JP2882828B2 - 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 - Google Patents
人尿トリプシンインヒビターの精製方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、人尿トリプシンインヒビターを工業的規模
で実施することができる精製方法に関する。
で実施することができる精製方法に関する。
［従来の技術］ 人尿中にトリプシンインヒビターが含有されているこ
とは知られている。人尿トリプシンインヒビター（以
下、UTIと略す）は、分子量68000、等電点pH2〜３の糖
タンパク質であり、特にトリプシン、キモトリプシン、
プラスミンなどを阻害する（須見ら、日本生理誌、39、
53（1977））ことから、抗炎症剤として臨床応用されて
いる。
とは知られている。人尿トリプシンインヒビター（以
下、UTIと略す）は、分子量68000、等電点pH2〜３の糖
タンパク質であり、特にトリプシン、キモトリプシン、
プラスミンなどを阻害する（須見ら、日本生理誌、39、
53（1977））ことから、抗炎症剤として臨床応用されて
いる。
例えば、純度99％以上、比活性2500単位/1mg以上、エ
ンドトキシン濃度20pg/トリプシンインヒビター1mg以下
のUTIが抗炎症剤として使用されている。
ンドトキシン濃度20pg/トリプシンインヒビター1mg以下
のUTIが抗炎症剤として使用されている。
ところで、大量の尿から工業的規模でUTIを回収、精
製するには（ｉ）高純度のUTIを得る、（ii）操作が簡
便である、（iii）効率がよい、（iv）再現性がよい、
（ｖ）分解・失活がない等が要求されている。
製するには（ｉ）高純度のUTIを得る、（ii）操作が簡
便である、（iii）効率がよい、（iv）再現性がよい、
（ｖ）分解・失活がない等が要求されている。
UTIの精製方法として、これまで電気泳動をはじめと
する実験室的手法を精製工程中に組み込んだ方法が知ら
れているが、これらは小量規模の精製方法でしかない。
従来の方法として例えば、メタノール沈澱、固定化トリ
プシンアフィニティークロマトグラフィー、調整用電気
泳動を組み合わせた方法（B.J.Bromke et.al.;Biochem.
Med.27,56（1982））、過塩素酸処理、固定化トリプシ
ンアフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳
動、ゲル濾過を組み合わせた方法（Enzyme;35,225（198
6））等がある。
する実験室的手法を精製工程中に組み込んだ方法が知ら
れているが、これらは小量規模の精製方法でしかない。
従来の方法として例えば、メタノール沈澱、固定化トリ
プシンアフィニティークロマトグラフィー、調整用電気
泳動を組み合わせた方法（B.J.Bromke et.al.;Biochem.
Med.27,56（1982））、過塩素酸処理、固定化トリプシ
ンアフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳
動、ゲル濾過を組み合わせた方法（Enzyme;35,225（198
6））等がある。
しかし、人尿中のUTIを工業的規模でかつ医薬品に適
用できる程度に高純度化する報告は無い。
用できる程度に高純度化する報告は無い。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明者らは、人尿中に存在するUTIを工業的規模で
かつ上記医薬用としての純度を有するまで容易に高純度
化する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
かつ上記医薬用としての純度を有するまで容易に高純度
化する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は以下を要旨とするものである。
1. 下記の工程からなることを特徴とする人尿トリプシ
ンインヒビターの精製方法。
ンインヒビターの精製方法。
第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に塩濃度を低くして
その吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液をゲル濾過用担体と
接触させ、分画することによりUTIを取得する工程 2. 第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、
銅、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれ
た少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈
殿を除去することを特徴とする１記載のUTIの精製方法
である。
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に塩濃度を低くして
その吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液をゲル濾過用担体と
接触させ、分画することによりUTIを取得する工程 2. 第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、
銅、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれ
た少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈
殿を除去することを特徴とする１記載のUTIの精製方法
である。
以下、さらに本発明について詳しく説明する。
まず、請求項１の発明について説明すると、この発明
は、大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度の
UTIを得るための精製方法であって、上記した第１工程
から第４工程までの工程から成るものである。
は、大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度の
UTIを得るための精製方法であって、上記した第１工程
から第４工程までの工程から成るものである。
以下、工程別に説明する。
第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 この工程は、大量の尿からUTIを抽出する際、濃縮ま
たは吸着剤による回収・濃縮を行なうものである。その
一般的な手段としては、限外濾過濃縮および水酸化アル
ミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、カオリン、シ
リカゲル、イオン交換樹脂、キトサン等の吸着剤による
方法等が例示される。限外濾過濃縮の場合は、方式等は
特に限定されない。また、吸着剤による回収・濃縮の場
合も、UTIが吸着されるものであればその種類は特に限
定されないが、それぞれの吸着剤の添加量、添加条件、
吸着剤からの溶出条件などを吟味する必要がある。例え
ば、水酸化アルミニウムゲル（キヨーワード200B:協和
化学工業（株）製）の場合は、尿を酢酸などによりpHを
３〜５に調整後、0.25〜2.0％となるように添加し、数
時間攪拌吸、着後pH10〜12の溶液で溶出する事によりUT
Iを回収・濃縮することが可能である。
液を得る工程 この工程は、大量の尿からUTIを抽出する際、濃縮ま
たは吸着剤による回収・濃縮を行なうものである。その
一般的な手段としては、限外濾過濃縮および水酸化アル
ミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、カオリン、シ
リカゲル、イオン交換樹脂、キトサン等の吸着剤による
方法等が例示される。限外濾過濃縮の場合は、方式等は
特に限定されない。また、吸着剤による回収・濃縮の場
合も、UTIが吸着されるものであればその種類は特に限
定されないが、それぞれの吸着剤の添加量、添加条件、
吸着剤からの溶出条件などを吟味する必要がある。例え
ば、水酸化アルミニウムゲル（キヨーワード200B:協和
化学工業（株）製）の場合は、尿を酢酸などによりpHを
３〜５に調整後、0.25〜2.0％となるように添加し、数
時間攪拌吸、着後pH10〜12の溶液で溶出する事によりUT
Iを回収・濃縮することが可能である。
さらに、ウィルス除去の目的で尿原液の加熱処理60〜
65℃で10〜15時間を好ましくは実施する。
65℃で10〜15時間を好ましくは実施する。
第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第１工程で得られた尿原液をpH3〜５の
緩衝液に対して透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムに吸着させ、十分な洗浄後、塩濃
度を高めてUTIを溶出させるものである。この場合、陰
イオン交換樹脂はジエチルアミノエチル（DEAE）基、４
級化アミノエチル（QAE）基を官能基として有する物が
一般的であるが、これらに限定されるものではない。透
析用およびカラム平衡化用緩衝液に、0.05〜0.15M程度
の塩化ナトリウムを添加しておいてもよく、UTIの溶出
する塩濃度は好ましくは0.25〜0.35M塩化ナトリウムで
ある。
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第１工程で得られた尿原液をpH3〜５の
緩衝液に対して透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムに吸着させ、十分な洗浄後、塩濃
度を高めてUTIを溶出させるものである。この場合、陰
イオン交換樹脂はジエチルアミノエチル（DEAE）基、４
級化アミノエチル（QAE）基を官能基として有する物が
一般的であるが、これらに限定されるものではない。透
析用およびカラム平衡化用緩衝液に、0.05〜0.15M程度
の塩化ナトリウムを添加しておいてもよく、UTIの溶出
する塩濃度は好ましくは0.25〜0.35M塩化ナトリウムで
ある。
第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に塩濃度を低くして
その吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第２工程で得られた溶出液に、硫酸アン
モニウムを1.2〜1.5Mとなるように添加して試料を作成
し、あらかじめ同濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩
衝液で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム、例え
ば、官能基にフェニル基、オクチル基、ブチル基を有す
る担体を充填したカラムに試料を給送しタンパク質を吸
着させ、硫酸アンモニウム濃度を1.0Mに低下させること
で溶出される画分をUTI活性画分として分取し、他の夾
雑タンパク質と分離するものである。
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に塩濃度を低くして
その吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第２工程で得られた溶出液に、硫酸アン
モニウムを1.2〜1.5Mとなるように添加して試料を作成
し、あらかじめ同濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩
衝液で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム、例え
ば、官能基にフェニル基、オクチル基、ブチル基を有す
る担体を充填したカラムに試料を給送しタンパク質を吸
着させ、硫酸アンモニウム濃度を1.0Mに低下させること
で溶出される画分をUTI活性画分として分取し、他の夾
雑タンパク質と分離するものである。
第２工程と第３工程の実施順序は、逆であっても最終
的な精製結果には何ら影響がなく、任意に選択してもよ
い。
的な精製結果には何ら影響がなく、任意に選択してもよ
い。
第４工程：第３工程で得られた溶液をゲル濾過用担体と
接触させ、分画することによりUTIを取得する工程 この工程は、第３工程で得られた溶液を限外濾過濃縮
等により約10mg/mlまで濃縮し、分画分子量範囲1000〜1
00万のゲル濾過用クロマト担体（セファクリルＳ−300H
R:ファルマシア社製）を充填したカラムに給送して、相
対溶出液量が1.3〜2.1、好ましくは、1.5〜1.8である分
画を集めるものである。ゲル濾過用クロマト担体は特に
限定されず、セファクリルＳ−300HRの他にセファデッ
クスＧ−100、セルロファインGCL−200−ｍ等を用いて
も、相当する画分を分取する事は可能である。
接触させ、分画することによりUTIを取得する工程 この工程は、第３工程で得られた溶液を限外濾過濃縮
等により約10mg/mlまで濃縮し、分画分子量範囲1000〜1
00万のゲル濾過用クロマト担体（セファクリルＳ−300H
R:ファルマシア社製）を充填したカラムに給送して、相
対溶出液量が1.3〜2.1、好ましくは、1.5〜1.8である分
画を集めるものである。ゲル濾過用クロマト担体は特に
限定されず、セファクリルＳ−300HRの他にセファデッ
クスＧ−100、セルロファインGCL−200−ｍ等を用いて
も、相当する画分を分取する事は可能である。
なお、相対溶出液量とはVe/Voで表わされる数値であ
る（Veはカラムに通液する試料液がカラムから溶出する
液量を示し、Voはカラム内のゲル粒子外部の溶液量を示
す）。
る（Veはカラムに通液する試料液がカラムから溶出する
液量を示し、Voはカラム内のゲル粒子外部の溶液量を示
す）。
以上、上記した第１工程から第４工程までのUTIの精
製方法を実施することにより大量の尿から工業的規模で
医薬品に適する高純度のUTIを得ることができる。
製方法を実施することにより大量の尿から工業的規模で
医薬品に適する高純度のUTIを得ることができる。
次に、請求項２の発明について説明すると、この発明
は、大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度の
UTIを得るための精製方法であって請求項１の改良発明
である。
は、大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度の
UTIを得るための精製方法であって請求項１の改良発明
である。
すなわち、請求項１記載の第１工程の後に、金属塩に
よる処理工程を実施するものである。この工程は、尿原
液中の夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする
粘性物質をUTIの活性損失することなく除去するもので
ある。これにより請求項１記載の第２工程においては、
（ｉ）カラムに対する負荷を軽減し、（ii）十分な分離
を行うことができる。さらに、限界濾過等による濃縮で
は時間を短縮できる。など操作性の向上がはかられる。
よる処理工程を実施するものである。この工程は、尿原
液中の夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする
粘性物質をUTIの活性損失することなく除去するもので
ある。これにより請求項１記載の第２工程においては、
（ｉ）カラムに対する負荷を軽減し、（ii）十分な分離
を行うことができる。さらに、限界濾過等による濃縮で
は時間を短縮できる。など操作性の向上がはかられる。
この金属塩処理工程は、第１工程で得られた尿原液に
亜鉛、カルシウム、銅、バリウム、アルミニウムの各金
属塩から選ばれた少なくとも一種以上の金属塩を添加し
た後、生じた沈澱を除去するものである。この沈殿は、
夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘性物
質等である。
亜鉛、カルシウム、銅、バリウム、アルミニウムの各金
属塩から選ばれた少なくとも一種以上の金属塩を添加し
た後、生じた沈澱を除去するものである。この沈殿は、
夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘性物
質等である。
添加する金属塩は、亜鉛、カルシウム、銅、バリウ
ム、アルミニウムの硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物等
が利用可能であり、添加濃度は10mM〜5M程度であり、好
ましくは、0.1〜1.0Mである。添加方法は、特に限定さ
れないが、添加した金属塩が均一に溶解する条件が望ま
しく、そのためには４〜80℃の温度範囲の中で攪拌及び
／又は振とうしつつ添加し、0.5〜24時間放置するのが
好ましい。
ム、アルミニウムの硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物等
が利用可能であり、添加濃度は10mM〜5M程度であり、好
ましくは、0.1〜1.0Mである。添加方法は、特に限定さ
れないが、添加した金属塩が均一に溶解する条件が望ま
しく、そのためには４〜80℃の温度範囲の中で攪拌及び
／又は振とうしつつ添加し、0.5〜24時間放置するのが
好ましい。
この工程の後に、請求項１記載の第２工程から第４工
程を同様に引き続き実施するものである。
程を同様に引き続き実施するものである。
以上、上記した第１工程から第５工程までのUTIの精
製方法を実施することにより、大量の尿から工業的規模
でかつ、良好な操作性で、医薬品に適する高純度のUTI
を得ることができる。また本発明の請求項１および２の
精製方法を実施することにより、医薬品に混入し、体内
に投与されたときに発熱作用を誘発する物質、いわゆる
パイロジェンの除去も可能である。
製方法を実施することにより、大量の尿から工業的規模
でかつ、良好な操作性で、医薬品に適する高純度のUTI
を得ることができる。また本発明の請求項１および２の
精製方法を実施することにより、医薬品に混入し、体内
に投与されたときに発熱作用を誘発する物質、いわゆる
パイロジェンの除去も可能である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１ 第１工程 正常人尿1000に塩酸を添加し、pHを4.0に調整して
酸処理尿を得た。この酸処理尿に5kgの水酸化アルミニ
ウムゲル（キヨーワード200B;協和化学工業（株）製）
を添加し、室温にて３時間攪拌した。１時間放置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50で２時間攪拌溶出を行ない、遠心分離
（8000回転、60分）により溶出液を得た。
酸処理尿を得た。この酸処理尿に5kgの水酸化アルミニ
ウムゲル（キヨーワード200B;協和化学工業（株）製）
を添加し、室温にて３時間攪拌した。１時間放置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50で２時間攪拌溶出を行ない、遠心分離
（8000回転、60分）により溶出液を得た。
第２工程 第１工程で得られた尿原液を、ペリコンカセット（ミ
リポア社製）を用い濃縮・透析し、0.1MNaClを含有する
0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）にバッファーであらかじめ平
衡化しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファ
インA500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）
に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3MNaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画
分を、UTI活性画分として分取した。この画分の活性回
収率は67％であり、比活性は1189U/mgであった。
リポア社製）を用い濃縮・透析し、0.1MNaClを含有する
0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）にバッファーであらかじめ平
衡化しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファ
インA500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）
に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3MNaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画
分を、UTI活性画分として分取した。この画分の活性回
収率は67％であり、比活性は1189U/mgであった。
第３工程 第２工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを1.3M
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。1M硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。1M硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は93％であり、比活性は2541U/
mgであった。
mgであった。
第４工程 第３工程で得られた溶液を、ペリコンラボカセット
（ミリポア社製）を用い約10mg/mlまで濃縮した。この
濃縮液を、あらかじめリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で
平衡化したゲル濾過カラム（セファクリルＳ−300HR:フ
ァルマシア社製）（直径2.6cm、高さ90cm）に給送し、
相対溶出液量（Ve/Vo）1.5〜1.8の画分を、UTI活性画分
として分取した。
（ミリポア社製）を用い約10mg/mlまで濃縮した。この
濃縮液を、あらかじめリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で
平衡化したゲル濾過カラム（セファクリルＳ−300HR:フ
ァルマシア社製）（直径2.6cm、高さ90cm）に給送し、
相対溶出液量（Ve/Vo）1.5〜1.8の画分を、UTI活性画分
として分取した。
この画分の活性回収率は88％であり、比活性は2733U/
mgであった。また、エンドトキシン濃度は17.3pg/mg・U
TIであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
mgであった。また、エンドトキシン濃度は17.3pg/mg・U
TIであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
実施例２ 第１工程 正常人尿1000に塩酸を添加し、pHを4.0に調整して
酸処理尿を得た。この酸処理尿に5kgの水酸化アルミニ
ウムゲル（キヨーワード200B;協和化学工業（株）製）
を添加し、室温にて３時間攪拌した。１時間放置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50で２時間攪拌溶出を行ない、遠心分離
（8000回転、60分）により溶出液を得た。
酸処理尿を得た。この酸処理尿に5kgの水酸化アルミニ
ウムゲル（キヨーワード200B;協和化学工業（株）製）
を添加し、室温にて３時間攪拌した。１時間放置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50で２時間攪拌溶出を行ない、遠心分離
（8000回転、60分）により溶出液を得た。
第２工程 第１工程で得られた尿原液を塩酸で中和後、0.5Mとな
るように塩化亜鉛を添加し、室温３時間放置後、遠心分
離（8500回転、60分）により沈澱を除去した。この塩化
亜鉛処理液をペリコンカセット（ミリポア社製）による
限外濾過で５まで濃縮し亜鉛処理尿原液とした。
るように塩化亜鉛を添加し、室温３時間放置後、遠心分
離（8500回転、60分）により沈澱を除去した。この塩化
亜鉛処理液をペリコンカセット（ミリポア社製）による
限外濾過で５まで濃縮し亜鉛処理尿原液とした。
第３工程 第２工程で得られた亜鉛処理尿原液を、ペリコンカセ
ット（ミリポア社製）を用い濃縮・透析し、0.1MNaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）にバッファー交換し
た。これを、同バッファーであらかじめ平衡化しておい
て陰イオン交換カラム（DEAE−セルファインA500:生化
学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に給送し、同
バッファーで十分に洗浄した。0.3MNaClを含有する0.1M
酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画分を、UTI活性
画分として分取した。この画分の活性回収率は78％であ
り、比活性は1215U/mgであった。
ット（ミリポア社製）を用い濃縮・透析し、0.1MNaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）にバッファー交換し
た。これを、同バッファーであらかじめ平衡化しておい
て陰イオン交換カラム（DEAE−セルファインA500:生化
学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に給送し、同
バッファーで十分に洗浄した。0.3MNaClを含有する0.1M
酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画分を、UTI活性
画分として分取した。この画分の活性回収率は78％であ
り、比活性は1215U/mgであった。
第４工程 第３工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを1.3M
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。1M硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。1M硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は99％であり、比活性は2662U/
mgであった。
mgであった。
第５工程 第４工程で得られた溶液を、ペリコンラボカセット
（ミリポア社製）を用い約10mg/mlまで濃縮した。この
濃縮液を、あらかじめリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で
平衡化したゲル濾過カラム（セファクリルＳ−300HR:フ
ァルマシア社製）（直径2.6cm、高さ90cm）に給送し、
相対溶出液量（Ve/Vo）1.5〜1.8の画分を、UTI活性画分
として分取した。
（ミリポア社製）を用い約10mg/mlまで濃縮した。この
濃縮液を、あらかじめリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で
平衡化したゲル濾過カラム（セファクリルＳ−300HR:フ
ァルマシア社製）（直径2.6cm、高さ90cm）に給送し、
相対溶出液量（Ve/Vo）1.5〜1.8の画分を、UTI活性画分
として分取した。
この画分の活性回収率は89％であり、比活性は2826U/
mgであった。また、エンドトキシン濃度は16.6pg/mg・U
TIであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
mgであった。また、エンドトキシン濃度は16.6pg/mg・U
TIであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
なお、実施例1,2におけるUTI活性、タンパク質量、エ
ンドトキシン濃度、および純度は以下の方法により測定
した。
ンドトキシン濃度、および純度は以下の方法により測定
した。
1. UTI活性:Muramatsu等の方法（J.Biochem.,57,402
（1965））に準拠し、カゼイン分解法で測定した。
（1965））に準拠し、カゼイン分解法で測定した。
2. タンパク質量:BCA法タンパク質定量キット（ピアス
社製）を用いた。
社製）を用いた。
3. エンドトキシン濃度：トキシカラーシステムLS−１
セットおよびEt−１セット（エンドトキシン標準液）
（生化学工業社製）による比色法エンドトキシン測定法
を用いた。
セットおよびEt−１セット（エンドトキシン標準液）
（生化学工業社製）による比色法エンドトキシン測定法
を用いた。
4. 純度検定 電気泳動法:SDS−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−P
AGE）により行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（C
BB）染色後、デンシトメーターにて定量分析を実施し
た。
AGE）により行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（C
BB）染色後、デンシトメーターにて定量分析を実施し
た。
HPLC法：シリカ系C4カラム（AP−813−15:YMC製）を用
い、0.1％TFA存在下アセトニトリル溶出系で分離し、ピ
ーク面積の定量分析を実施した。
い、0.1％TFA存在下アセトニトリル溶出系で分離し、ピ
ーク面積の定量分析を実施した。
［発明の効果］ 本発明による、UTIの精製方法を用いることにより、
大量の尿から工業的規模でUTIを簡便に、効率よく、再
現性をもって回収、精製することができるばかりでな
く、医薬品に適用できる高純度のUTIを得ることが可能
となった。
大量の尿から工業的規模でUTIを簡便に、効率よく、再
現性をもって回収、精製することができるばかりでな
く、医薬品に適用できる高純度のUTIを得ることが可能
となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−160724（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−51579（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ，109，Ｎｏ．２（1980）ｐ．273− 283 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/81 C07K 1/18 C07K 1/20 C07K 1/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記の工程からなることを特徴とする人尿
トリプシンインヒビターの精製方法。 第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に塩濃度を低くして
その吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液をゲル濾過用担体と
接触させ、分画することにより人尿トリプシンインヒビ
ターを取得する工程 - 【請求項２】第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシ
ウム、銅、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から
選ばれた少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生
じた沈殿を除去することを特徴とする請求項１記載の人
尿トリプシンインヒビターの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31328189A JP2882828B2 (ja) | 1989-12-04 | 1989-12-04 | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31328189A JP2882828B2 (ja) | 1989-12-04 | 1989-12-04 | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03176499A JPH03176499A (ja) | 1991-07-31 |
| JP2882828B2 true JP2882828B2 (ja) | 1999-04-12 |
Family
ID=18039322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31328189A Expired - Lifetime JP2882828B2 (ja) | 1989-12-04 | 1989-12-04 | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2882828B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2722140B2 (ja) * | 1991-07-02 | 1998-03-04 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
-
1989
- 1989-12-04 JP JP31328189A patent/JP2882828B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ，１０９，Ｎｏ．２（１９８０）ｐ．２７３−２８３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03176499A (ja) | 1991-07-31 |
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