전물 중에서 농축되었고, 상청액에는 30%만이 남아있음이 나타났다. 이는 동결침전물 단백질과 시트레이트 사이에 강한 상호작용이 있음을 나타낸다. 추가로, 통상의 동결침전물은 실온수 또는 완충제에 재용해될 수 있으나, 시트레이트 동결침전물은 실온수에 거의 불용성이다. 그러나, 이는 실온의 염수 완충제에 가용성이며, 완충제가 시트레이트를 함유하는 경우 가장 가용성이다. 이러한 현상을 설명하기 위한 한 가지 방법은 시트레이트 분자상의 음의 다전하가 동결침전물 단백질 상의 양의 전하와 상호작용하여 이들을 가교결합시키고 있다고 가정하는 것이다. 첨가된 시트레이트는 가교결합이 제거되도록 이들 양의 전하를 "충족시킨다". 단백질을 동결침전물로 응고시킨 농축물로 인해, 응고 단백질이 시트레이트 분자와 상호작용하는 일종의 양전하 모티프(motif)를 공유하는 것을 이론화할 것이 기대된다.

요약하면, "통상의" 동결침전물과 비교하여 시트레이트 동결침전물은 필수적으로 혈장의 처리된 분취량에서 발견된 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 VIII 및 폰빌데브란트 인자를 모두 함유한다. 시트레이트 동결침전물은 또한 당해 실험에서 아직 분석되지 않은 (인자 XIII과 같은) 보다 작은 기타 인자들을 함유할 수도 있다. 유의적일 수 있는 것은 시트레이트 동결침전물이 함유하지 않는 것이다. 유의적으로 "통상의" 동결침전물보다 알부민, 글로블린 및 기타 보다 작은 단백질이 적은 것이다. 실험은 이들 차이점을 특성화하고 있다.

시트레이트가 응고 인자의 침전에 강하게 영향을 미치는 것 같지만, 이들 단백질을 변성시키는 것 같진 않다. 2중량%의 시트레이트를 6일 동안 실온에서 보관한 혈장의 분취량에 가한다. 응고 인자 및 혈소판을 시간 주기의 처음과 끝에서 계수한다. 대조군 혈장과 비교하면, 시트레이트의 첨가는 응고 인자에 해로운 것 같지는 않다. 시트레이트가 혈소판을 보호하는 것을 사실상 도울 수 있는 일종의 제안이 있다. 이는 시트레이트가 일종의 프로테아제를 억제하는 가설과 일관된다.

2% 시트레이트 혈장

측정	1일	6일
피브리노겐(mg/dl)	243	239
인자 II(%)	104	91
인자 V	49	22
인자 VII(%)	81	72
인자 VIII(%)	103	92
인자 IX(%)	106	95
인자 X(%)	92	97
혈소판(10³/10^-6L)	311	239
PT(초)	14.1	16.2
PTT(초)	31.4	47.9

대조군 혈장

측정	1일	6일
피브리노겐(mg/dl)	241	239
인자 II(%)	103	93
인자 V	58	25
인자 VII(%)	86	69
인자 VIII(%)	100	89
인자 IX(%)	106	92
인자 X(%)	93	85
혈소판(10³/10^-6L)	317	192
PT(초)	13.7	19.5
PTT(초)	32.5	50.2

현저하게, 세균학 실험은 2%의 삼나트륨 시트레이트가 대장균의 성장을 억제하고 스타필로코커스 에피더미디스의 성장을 완전히 억제함을 나타낸다. 혈소판 농축물 중의 박테리아(주로 불충분한 표면 살균으로 인한 피부 박테리아)의 성장이 혈소판 풍부 용액의 사용가능한 수명을 현저히 감소시킨다. 시트레이트의 첨가는 박테리아 성장을 억제함으로써 잠재적으로 이러한 농축물의 수명을 연장시킨다. 위에서 입증된 바와 같이, 시트레이트의 첨가는 혈장 성분을 손상시키지 않고, 동결침전물의 생성을 사실상 현저하게 향상시킨다. 따라서, 블러드 백의 시트레이트의 수준을 현재 항응고에 사용되는 0.4%에서 2중량% 이상의 삼나트륨 시트레이트로 현저하게 증가시킬 것이 제안된다. 이 수준은 다수의 오염 미생물을 억제하거나 죽이고, 혈장을 동결침전물의 생성에 보다 적합하도록 할 것이다. 2% 이상의 수준이 필요한 동결침전물 생성 직전에 삼나트륨 시트레이트를 첨가하는 것이 또한 간단한 일일 수도 있다.

첨가된 시트레이트는 열을 포함하는 각종 "살균제"에 대하여 미생물의 민감도를 향상시키는 것으로 보인다. 하나의 실험에 있어서, 2%의 나트륨 시트레이트를 통상의 박테리아 성장 액체배지에 가한다. 25ml의 액체배지 분취량에 대장균 또는 스타필로코커스 에피더미디스의 1 ×10⁴의 유기체를 스파이킹(spiking)한다. 액체배지의 샘플을 2중량%의 삼나트륨 시트레이트에 가져오고 나서, 샘플을 성장 배지에 평판 배양한지 5분 또는 10분 후 65℃에서 "저온살균"시킨다. 10분간의 시트레이트 처리가 박테리아의 총 파괴를 중지시킨다. 10분에 대조군 박테리아가 본질적으로 영향을 받지 않는다. 그러나, 5분간의 시트레이트 처리가 E. coli 박테리아를 모두 죽이는 것은 아니다(약 3-log 소멸). 스타필로코커스 에피더미디스는 보다 민감성이며, 시트레이트의 존재하에 완전히 소멸한다. 시트레이트의 첨가는 미생물을 죽이는 열 능력을 명백히 향상시킨다. 추가로, 첨가된 시트레이트가 열 변성에 대하여 불안정한 단백질을 안정화시키는 듯하다. 이들 결과는 증가된 시트레이트의 첨가가 혈장의 효과적인 열처리를 가능케 함을 나타낸다.

혈소판 농축물과 혈장의 문제점은 본래 매우 낮은 수로 존재하는 박테리아의 시간의 경과에 따른 증가이다. 일종의 오염 박테리아는 혈액이 정맥천자에 의해 수득되는 경우 피부 표면으로부터 명백히 나타난다. 추가로, 혈액이 완전히 무균성이 아니라는 증거가 발생한다. 즉, 통상적으로 사람의 혈류 내를 순환하는 소수의 박테리아가 존재한다. 통상의 면역은 이들 박테리아의 과잉 성장을 방지한다. 당해 상태를 모의실험하기 위해, 10ml의 사람 혈장 샘플을 매우 낮은 수준(1ml당 10개의 미생물)으로 이하의 표에 열거한 박테리아와 접종시킨다. 정상 혈장(N)이나 2중량%의 시트레이트를 함유한 혈장(C)을 사용한다. 샘플을 7일 동안 각 시점에서 성장 우무에 플레이팅된 샘플과 함께 실온에서 배양시킨다. 3개의 상이한 사람 혈장을 사용하나, 모두 동일한 결과를 생성하였다. 표에서, "ng"는 "성장하지 않음"이고, "+"는 일종의 박테리아 성장을 나타내고, "++"은 보다 광대한 성장을 나타낸다.

a) 대장균

b) 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)

c) 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)

d) 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)

e) 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)

f) 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)

g) 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)

접종물

1일

2일

3일

4일

5일

6일

7일

N

C

N

C

N

C

N

C

N

C

N

C

N

C

a)

ng

+

ng

++

ng

b)

ng

+

ng

++

ng

d)

ng

+

ng

++

ng

e)

ng

+

ng

+

ng

f)

ng

+

ng

+

ng

g)

ng

6일 및 7일에, 정상 혈장은 세라티아 외의 접종된 박테리아 종 전체의 성장을 나타낸다. 한편, 시트레이트를 함유하는 어떠한 혈장 샘플도 박테리아 성장을 입증하지 못한다. 이는 2중량%의 시트레이트가 폭넓은 박테리아의 성장을 강하게 억제할 수 있음을 나타낸다. 당해 결과를 유리한 혈소판 결과물과 합하면 혈소판농축물에의 2% 이상의 시트레이트의 첨가가 혈소판을 손상시키지 않고 박테리아 성장에 대하여 농축물을 보존할 수 있음을 입증한다. 혈소판 내의 과량의 시트레이트에 대한 우려가 존재하는 경우, 이는 음이온 교환 수지 또는 유사한 물질로 처리하여 용이하게 제거할 수 있다.

당해 유기체의 늦은 성장 속도로 인하여 세라티아를 관찰하지 못한 것으로 짐작되었다. 따라서, 세라티아 마르세슨즈와 스타필로코커스 에피더미디스를 사용하여 실험을 반복하여 1ml당 100개의 유기체의 수준으로 혈장 샘플을 접종시킨다. 이 경우, 세라티아의 1일 시점은 92콜로니를 나타내고, 스타필로코커스는 정상 혈장에 대하여 101콜로니를 나타낸다. 따라서, 시트레이트 함유 혈장에 대한 어떤 경우에도 성장이 관찰되지 않았다.

시트레이트와 유사한 분자들을 작용시키는 정밀한 기작이 공지되어 있지 않다. 다수의 카복실 그룹은 동결침전물의 경우에 특히 중요한 듯하다. 옥살산 및 락트산은 덜 효과적이다. 일종의 전하 상호작용이 응고 인자의 침전을 지지하는 것이 가능해 보일 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 시트레이트가 우선적으로 동결침전물 단백질에 가교결합하는 가설을 지지하는 우수한 데이터인 듯하다. 킬레이팅 능력은 시트레이트의 익히 공지되어 있는 항응고 효과에 대하여 명백히 중요하나, 킬레이트화는 이소시트레이트가 시트레이트보다 열등한 킬레이팅제인 것으로 여겨지므로 본 발명에 대하여 중심적이지 않을 수 있다. 또한, 트리카복실산 사이클 내의 효과적인 다수의 분자의 침전이 또한 이의 효과-특히 박테리아 성장과 관련되어 있을 수도 있다. 즉, 동결침전 현상과 박테리아 성장 현상이 개개의 설명을 가질 것으로 보인다.

본 발명은 주로 동결침전에 관하여 기술하였다. 기타 성질 및, 본 발명의 제제를 형성하는 혈액 성분과 생성물이 있다. 이들은 분별화 도식, 및 시스템으로부터 수득되고 시트레이트 기술이 적용되는 상이한 혈액 성분 및 혈장 단백질을 나타내는 첨부된 도 2에서 설명된다. 출발점에서 혈액-본원에서 CPDA(시트레이트-포스페이트-덱스트로즈-아데닌) 처리된 블러드 백가 수거된다. 추가의 시트레이트가 당해 제1 주머니에 첨가되거나, 예를 들면 약 2중량(또는 체적)% 내지 약 10중량(또는 체적)% 초과의 삼나트륨 시트레이트의 유효 농도로 시트레이트를 함유하는 주머니와 함께 비어 있는 제2 주머니의 단계에서 첨가할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 시트레이트는 동결/해동 단계에서 가할 수 있다. 시트레이트의 추가의 첨가로 인하여, 상이한 신규 생성물이 수득된다.

당해 시트레이트 관련 방법은 도 2와 관련된 이하의 특성을 갖는다:

1. 비어 있는 제2 주머니로부터 출발한 생성물과 공정은 정상적으로 분별화된 혈장의 순도와 안전성의 향상을 나타낸다. 풍부한 동결침전물(1)은 선행기술보다 수율이 높다. 풍부한 동결침전물(1)은 "정상" 동결침전물과 비교하여 "오염" 외래 혈청 단백질을 거의 갖지 않는다. 조 섬유소 아교(4)가 트롬빈 또는 프로트롬빈 복합체(인자 II, VII, IX 및 X)의 첨가에 의해 풍부한 동결침전물로부터 직접 생성되면, 생성된 아교는 "정상 동결침전물"로부터 동일 방식으로 생성된 조 섬유소 아교보다 강도가 우수하다. 생성물은 시트레이트가 박테리아 성장을 억제하고, 시트레이트가 추가의 파괴 병원균에 "저온살균" 단계를 용이하게 할 수 있으므로보다 안전하다. 또한, 풍부한 동결침전물의 보다 높은 수율과 조 섬유소 아교의 보다 높은 강도로 인하여 자가 이식한 섬유소 아교가 더욱 적합해진다. 자가이식 생성물은 본래 보다 안전하다. 또한, 풍부한 동결침전물을 함유하는 피브리노겐의 더욱 높은 수율로 인해, 인자 VIII 및 기타 성분이 포함될 수 있을지라도 주로 순수한 피브리노겐과 트롬빈(적용중에 첨가됨)인 실란트 또는 "정제된" 피브린 아교를 생성하기 용이해진다.

저온 제거된 혈장(3)은 위에서 언급한 이유로 보다 안전하다. 이는 또한 정상 처리된 혈장보다 적은 피브리노겐을 함유하므로 본래 더욱 안전하다. 이는 당해 물질이 프로트롬빈 복합체의 활성으로 인하여 미세덩어리(이러한 미세덩어리는 혈관내 응고 및 관련 수혈 문제를 야기할 수 있다)를 전개시키는 것이 사실상 불가능함을 의미한다. 또한, 증가된 시트레이트 수준은 프로트롬빈 복합체의 활성을 감소시킨다. 증가된 카복실산 및/또는 시트레이트 유도체를 함유하는 제2 주머니(또는 보다 높은 수준의 시트레이트의 기타 용도)는 본 발명에 앞서 혈액 분별화 공정의 일부나 임상용 혈액 성분의 생성의 일부가 결코 아닌 특성이다. 증가된 시트레이트( 또는 관련 카복실산)을 사용하는 중요한 이점이 있다.

2. 피브리노겐(3), 섬유소 아교(4), 폰 빌데브란트 인자(5), 피브로넥틴(6) 및 인자 VIII(7)이 표준 크로마토그래피법에 의해 생성될 수 있으나, 시차 추출(differential extraction)의 사용이 당해 공정을 단순화시킨다. 위에서 언급한 바와 같이, 풍부한 시트레이트 동결침전물(1)은 물에서 거의 불용성이다. 이는 정상 염수에서 가용성이며, 시트레이트가 첨가된 염수로서 매우 가용성이다. 따라서, 상이한 양의 시트레이트를 갖는 완충제를 함유한 추출은 상이한 생성물의 우선적인 용해도를 야기한다.

3. 생성물(8, 9 및 10)은 단일 헌혈자 또는 혼주 혈장으로부터(바람직하게는, 예를 들면 미국 특허 제6,045,787호에서 상세화된 바와 같이, 요오드 살균과 함께) 생성될 수 있다.

4. 동결침전 단계 전에 요오드 살균을 사용할 수 있다. 계류중인 특허원은 시트레이트가 요오드 처리를 향상시키는 것을 입증한다. 그러나, 참조 특허에서 사용된 칼럼은 시트레이트를 제거한다. 따라서, 요오드 살균 후, 동결/해빙 공정 전에 제2 혈액 비함유 백 단계에 추가의 시트레이트를 가한다.

알부민과 글로불린(생성물 10)을 추가로 분별화하여 분리된 알부민과 γ-글로불린을 수득한다. 일반적으로, 익히 공지된 분별화 기술을 사용한다. 음이온 교환(DEAE)을 사용하여 프로트롬빈 복합체를 정제한다. DEAE/세파덱스를 단일 공여 방법으로 사용하여 프로트롬빈을 정제하면서 탈수시킨다. 세르핀 9를 표준 방법으로 정제한다. 프로테아제가 첨가된 시트레이트의 특성을 억제하기 때문에 수율은 향상된다. 또한, 이들 생성물은 시트레이트로 인해, 요오드 단계로 인해, 단일 공여 생성물이 쉽게 제조되기 때문에 그리고 저온살균이 용이하기 때문에 보다 안전하다.

본 발명은 방법 및 당해 방법으로 수득된 생성물에 관한 것이다. 따라서, 다음 청구의 범위는 위에서 구체적으로 예시한 것과 기재한 것, 분명히 대체될 수 있는 것 및 본 발명의 필수불가결한 사상을 포함하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예시된 양태는 단지 예로서 제시되었으며 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 따라서, 첨부된 청구의 범위 내에서 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 기재된 바와 달리 수행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

카복실산 또는 카복실산의 염 약 2중량% 이상을 혈액 또는 혈장에 가하는 단계를 포함하여, 혈장에서의 수혈 관련 질환 및 부작용을 감소시키고 혈구 및 혈장을 포함하는 혈액의 다중 유도체 성분들의 순도 및 안전성을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 카복실산이 시트르산인 방법.
제2항에 있어서, 시트르산의 삼나트륨 염이 혈장에 첨가되는 방법.
제1항에 있어서, 혈장이 혈소판 농축물인 방법.
제1항에 있어서, 혈장을 45℃ 이상으로 가열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 카복실산 또는 카복실산 염을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 혈장을 카복실산 또는 카복실산 염을 함유하는 블러드 백(blood bag) 속에 넣는 방법.
제7항에 있어서, 블러드 백이 전혈을 수집하는 데 사용되는 백 또는 용기와 상이한 방법.
시트르산 또는 시트르산의 염 약 2중량% 이상을 혈장에 가하는 단계를 포함하여, 혈장에서의 수혈 관련 질환 및 부작용을 감소시키고 혈구 및 혈장을 포함하는 혈액의 다중 유도체 성분들의 순도 및 안전성을 향상시키는 방법.
제9항에 있어서, 혈장이 시트르산 또는 시트르산 염을 함유하는 블러드 백 속에 수집되는 방법.
제9항에 있어서, 시트르산의 삼나트륨 염을 혈장에 가하는 방법.
제9항에 있어서, 혈장이 혈소판 농축물인 방법.
제9항에 있어서, 카복실산 또는 카복실산 염을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 혈장을 45℃ 이상으로 가열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
카복실산 또는 카복실산 염 약 2중량% 이상을 혈장에 가하는 단계,

혈장을 동결/해빙시켜 풍부한 동결침전물과 저온 제거 혈장을 생성시키는 단계 및

풍부한 동결침전물을 저온 제거 혈장으로부터 분리시키는 단계를 포함하여, 혈장을 분별화함으로써 혈장에서의 수혈 관련 질환 및 부작용을 감소시키고 혈액의 다중 유도체 성분들의 순도 및 안전성을 향상시키는 방법.
제15항의 방법에 따라서 생성된 풍부한 동결침전물.
제15항의 방법에 따라서 생성된 저온 제거 혈장.
제15항에 있어서, 카복실산 또는 카복실산 염을 동결/해빙 단계의 해빙 단계 동안에 첨가하는 방법.
제15항에 있어서, 풍부한 동결침전물을 분별화하여 피브리노겐, 폰 빌데브란트 인자(von Willdebrand's factor), 피브로넥틴 및 인자 VIII 중의 하나 이상을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 피브리노겐을 사용하여 피브린 아교(fibrin glue)를 생성시키는 방법.
제20항에 있어서, 피브린 아교가 프로트롬빈 복합체 및 트롬빈 중의 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제20항 또는 제21항의 방법에 따라서 생성된 피브린 아교.
제19항에 있어서, 분별화 단계가 시차 추출(differential extraction)을 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 풍부한 동결침전물을 사용하여 피브린 아교를 생성시키는 방법.
제24항에 있어서, 피브린 아교가 프로트롬빈 복합체 및 트롬빈 중의 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제24항 또는 제25항의 방법에 따라서 생성된 피브린 아교.
제15항에 있어서, 저온 제거 혈장을 분별화하여 프로트롬빈 복합체, 세르핀, 알부민 및 글로불린 중의 하나 이상을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 혈장이 요오드 살균 단계에 적용되는 방법.
제15항에 있어서, 카복실산이 시트르산인 방법.
제29항에 있어서, 시트르산의 삼나트륨 염이 혈장에 첨가되는 방법.
제15항에 있어서, 혈장을 45℃ 이상으로 가열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 카복실산 또는 카복실산 염을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 혈장을 카복실산 또는 카복실산 염을 함유하는 블러드 백 속에 넣는 방법.
제33항에 있어서, 블러드 백이 전혈을 수집하는 데 사용되는 백 또는 용기와 상이한 방법.