CN117355538A - 简化高效分离蛋白质的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了简化从血清或血浆中分离目标蛋白的组合物和方法。细碎二氧化硅或类似的脂质/脂蛋白结合固体与蛋白质沉淀剂组合使用，以产生包含目标蛋白的溶液且可以应用于层析介质而不产生显著的介质污染。该方法特别适合于分离免疫球蛋白G。

Description

简化高效分离蛋白质的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2020年4月10日提交的美国临时专利申请No.63/008365的权益。该材料和所有其他引用的外部材料通过引用全文并入本文。如果通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语定义不一致或相反，则以本文提供的术语定义为准。

技术领域

本发明的领域是血液制品免疫球蛋白G的制备，特别是利用亲和层析法。

背景技术

背景描述包括可能有助于理解本发明的信息。这里提供的任何信息都不是承认为现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物都是现有技术。

施用已恢复或正在从感染中恢复的个体的血浆或血清已用于为受感染个体提供短暂的被动免疫。这种被动免疫可以追溯到20世纪初，当时特异性抗体是从接种过疫苗的动物身上获得的血清中提取的。人类血液也被确认为抗体的来源。这种被动免疫通过提供病原体的特异性抗体来提供针对病原体的即时和短期免疫。自引入以来，这种被动免疫已被证明能挽救许多急性感染的生命。虽然抗生素在治疗细菌感染方面已在很大程度上取代了被动免疫，但在没有疫苗或其他特定治疗方法的情况下，被动免疫仍然是治疗许多病毒病原体的重要工具。值得注意的是，人们已探索了这种被动免疫作为埃博拉和冠状病毒感染的治疗方法。

恢复期血液制品通常通过从先前感染的个体采集全血或血浆来获得，该个体已对引起所讨论疾病的病原体产生了有效的体液免疫，并可提供特异性人类抗体源。输注这种恢复期血液制品可以有效地中和病原体，并有助于将其从循环中清除。不同的恢复期或高免疫性血液制品被用于提供这种被动免疫，包括恢复期全血、恢复期血浆和恢复期血清。

恢复期血浆已成为越来越受关注的对象，例如在治疗SARS和相关冠状病毒方面。目前，通过采血获得的血浆是首选的，因为每次采血可以收集更多的血浆，更频繁的献血是可能的，而且事实上对献血者的血红蛋白水平几乎没有影响(由于红细胞的回输)。然而，用这种血液制品进行被动免疫对接受者并非没有风险。这些风险与血液物质的转移有关，包括意外感染其他传染病病原体和对血清成分的反应，包括免疫反应，如血清病。随着现代血库实践和血型鉴定，无意中转移已知传染源或引发输血反应的风险很低，但在恢复期或恢复期患者人数有限的情况下，这种做法可能会有所放松。此外，用于提供被动免疫的恢复期血清或血浆很可能用于患有肺部疾病的患者，在这些患者中，输注血浆可能会导致输血相关的急性肺损伤。

因此，人们对从恢复期或超免疫源获得的血液制品中分离免疫球蛋白(通常是IgG)，随后向患者施用相对纯(例如大于95％)的免疫球蛋白越来越感兴趣。这种方法可以提供所需的被动免疫，同时避免因引入其他血液制品成分而引起的并发症。此外，如此分离的IgG可以在使用前冻干和重悬，简化了储存和分配。

使用分离的高免疫性免疫球蛋白的另一个好处是，相对于高免疫性血浆输注，能够使用较小的体积。治疗性血浆的施用不可避免地受到血浆体积的限制(除非患者血浆被去除，即血浆置换)。施用血浆是一个涉及医学的过程，特别是在使用血浆置换的情况下，这有效地限制了可以施用的IgG剂量。相比之下，由于其浓度，分离的超免疫抗体的施用不受此方式的限制。由此产生的小体积使得施用比通过输注超免疫血清可获得的更高剂量治疗性IgG安全和方便。

不幸的是，从血液制品中以所需纯度分离IgG是一个复杂的过程。典型的方法包括几个沉淀步骤，在此期间IgG可能丢失，并且可能包括不适合大规模生产的步骤。例如，亲和层析(例如，使用蛋白A或蛋白G亲和介质)是在有限数量的步骤中提供高纯度IgG的有吸引力的方法。不幸的是，这种亲和介质的层析柱容易被脂类、非IgG血液蛋白等污染。这种污染大大降低了昂贵亲和介质的容量，并且可能需要较长的柱清洗步骤，随着时间的推移会降低性能，并缩短这种昂贵介质的使用周期。因此，目前使用这种IgG特异性亲和层析的方法通常包括在引入亲和介质之前对血液制品进行冗长而复杂的处理，这限制了其应用。

因此，当亲和层析用于分离血液蛋白时，仍需要简化和精简(streamline)上游处理步骤的组合物和方法。

发明内容

本发明主题提供了简化应用于层析介质的血液制品制备的设备、系统和方法。将二氧化硅颗粒或粉末与有机盐(例如，柠檬酸盐或乙酸盐)一起添加到血液制品中，形成沉淀和上清液部分。上清液部分可直接应用于层析分离步骤，无需额外处理或仅少量处理。

本发明构思的一个实施方案是一种通过使血液制品与脂质/脂蛋白吸附材料(例如细碎二氧化硅(例如，气相二氧化硅)和/或其他亲脂性和/或惰性蛋白质吸附材料(如，带电二氧化硅、木炭、活性炭、Al(OH)₃、膨润土、磷酸钙/羟基磷灰石)，同时将血液制品与有机盐混合，其浓度可产生第一沉淀和第一上清液。细碎二氧化硅和有机盐可以按任何顺序或同时加入。将第一上清液应用于分离柱，并从分离柱中收集包含目标蛋白(例如，IgG)的部分。在一些实施方案中，可以从分离柱的流穿级分回收额外的蛋白质(例如非IgG蛋白质)。合适的分离柱可以包括亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质，混合模式介质和/或尺寸排阻介质。

所用有机盐的浓度足以从血液制品中沉淀第一种非目标蛋白(例如，非IgG蛋白)，例如以重量计约5％至约20％。第一沉淀包括细碎二氧化硅和非目标蛋白。在一些实施方案中，将第一沉淀重悬或再溶解以产生包含第一非IgG蛋白的第二溶液。该第二溶液可以从细碎二氧化硅中分离出来，并进一步加工以从第二溶液中回收非目标蛋白。

另一实施方案是一种从血液制品中分离目标蛋白的方法，所述分离是通过使血液制品与细碎二氧化硅(例如，气相二氧化硅)接触，而血液制品与有机盐(如柠檬酸盐或乙酸盐)以产生第一沉淀(其可包括细碎二氧化硅和非目标蛋白以及第一上清液)的浓度组合。在一些实施方案中，在添加细碎二氧化硅之前，将有机盐添加到血液制品中。该第一浓度的有机盐足以从血液制品中沉淀非目标蛋白(例如以重量计约5％至约15％)。将额外量的有机盐添加到第一上清液中以提供产生第二沉淀和第二上清液的第二浓度有机盐。在一些实施方案中，从该第二上清液中分离非目标蛋白。将第二沉淀重悬或再溶解以产生再溶解的第二沉淀，该第二沉淀又被施加到分离柱。这种分离柱可以包括亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和/或尺寸排阻介质。然后从分离柱中收集含目标蛋白(例如IgG)的级分。在一些实施方案中，从分离柱收集流穿级分并进一步处理以分离非目标蛋白。

这些实施方案中的一些包括重新悬浮第一沉淀以产生包含非目标蛋白的第二溶液，并将第二溶液与细碎二氧化硅分离。随后可从第二溶液中回收非目标蛋白。

本发明构思的另一个实施方案是一种从血液制品分离目标蛋白(例如，IgG)的方法，所述分离是通过使血液制品与第一浓度的有机盐(例如，柠檬酸盐或乙酸盐)接触(其足以从血液制品中沉淀非目标蛋白，例如，以重量计约5％至约15％)来沉淀(其可包括非目标蛋白)和第一上清液，然后向第一上清物中加入细碎二氧化硅(例如，气相二氧化硅)和额外量的有机盐，以提供第二浓度的有机盐。细碎二氧化硅可以是在向血液制品中加入有机盐之后或基本上同时加入。这产生第二沉淀(其包括目标蛋白(例如IgG)和细碎二氧化硅)和第二上清液(其可以包括非目标蛋白的蛋白)。在一些实施方案中，从该第二上清液中回收非IgG蛋白。将第二沉淀重悬并溶解以产生再溶解的第二沉淀和残余沉淀(其包括细碎二氧化硅)。将再溶解的第二沉淀施用到分离柱，并从分离柱收集含IgG的级分。在一些实施方案中，收集包括从分离柱收集的非目标蛋白的流穿级分；这种非目标蛋白随后可以从流穿级分中分离出来。合适的分离柱可以包括亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和/或尺寸排阻介质。

在一些这样的实施方案中，将第一沉淀重悬并再溶解以产生含有非IgG蛋白的第二溶液。随后从第二溶液中回收非IgG蛋白。

根据以下对优选实施方案的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1A和图1B示意性地描绘了本发明构思的示例性方法。图1A描述了利用对目标蛋白的正向选择方法。图IB描述了利用对目标蛋白的反向选择方法。

图2A和图2B示意性地描绘了本发明构思的方法的替代实施方案。图2A描述了利用对目标蛋白的正向选择方法。图2B描述了利用对目标蛋白的反向选择方法。

图3A、图3B和图3C示意性地描绘了本发明构思的方法的替代实施方案，图3B示图3A的续图，图3C描绘了图3A的替代续图。图3A描述了该方法的初始沉淀步骤。图3B是图3A的续图，并描绘了利用正向选择选择目标蛋白的方法。图3C是图3A的续图，并描绘了利用反向选择选择目标蛋白的方法。

图4示意性地描绘了本发明构思的方法，该方法利用空层析柱捕获来自中间产物的固体。

具体实施方式

本发明主题提供了一种设备、系统和方法，其中脂质和/或脂蛋白去除步骤和蛋白质沉淀步骤组合应用(例如作为层析分离步骤(例如，亲和层析步骤)上游的处理步骤)于血液制品，从而从洗脱级分或流穿级分中获得目标蛋白。这简化了血液制品的上游处理同时减少和/或消除层析介质(例如IgG特异性亲和介质)的污垢。层析介质的污垢的减少保留了介质的容量(允许使用比减少处理步骤可能使用的更少介质)和/或减少了对层析介质的清洁需求。

从以下对优选实施方案的详细描述以及附图中相似数字表示相似部件的附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。

在一些实施方案中，用于描述和本发明要求保护的某些实施方案的表示成分数量、性质(如浓度、反应条件等)的数字应理解为在某些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求中所述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方案寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方案中，应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释数字参数。尽管规定本发明某些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施方案中规定的数值尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可以包含某些误差，这些误差必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起。

如本文描述中所使用的，以及随后的所有权利要求，除非上下文另有明确规定，否则“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”的含义包括复数引用。此外，如本文描述中所用，“在…中(in)”的含义包括“在…中(in)”和“在…上(on)”，除非上下文另有明确规定。

本文中数值范围的描述仅旨在作为一种简写方法，单独引用范围内的每个单独数值。除非本文另有说明，否则每个单独的值都包含在说明书中，如同在本文中单独叙述一样。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行，除非本文中另有指示或上下文中另有明确矛盾。本文中针对某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并不限制本发明的范围。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的元素。

此处公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独地或以与组的其他成员或本文中发现的其他元素的任何组合来引用和声明。出于方便和/或可专利性的原因，可以将组中的一个或多个成员包括在组中或从组中删除。当出现任何此类包含或删除时，本说明书被视为包含修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

应当理解，所公开的组合物和方法提供了许多有利的技术效果，包括减少利用层析分离步骤的经济影响，特别是在大规模生产用于治疗目的的特异性免疫IgG中使用IgG特异性亲和层析介质。这样做的好处是使这种材料更容易获得。

以下讨论提供了本发明主题的许多示例性实施方案。尽管每个实施方案代表发明元素的单个组合，但本发明主题被认为包括所公开元素的所有可能组合。因此，如果一个实施方案包括元素A、B和C，而第二个实施方案包含元素B和D，则本发明主题也被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使未明确公开。

在本发明构思的方法中，血液制品与蛋白质沉淀剂接触，或与蛋白质沉淀剂接触的同时与脂质/脂蛋白接触。合适的血液制品包括血清、血浆(例如，新鲜或非冷冻血浆、除去冷沉淀的贫冷(cryo-poor)血浆、以及在其中重新溶解了冷沉淀的先前冷冻血浆等)和来自血液蛋白分馏方法的中间产物(例如，Cohn沉淀、硫酸铵沉淀、有机盐沉淀等)。这种中间产物可以是沉淀步骤的上清液，或者是沉淀步骤中重悬和再溶解的沉淀。

合适的沉淀剂包括但不限于有机溶剂(例如，醇、丙酮等)、亲水聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐等)、无机盐(氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸钠、磷酸铵等)和/或有机酸盐(柠檬酸盐、乙酸盐等)。

合适的脂质/脂蛋白吸附固体可以具有吸附脂质、脂蛋白和/或其他污染物的能力，并且可以以细碎的形式提供(例如，平均直径小于5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、800μm、500μm、300μm、100μm或50μm)。此类固体的密度可以大于、小于或基本上类似于(即，在10％以内)它们所用的水溶液的密度。合适的脂质/脂蛋白吸附固体包括(但不限于)疏水层析介质、疏水相互作用层析介质、二氧化硅(例如，气相二氧化硅、细二氧化硅、带电二氧化硅等)、木炭、活性炭、Al(OH)₃、膨润土和/或磷酸钙/羟基磷灰石。在本发明构思的优选实施方案中，血液制品是血浆，沉淀剂是柠檬酸盐，脂质/脂蛋白吸附固体是气相二氧化硅。

在本发明构思的实施方案中，可在引入脂质/脂蛋白吸附固体之前将沉淀剂添加到血液制品中。例如，在这种实施方案中，沉淀剂可在添加脂质/脂蛋白吸附固体之前约5分钟至约1小时添加到血液制品中(无需中间分离步骤)。在其他实施方案中，沉淀剂可在引入脂质/脂蛋白吸附固体的大约同时添加到血液制品中。例如，在这种实施方案中，沉淀剂可在添加脂质/脂蛋白吸附固体后约±5分钟内添加(无需中间分离步骤)。在又一些实施方案中，沉淀剂可以在引入脂质/脂蛋白吸附固体之后添加到血液制品中。例如，在这种实施方案中，沉淀剂可以在向血液制品中添加脂质/脂蛋白吸附固体后约5分钟至约1小时(无需中间分离步骤)，将其添加到血液制品中。

沉淀剂和脂质/脂蛋白吸附固体可作为单独的制剂提供。这些可以单独应用于血液制品，也可以在应用前立即混合。本发明构思的一个实施方案是一种制剂，所述制剂将一种或多种沉淀剂与一种或多种脂/脂蛋白吸附固体组合。这进一步通过提供单一组合制剂将所述发明构思的方法简化为组合蛋白质沉淀和脂质和/或脂蛋白去除的步骤。

沉淀剂可在任何合适的浓度下使用，浓度范围可根据沉淀剂的性质、所用血液制品、所用脂质/脂蛋白吸附固体、沉淀剂和脂质/脂素吸附固体添加的顺序和/或时间、和/或引入沉淀剂的分离过程的阶段而变化。例如，当将柠檬酸盐应用于血浆以沉淀至少一部分非IgG蛋白含量，同时将IgG留在溶液中时，柠檬酸盐可按以重量计约5％至约15％提供。或者，当将柠檬酸盐应用于血浆以沉淀大部分或全部IgG含量时，柠檬酸盐可按以重量计约15％至约50％提供。沉淀剂的浓度可以优化，以便在所需级分(即上清液或沉淀，取决于工艺)中提供IgG的最大保留，同时最小化下游亲和柱的污染。

类似地，脂质和/或脂蛋白吸附固体可在任何合适的浓度下使用，浓度范围可根据脂质/脂蛋白吸附固体的性质、沉淀剂的性质、所使用的血液制品、沉淀剂和脂质/脂素吸附固体添加的顺序和/或时间，和/或引入脂质/脂蛋白吸附固体的分离过程的阶段而变化。在一些实施方案中，血液制品的脂质和/或脂蛋白含量可在处理之前表征。例如，当将气相二氧化硅应用于具有典型脂质和/或脂蛋白含量，该量可以在约10mg/mL血浆至约500mg/mL血浆的范围内。当血浆具有高脂和/或脂蛋白含量时，该量可调节至高达750mg/mL血浆或更高。

在这种处理之后进行的层析分离步骤可用于分离或进一步纯化IgG或其他目标蛋白，可利用所需蛋白质物种的正向选择或反向选择。

在正向选择中，IgG或其他目标蛋白与层析介质结合，不需要的类别在流穿中通过层析介质。随后将IgG或其他所需蛋白质从洗脱的级分中的层析介质中洗脱(任选地在洗涤或冲洗层析介质之后)。将上述方法的产物施用于蛋白A或蛋白G亲和柱，然后使用酸性缓冲液洗脱IgG级分是IgG正向选择的一个例子。在一些实施方案中，可以从流穿级分中回收一种或多种额外的目标蛋白。

在反向选择中，不需要的类别与层析介质结合，IgG或另一种目标蛋白在流穿级分中通过层析介质。然后可以通过洗脱不需要的物质来再生层析介质以供重复使用。反向选择IgG的一个示例是，在适当的缓冲条件下将上述方法的产物施用于阴离子交换柱，收集含IgG的流穿级分。在一些实施方案中，可以从通过洗脱释放的结合材料中回收一种或多种额外的目标蛋白。

用于本发明构思的方法的合适层析介质包括尺寸排阻介质、离子交换介质(例如，阴离子交换介质、强阴离子交换介质，阳离子交换介质或强阳离子交换介质)、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和亲和介质。层析介质可提供为多孔颗粒或珠、非多孔颗粒或珠、多孔膜和/或过滤器。作为颗粒或珠提供的层析介质可以以层析柱的形式或在流动层析系统中应用。在一些实施方案中，可以采用两个或更多层析步骤。

在一些实施方案中，可以在施用于层析步骤之前采用缓冲液交换步骤。合适的缓冲液交换步骤包括尺寸排阻层析法、透析、超滤和沉淀，然后重悬和溶解沉淀。

适用于本发明构思的方法的多种亲和层析介质可用于从溶液中分离IgG。这些包括具有IgG Fc区(蛋白A、蛋白G)、IgG轻链(蛋白L)和抗体类特异性抗体(例如，山羊抗人IgG)的偶联细菌受体的层析介质。反过来，这些配体可以偶联到多种固相，包括琼脂糖、交联琼脂糖，合成聚合物、天然和合成聚合物的混合物、多孔玻璃、膜和过滤器。IgG结合配体及其偶联介质的选择可影响所用的浓度和沉淀剂和/或脂质/脂蛋白吸附固体。例如，使用与低非特异性结合介质(如合成或部分合成介质)偶联的强配体(如蛋白A)可产生亲和层析介质，该亲和层析介质在一定程度上抗污染并耐受苛刻的清洁过程。例如，与在亲和分离步骤中使用与易污染介质偶联的相对不稳定的配体(例如免疫球蛋白特异性抗体)相比，使用这种介质可以允许使用较少的沉淀剂和/或脂质/脂蛋白吸附固体。

在涉及分离IgG的实施方案中，可使用除免疫球蛋白特异性亲和层析以外的层析介质。合适的替代层析介质包括但不限于阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和尺寸排阻介质。可以选择使IgG与介质结合的介质。或者，可以选择使得IgG不会与介质发生明显的相互作用、并且可以在柱的流穿级分中找到的介质。在一些实施方案中，可选择与IgG相互作用，但不保留IgG，以使IgG作为柱流出物中的独特峰回收的介质。

在这些实施方案中，沉淀剂的浓度可以选择为使得上清液或重悬和溶解的沉淀中的残余沉淀剂不会干扰IgG和非IgG特异性层析介质之间的相互作用(或不会相互作用)。在一些实施方案中，可以整合稀释步骤以实现这一点。

图1A中示出了本发明构思的方法的示例。如图所示，将沉淀剂(此处为有机盐)和脂质/脂蛋白吸附固体(此处为二氧化硅)添加到血液制品中。如上所述，这种添加可以是按顺序的或同时的。所得上清液包括IgG并且具有含量减少的污垢、非IgG蛋白以及脂质/脂蛋白，继续进行正向选择IgG的下游层析步骤(例如，利用IgG结合介质的层析步骤，例如蛋白质A层析介质或蛋白质G层析介质)，其中IgG与层析介质结合并随后洗脱。在这种实施方案中，非IgG蛋白可任选地从层析柱的流穿中回收。在优选实施方案中，沉淀剂的浓度选择为使其不干扰IgG与层析介质的结合，从而允许在去除固体后直接施用上清液。或者，可以选择沉淀剂的浓度，使IgG在简单稀释上清液部分后与层析介质结合。由于层析介质用于在柱体积内浓缩IgG，这不会对纯化的IgG产物的浓度产生不利影响。由这种方法产生的沉淀包括二氧化硅以及非IgG蛋白。这种非IgG蛋白可以通过悬浮和溶解沉淀、除去固体二氧化硅部分并进一步处理溶解的沉淀来回收。

图1B中示出了替代实施方案。如图所示，将沉淀剂(此处为有机盐)和脂质/脂蛋白吸附固体(此处为二氧化硅)添加到血液制品中。如上所述，这种添加可以是按顺序的或同时的。所得上清液包括IgG，并且具有含量减少的污垢、非IgG蛋白以及脂质/脂蛋白，继续进行对IgG进行反向选择的下游层析步骤(例如，使用不结合IgG但结合污染非IgG组分的层析介质的层析步骤)，其中在流穿液(即未结合级分)中发现IgG。非IgG蛋白可任选地通过洗脱柱(例如使用低pH和/或高盐含量缓冲液)并收集洗脱的级分而从层析介质中回收。这也可以用于再生层析介质。在优选实施方案中，沉淀剂的浓度选择为使其不干扰所施加的上清液的非IgG组分与层析介质的结合，从而允许在去除固体后直接施加上清液。或者，可以选择沉淀剂的浓度，使上清液的非IgG组分在简单稀释上清液部分后与层析介质结合。由这种方法产生的沉淀包括二氧化硅以及非IgG蛋白。这种非IgG蛋白可以通过悬浮和溶解沉淀、除去固体二氧化硅部分并进一步处理溶解的沉淀来回收。

本发明构思的另一种方法如图2A所示。如图所示，将沉淀剂(此处为有机盐)和脂质/脂蛋白吸附固体(此处为二氧化硅)添加到血液制品中。如上所述，这种添加可以是连续的或同时的，并产生上清液和沉淀(包括吸附性固体和非IgG蛋白)。所得上清液包括IgG，并且具有含量减少的污染、非IgG蛋白以及脂质/脂蛋白。该初始上清液继续进行第二沉淀步骤，该步骤通过应用额外的沉淀剂进行。该额外或第二沉淀剂可以与初始沉淀步骤中使用的沉淀剂相同或不同。如图所示，这可以产生第二上清液和第二沉淀(包括其他非IgG蛋白)。该第二上清液随后进行正向选择层析步骤，该步骤中IgG与层析介质(例如蛋白A或蛋白G介质)结合并随后洗脱。非IgG蛋白可以从层析介质柱的流动中回收。类似地，可以从上游沉淀步骤中产生的沉淀中回收非IgG蛋白。在优选实施方案中，沉淀剂的浓度选择为使其不干扰IgG与层析介质的结合，从而允许在除去固体后直接施用第二上清液。或者，可以选择沉淀剂的浓度，使IgG在简单稀释第二上清液后与层析介质结合。由于层析介质用于将IgG浓缩在层析介质的体积内，这不会对纯化的IgG产物的浓度产生不利影响。

如上所述，由这种方法的第一沉淀步骤产生的第一沉淀包括二氧化硅以及非IgG蛋白。这种非IgG蛋白可以通过悬浮和溶解沉淀、除去固体二氧化硅部分并进一步处理溶解的沉淀来回收。类似地，从第二沉淀步骤获得的第二沉淀可以重悬并溶解，从溶解的第二沉淀中分离出额外的非IgG蛋白。

可选地，可选择图2A所示第二沉淀步骤中使用的额外沉淀剂的量以从第一上清液中沉淀IgG。在这个实施方案中，收集、重悬和溶解第二沉淀。在除去固体二氧化硅后，溶解的第二沉淀可移动至下游IgG特异性亲和层析柱。在这样的实施方案中，可以从第二上清液和/或从从亲和柱获得的流穿级分回收额外的非IgG蛋白。

图2B示出了本发明构思的方法的替代实施方案。如图所示，将沉淀剂(此处为有机盐)和脂质/脂蛋白吸附固体(此处为二氧化硅)添加到血液制品中。如上所述，这种添加可以是连续的或同时的，并产生上清液和沉淀(包括吸附性固体和非IgG蛋白)。所得上清液包括IgG，并且具有含量减少的污垢、非IgG蛋白以及脂质/脂蛋白。该初始上清液继续进行第二沉淀步骤，该步骤通过应用额外的沉淀剂进行。该额外或第二沉淀剂可以与初始沉淀步骤中使用的沉淀剂相同或不同。如图所示，这可以产生第二上清液和第二沉淀(包括其他非IgG蛋白)。该第二上清液随后进行反向选择层析步骤，该步骤中非IgG组分结合到层析介质上。非IgG蛋白可通过将其作为洗脱级分从层析介质中洗脱而回收，这也可用于再生层析介质。类似地，可以从上游沉淀步骤中产生的沉淀中回收非IgG蛋白。在优选实施方案中，沉淀剂的浓度选择为使其不干扰非IgG污染物与层析介质的结合，从而允许在去除固体后直接施用第二上清液。或者，可以选择沉淀剂的浓度，以允许非IgG污染物在第二上清液的简单稀释后与层析介质结合。

如上所述，由这种方法的第一沉淀步骤产生的第一沉淀包括二氧化硅以及非IgG蛋白。这种非IgG蛋白可以通过悬浮和溶解沉淀、除去固体二氧化硅部分并进一步处理溶解的沉淀来回收。类似地，从第二沉淀步骤获得的第二沉淀可以重悬并溶解，从溶解的第二沉淀中分离出额外的非IgG蛋白。

或者，可选择图2B所示第二沉淀步骤中使用的额外沉淀剂的量以从第一上清液中沉淀IgG。在这种实施方案中，收集、重悬和溶解第二沉淀。在除去固体二氧化硅之后，该溶解的第二沉淀可进行下游层析步骤，利用结合非IgG污染物并允许IgG以流穿级分通过的层析介质。在这种实施方案中，可以从第二上清液和/或通过从层析介质洗脱来回收额外的非IgG蛋白。

本发明构思的另一种方法如图3A以及图3B和图3C(它们各自独立地为图3A的续图)所示。如图3A所示，在这种方法中，通过将沉淀剂(在这种情况下为有机盐)施用于血液制品以产生第一沉淀和第一上清液来执行初始沉淀步骤。如图所示，选择沉淀剂的初始浓度以将IgG保留在第一上清液中。所得第一沉淀可进一步处理以回收非IgG蛋白。将额外的沉淀剂和脂质/脂蛋白吸附固体(在这种情况下为二氧化硅)施加到第一上清液以产生第二上清液和第二沉淀。该附加沉淀剂可以与初始沉淀步骤中使用的第一沉淀剂相同或不同。可以选择额外沉淀剂的量以从第二上清液沉淀IgG。在这种实施方案中，第二沉淀包括IgG和脂质/脂蛋白吸附固体。可以从第二上清液中回收额外的非IgG蛋白。

图3B是图3A的续图。如图3B所示，该第二沉淀可重悬并溶解以产生包含IgG的第三上清液和包含脂质/脂蛋白吸附固体(其不可溶)的第三沉淀。第三上清液可使用结合IgG的层析介质移动至下游正向选择层析步骤，产生包含非IgG组分的流穿级分。这种非IgG组分可以从该流穿级分中回收。从通过向层析介质中加入洗脱缓冲液(例如低pH缓冲液)而产生的洗脱级分中回收IgG。

或者，可以选择沉淀剂浓度，使IgG保留在第二上清液中。在这些实施方案中，第二上清液可利用IgG结合层析介质转移至下游正向选择层析步骤，使得非IgG组分作为流穿级分通过层析介质。这样的非IgG组分随后可以从该流穿级分中回收。IgG可以在通过将洗脱缓冲液(例如低pH缓冲液)应用于层析介质而产生的洗脱级分中回收。如上所述，在此类实施方案中，可选择第二上清液中沉淀剂的浓度，使其支持有效的正向选择层析步骤，或使第二上清的简单稀释可调节沉淀剂浓度，以提供有效的正向选择性层析，在这些实施方案中，可从第二沉淀中回收额外的非IgG蛋白(在重悬、溶解和除去脂质/脂蛋白吸附固体之后)。

图3C示出了从图3A继续的替代路径。如图3C所示，该第二沉淀可重悬并溶解以产生包含IgG的第三上清液和包含脂质/脂蛋白吸附固体(其不可溶)的第三沉淀。第三上清液可使用结合非IgG组分的层析介质移动至下游阴性选择层析步骤，产生包含IgG的流穿级分。这种非IgG组分可以通过洗脱从层析介质中回收，这也可以用于再生层析介质。

或者，可以选择沉淀剂浓度，使IgG保留在第二上清液中。在这些实施方案中，第二上清液可利用结合非IgG组分的层析介质转移至下游反向选择层析步骤，使得IgG作为流穿级分通过层析介质。非IgG组分随后可通过洗脱层析介质，这也可用于再生层析介质。如上所述，在此类实施方案中，可选择第二上清液中沉淀剂的浓度，使其支持有效的反向选择层析步骤，或使第二上清的简单稀释可调节沉淀剂浓度，以提供有效的反向选择性层析，在这些实施方案中，可从第二沉淀中回收额外的非IgG蛋白(在重悬、溶解和除去脂质/脂蛋白吸附固体之后)。

应当理解，虽然上文引用了免疫球蛋白G的分离，但本发明构思的方法可应用于血液制品中发现的其他蛋白质。这些目标蛋白包括但不限于白蛋白、α-1抗蛋白酶抑制剂、纤维蛋白原、凝血因子和其他具有治疗意义的血液蛋白质。

在一些实施方案中，本发明概念的方法可应用于其他富含蛋白质的溶液(即，蛋白质含量大于0.1％、0.3％、1％、3％、10％或更多)。此类富含蛋白质的溶液包括细胞介质(例如细菌介质、杂交瘤介质等)、病毒和/或细胞裂解物(例如细菌裂解物、真核细胞裂解物)、蛋制品(例如，含有IgY的蛋清材料)、来自血清或血浆纯化过程的过程中间体(例如，Cohn级分、层析柱流出物等)、无细胞合成产物和化学合成产物。

如上所述，本发明构思的实施方案可包括固体分离步骤。合适的固体分离方法包括沉降、倾析、过滤和离心。在固体包括沉淀蛋白和脂质/脂蛋白吸附固体两者的实施方案中，如果沉淀蛋白和脂/脂蛋白吸收固体之间存在显著的密度和/或流体动力学差异。例如，气相二氧化硅是一种低密度材料，可用于吸附脂质，并可根据密度和/或流体动力学行为与相对致密的蛋白质沉淀分离。这种离心过程可产生上清液流、沉淀蛋白流和脂质/脂蛋白吸附固体流。应当理解，使用这种离心分离方法可以允许以连续或至少部分连续的方式执行上述分离方法。

如上所述，固体也可以通过过滤从处理的中间体中去除。合适的过滤器包括膜过滤器、纤维或颗粒深度过滤器和多孔过滤器。应当理解，在层析柱中用作玻璃料的多孔材料可以在本发明构思的方法中用作过滤器。例如，空的或缓冲液填充的层析柱可以直接放置在处理中使用的亲和性或非亲和性分离柱的上游，使得空的或填充缓冲液的层析柱的介质保留玻璃料可以在进入亲和性介质或非亲和力介质之前捕获固体。这种布置如图4所示。类似地，用于保持亲和性或非亲和性介质的柱可以选择为尺寸过大，并另外设置有紧邻亲和性和非亲和介质输入部分上方的上部玻璃料，以在柱内留下开放的顶部空间。固体可通过保留在上部玻璃料上而积聚在顶部空间中，并通过颠倒柱和/或颠倒缓冲液流动方向而去除。

对于本领域技术人员来说显而易见的是，除了已经描述的那些之外都是可能的。因此，本发明的主题不受限制，除非符合所附权利要求的精神。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语都应以与上下文一致的最广泛方式进行解释。特别是，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”应被解释为以非排他性方式指代元素、组件或步骤，表示引用的元素、组件和步骤可能存在或使用，或与未明确引用的其他元素、组件或者步骤相结合。如果说明书权利要求涉及选自A、B、C…和N的至少一种元素，则文本应解释为只需要该组中的一个元素，而不是A加N或B加N等。

Claims (47)

1.一种从血液制品中分离目标蛋白的方法，包括：

使包含目标蛋白的血液制品与脂质或脂蛋白吸附颗粒接触，同时将血液制品与一定浓度的有机盐混合以产生第一沉淀和第一上清液；

将所述第一上清液施用于层析介质；以及

从所述层析介质中获得包含所述目标蛋白的流出物，其中所述有机盐的浓度足以从所述血液制品中沉淀第一非目标蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中所述有机盐是柠檬酸盐或乙酸盐。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述浓度为以重量计5％至20％。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒是气相二氧化硅。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀包括所述脂质或脂蛋白吸附颗粒和所述第一非目标蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，包括重新悬浮所述第一沉淀以产生包含所述第一非目标蛋白的第二溶液，并将所述第二溶液与所述脂质或脂蛋白吸附颗粒分离。

7.根据权利要求6的方法，包括从第二溶液中回收第一非目标蛋白。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒基本上与所述有机盐同时添加到所述血液制品中。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在添加脂质或脂蛋白吸附颗粒之前，将有机盐添加到血液制品中。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述层析介质结合所述目标蛋白，包括从包含所述目标蛋白的层析介质收集洗脱液。

11.根据权利要求10所述的方法，包括从所述层析介质中收集流穿级分，并任选地从所述流穿级分中分离第二非目标蛋白。

12.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述层析介质不结合所述目标蛋白，包括从所述层析中收集包含所述目标蛋白的流穿级分。

13.根据权利要求12所述的方法，包括洗脱所述层析介质以产生洗脱的级分，并任选地从洗脱的组分中分离第二非目标蛋白。

14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述分离柱包括层析介质，所述层析介质选自亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和尺寸排阻介质。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是免疫球蛋白G(IgG)。

16.一种从血液制品中分离目标蛋白的方法，包括：

使包含目标蛋白的血液制品与脂质或脂蛋白吸附颗粒接触，同时将血液制品与第一浓度的有机盐混合以产生第一沉淀和第一上清液；向第一上清液中添加额外量的有机盐以提供第二浓度的有机盐，从而产生第二沉淀和第二上清液；

重悬和溶解第二沉淀以产生再溶解的第二沉淀；

将再溶解的第二沉淀施用于层析介质；以及

从所述层析介质中收集包含所述目标蛋白的流出物，其中所述有机盐的第一浓度足以从所述血液制品中沉淀第一非目标蛋白。

17.根据权利要求16的方法，其中所述有机盐是柠檬酸盐或乙酸盐。

18.根据权利要求16或17的方法，其中所述第一浓度为以重量计5％至15％。

19.根据权利要求16至18任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒是气相二氧化硅。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀包括所述脂质或脂蛋白吸附颗粒和所述非目标蛋白的蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，包括重新悬浮所述第一沉淀以产生包含所述第一非目标蛋白的第二溶液，并将所述第二溶液与所述脂质或脂蛋白吸附颗粒分离。

22.根据权利要求21所述的方法，包括从所述第二溶液中回收所述第一非目标蛋白。

23.根据权利要求16至22任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒基本上与所述有机盐同时添加到所述血液制品中。

24.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中在添加脂质或脂蛋白吸附颗粒之前，将有机盐添加到血液制品中。

25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中所述层析介质结合所述目标蛋白，并且其中所述流出物是来自包含所述目标蛋白的层析介质的洗脱液。

26.根据权利要求25所述的方法，包括从所述层析介质中收集流穿级分，并任选地从所述流穿级分中分离第二非目标蛋白。

27.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中所述层析介质不结合所述目标蛋白，并且其中所述流出物是来自所述层析介质的包含所述目标蛋白的流穿级分。

28.根据权利要求27所述的方法，包括洗脱所述层析介质以产生洗脱的级分，并任选地从洗脱的组分中分离第二非目标蛋白。

29.根据权利要求16至28任一项所述的方法，包括从第二上清液中分离第三非目标蛋白。

30.根据权利要求16至29任一项所述的方法，其中所述分离柱包括层析介质，所述层析介质选自亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和尺寸排阻介质。

31.根据权利要求16至30中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是IgG。

32.一种从血液制品中分离目标蛋白的方法，包括：

使包含目标蛋白的血液制品与第一浓度的有机盐接触以产生第一沉淀和第一上清液；将脂质或脂蛋白吸附颗粒和额外量的有机盐添加到第一上清液中，以提供第二浓度的有机盐，从而产生第二沉淀和第二上清液，其中第二沉淀包括目标蛋白和脂质或脂素吸附颗粒；

重悬和溶解第二沉淀，并产生再溶解的第二沉淀和包含脂质或脂蛋白吸附颗粒的残余沉淀；

将再溶解的第二沉淀施加到分离柱；以及

从所述分离柱收集包含所述目标蛋白的流出物，其中所述有机盐的第一浓度足以从所述血液制品中沉淀所述目标蛋白。

33.根据权利要求32的方法，其中所述有机盐是柠檬酸盐或乙酸盐。

34.根据权利要求32或33的方法，其中所述第一浓度为以重量计5％至15％。

35.根据权利要求32至34任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒是气相二氧化硅。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述第一沉淀包含第一非目标蛋白。

37.根据权利要求36所述的方法，包括重新悬浮所述第一沉淀以产生包含所述第一非目标蛋白的第二溶液。

38.根据权利要求37的方法，包括从第二溶液中回收第一非目标蛋白。

39.根据权利要求32至38任一项所述的方法，其中所述脂质或脂蛋白吸附颗粒基本上与所述有机盐同时添加到所述第一上清液中。

40.根据权利要求32至38任一项所述的方法，其中在添加脂质或脂蛋白吸附颗粒之前将有机盐添加到第一上清液中。

41.根据权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述层析介质结合所述目标蛋白，并且其中所述流出物是来自包含所述目标蛋白的层析介质的洗脱液。

42.根据权利要求41所述的方法，包括从所述层析介质中收集流穿级分，并任选地从所述流穿级分中分离第二非目标蛋白。

43.根据权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述层析介质不结合所述目标蛋白，并且其中所述流出物是来自包含所述目标蛋白的层析介质的流穿级分。

44.根据权利要求43所述的方法，包括洗脱所述层析介质以产生洗脱的级分，并任选地从洗脱的组分中分离第二非目标蛋白。

45.根据权利要求32至44任一项所述的方法，包括从第二上清液中分离第三非目标蛋白。

46.根据权利要求32至45任一项所述的方法，其中所述分离柱包括层析介质，所述层析介质选自亲和介质、阴离子交换介质、阳离子交换介质、疏水相互作用介质、染料亲和介质、混合模式介质和尺寸排阻介质。

47.根据权利要求32至46任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是IgG。