NL7905045A - Werkwijze voor de bereiding van zuivere urokinase. - Google Patents

Description

v ir.o. 27.928

Alpha Patent Ltd., te TEL-AVIV, Israel Werkwijze voor de bereiding van zuivere urokinase i

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ! voor de bereiding van zuivere urokinase.

Bekend is dat urokinase een enzym is dat in klei-j j ne hoeveelheden in urine van zoogdieren en dus ook in menselijke urine voorkomt. Urokinase is een activator en 5 dient voor de omzetting van plasminogeen in piasmine.

Dit enzym kan weer stolsels van fibrine oplossen. Derhalve zijn farmaceutische urokinase-preparaten in de geneeskunde waardevolle produkten ter behandeling van bijvoorbeeld door trombose veroorzaakte embolien. 10

Voor de isolering van urokinase uit menselijke ' ur^ne en een daarop volgende zuivering en concentrering tot een sterk werkzaam produkt is een aantal werkwijzen bekend, die daarin bestaan dat de urine met een adsorptie-middel in contact wordt gebracht, waarna het adsorbaat 15 wordt geëlueerd. Het extract bevat dan de onzuivere urokinase in een vergrote concentratie. Dit extract wordt vervolgens volgens verschillende adsorptie-eluerings-methoden en andere scheidingsmethoden opgewerkt, zodat tenslotte een sterk geconcentreerde en sterk gezuiverde 20 urokinase-oplossing wordt verkregen.

Bekende adsorptiemiddelen zijn bijvoorbeeld cal-ciumcarbonaat, bariumsulfaat-, aluminiumoxide, calcium-fosfaat, zinkhydroxide, actieve kool, gehydrogeneerde aluminiumsilicaten zoals bentoniet en kaolien, iomen- 25 uitwisselende silicaten, moleculaire zeven alsmede een aantal andere, organische en anorganische stoffen.

In het Duitse octrooischrift 2.428.24-8 is een der-gelijk nieuw adsorptiemiddel beschreven: een kationen-uit- 790 50 45 -I- r ' 2 k wisselaar op basis van een acrylhars.

Intussen zijn verschillende chromatografische methoden onder benutting van affiniteitsverschillen voor de concentrering en de zuivering van urokinase voorgesteld.

Volgens de meesten van deze werkwijzen worden voor de 5 adsorptie onder benutting van affiniteitsverschillen matrices van vaste stoffen gebruikt, die bijvoorbeeld de volgende verbindingen aan de oppervlakte geïmmobiliseerd bevatten: £-aminocapronzuur en p-aminobenzamidine op

Sepharose (merknaam), antilichamen voor urokinase op .10

Sepharose, arginine op polyacrylamideharsen, agmatine-£ -aminocapronzuur op Sepharose, trypsine-inhibitor op agarose, lysine of arginine op agarose, trypsine-inhibitor op Sepharose, urokinase-inhibitor uit menselijke placenta op Sepharose en soortgelijke combinaties. 15

Anderzijds is bekend aprotinine aan de oppervlakte van een matrix van een vaste stof te immobiliseren en de op een dergelijke wijze voorbereide harsen voor de op---- affiniteitsverschillen berustende chromatografische scheiding en concentratie van verschillende verbindingen, niet 20 echter van urokinase, te gebruiken. Bijvoorbeeld is in het tijdschrift Biochimie, 1323 (1973) een op affiniteitsverschillen berustende chromatografische methode voor de concentrering van trypsinen aai. dergelijke harsen beschreven. Een soortgelijke methode is in hetzelfde tijdschrift 25 in deel 15, blz. 4 (1976) beschreven. Voorts is in Journal of Physiological Chemistry, 337·. 1153 ©π. volgende (1976) een werkwijze voor de zuivering en de karakterisering van menselijke pancreaselastase aangegeven. Tenslotte wordt nog gewezen op de publicatie in Journal of Clinical 30

Chemistry/Clinical Biochemistry, 1£, 479 en volgende (1977)j die betrekking heeft op een werkwijze voor de isolering van menselijk callisreïne.

Terwijl volgens de stand van de techniek enerzijds bekend is urokinase door adsorptie, met uitzondering van 35 aptotinine, aan verschillende verbindingen te isoleren en 7905045 5 anderzijds voor de concentrering en zuivering van verschillende verbindingen, met uitzondering van urokinase, matrices van vaste stoffen te gebruiken, waarbij het aprotinine op de oppervlakte van de matrices geïmmobiliseerd aanwezig is, werd verrassenderwijze gevonden dat 5 urokinase met behulp van een poreuze matrix van een vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte, waarop aprotinine door covalente chemische bindingen is geïmmobiliseerd, bijzonder doelmatig kan worden geconcentreerd en bijzonder zuiver kan worden afgescheiden. 10

Het uitstekende resultaat van de werkwijze volgens de uitvinding is zodanig dat de werkwijze economisch van groot belang is.

Te vermelden is dat volgens de bekende werkwijzen urokinase in het algemeen in twee vormen wordt verkregen, 15 namelijk een vorm met een betrekkelijk groot molecuulge-wicht van gemiddeld ongeveer 54.000 en een vorm met een betrekkelijk klein molecuulgewicht van gemiddeld ongeveer 33.000. Yerrassenderwijze blijkt dat volgens de werkwijze van de uitvinding urokinase slechts in een enkele vorm 20 wordt verkregen waarvan het molecuulgewicht om een gemiddelde waarde van ongeveer 54.000 schommelt. De oorzaak van deze verbetering van de produktkwaliteit is nog niet duidelijk. Onderzocht wordt of de urokinase met het kleinere gemiddelde molecuulgewicht een ontledingsprodukt van de 25 urokinase met het grotere molecuulgewicht is.

De werkwijze volgens de uitvinding voor de bereiding van zuivere urokinase in een grote concentratie en met een grote activiteit, uitgaande van een volgens bekende werkwijzen voor-gezuiverde en geconcentreerde ruwe 30 urokinase-oplossing, is gekenmerkt, doordat men de ruwe urokinase-oplossing bij een pH van gelijk aan of groter dan 6 met een poreuze matrix van een vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte waarop aprotinine door covalente chemische bindingen is geïmmobiliseerd in contact 35 brengt, doordat men de als matrix gebruikte, met urokinase 7905045 Γ beladen vaste stof afscheidt en doordat men vervolgens de geadsorbeerde urokinase door middel van een elueringsmid-del bij pH gelijk aan of kleiner dan 4,5 elueert, waarna de bekende werkwijzen voor de bereiding van de verschillende farmaceutische preparaten kunnen worden uitgevoerd. 5

Een speciale uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding die industrieel van groot belang is, is dat de genoemde ruwe urokinase-oplossing in een door middel van een poreuze matrix van een vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte waarop aprotinine door 10 covalente chemische bindingen is geïmmobiliseerd bij een pH gelijk aan of groter dan 6 op grond van affiniteits-verschillen chromatografisch wordt gescheiden en dat vervolgens de geadsorbeerde urokinase door middel van een elueringsmiddel bij pH gelijk aan of kleiner dan 4,5 wordt 15 geëlueerd.

De werking van de geïmmobiliseerde aprotinine bij de specifieke adsorptie van urokinase is vooral des te verrassender, daar aprotinine zoals bekend in opgeloste vorm bij de gebruikelijke concentraties de urokinase-wer- 20 king niet inhibeert.

Daarnaast blijken harsen waarvan de oppervlakte met aprotinine is geactiveerd vergeleken met thans gebruikelijke chrornatografeerkolom/meeen langere en constante gebruikstijd te hebben. 25

De gebruikte ruwe urokinase-oplossing dient een concentratie van 2.000 - 10.000 IE urokinase per ml oplossing, bij voorkeur 5·000 - 5·000 IE, alsmede een zuiverheid van 200 - 2.000 IE urokinase per mg aanwezige pro-teïnea, bij voorkeur 500 - 1.000 IE te hebben. 50

Als poreuze matrix van een vaste stof kunnen verschillende harsen worden gebruikt, bijvoorbeeld harsen op basis van polysacchariden, cellulose, agarose zoals Sepharose (merknaam van de firma Pharmacia AB, Zweden), dextranen zoals bijvoorbeeld Sephadex (merknaam van de 55 firma Pharmacia AB, Zweden), of op basis van copolymere 7905045

V

5 additieprodukten op basis van polyacrylamiden met agarose zoals Sephacryl (merknaam van de firma Pharmacia IB,

Zweden) of Ultrogel (merknaam van de firma 1KB). Vanzelfsprekend kunnen ook andere vaste stoffen als matrices worden gebruikt; daarbij geldt als belangrijkde voorwaarde 5 dat de vaste stof het vermogen heeft met de aprotinine öf direkt óf indirekt via binding veroorzakende brugeenheden covalente bindingen aan te gaan. Dergelijke als brugeenheden geschikte verbindingen of "spacer” zijn bijvoorbeeld £-aminocapronzuur, in de literatuur veelvuldig 10 EAOA (6-aminohexanonzuur) genoemd, divinylsulfon, verschillende bis-oxiranen en andere verbindingen.

De als matrix gebruikte vaste stof kan.zoals bij de chromatografie op basis van affiniteitsverschillen veelvuldig plaats vindt, vooraf worden geactiveerd. Bij- 15 voorbeeld kan de activering door middel van BrCÏÏ of van andere bekende activeringsmiddelen worden uitgevoerd.

Er dient opnieuw erop te worden gewezen dat de werkwijze volgens de uitvinding niet voor de opwerking van ruwe urine geschikt is; de urokinase-concentratie in een 20 dergelijke oplossing is te klein. De zoutconcentratie van de genoemde ruwe urokinase-oplossing kan door toevoegen van verschillende zouten, bijvoorbeeld NaCl of KC1, op een totale zoutconcentratie van 0,5 tot 1 mol worden gebracht . 25

Het adsorptiemiddel, in het bijzonder indien het middel in een kolom is gebracht, kan vóór de eigenlijke adsorptie met een vloeistof met een pH van 6 - 9 en een totale zoutconcentratie van 0,5-1 mol worden geconditioneerd. Als bufferverbindingen kunnen niet alleen de be- 30 kende fosfaatbuffers of tris-buffers worden gebruikt, maar ook andere. Als zouten voor de conditionering kunnen iTaCl of KOI of andere soortgelijke verbindingen worden gebruikt.

Ha het eigenlijke adsorptieproces van de urokinase aan de matrix van de vaste stof met de aprotinine en vóór 35 de eigenlijke eluering van de urokinase kan de beladen 7905045 t 6 matrix aan een tussenspoeling worden onderworpen. Daartoe kan een vloeibaar middel met een 0,5- tot 1 molaire HaCl-oplossing worden gebruikt. Deze tussenspoeling dient vooral ter verwijdering van ongewenste proteïnen uit de matrix. Er kan met het middel worden gespoeld totdat het 5 uittredende middel bij een golflengte van 280 nm optisch inactief is, dat wil zeggen dat nagenoeg geen proteïne-concentratie meer wordt aangetoond.

Als elueringsmiddel kan een 0,5-1 molaire oplossing van ÏTaOl of KOI dienen. Daar de eluering volgens de 10 uitvinding bij een pH gelijk aan of kleiner dan 4,5 dient te worden uitgevoerd kunnen bijvoorbeeld oplossingen van de bovengenoemde zouten in de bovengenoemde concentraties bij een pïï van 2-4,5 worden gebruikt. De pH van de oplossingen . kan bijvoorbeeld door toevoegen van azijn- 15 zuur of HOI, maar ook van andere verbindingen, worden ingesteld.

Aan het elueringsmiddel kunnen ook de op zichzelf bekende hulpmiddelen worden toegevoegd, zoals aminozuren, bijvoorbeeld lysine of arginine of andere. 20

Volgens de werkwijze van de uitvinding worden oplossingen van urokinasen verkregen die zowel grote uro-kinase-concentraties hebben, als een grote zuiverheid.

Het is bijvoorbeeld niet uitgesloten dat volgens de werkwijze van de uitvinding met betrekking tot de concentra- 25 tie van de urokinase en/of met betrekking de zuiverheid daarvan vergeleken met het uitgangsprodukt een verbetering met een factor 100 wordt bereikt. Er kunnen volgens de werkwijze van de uitvinding urokinase-oplossingen worden verkregen die een zuiverheid van meer dan 50.000 IE 30 urokinase per mg aanwezige proteïne hebben. Dergelijke zuiverheden gelden thans in het algemeen als voldoende om het produkt direkt voor klinische doeleinden te gebruiken.

Een ander voordeel is nog dat de volgens de uitvinding in zuivere vorm verkregen urokinase een homogeen molecuulge- 35 wicht van ongeveer 50.000 heeft.

7905045 7

De urokinase-bereiding volgens de uitvinding wordt aan de hand van de in de tabel samengevatte resultaten geïllustreerd· gabel ïïitgangs- ïoegepaste Zuiverhied Opbrengst Volumina materiaal methode [IE uroki- [IE uroki- [liter] nase per^ nase] (being proteïne] trokken op 1 liter uitgangs- _oplossing)_ urine 8.000 10.000 adsorptie urokinase- 300 tot 1.000 8.000 25 oplossing werkwijze volgens de uitvinding zuiver 30.000 tot 5.000 a'fhanke- concentraat 100.000 lijk van.

de werk-wij'ze depyrogenat ie , andere methoden

De werkwij’ze volgens de uitvinding wordt door de volgende voorbeelden geïllustreerd. 5

Voorbeeld I

• 500 ml van een ruwe urokinase-oplossing die g 12.10 IE urokinase bevat, dat wil zeggen met een concentratie van 24.000 IE urokinase per ml oplossing en een zuiverheid van 630 IE urokinase per mg proteïnen, werd 10 door een Sepharose-aprotinine-kolqm met een inhoud van « 1 liter gepercoleerd. De kolcm was te voren met een 0,1 molaire tris-buffer op pH 8 geconditioneerd. De voor het conditioneren gebruikte vloeistof bevatte daarnaast 0,5 mol KaCl. Ba de adsorptie werd de fclom met dezelfde, voor 15 het conditioneren gebruikte vloeistof gespoeld, totdat de uittredende oplossing bij’ 280 nm een optische dichtheid van kleiner dan 0,100 had. Vervolgens werd de kolom met 7905045 8 v* 1 liter 0,5 molaire NaCl-oplossing gespoeld.

De geadsorbeerde urokinase werd tenslotte met een 0,5-molaire NaCl-oplossing die met HC1 op pH 2,5 was ingesteld geëlueerd.

Er werd 1,5 liter eluaat verkregen, dat in totaal 5 8.160.000 IE urokinasen bevatte (opbrengst 68 %). De zuiverheid van de verkregen oplossing was 53*000 IE urokinase per mg aanwezige proteïne*!

Voorbeeld II

4,2 liter van een ruwe urokinase-oplossing, die in 10 totaal 22.260.000 IE urokinase bevatte, dat wil zeggen met een concentratie van 5*200 IE urokinase per ml oplossing en met een zuiverheid van 570 IE urokinase per mg aanwezige proteïne^ werden door een kolom die met Sepharose-EACA-ap-rotinine was gevuld, gepercoleerd. Dek±m . had een 15 volume van 1,5 liter. De kolaawas te voren met een 0,02 molaire fosfaat-buffer big pïï 7,2 geconditioneerd. De . bufferoplossing bevatte daarnaast 1,0 mol NaCl, De beladen hars werd vervolgens met 5 liter van de genoemde bufferoplossing en daarna met 2 liter van een 1,0 molaire 20

NaCl-oplossing gespoeld. De geadsorbeerde urokinase werd vervolgens met een 1,0 molaire NaCl-oplossing die met azijnzuur op pH 5,9 was ingesteld, geëlueerd.

Er werden 2 liter urokinase-oplossing verkregen die in totaal 15*915*000 IE urokinasen bevatte, hetgeen 25 een opbrengst van 7^,5 % was. De zuiverheid vein de verkregen oplossing was 61.500 IE urokinase per mg aanwezige proteïneo.

790 50 45

Claims (11)

1. Werkwijze voor de bereiding van zuivere uro kinase in een grote concentratie en met een grote activiteit, uitgaande van een volgens bekende werkwijzen vooraf gezuiverde en geconcentreerde ruwe urokinase-oplossing, 5 met het kenmerk, dat men de ruwe urokinase-oplossing bij een pH gelijk aan of groter dan 6 met een poreuze matrix van een vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte waarop aprotinine door covalente chemische bindingen is geïmmobiliseerd in contact brengt, · 10 dat men de als matrix gebruikte, met urokinase beladen vaste stof afscheidt en dat men de geadsorbeerde urokinase vervolgens door middel van een elueringsmiddel bij pH gelijk aan of kleiner dan 4,5 elueert, waarna de bekende methoden ter verkrijging van de verschillende farma- 15 ceutische preparaten kunnen worden uitgevoerd.

2, Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de ruwe urokinase-oplossing door middel van een hoeveelheid van een poreuze vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte waarop aprotinine door 20 covalente chemische bindingen is geïmmobiliseerd bij een pH gelijk aan of groter dan 6 op grond van affiniteits-verschillen chromatografisch scheidt en dat men vervolgens de geadsorbeerd? urokinase door middel van een voor het elueren geschikte oplossing bij pH gelijk aan of klei- 25 ner dan 4,5 elueert.

5. Werkwijze volgens conclusies 1 en 2, met het kenmerk, dat men een ruwe urokinase-oplossing gebruikt die een concentratie van 2.000 - 10.000 IE urokinase per ml oplossing, hij voorkeur 3*000 - 5*000 IE 30 urokinase per ml oplossing, en een zuiverheid van 200 - 2.000 IE urokinase per mg aanwezige proteïne^ bij voorkeur 300 - 1.000 IE urokinase per mg aanwezige proteïnen heeft.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3» iet 35 het kenmerk, dat men als vaste stof voor de po- 790 5 0 45 '*· reuze matrix een hars op basis van polysacchariden, cellulose, agarose, bijvoorbeeld Sepharose, dextranen, bijvoorbeeld Sephadex, of op basis van copolymere additieprodutten van polyacrylamiden met agarose, bijvoorbeeld Sepha-cryl, of ïïltrogel of op basis van soortgelijke stoffen 5 gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusies 1 - 4·, m e t het kenmerk, dat men een poreuze matrix van een vaste stof met een soortelijke oppervlakte gebruikt waarop aprotinine door covalente bindingen direkt of via als 10 bindingen geschikte brugeenheden (spacer) aan de matrix van de vaste stof is gebonden, waarbij als spacer bijvoorbeeld £-aminocapronzuur EACA (6-aminohexanonzuur), di-vinylsulfon, bis-oxiranen of andere verbindingen worden gebruikt· 15

6. Werkwijze volgens conclusies 1-5» met het kenmerk, dat men de matrix van de vaste stof vooraf activeert, bijvoorbeeld door middel van BrCN of andere bekende activeringsmiddelen.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-6,met 20 het kenmerk, dat men de werkwijze uitvoert onder toepassing van een voor het chromatograferen geschikte kolom, waarbij men de kolom vóór het eigenlijke adsorp-tieproces van de urokinase voor de op affiniteitsversch.il- len berustende chromatografische scheiding daarvan door 25 middel van een vloeistof bij pH 6 - 9 en bij een totale zoutconcentratie van 0,5 - 1 mol conditioneert, waarbij als bufferstoffen bijvoorbeeld fosfaatmengsels of tris-buffers of andere stoffen en als zouten NaCl, KCl of andere zouten worden gebruikt. 30

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, iet het kenmerk, dat men de ruwe urokinase-oplos-sing op een totale zoutconcentratie van 0,5 - 1 mol instelt, bijvoorbeeld door toevoegen van NaCl, KOI of andere zouten. 35

9. Werkwijze volgens conclusies 1 - 8 , met 790 5 0 45 s het kenmerk, dat men na de eigenlijke adsorptie van de urokinase aan de poreuze matrix, van de vaste stof met een grote soortelijke oppervlakte waarop aprotinine is geïmmobiliseerd en voor het eigenlijke elueringsproces een tussenspoeling van de kolan met een 0,5 — 1 molaire 5 UaCl-oplossing uitvoert ter verwijdering van ongewenste proteïnen uit de voor de scheiding gebruikte kolcm,waarbij' men de tussenspoeling uitvoert totdat het spoelmiddel optisch zuiver is.

10. Werkwij'ze volgens conclusies 1 - 9, m e t 10 het kenmerk, dat men het elueringsproces uitvoert met een elueringsmiddel met een pH van 2 - 4,5 en een zoutconcentratie van 0,5-1 mol, waarbij' men als zout bijvoorbeeld NaCl, KC1, enz. gebruikt, waarbij de pH door middel van azijnzuur, ÏÏC1 of andere verbindingen 15 wordt ingesteld.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men aan het elueringsmiddel hulpmiddelen zoals aminozuren, bijvoorbeeld lysine, arginine of andere verbindingen toevoegt. 20 790 5 0 45