DK141583B

DK141583B - Fremgangsmåde og hjælpemiddel til binding af immunoglobulin IgG eller dets fri Fc-fragment til en matrice i forbindelse med rensning deraf eller i forbindelse med immunologiske bestemmelsesmetoder.

Info

Publication number: DK141583B
Application number: DK593173AA
Authority: DK
Inventors: John Axel Sjoequist
Original assignee: Pharmacia Ab
Priority date: 1972-11-06
Filing date: 1973-11-02
Publication date: 1980-04-28
Also published as: GB1441979A; IL43462A0; IL43462A; FR2205531A1; JPS49133518A; DK141583C; FR2205531B1; NL7315193A; US3995018B2; DE2322533C2; US3995018A; US3995018B1; JPS6129932B2; DE2322533A1

Description

(llpY

\fiay (11) FREMLÆ66ELSES$KRIFT 141583 DANMARK (51) lnt 0,3 C 07 θ 7/00 DMIN IV!/ΛΠ g ρ| Ν 33/68 // A 61 Κ 39/44 «(21) Ansøgning nr. 593,1/73 (22) indleverat den 2« ΠΟΥ. 1973 (23) Lebedeg 2. nov. 1973 (44) Ansegningen fremlagt og fremlæggetsesekriftetoffentHggJo*den 28. apr. 1 980

Dl REKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet bsgærat fra døn

6. nov. 1972, 14330/72, SE

8. feb. 1973» 7301779, SE

<71) PHARMACIA AKTIEBO LAG, Bjoerkgatan 30, Uppsala, SE.

(72) Opfinder: John Axel SJoequist, Haessjevaegen 12, Uppeala, SE.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Induetriel fileret v. Svend Schønning.

(54) Fremgangsmåde og hjælpemiddel til tinding af immuno globulin IgG eller dets fri Fc-fragment til en matrice i forbindelse med rensning deraf eller i forbindelse med immunologiske bestemmelsesmetoder.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav 1's indledning angivne art til i nærværelse af en vandholdig væske at binde mindst ét immunoglobulin IgG fra hvirveldyr, fortrinsvis pattedyr, eller dets fri Fc-fragment til en matrice. Som anført i nævnte kravindledning foreligger immunoglobulinet enten i fri form eller med sin Fab-del bundet til et antigen til hvilket der eventuelt er bundet en eller flere grupper eller stoffer, og bindingen sker under formidling af et til matricen ved hjælp af bindinger af kovalent karakter fæstnet polypeptid med evne til at binde sig til immunoglobulinets Fc-del eller dets fri Fc-fragment, nemlig det såkaldte protein A fra staphylococcer eller fragmenter af dette 2 141583 protein A. I nærværende beskrivelse omfatter betegnelsen "antigen" også haptener.

Fra J. Immunology bd. 105 nr. 4, side 944-948 (1970) er det kendt med immunoglobulin IgG og dets Fc-fragment at agglutinere røde blodlegemer fra får, der er stabiliseret med glutaraldehyd og overtrukket med protein A fra Staphylococcus aureus og bovint serumalbumin. Det er en ulempe ved denne kendte fremgangsmåde til at binde immunoglobulin IgG eller dets Fc-fragment til en matrice at matricen, nemlig erythrocytter-ne, indeholder forskellige forurenende stoffer og at de ikke er stabile i vand eller vandholdige væsker. For at erythrocyt-terne skal kunne fungere tilfredsstillende som matricer, må der tilsættes elektrolytter, men det komplicerer fremgangsmåden. Erythrocytterne er desuden ikke inerte; ved hæmolyse og på andre måder udløses der forstyrrende stoffer. Endvidere findes der på blodlegemernes overflade biokemisk reaktivt materiale, fx blodgruppesubstanser, mod hvilke der kan være rettet antistoffer, fx af IgG-klassen, samt stoffer der kan reagere med lektiner. Hertil kommer forstyrrende uspecifik adsorption på grund af blodlegemernes overfladestruktur, i hvilken der også forekommer ionbyttende grupper. Tilstedeværelse af lipider i blodlegemer er også en ulempe i den foreliggende sammenhæng.

Ved den kendte fremgangsmåde anvendes der således et materiale som er meget ømtåleligt og har dårlig stabilitet. Det kan kun lagres med stort besvær og har på grund af sine fysisk-kemiske egenskaber meget begrænset anvendelse, i hovedsagen til at påvirke IgG. Materialet kan ikke anvendes i kolonner.

Det har nu overraskende vist sig at disse ulemper kan overvindes eller i det mindste nedbringes væsentligt, hvis man ved den fremgangsmåde som angivet i krav 1's indledning ifølge opfindelsen som matrice anvender en i vand og den anvendte væske uopløselig, inert polymer.

Særlig hensigtsmæssigt anvendes ifølge opfindelse polymeren i partikelform, hvorved der opnås stor kontaktoverflade og mulighed for at pakke matricen i en kolonne.

Opfindelsen angår også et hjælpemiddel af den i indledningen til krav 3 angivne art til anvendelse ved udøvelse af den beskrevne fremgangsmåde. Ifølge opfindelsen er dette hjælpemid 141583 3 del ejendommeligt ved at matricen er en i vand og den til anvendelse bestemte væske uopløselig, inert polymer. Af de ovenfor anførte grunde foreligger ifølge opfindelsen polymeren fortrinsvis i partikelform.

Immunoglobulin IgG eller dets fri Fc-fragment, der skal bindes, kan være afledet fra forskellige arter hvirveldyr og fortrinsvis pattedyr. Immunoglobuliner hører som bekendt til forskellige immunoglobulin-klasser, fx klasse A (IgA), D (IgD), E (IgE), G (IgG) og M (IgM) . Den foreliggende opfindelse er særlig værdifuld fordi den anvendes i forbindelse med immunoglobuliner af IgG-klassen, da denne klasse bl.a. kvantitativt dominerer immunoglobulinerne. Immunoglobuliner-nes Fc-del kan fraspaltes til det tilsvarende Fc-fragment ved hjælp af kendte enzymatiske metoder.

Immunoglobulinet eller dets fri Fc-fragment kan være umærket eller mærket. Ved "mærkning" menes her at immunoglobulinet eller dets fri Fc-fragment er forsynet med karakteristiske grupper eller atomer, fx radioaktive atomer eller grupper indeholdende sådanne eller fluorescerende grupper eller en eller flere substituenter med enzymatisk aktivitet, til analytiske formål. På lignende måde kan antigenet eller grupper bundet dertil være umærkede eller mærkede i den netop anførte forstand, hvis antigenet er bundet til immunoglobulinets Fab-del.

Det anvendte polypeptid fra staphylococcer kan være det såkaldte protein A fra Staphylococcus aureus eller fragmenter af dette protein, hvilke fragmenter er af polypeptid-natur og er i stand til at binde mindst ét immunoglobulin ved dette immunoglobulins Fc-del. Protein A og fragmenter deraf fra Staphylococcus aureus kan binde immunoglobuliner hørende til IgG-klassen ved deres Fc-dele. Andre eksempler er protein A fra Staphylococcus epidermidis og fra andre staphylococstammer.

Som nævnt foran gennemføres den foreliggende fremgangsmåde i nærværelse af en vandig væske såsom en vandig pufret almindelig saltopløsning med passende pH-værdi, fx i nærheden af neutralpunktet.

Det anvendte polypeptid, protein A eller fragmenter deraf, er som nævnt fikseret til polymeren ved hjælp af bindinger af kovalent natur. På denne måde sikres det at polypeptidet 4 141583 ikke opløses fra den faste fase eller fjernes derfra ved vaskeprocesser. Polypeptidet kan være bundet til polymeren ved metoder der konventionelt anvendes til binding af polypeptider, fx proteiner, til polymere stoffer, fx ved hjælp af cyanogenhalogenid, isocya-nater og lignende stoffer. De anvendte uopløselige polymere stoffer kan være polymerer der konventionelt bruges til lignende formål, dvs. polymerer med funktionelle grupper som kan bruges når proteiner skal bindes til polymerer. Eksempler på sådanne funktionelle grupper er hydroxyl grupper, merkaptogrupper, primære og sekundære aminogrupper, learbonylgrupper, hydrazidgrupper, diazogrup-per og karboxylgrupper. Disse grupper kan anvendes når man ved konventionelle metoder danner grupper fra polymeren til et polypeptid, der i dette tilfælde er protein A fra staphylococcer eller fragmenter deraf. Polymeren, der er uopløselig i den anvendte væske, kan imidlertid være en sådan der kvælder i nævnte væske. Fx kan den være kvældbar i vand, da der bruges en vandig væske. Polymeren kan bestå af et tredimensionalt netværk, fx vundet ved tværbinding af en polymer såsom en polysakkarid. Der kan således anvendes meget forskellige polymerer. Cellulose, agarose, polyaminostyren, tvær-bundne polymerer (fx tværbundne polysakkarider) såsom dextran tvær-bundet med epiklorhydrin ("Sephadex"; et i Danmark indregistreret varemærke) eller med diepoxyder (fx med 1,4-butandioldiglycidæter) eller stivelse- eller cellulosederivater eller polyvinylalkohol tværbundet med epiklorhydrin eller diepoxyder er nogle få eksempler på sådanne polymerer. Andre eksempler er uopløselige polymerer vundet ved omsætning af tetraætylenpentamin eller hexametylendiamin med epiklorhydrin eller diepoxyder. Yderligere et eksempel er tværbundne polyakrylamidpolymerer substitueret med p-aminofenyl-grupper ("Enzacryl"; et i Danmark ikke indregistreret varemærke).

Den faste fase bestående af polymer kan eksistere i forskellige former. I mange tilfælde kan polymeren have partikelform. Et andet eksempel er en polymer reagensglasvæg.

Opfindelsen kan udnyttes på forskellige områder når det ønskes specifikt og eventuelt reversibelt at binde immunoglobulin igG eller dets Fc-fragment til en polymer fast fase. Eksempler på sådanne anvendelser er rensning af immunoglobulinet eller dets Fc-fragment. På grund af at immunoglobulin IgG eller Fc-fragmen-tet kan bindes under milde betingelser og derefter kan fraskil- 5 141583 les igen under milde betingelser, fx ved ændring af pH-værdien eller ionstyrken, kan immunoglobulinet eller dets Fc-fragraent vindes i meget ren form. Opfindelsen kan også udnyttes til adskillelse af et eller flere immunoglobuliner af klasse G fra øvrige immunoglobulin-klasser i en blanding af forskellige immunoglobuliner .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det også muligt specifikt at binde Fc-fragmenterne fra en blanding af Fc- og Fab-fragmenter så at Fab-fragmentet let kan vindes i ren tilstand.

Det bundne Fc-fragment kan derefter skilles fra den uopløselige polymer ved en hensigtsmæssig metode under milde betingelser og vindes i ren tilstand.

Fremgangsmåden kan desuden anvendes i forbindelse med forskellige immunologiske metoder til bestemmelse af immunoglobuliner eller antigener.

Med sådanne metoder kan fremgangsmåden og hjælpemidlet ifølge den foreliggende opfindelse bruges til at uopløseliggøre immunoglobulin IgG i fri eller antigen-bundet form eller dets Fc-fragment. Det kan også mærkes i forbindelse hermed.

Hvis immunoglobulinerne bindes i fri form kan deres Fab-dele bruges til at binde antigener mod hvilke disse Fab-dele er rettede. Antigenet kan eksistere i mærket form. På sin side kan antigenet bindes til forskellige grupper eller substanser som kan være mærket i overensstemmelse med det foregående.

Fremgangsmåden og hjælpemidlet ifølge opfindelsen fekal i det følgende beskrives nærmere ved nogle udførelseseksempler.

Eksempel 1 I. Fremstilling af rent protein A ud fra Staphylococcus aureus A. Fremstilling af en råekstrakt af protein A fra Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus, stamme Cowan I, dyrkedes i overensstemmelse med de anbefalinger der er givet i European J. Bio— chem. Vol. 29 (1972) side 572 (Sjoquist et al).

6 141583

Protein A frigaves fra bakterierne ved hjælp af enzympræparatet lysostaphin. Uopløseligt materiale fjernedes ved centrifugering og den flydende fase udvandtes. pH-Værdien reguleredes til 3,5 med HC1 og det uopløselige materiale fjernedes ved centrifugering, hvorefter væsken opsamledes. Derpå reguleredes pH-værdien til 7,0 ved hjælp af NaOH i overensstemmelse med ovennævnte reference .

Den på denne måde vundne væske er en råekstrakt indeholdende protein A i blanding med stoffer af karakter som urenheder.

B. Fremstilling af agarose med IgG bundet dertil

Agarose i form af et kommercielt tilgængeligt præparat ("Sepharose" 4 B; et i Danmark indregistret varemærke) anvendtes herved.

Agarosen brugtes i form af ganske små partikler (40-190 μ) kvældede i vand. Partikelmassen indeholdt 4 vægt% agarose. Partikelmassen vaslcedes først med vand. 100 ml pakket partikelmasse med tilsætning af 50 ml vand blandedes med 10 g cyanogenbromid i 50 ml vand under omrøring ved 20°C, idet pH holdtes på 10-11 ved tilsætning af 5—normal NaOH. Efter ti minutters forløb vaskedes partikelmassen omhyggeligt med iskoldt vand og derefter med 0,2M natriumlcarbonat-natriumhydro-genkarbonatpuffer i vand ved pH 9,0 og 4°C.

Den med cyanogenbromid aktiverede partikelmasse opslæm-medes i 120 ml af den ovennævnte puffer ved pH 9,0, indeholdende 3,0 g humant IgG (fremskaffet fra Kabi AB, Stockholm, Sverige) ved 4°C under omrøring.

Efter fire timers forløb fjernedes partikelmassen ved filtrering og vaslcedes med ovennævnte puffer ved pH 9,0, og derefter suspenderedes partikelmassen i 1,5 l af en vandig opløsning indeholdende 0,05M 2-aminoætanol og 0,2M natriumkarbonat-natriumhydro-genkarbonat ved pH 9,0, hvorpå der omrørtes ved 4°C i 18 timer. Derefter vaslcedes partikelmassen med en ο,ΙΜ natriumfosfatpuffer i vand indeholdende 4M urinstof med pH 6,0 og derefter med en 0,1M natriumfosfatpuffer i vand med pH 7,0 indtil OD 280 nm af vaske-væsken var under 0,01. Derefter vaslcedes gelmassen med en 0,1M glycin-HCl-puffer i vand ved pH 3,0 og derefter påny med ovennævnte 0,1M natriumfosfatpuffer med pH 7,0. Det vundne produkt indeholdt ca. 30 mg bundet IgG pr. 1 ml pakket partikelmasse.

7 141583 C. Adskillelse af protein A fra råekstrakten fra Staphylococcus aureus

En kromatografikolonne fyldtes med 100 ml af den pakkede partikelmasse med IgG bundet dertil med pH 7,0 fra den ovenfor gengivne sekvens B. 500 ml cif råekstrakten med pH 7,0 og indeholdende protein A fra sekvens A foran førtes langsomt gennem kolonnen med partikelmassen ved 20°C, idet gennemstrømningshastigheden reguleredes til 50 ml/time. Derefter vaskedes partikelmassen omhyggeligt i kolonnen med 0,1M natriumfosfatpuffer i vand med pH

7,0 indtil OD 280 nm af vaskevæsken var under 0,02. Det vundne produkt indeholdt ca. 3 mg bundet protein A pr. 1 ml pakket partikelmasse.

D. Adskillelse af protein A fra partikelmassen

Protein A bundet til partikelmassen fra sekvens C foran frigjordes derfra ved eluering af kolonnen med 100 ml 0,1M glycin-HCl-puffer i vand ved pH 3,0. Den opsamlede glycin-HCl-puffer indeholdende protein A dialyseredes mod destilleret vand, hvorefter protein A vandtes i fast form ved frysetørring. Der vandtes ca.

250 mg protein A i ren form. (Det er også muligt i stedet for dialyse at udføre afsaltning ved hjælp af gelfiltrering). ved immunologiske prøver kunne det vises at protein A var fri for stofferne med karakter af urenheder.

II. Fremstilling af agarose med protein A fra Staphylococcus aureus bundet dertil E. Fremstilling af agarose med protein A bundet dertil

Agarose i form af det kommercielt tilgængelige præparat "Sepharose” ® 4.B anvendtes her.

Agarosen brugtes i form af ganske små partikler (40-190 μ) kvældet i vand. Partikelmassen indeholdt 4 vægt% agarose. Partikelmassen vaskedes først med vand. 10 ml pakket partikelmasse med tilsætning af 5 ml vand blandedes med 1 g cyanogenbromid i 5 ml vand 141583 δ under omrøring ved 20°C, idet pH holdtes på 10-11 ved tilsætning af l-normal NaOH. Efter ti minutter vaskedes partikelmassen omhyggeligt med iskoldt vand og derefter med 0,2M natriumkarbonat-natriumhydrogenkarbonat-puffer i vand ved pH 9,0 og 4°C.

Den med cyanogenbromid aktiverede partikelmasse opslæm-medes i 12 ml af ovennævnte puffer med pH 9,0 og indeholdende 50 mg rent protein A ved 4°C tinder omrøring.

Efter fire timers forløb fjernedes partikelmassen ved filtrering og vaskedes med ovennævnte puffer ved pH 9,0, hvorefter partikelmassen suspenderedes i 500 ml af en vandig opløsning indeholdende 0,05M 2-aminoætanol og 0,2M natriumkarbonat-natriumhydro-genkarbonat med pH 9,0, hvorpå der omrørtes ved 4°C i 18 timer. Partikelmassen vaskedes derefter med en 0,1M natriumfosfatpuffer i vand indeholdende 4M urinstof med pH 6,0 og derpå med en 0,1M natriumfosfatpuffer i vand og med pH 7,0, indtil vaskevæskens OD ved 280 nm var under 0,01. Derefter vaskedes gelmassen med 0,1M gly-cin-HCl-puffer i vand ved pH 3,0 og derpå påny med den foran nævnte 0,1M natriumfosfatpuffer ved pH 7,0. Det vundne produkt indeholdt ca. 5 mg bundet protein A pr. ml pakket partikelmasse.

III. Binding af immunoglobulin fra humant serum F. Binding til agarose med protein A bundet dertil 10 ml pakket partikelmasse til hvilken der ved kovalente bindinger var bundet protein A (i henhold til sekvens E foran) og med pH 7,0 indførtes i en kromatografikolonne. 10 ml humant serum fortyndet med 10 ml af den foran nævnte 0,1M natriumfosfatpuffer med pH 7,0 førtes langsomt gennem kolonnen med partikelmassen ved 20°C, idet gennemstrømningstiden var 30 minutter. Derefter vaskedes partikelmassen grundigt i kolonnen med 0,1M natriumfosfatpuffer i vand ved pH 7,0 indtil vaskevæskens OD ved 280 nm var under 0,02. Det vundne produkt indeholdt immunoglobuliner hørende til IgG-lclassen og bundet til partikelmassen.

De bundne immunoglobuliner kan frigøres fra polymerpar-tilclerne ved simple processer, fx ved ændring af pH-værdien eller ionstyrken. Således genadskiltes de immunoglobuliner, der var bun 9 141583 det i overensstemmelse med det foran beskrevne, fra partikelmassen ved eluering med en 0,1M glycin-HCl-puffer i vand ved pH 3»0T Det kunne fastslås ved immunologiske prøver etc. at de frigjorte immu-noglobuliner var rene for øvrige serumproteiner og hørte til immu-noglobulin-klassen IgG.

Eksempel 2

Binding af immunoglobulin fra svineserum

Dette forsøg udførtes på lignende måde som beskrevet i eksempel 1. I dette tilfælde indførtes partikelmassen med protein A anbragt derpå imidlertid ikke i en kolonne, men immunoglobulinet blev bundet på følgende måde: 10 ml af den pakkede partikelmasse med protein A kovalent bundet dertil (idet protein A var vundet analogt med sekvens E i eksempel l) suspenderedes i 50 ml 0,1M natriumf osfatpuffer i vand ved pH 7,0. Der tilsattes 10 ml svineserum dråbevis i løbet af ti minutter ved en temperatur på 20°C. Efter 30 minutters forløb fraskiltes partikelmassen ved filtrering og vaskedes omhyggeligt med 0,1M natriumfosfatpuffer i vand ved pH 7,0. På lignende måde som i eksempel 1 var immunoglobuliner hørende til igG-klassen blevet bundet til partikelmassen. Dette kunne påvises efter fraskillelse af bundne immunoglobuliner og påfølgende analyser på analog måde med den der er beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 3 I. Fremstilling af polypeptid A. Fremstilling af en rå ekstrakt af et polypeptidfrag-ment af protein A fra Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus, stamme Cowan I, dyrkedes i overensstemmelse med de anbefalinger der er givet af Sjoquist et al i European J. Biochem. Vol. 29 side 572 (1972).

U1583 10

Bakterierne fjernedes ved centrifugering og vaskedes med 0. 9%s NaCl-opløsning i vand. 100 g bakterier (vådvægt) opslæmmedes i 150 ml fysiologisk kogsaltopløsning. Der sattes 10 mg trypsin (frit for cktymo trypsin) dertil. pH-vær di en var 7,2. Enzymbehandlingsprocessen udførtes ved 30°C ved pH 7»2 i 30 minutter, hvorefter der tilsattes 20 mg trypsininhibitor fra sojabønner. Suspensionen centrifugeredes derefter. Den ovenstående væske opsamledes og filtreredes sterilt gennem Milliporefiltere.

Den sterile filtrerede væske indeholder fragmenter A med polypeptidkarakter, i blanding med substanser med karakter af urenheder. Med henblik på at rense de fragmenter der har evne til at binde sig til Fc-delen af IgG-molekylerne isoleredes de ved hjælp af agarose med IgG bundet dertil.

B. Fremstilling af agarose med IgG bundet dertil

Humant IgG bandtes til agarose som beskrevet i eksempel 1, afsnit B.

C. Adskillelse af polypeptidfragmenter af protein A stammende fra Staphylococcus aureus

En kromatografikolonne fyldtes med 100 ml af den pakkede partikelmasse med IgG bundet dertil og med pH 7,0, stammende fra sekvens B i nærværende eksempel 3. 100 ml af råekstrakten med pH • 7,0 og indeholdende polypeptidfragmenter fra protein A fra ovenstående sekvens A førtes langsomt gennem kolonnen med partikelmassen ved 20 °C, idet gennemstrømningshastigheden reguleredes til 50 ml pr. time. Partikelmassen vaslcedes derefter omhyggeligt i kolonnen med 0,1M natriumfosfatpuffer i vand ved pH 7,0 indtil vaske-væskens OD ved 280 nm var under 0,02. Det vundne produkt indeholdt ca. 1 mg bundne polypeptider pr. l ml pakket partikelmasse.

D. Adskillelse af polypeptidfragmenter af protein A fra partikelmassen

De polypeptider der blev bundet til partikelmassen i sekvens C foran frigjortes fra partikelmassen ved eluering af kolon- 11 141583 nen med 100 ml 0,1M glycin-HCl-puffer i vand med pH 3,0. Den op-samlede glycin-HCl-puffer indeholdende polypeptiderne med evne til at binde Fc-delen af IgG-molekylerne afsaltedes ved gelfiltrering ved hjælp af "Sephadex*® G 25 (partikler af dextran tvæcbundet med epiklorhydrin). Der isoleredes ca. 100 mg polypeptider med en molekylvægt på ca. 7000 ved frysetørring. Ved kromatografering kunne det vises at polypeptidfraktionen indeholdt flere indbyrdes nært beslægtede polypeptider, alle med den nævnte evne til at binde Fc-delen af IgG-molekylerne. Ved bl.a. immunologiske prøver kunne det påvises at polypeptidfraktionen var ren for stoffer af forurenende karakter. ^ På tilsvarende måde kan polypeptidfragmenter med evne til at binde Fc-delen af IgG-molekyler isoleres ved at man først isolerer protein A og derefter behandler protein A i opløsning ved fx pH 8,2 med trypsin på analog måde med det foregående, hvorefter polypeptidfragmenter med de relevante egenskaber fraskilles på tilsvarende måde som beskrevet ovenfor ved at blive bundet til agarose med igG bundet dertil, hvorefter polypeptidfragmenterne fraskilles.

II. Fremstilling af agarose med polypeptidfragmenter fra protein A stammende fra Staphylococcus aureus bundet dertil E. Fremstilling af agarose med polypeptid bundet dertil

Agarose i form af det kommercielt tilgængelige præparat (6) "Sepharose" w 4 B anvendtes ved metoden.

Agarosen brugtes i form af ganske små partikler (40-190 μ) kvældet i vand. Partikelmassen indeholdt 4 vægt% agarose. Partikelmassen vaskedes først med vand. 10 ml pakket partikelmasse med tilsætning af 5 ml vand blandedes med 1 g cyanogenbromid i 5 ml vand under omrøring ved 20°C, idet pH holdtes på 10-11 ved tilsætning af 1-normal NaOH. Efter ti minutters forløb vaskedes partikelmassen omhyggeligt med iskoldt vand og derefter med en 0,2M natri-umkarbonat-natriumhydrogenkarbonatpuffer i vand ved pH 9,0 ved 4°C.

Den med cyanogenbromid aktiverede partikelmasse opslæm-medes i 12 ml af den foran nævnte puffer red pH 9,0 og indeholdende 25 mg rent polypeptid ved 4°C under omrøring.

12 141583

Efter fire timers forløb fjernedes partilcelmassen ved filtrering og vaskedes med ovennævnte puffer ved pH 9,0, hvorefter partilcelmassen suspenderedes i 500 ml af en vandig opløsning indeholdende 0,05M 2-aminoætanol og 0,2M natriumlcarbonat-natriumhydrogen-karbonat med pH 9,0, hvorpå der omrørtes ved 4°C i 18 timer. Derefter vaslcedes partikelmassen med en 0,1M natriumfosfatpuffer i vand indeholdende 4M urinstof med en pH-værdi på 6,0 og derefter med en 0,1M natriumfosfatpuffer i vand med pH 7,0 indtil OD ved 280 nm af vaskevæslcen var.under 0,01. Derefter vaskedes gelmassen med en 0,1M glycin-HCl-puffer i vand ved pH 3,0 og derefter påny med foran nævnte 0,1M natriumfosfatpuffer ved pH 7,0. Det vundne pr o dulet indeholdt bundet polypeptid med evne til at binde Fc-delen af IgG-mole-kylerne.

III. Binding af immunoglobulin fra humant serum F. Binding til agarose med polypeptid bundet dertil

10 ml pakket partikelmasse hvortil der med kovalente bindinger var bundet et polypeptid fra sekvens E foran og med pH

7,0 indførtes i en kromatografikolonne hvorefter der langsomt førtes 10 ml humant serum fortyndet med 10 ml af den ovennævnte 0,1M natriumfosfatpuffer med pH 7,0 gennem kolonnen med partilcelmassen ved 20°C, idet gennemstrømningstiden var 30 minutter. Derefter vas-• kedes partilcelmassen omhyggeligt i kolonnen med 0,1M natriumfosfatpuffer i vand ved pH 7,0 indtil OD ved 280 nm af vaskevæslcen var under 0,02. Det vundne produkt indeholdt immunoglobuliner hørende til IgG-klassen og bundet til partilcelmassen.

De bundne immunoglobuliner kan frigøres fra polymerpar-tilclerne ved simple processer,, fx ved ændring af pH-værdien eller ionstyrken. Således skiltes de immunoglobuliner, der var bundet i overensstemmelse med den foran beskrevne teknik, fra partikelmassen ved eluering med 0,1M glycin-HCl-puffer i vand ved pH 3,0. Det påvistes ved immunologiske prøver etc. at de genfrigjorte immuno-globuliner var fri for øvrige serumproteiner og hørte til immu-noglobulinlclassen IgG.

13 141583

Eksempel 4

Binding af immunoglobulin fra svineserum

Porsøget udførtes på lignende måde som beskrevet i eksempel 3. I dette tilfælde indførte man imidlertid ikke partikelmassen med det derpå anbragte polypeptid i en kolonne, men immunoglobuli-net bandtes på følgende måde: 10 ml af den pakkede partikelmasse med polypeptid Jcovalent bundet dertil (polypeptidet var vundet på. en måde analog med sekvens E i eksempel 3) suspenderedes i 50 ml 0,1M natriumfosfatpuffer i vand med en pH-værdi på 7,0. Der tilsattes dråbevis 10 ml svineserum i løbet af ti minutter ved en temperatur på 20°C. Efter 30 minutters forløb fraskiltes partikelmassen ved filtrering og vaskedes omhyggeligt med 0,1M natriumfos-fatpuffer i vand med pH 7,0. På lignende måde som i eksempel 3 var . immunoglobuliner af klasse IgG blevet bundet til partikelmassen.

Dette kunne påvises efter fraskillelse af bundne immunoglobuliner og påfølgende analyse på analog måde med den i eksempel 3 beskrevne.

På lignende måde som i de foregående eksempler anvendtes der uopløselige partikler af dextran tværbundet med epiklor-hydrin ("Sephadex"®) og cellulose i stedet for agarose, og der opnås herved lignende resultater.