JPS5816874B2 - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの精製法Info
- Publication number
- JPS5816874B2 JPS5816874B2 JP52083679A JP8367977A JPS5816874B2 JP S5816874 B2 JPS5816874 B2 JP S5816874B2 JP 52083679 A JP52083679 A JP 52083679A JP 8367977 A JP8367977 A JP 8367977A JP S5816874 B2 JPS5816874 B2 JP S5816874B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- gel
- units
- column
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製法に関し、更に詳しくは人
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから発熱性物
質を除去し、かつ高純度のウロキナーゼを工業的有利に
取得する方法に関する。
尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼから発熱性物
質を除去し、かつ高純度のウロキナーゼを工業的有利に
取得する方法に関する。
ウロキナーゼは血清中に含まれているプラスミノーゲン
を活性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生
成する機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であ
り、末梢動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨
床使用されている。
を活性化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを生
成する機能があるため、線溶系の賦活剤として有用であ
り、末梢動脈血栓症や心筋硬そく症などの治療に広く臨
床使用されている。
またウロキナーゼは近年抗ガン剤の増強剤としての用途
も開発され、その需要は急速に増大している。
も開発され、その需要は急速に増大している。
ウロキナーゼの精製法としては、燐酸セルロース、アン
バーライトＩＲＱ−５０、カルボキシメチルデキストラ
ン、カルボキシメチルセルロースの如きイオン交換体を
用いる方法、シリカゲル、ガラスヒース、多孔性ガラス
、カーボワックス処理多孔性ガラス、ケイ酸アルミニウ
ムマグネシウム、活性化ケイソウ士、ヒドロキシルアパ
タイト、ベントナイトの如き物理化学的吸着剤を用いる
方法、アクリルニトリル系繊維、シアノアルキル化セル
ロース、ポリエチレンイミン含有ポリアミド繊維、寒天
の如き特異的吸着剤を用いる方法等様々の方法が知られ
ている。
バーライトＩＲＱ−５０、カルボキシメチルデキストラ
ン、カルボキシメチルセルロースの如きイオン交換体を
用いる方法、シリカゲル、ガラスヒース、多孔性ガラス
、カーボワックス処理多孔性ガラス、ケイ酸アルミニウ
ムマグネシウム、活性化ケイソウ士、ヒドロキシルアパ
タイト、ベントナイトの如き物理化学的吸着剤を用いる
方法、アクリルニトリル系繊維、シアノアルキル化セル
ロース、ポリエチレンイミン含有ポリアミド繊維、寒天
の如き特異的吸着剤を用いる方法等様々の方法が知られ
ている。
ところでウロキナーゼを注射用薬剤として用いる場合に
は、充分なる比活性を有すると共に発熱性物質が除去さ
れていなければならないが、前記の精製法にては発熱性
物質が除去されない。
は、充分なる比活性を有すると共に発熱性物質が除去さ
れていなければならないが、前記の精製法にては発熱性
物質が除去されない。
従来、ウロキナーゼ中の発熱性物質の除去については種
々の方法が報告されているが、ウロキナーゼの回収率が
悪いなどの欠点がある。
々の方法が報告されているが、ウロキナーゼの回収率が
悪いなどの欠点がある。
本発明者らは、かかる欠点を解決すべく種々研究を重ね
た結果、人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼを
ポリアクリルアミドゲルとアガロースゲルとからなるゲ
ルビーズによりゲルろ過することにより発熱性物質を含
まない高純度のウロキナーゼを高収率で収得することが
できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
た結果、人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼを
ポリアクリルアミドゲルとアガロースゲルとからなるゲ
ルビーズによりゲルろ過することにより発熱性物質を含
まない高純度のウロキナーゼを高収率で収得することが
できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
′本発明で用いられるポリアクリルアミドゲルとアガロ
ースゲルとからなるゲルビーズとしては、例えばウルト
ロゲルＡｃＡ３４（商品名、ＬＫＢ−プロダクターＡＢ
社）、ウルトロゲ゛ルＡｃＡ ４４ （同上）などが好
適に挙げられる。
ースゲルとからなるゲルビーズとしては、例えばウルト
ロゲルＡｃＡ３４（商品名、ＬＫＢ−プロダクターＡＢ
社）、ウルトロゲ゛ルＡｃＡ ４４ （同上）などが好
適に挙げられる。
以下、本発明方法を具体的に説明する。
まず、上記ゲルビーズをｐＨ６〜１１の濃厚塩類溶液（
例えば、電気伝導率５０ ｍ ｍｈｏＺ薄以上のリン酸
緩衝液、食塩溶液）で緩衝化した後カラムに充填するか
、上記ゲルビーズをカラムに充填した後前記濃厚塩類溶
液で緩衝化する。
例えば、電気伝導率５０ ｍ ｍｈｏＺ薄以上のリン酸
緩衝液、食塩溶液）で緩衝化した後カラムに充填するか
、上記ゲルビーズをカラムに充填した後前記濃厚塩類溶
液で緩衝化する。
次いでこのカラムに人尿またはこれに由来する粗製ウロ
キナーゼの溶液をかけ、前記の濃厚塩類溶液にてゲルろ
過を行なう。
キナーゼの溶液をかけ、前記の濃厚塩類溶液にてゲルろ
過を行なう。
かくすることにより、発熱性物質の大部分はウロキナー
ゼよりも先に溶出し、また不純蛋白も除去できるので、
ウロキナーゼ活性分画を集めることにより発熱性物質を
含まない高純度のウロキナーゼを高収率に取得すること
ができる。
ゼよりも先に溶出し、また不純蛋白も除去できるので、
ウロキナーゼ活性分画を集めることにより発熱性物質を
含まない高純度のウロキナーゼを高収率に取得すること
ができる。
得られたウロキナーゼ活性分画は常法により硫安塩析し
、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼを単離
することができる。
、透析後、凍結乾燥することによりウロキナーゼを単離
することができる。
以下、実施例を挙げて本発明方法を説明するが、本発明
はこの実施例により限定されるものではない。
はこの実施例により限定されるものではない。
尚、実施例中ウロキナーゼの力価測定はプロラグらのフ
ィブリン平板法（Ｊ、 Ｐｌｏｕｇら、１３ｉｏｃｈｉ
ｍ。
ィブリン平板法（Ｊ、 Ｐｌｏｕｇら、１３ｉｏｃｈｉ
ｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ２４．２７８ （１９５
７）〕にて測定し、力価表示はジョンソンらにより定め
られた国際単位（Ａ、 Ｊ、 Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓ、Ｄｉａｔｈａｓ。
７）〕にて測定し、力価表示はジョンソンらにより定め
られた国際単位（Ａ、 Ｊ、 Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓ、Ｄｉａｔｈａｓ。
ｈａｅｍｏｒｒｈ（Ｓｔｕｇｇ、）、 ２１、２５９（
１９６９） ）によった。
１９６９） ）によった。
実施例 １
（１） アンバーライトＩＲＱ−５０（商品名、ロー
ム・アンド・ハース社製）５０ｍｌをカラム（１，５Ｃ
ｒｒＬ×２８ｃｒｆＬ）に充填し、０．１Ｍ食塩含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で緩衝化する。
ム・アンド・ハース社製）５０ｍｌをカラム（１，５Ｃ
ｒｒＬ×２８ｃｒｆＬ）に充填し、０．１Ｍ食塩含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で緩衝化する。
次いで。新鮮人尿から調製した粗製ウロキナーゼを０．
１Ｍ食塩含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６−２）に溶
解して得た粗製ウロキナーゼ溶液１００ｍ１（全活性：
４５０，０００単位、比活性：１，５００単位／〜蛋白
質、電気伝導率： ２０ｍ ｍｈｏ／儂）をカラムに流
し、ウロキナーゼを吸着させる。
１Ｍ食塩含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６−２）に溶
解して得た粗製ウロキナーゼ溶液１００ｍ１（全活性：
４５０，０００単位、比活性：１，５００単位／〜蛋白
質、電気伝導率： ２０ｍ ｍｈｏ／儂）をカラムに流
し、ウロキナーゼを吸着させる。
次いで、カラムを０．１Ｍ食塩含有０．１ Ｍ ＩＪン
酸緩衝液（ｐＨ６，２）で充分洗浄後、０．５Ｍ食塩含
有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）１５０ｍｌに
て溶出し、ウロキナーゼ活性の高い分画を集める。
酸緩衝液（ｐＨ６，２）で充分洗浄後、０．５Ｍ食塩含
有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）１５０ｍｌに
て溶出し、ウロキナーゼ活性の高い分画を集める。
かくして得られるウロキナーゼ溶出液の比活性は２３，
０００単位／ｒｒ１９蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ
溶液からの活性収率は６８％であった。
０００単位／ｒｒ１９蛋白質であり、粗製ウロキナーゼ
溶液からの活性収率は６８％であった。
上記ウロキナーゼ溶出液を非発熱性の蒸留水１００倍量
に対し一夜透析し、これを３，０００単位／ｋｇ家兎体
重で投与して発熱性物質試験を行なったところ、体温上
昇度（’Ｃ）は１．０５゜１．１０、１．００で、日本
薬局方第９版の規準により発熱性物質陽性であった。
に対し一夜透析し、これを３，０００単位／ｋｇ家兎体
重で投与して発熱性物質試験を行なったところ、体温上
昇度（’Ｃ）は１．０５゜１．１０、１．００で、日本
薬局方第９版の規準により発熱性物質陽性であった。
そこで、上記ウロキナーゼ溶出液を下記の如く処理して
発熱性物質の除去を行なった。
発熱性物質の除去を行なった。
（２）ウルトロゲルＡｃＡ ４４ （商品名、ＬＫＢ−
プロダクターＡＢ社）２００ｍｌをカラム（２，１ｅｍ
×５８ｃｒｆＬ）に充填し、０．８Ｍ食塩含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化する。
プロダクターＡＢ社）２００ｍｌをカラム（２，１ｅｍ
×５８ｃｒｆＬ）に充填し、０．８Ｍ食塩含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化する。
次いで上記（１）で得られたウロキナーゼ溶出液１５７
７１１（全活性：３００，０００単位、比活性：２３，
０００単位／１ｎ９蛋白質）をカラムにかけ、０．８Ｍ
食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を３０
ｍ１／ｈｒの流速で流してゲルろ過を行なう。
７１１（全活性：３００，０００単位、比活性：２３，
０００単位／１ｎ９蛋白質）をカラムにかけ、０．８Ｍ
食塩含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を３０
ｍ１／ｈｒの流速で流してゲルろ過を行なう。
流出液を４ｒｒＬｌずつ採取し、ウロキナーゼ活性の高
いフラクション４１〜４７を集める。
いフラクション４１〜４７を集める。
かくして得られるウロキナーゼ分画（２８ｍｌ）の比活
性はｓｓ、ｏｏｏ単位／Ｔｎ９蛋白質であり、前記（１
）のウロキナーゼ溶出液からの活性収率は９２％であっ
た。
性はｓｓ、ｏｏｏ単位／Ｔｎ９蛋白質であり、前記（１
）のウロキナーゼ溶出液からの活性収率は９２％であっ
た。
上記ウロキナーゼ分画を前記（１）と同様に一夜透析し
、これを３，０００単位／ゆ家兎体重で投与して発熱性
物質試験を行なったところ、体温上昇度（’Ｃ）は０．
００、０．０５、０．０５で発熱性物質陰性であった。
、これを３，０００単位／ゆ家兎体重で投与して発熱性
物質試験を行なったところ、体温上昇度（’Ｃ）は０．
００、０．０５、０．０５で発熱性物質陰性であった。
また、上記ゲルろ過により発熱性物質はフラクション２
５付近に溶出していることが認められた。
５付近に溶出していることが認められた。
Claims (1)
- １ 人尿またはそれに由来する粗製ウロキナーゼをポリ
アクリルアミドゲルとアガロースゲルとからなるゲルビ
ーズによりゲルろ過することを特徴とするウロキナーゼ
の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52083679A JPS5816874B2 (ja) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52083679A JPS5816874B2 (ja) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5420191A JPS5420191A (en) | 1979-02-15 |
| JPS5816874B2 true JPS5816874B2 (ja) | 1983-04-02 |
Family
ID=13809156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52083679A Expired JPS5816874B2 (ja) | 1977-07-12 | 1977-07-12 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5816874B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61295477A (ja) * | 1985-06-21 | 1986-12-26 | ロイヤル株式会社 | 生鮮食品運搬方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5074555A (en) * | 1989-04-24 | 1991-12-24 | Sandvik Special Metals Corp. | Tapered wall shaft with reinforced tip |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4966885A (ja) * | 1972-10-30 | 1974-06-28 |
-
1977
- 1977-07-12 JP JP52083679A patent/JPS5816874B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4966885A (ja) * | 1972-10-30 | 1974-06-28 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61295477A (ja) * | 1985-06-21 | 1986-12-26 | ロイヤル株式会社 | 生鮮食品運搬方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5420191A (en) | 1979-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4172071A (en) | Chromophore blue adsorbent method for the purification of preparations having an interferon type activity | |
| JP2651307B2 (ja) | 血液凝固ｉｘ因子を含有する複合体 | |
| US3943245A (en) | Purification of plasminogen | |
| US4380511A (en) | Purification of bovine thrombin | |
| JPS58201794A (ja) | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 | |
| GB2025977A (en) | Process for the purification and concentratio of urokinease | |
| JPS5816874B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPH0734743B2 (ja) | プラスミノーゲン活性化剤 | |
| US4160697A (en) | Method for purification of crude urokinase | |
| JPS5937072B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPH0223158B2 (ja) | ||
| JPS5932116B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPS596883A (ja) | 人尿カリクレインの濃縮精製法 | |
| Svenson et al. | Preparation of amine oxidase from bovine serum by affinity chromatography on aminohexyl-sepharose | |
| JPS5921595B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
| JPH0260316B2 (ja) | ||
| KR790001376B1 (ko) | 우로키나제의 정제 및 회수법 | |
| JPS6230755B2 (ja) | ||
| JPS5824176B2 (ja) | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 | |
| JPH0768274B2 (ja) | プラスミノゲンの製造方法 | |
| JPS5820268B2 (ja) | ウロキナ−ゼ精製法 | |
| JP2882828B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
| JPS6140392B2 (ja) | ||
| JPS5889184A (ja) | 人尿中のカリクレインの精製法 | |
| JPS6148918B2 (ja) |