JPS5832591B2 - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウロキナーゼの新規な精製法に関する。

知られているように、ウロキナーゼは動物の尿中に、ま
た同様に人間の尿中にも少量存在する酵素である。

ウロキナーゼは活性物であり、プラスミンをプラスミノ
ーゲンに変換するのに用いられる。

この酵素もまた繊維素凝塊を溶解させることができる。

このように調剤医薬において、ウロキナーゼ調合剤は例
えばトロンボ塞栓の処置に大切なものである。

人間の尿からウロキナーゼを分離し、その後極めて有効
な生成物に精製濃縮する多くの方法が知られている。

これらの方法は尿を吸着剤と接触させ、次いで吸着物質
を溶離させることから成る。

最終的に極めて濃縮された極めて純度の高いウロキナー
ゼ溶液が得られるように、種々の吸着−溶離その池の分
離工程によって抽出が行われる。

知られた吸着剤は、例えば炭酸カルシウム、硫酸バリウ
ム、酸化アルミニウム、りん酸カルシウム、水酸化亜鉛
、活性炭、ベントナイト及びカオリンの如き水素化アル
ミニウムシリケート、イオン交換シリケート、分子篩及
びその池の多くの有機及び無機物質類である。

スイス特許出願１０５１２１７４には、このタイプの新
規な吸着剤、即ち陽イオン交換アクリル系樹脂が記載さ
れている。

この発明は特にドイツ特許第２４２８２４８号に通ずる
。

その間に、ウロキナーゼの濃縮及び精製についての各種
の親和アフィニティークロマトグラフ法が提案された。

これらの方法の殆んどは、例えば次のような表面固定型
のもの、即ちセファロースＲ上にε−アミノカプロン酸
及びｐ−アミノベンツアミジン、セファローズ上にウロ
キナーゼの抗体、ポリアクリルアミルジン上にアルギニ
ン、セファローズ上にアグマチンーε−アミノカプロン
酸、アガローズ上にトリプシン抑制剤、アかロース上に
リジンまたはアルギニン、セファロース上にトリフシン
抑制剤、セファロース上に人の胎盤のウロキナーゼ抑制
剤及び類似の組合せの如きを有する固体マトリックスを
親和吸着用に用いている。

固体マトリックスの一友面にアプロチニン（ａｐｒｏｔ
ｉｈｉｎ ）を固定すること及び池の物質を親和−クロ
マトグラフ的に分離・濃縮するためにこのように調製さ
れたレジンを用いることも知られているが、ウロキナー
ゼについては知られていない。

例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、
Ｖｏｌ。５５、第１３２３頁（１９７３）には、かかる
レジン上でトリプシンを濃縮する親和−クロマトグラフ
法が記載されている。

同様な研究が該ＪｏｕｒｎａｌのＶｏｌ、１５．ｐ４（
１９７６）に記載されている。

Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、 ３５７ ｐ １
１５３ ｆ ｆ（１９７６）は、人のすい臓のエラスタ
ーゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）の精製及び特性付与方法を記
載している。

最後に、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎ
ｉｃａｌＣｈｅ／Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｂｉｏｏｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ。

Ｖｏｌ、１５．ｐ４７９ ｆｆ （１９７７）に研
究が紹介され、そこには人のカリクレイン（Ｋａｌ １
ｉｋｒｅｉｎ）の分離方法が記載されている。

先行技術は、一方では特にアプロチニン以外の色々な表
面結合物質によるウロキナーゼの分離について、又他方
では特にウロキナーゼ以外の全く別異の化合物を濃縮及
び精製するために、固体マトリックス上へのアプロチニ
ンの固定について記載しているが、固体表面に固定され
たアプロチニン上でウロキナーゼを分離・濃縮すると浸
れた且つ工業的に極めて好ましい結果が得られることは
まさに驚くべき発見であった。

本発明の実際を記載する前に、ウロキナーゼを分離する
知られた方法では、平均分子量５４，０００の高分子型
及び分子量３３，０００の低分子型の２つ型を組合せて
一般に行なわれていることを指摘しておこう。

後記する本発明の方法によれば、分子量が約５４，００
０の平均状態に変化したウロキナーゼのみが得られるこ
とが見出されたことはまさに驚きであった。

これまで生成物の質的改善を説明することはできなかっ
たし、現在、低平均分子量のウロキナーゼが高分子量物
の分解生成物であるかどうかについて確認されつつあっ
た。

従って、本発明は周知方法で予備精製され濃縮された粗
ウロキナーゼから出発して、高い濃度及び活性を有する
ウロキナーゼに精製する方法に関し、この粗ウロキナー
ゼ溶液をｐＨン６の媒質で、高い比表面積を有しその表
面にアプロチニンが共役化学結合によって固定された多
孔性固体マトリックスと接触させ、該キャリヤー媒質を
分離し、次いで吸着したウロキナーゼをｐＨ＜４．５の
溶離剤によって溶離させる方法であり、次いでこれは知
られた調製法により池の薬剤製品を製造することができ
る。

上記方法の特別な且つ産業上重要な具体例に従えば、粗
ウロキナーゼ溶液は高い比表面積を有し、その表面にア
プロチニンが共役化学結合により固定された多孔性固体
マトリックスを充填したカラム中で、ｐＨ）６の媒質条
件で親和−クロマトグラフ的（ａｆｆｉｎｉｔｙ −ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ）に分離され、
次いで、この方法で吸着されたウロキナーゼはｐＨζ４
，５の溶離剤で溶離される。

ウロキナーゼを特定吸着する固定アプロチニンの作用は
、通常の濃度の溶液ではアプロチニンがウロキナーゼの
機能を抑制しないので特にすばらしいものである。

更に、アプロチニンで表面活性化された樹脂は、現在一
般的なりロマトグラフイ力ラムより長期で一層一定した
操業寿命を有する。

用いられる粗ウロキナーゼ溶液は、溶液１就中２，００
０〜１０，０００ Ｉ、Ｕ、のウロキナーゼ、好ましく
は溶液１ｒＩＬｌ中に３，０００〜５，０００１．Ｕ。

ウロキナーゼを有し、存在するたん白質１■中に２００
〜２，０００１．Ｕ、有利には３００〜１，０００Ｉ、
Ｕ、のウロキナーゼ純度を有するものである。

使用される多孔性固体マｌ−ＩＪラックス、例えばポリ
サッカライド類、セルロース類、ＰｈａｒｍａｃｉａＡ
Ｂの５ｅｐｈａｒｏｓｅ” （スウェーデン）の如き
アガロース類、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢの５ｅｐｈａ
ｄｅｘ”（スウェーデン）の如きデキストラン類に基く
もの或はＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢの５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ ＦＬ（スウェーデン）やＬＫＢのＵｌｔｒｏｇｅｌ
”の如きアカロースをもったポリアクリルアミド類にコ
ポリマー付加生成物を形成させたものに基くような各種
レジン類の形式のものであり得る。

また他の固体マトリックスを用い得ることも明かである
。

主として必要なことは直接または促進剤やスペーサーの
結合を介してアプロチニンと共有結合を形成する能力の
あることである。

後者の例は、しばしば国際的文献にＥＡＣＡ（６−アミ
ノヘキサノイツクアシド）の表現で照会されるε−アミ
ノカプロン酸、ジビニルスルホン、各種ビスオキシラン
類その池の化合物類である。

親和クロマトグラフの場合にしばしば行われるように、
固体マトリックスは、例えばＢｒＣＮまたは他の知られ
た活性化剤により予め活性化される。

本発明の方法は生の尿を扱うのに適さないことを今一度
強調したい。

それはこの液中のウロキナーゼ濃度が低すぎるからであ
る。

上記の粗ウロキナーゼ液は、例えばＮａｃｌまたはＫｃ
ｌ の如き各種塩類を添加して全塩濃度を０．５〜１
ｍ（モル）にすることができる。

実際の吸着操作に先だって、特に吸着剤がカラム中にあ
るとき、ｐＨ６〜９及び全塩濃度０．５〜１７ｙＬの液
体媒質で吸着剤を調整することもできる。

緩衝物質として池の緩衝物質と同様に公知のりん、酸塩
バッファ類またはトリスバッファ類を用いることができ
る。

Ｎ ａ ｃ ｌまたはＫｃｌその池の好適な化合物類を
調整用塩として使用できる。

アプロチニンを有するマトリックス上へのウロキナーゼ
の吸着に続いて、ウロキナーゼを実際に溶離させる前に
固体マ） ＩＪラックス中間洗浄することができる。

この目的のために０．５〜ＩｍのＮ ａ ｃ ｌ溶液の
液剤が用いられる。

この中間洗浄は固体マトリックスから望ましくないたん
白質を除去するのに著しく貢献する。

液剤洗浄は、流出媒質が２８０ ｎｍの波長で光学的に
不活性となるまで、即ち実質的にたん白質の存在を示さ
なくなるまで行われる。

溶離剤は０．５〜１ｒｒＬのＮａｃ ｌまたはＫｃｌ
溶液でよい。

というのは、本発明によれば溶離はｐＨく４５で行われ
、例えば上記塩類及び濃度の溶液をｐＨ２〜４．５で用
いることができる。

かかる溶液は例えば酢酸または塩酸その池の化合物を加
えて調整される。

また例えばリジンまたはアルギニン等のアミノ酸の如き
それ自体周知の溶離助剤を溶離液に加え本発明の方法に
より高濃度且つ高い純度レベルのウロキナーゼ溶液が得
られる。

例えば本発明の方法はウロキナーゼの濃度に関して及び
／または純度に関して、出発物質と比較してファクター
で１００の改善をすることができる。

本発明の方法により、存在するたん白質１ｒｎ９中５０
，０００１．Ｕ。

以上の純度レベルのウロキナーゼを含有するウロキナー
ゼ溶液に導くことができる。

これらの利点に加えて、本発明によって得られた高純度
ウロキナーゼは約５０，０００の均一分子量を有するこ
ともまた上述の事実に付加言及されよう。

次に掲げた表はウロキナーゼの調製で得られた量及び濃
度値を説明している。

次に本発明の方法を実施例により例証説明する。

実施例 １ ウロキナーゼ１２１０６１．Ｕ、を含有する粗ウロキナ
ーゼ溶液５００ｍ１（即ち溶液Ｉ ｒｎｌ中２４．００
０ Ｉ、Ｕ、のウロキナーゼ濃度を有し、たん白質１■
あたりウロキナーゼ６３０■、Ｕ、の純度を有する）を
容量１ｔのセファロース−アプロチニン・カラムで沢過
した。

カラムは予め０．１ｍのトリスバッファーでｐＨ８に調
整された。

調整液はまた０、５ ｍのＮａｃｌを含有する。

吸着後、同カラムを同じ調整液で、流出洗液が２８０ｎ
ｍでの光学密度０．１００以下となる壕で洗った。

次いでカラムを０．５ｍのＮａｃｌｌで洗った。

吸着したウロキナーゼは、最後にＨｏｌでｐＨ２，５に
調整した０、 ５ ｍ１Ｎａ ｃ ｌ溶液で溶離させた
。

ウロキナーゼの総量８，１６０，０００１．Ｕ、を含有
する１、５βの溶離液が得られた（収率６８φ）、この
方法で得られた溶液の純度は存在するたん白質ＩＴＩＴ
９中ウロキナーゼ゛５３，０００１．Ｕ、であった。

実施例 ２ ウロキナーゼ５，２００１．Ｕ、 １ ｒｎｌの溶液濃
度及びたん白質１１ｎ９中３７０ Ｉ、Ｕ、のウロキナ
ーゼ純度を有する全ウロキナーゼ２２，２６０，０００
Ｉ、Ｕ。

を含有する粗ウロキナーゼ溶液４．２１をセファロース
−ＥＡＣＡ−アプロチニンのカラムに通した。

カラムの容量は１．５ｔであった。

カラムは予め０．０２ｍのりん酸塩バッファーでｐＨ７
，２に調整された。

液はまた１、０ｍのＮａｃ １を含有した。次に吸着し
たレジンをバッファー溶液３Ｌで洗い、次いでＬＯｒｎ
ｌのＮａｃｌ溶液２ｔで洗った。

それから吸着したウロキナーゼ酢酸でｐＨ３，９に調整
されたＮａｃｌ １ ｍ溶液によって溶離させた。

全ウロキナーゼ１５，９１５，０００１．Ｕ、を含有す
る２ｔのウロキナーゼ溶液が得られた。

これは収率７１．５％を意味する。

得られた溶液の純度は存在するたん白質１ｍ９中ウロキ
ナーゼ６１．６００１、Ｕ、であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 周知方法で予備精製され濃縮された粗ウロキナーゼ
   溶液をＩ）Ｈ＞６の媒質条件で、高い比表面積を有し且
   つその表面にアプロチニンが共有化学結合により固定さ
   れた多孔質固体マトリックスと接触させ、該キャリア媒
   質を分離し、次いで吸着したウロキナーゼをｐＨζ４．
   ５の溶離液によって溶離させることを特徴とする知られ
   た方法により池の調剤製品に調製し得る高い濃度及び活
   性を有するウロキナーゼの精製法。 ２ 粗ウロキナーゼ溶液をｐｎ≧６の媒質条件で、高い
   比表面積を有しその表面にアプロチニンが共有化学結合
   によって固定された多孔質固体マトリックスを充填した
   カラムに通してアフィニティークロマトグラフ的分離を
   行ない、次いでこの工程で吸着されたウロキナーゼをｐ
   Ｈ＜：４．５の溶離液によって溶離される特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 用いる粗ウロキナーゼ溶液が、溶液１ｍｌ中２．０
   ００〜１０，０００１．Ｕ、好ましくは３，０００〜５
   ，０００ Ｉ、Ｕ、のウロキナーゼ濃度を有し、且つ存
   在するたん白質ＩＴｎｇ中に２００〜２，０００■、Ｕ
   、有利には３００〜１，０００ Ｉ、Ｕ、のウロキナー
   ゼの純度を有する特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   の方法。 ４ 多孔質固体マトリックスが、ポリサッカライド類、
   セ／Ｌ１０−ス、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ（ス
   ウェーデン）の５ｅｐｈａｒｏｓｅＲの如きアガローズ
   、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ（スウェーデン）の
   ５ｅｐｈａｄｅｘＲの如きデキストラン類に基くレジま
   たは例えばＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ （スウェーデン
   ）のＳ ｅｐｈａｃ ｒｙ ｌ Ｒ或はＬＫＢのＵｌ
   ｔ ｒｏｇｅ ｌ ”の如きアガロースとポリアクリル
   アミド類との付加共重合物に基くレジンまたは同様な物
   質類に基くレジンである特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の方法。 ５ アプロチニンが固体マｔ−ＩＪラックス共有結合に
   より、直接または結合授与剤またはスペーサーを介して
   結合し、後者の例がε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ：
   ６−アミノヘキサノイツクアシド）ジビニルスルホン
   、ビス−オキシラン類その他の化合物である特許請求の
   範囲第１，２及び４項のいずれかに記載の方法。 ６ 固体マトリックスを予め、例えばＢｒＣＮまたは池
   の知られた活性化剤により活性化する特許請求の範囲第
   １．２．４及び５項のいずれかに記載の方法。 ７ アフィニティークロマトグラフ分離法においてウロ
   キナーゼの吸着を行う前に、カラム中の吸着剤を、ｐＨ
   ６〜９及び全塩濃度０．５〜１ｍの液体媒質により調整
   することを特徴とし、緩衝物質は、例えばりん酸塩混合
   物またはトリスバッファ類等であり、塩が例えばＮａｃ
   ｌ、Ｋｃｌ等である特許請求の範囲第４乃至６項のいず
   れかに記載の方法。 ８ ウロキナーゼの濃度及び純度が低すぎるので生の尿
   をを処理するために使用できない特許請求の範囲第１又
   は２項記載の方法。 ９ 粗ウロキナーゼ溶液が、例えばＮａｃｌ、Ｋｃｌま
   たは池の塩類の添加により０．５〜１扉の全塩濃度に調
   整される特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。 １０ アプロチニンによって表面活性化された固体マト
   リックスにウロキナーゼを吸着させたのち、溶離を行う
   前に分離カラムから望ましくないたん白質を除去するた
   めに０．５〜１ｍのＮａｃｌ溶液によりカラムを中間洗
   浄し、該中間洗浄を洗浄液が光学的に清純になるまで続
   ける特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。 １１ 酢酸、塩酸その他の化合物によりｐＨ調整され
   たｐＨ２〜４．５及び例えばＮａｃｌ 、Ｋｃｌ等の塩
   の濃度０．５〜１ｍの溶離液で溶離を行なう特許請求の
   範囲１又は２項記載の方法。 １２ 例えばリジン、アルギニン等のアミノ酸類のよう
   な溶離助剤を溶離液に加える特許請求の範囲第１１項記
   載の方法。