JPH0795894A - リポコルチンの精製方法 - Google Patents
リポコルチンの精製方法Info
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- JPH0795894A JPH0795894A JP3036501A JP3650191A JPH0795894A JP H0795894 A JPH0795894 A JP H0795894A JP 3036501 A JP3036501 A JP 3036501A JP 3650191 A JP3650191 A JP 3650191A JP H0795894 A JPH0795894 A JP H0795894A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4721—Lipocortins
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】リポコルチン特に遺伝子操作によって製造され
たタンパク質、ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４
−デルタの精製方法の提供。 【構成】陰イオン交換体でリポコルチン溶液を処理する
ことによるリポコルチンの精製において、該溶液にキレ
ート化剤および清浄剤を加え、その溶液を陰イオン交換
体と接触させそして液体を分離することからなる上記の
リポコルチンの精製方法。
たタンパク質、ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４
−デルタの精製方法の提供。 【構成】陰イオン交換体でリポコルチン溶液を処理する
ことによるリポコルチンの精製において、該溶液にキレ
ート化剤および清浄剤を加え、その溶液を陰イオン交換
体と接触させそして液体を分離することからなる上記の
リポコルチンの精製方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリポコルチン特に遺伝子
操作によって製造されたタンパク質ｒＰＰ４、ｒＰＰ４
−ＸおよびｒＰＰ４−デルタの精製方法に関する。これ
らのタンパク質は抗凝血性および抗炎症性作用を有す
る。
操作によって製造されたタンパク質ｒＰＰ４、ｒＰＰ４
−ＸおよびｒＰＰ４−デルタの精製方法に関する。これ
らのタンパク質は抗凝血性および抗炎症性作用を有す
る。
【０００２】
【従来の技術】天然タンパク質ＰＰ４はヨーロッパ特許
−Ａ ０ １２３ ３０７号明細書に記載されている。
−Ａ ０ １２３ ３０７号明細書に記載されている。
【０００３】ＰＰ４、抗凝血性活性もあるタンパク質、
ＰＰ４−Ｘおよび増大された活性を有する欠失変異型
（ＰＰ４−デルタ）の遺伝子操作による製造はドイツ特
許−Ａ３ ９１０ ２４０号明細書に記載されている。
ＰＰ４−Ｘおよび増大された活性を有する欠失変異型
（ＰＰ４−デルタ）の遺伝子操作による製造はドイツ特
許−Ａ３ ９１０ ２４０号明細書に記載されている。
【０００４】これらのタンパク質はリポコルチンと称さ
れるタンパク質（グルココルチコイド誘導のホスホリパ
ーゼ阻害タンパク質）またはカルパクチンと称されるタ
ンパク質（カルシウム依存のリン脂質−およびアクチン
−結合タンパク質）の一群に属するものとみなすことが
できる。
れるタンパク質（グルココルチコイド誘導のホスホリパ
ーゼ阻害タンパク質）またはカルパクチンと称されるタ
ンパク質（カルシウム依存のリン脂質−およびアクチン
−結合タンパク質）の一群に属するものとみなすことが
できる。
【０００５】
【発明の目的】本発明の目的はリポコルチン特に遺伝子
操作によって製造されたタンパク質ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ
およびＰＰ４−デルタ（ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−Ｘおよび
ｒＰＰ４−デルタ）を取得しかつ精製する方法を提供す
ることである。
操作によって製造されたタンパク質ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ
およびＰＰ４−デルタ（ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−Ｘおよび
ｒＰＰ４−デルタ）を取得しかつ精製する方法を提供す
ることである。
【０００６】ＰＰ４の精製法は知られているが、それら
は最初の溶液の組成が異なっているので遺伝子操作で製
造されたリポコルチンを取得するには不十分である。
は最初の溶液の組成が異なっているので遺伝子操作で製
造されたリポコルチンを取得するには不十分である。
【０００７】
【発明の構成】本発明はリポコルチンの溶液を陰イオン
交換体で処理することによるリポコルチンの精製方法に
関する。その方法は該溶液にキレート化剤および清浄剤
を加え、その溶液を陰イオン交換体と接触させそして液
体を分離することからなる。
交換体で処理することによるリポコルチンの精製方法に
関する。その方法は該溶液にキレート化剤および清浄剤
を加え、その溶液を陰イオン交換体と接触させそして液
体を分離することからなる。
【０００８】さらに該交換体を清浄剤不含緩衝液で清浄
しそしてリポコルチンを溶離することも可能である。
しそしてリポコルチンを溶離することも可能である。
【０００９】しかし、リポコルチンは適切ならば該液体
から得られる。
から得られる。
【００１０】記載の方法は遺伝子操作で製造されたリポ
コルチンに対して特に適している。このタイプのリポコ
ルチンは特にｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸまたはｒＰＰ４−
デルタである。リポコルチン溶液にキレート化剤を添加
して沈殿が生成する場合には、その沈殿を清浄剤添加の
前に分離するのが好ましい。
コルチンに対して特に適している。このタイプのリポコ
ルチンは特にｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸまたはｒＰＰ４−
デルタである。リポコルチン溶液にキレート化剤を添加
して沈殿が生成する場合には、その沈殿を清浄剤添加の
前に分離するのが好ましい。
【００１１】リポコルチン含有溶液は特に、大腸菌を用
いる遺伝子操作手法で製造される大腸菌リゼイトであ
る。キレート化試薬は０.００１〜０.０５モル／ｌ、好
ましくは０.００２〜０.０２モル／ｌの濃度で使用され
る。pHは６.５〜９.５好ましくは６.8〜７.５に調整さ
れる。使用し得る清浄剤は０.１〜２.０％（一般的に
は）の濃度でのイオン系または非イオン系または両性イ
オン系の、好ましくはコール酸誘導体およびその塩およ
びトリトン（RTriton）Ｘ−１００である。
いる遺伝子操作手法で製造される大腸菌リゼイトであ
る。キレート化試薬は０.００１〜０.０５モル／ｌ、好
ましくは０.００２〜０.０２モル／ｌの濃度で使用され
る。pHは６.５〜９.５好ましくは６.8〜７.５に調整さ
れる。使用し得る清浄剤は０.１〜２.０％（一般的に
は）の濃度でのイオン系または非イオン系または両性イ
オン系の、好ましくはコール酸誘導体およびその塩およ
びトリトン（RTriton）Ｘ−１００である。
【００１２】使用し得るイオン交換体は塩基性イオン交
換体好ましくはＱ−、ＱＡＥ−またはＤＥＡＥ−セファ
ロース（RSepharose；登録商標）、Ｑ−、ＱＡＥ−また
はＤＥＡＥ−セルロース、Ｑ−、ＱＡＥ−またはＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（RSephadex；登録商標）またはＱ
−、ＱＡＥ−またはＤＥＡＥ−フラクトゲル（RFractog
el；登録商標）（アミノ基を担持しそしてジビニルベン
ゼンと交叉結合されている、ペンタエリスリトール、メ
タクリル酸誘導体およびポリエチレングリコールからな
るコポリマー）またはハイドロキシアパタイトである。
それはpH６.５〜９.５でトリス、ＨＥＰＥＳまたはグリ
シン０.０１〜０.１モル／ｌの緩衝溶液から吸着を行う
ことができる。
換体好ましくはＱ−、ＱＡＥ−またはＤＥＡＥ−セファ
ロース（RSepharose；登録商標）、Ｑ−、ＱＡＥ−また
はＤＥＡＥ−セルロース、Ｑ−、ＱＡＥ−またはＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（RSephadex；登録商標）またはＱ
−、ＱＡＥ−またはＤＥＡＥ−フラクトゲル（RFractog
el；登録商標）（アミノ基を担持しそしてジビニルベン
ゼンと交叉結合されている、ペンタエリスリトール、メ
タクリル酸誘導体およびポリエチレングリコールからな
るコポリマー）またはハイドロキシアパタイトである。
それはpH６.５〜９.５でトリス、ＨＥＰＥＳまたはグリ
シン０.０１〜０.１モル／ｌの緩衝溶液から吸着を行う
ことができる。
【００１３】ｒＰＰ４およびｒＰＰ４−デルタは前記条
件下で陰イオン交換体に結合されるが、ｒＰＰ４−Ｘは
pH６.５〜８.０では結合されない。しかし、このタンパ
ク質の純化は、不純物混入タンパク質の大部分が交換体
上に吸着されるために達成される。
件下で陰イオン交換体に結合されるが、ｒＰＰ４−Ｘは
pH６.５〜８.０では結合されない。しかし、このタンパ
ク質の純化は、不純物混入タンパク質の大部分が交換体
上に吸着されるために達成される。
【００１４】また意外なことに、本発明によればｒＰＰ
４の外にｒＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４−デルタもまた、
０〜１０mSの伝導率およびpH６.５〜９.５でカルシウム
の存在下においてのみ、固定化された、サッカリドのポ
リ硫酸エステルまたは担体に結合された硫酸化糖に結合
し、これらのタンパク質がイオン強度を増加させること
により溶離され得ることが見出された。これらのタンパ
ク質はカルシウムの不在下またはキレート試薬の存在下
ではこれら吸着剤に結合しない。
４の外にｒＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４−デルタもまた、
０〜１０mSの伝導率およびpH６.５〜９.５でカルシウム
の存在下においてのみ、固定化された、サッカリドのポ
リ硫酸エステルまたは担体に結合された硫酸化糖に結合
し、これらのタンパク質がイオン強度を増加させること
により溶離され得ることが見出された。これらのタンパ
ク質はカルシウムの不在下またはキレート試薬の存在下
ではこれら吸着剤に結合しない。
【００１５】ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸまたはｒＰＰ４−
デルタはカルシウムの存在下におけるカオリン（Kaoli
n）またはエーロシル（RAerosil；登録商標）上への吸
着によってさらに精製され得る。溶離はイオン強度を増
加させることによりそして／またはキレート化試薬を用
いることによって実施される。
デルタはカルシウムの存在下におけるカオリン（Kaoli
n）またはエーロシル（RAerosil；登録商標）上への吸
着によってさらに精製され得る。溶離はイオン強度を増
加させることによりそして／またはキレート化試薬を用
いることによって実施される。
【００１６】また、これらのタンパク質をさらに精製す
るためにリン酸カルシウムへの結合を利用することも可
能である。これらのタンパク質は、イオン強度を増加さ
せるかまたはキレート化試薬例えばＥＤＴＡまたはクエ
ン酸の塩を使用することにより、またはこれらの試薬を
含有する混合物により溶離され得る。
るためにリン酸カルシウムへの結合を利用することも可
能である。これらのタンパク質は、イオン強度を増加さ
せるかまたはキレート化試薬例えばＥＤＴＡまたはクエ
ン酸の塩を使用することにより、またはこれらの試薬を
含有する混合物により溶離され得る。
【００１７】リポコルチンはさらに精製するためにアフ
ィニティークロマトグラフィーにかけることができる。
このためには、リポコルチン含有溶液を透析し、担体に
結合されたヘパリン上でバッチ法によりカルシウムイオ
ンを加えた後にトリス−ＨＣｌ、pH８.５、０.０１〜
０.０５モル／ｌ好ましくは０.０２モル／ｌ含有の緩衝
液中で吸着させ、吸着剤を洗浄し次に各タンパク質を段
階的な勾配を用いて溶離しついで透析することができ
る。透析物はＥＤＴＡ ０.０１〜２０ミリモル／ｌ好ま
しくは１ミリモル／ｌと混合し、好ましくはもう一度担
体に結合されたヘパリンと接触させ次いでリポコルチン
を透析する。
ィニティークロマトグラフィーにかけることができる。
このためには、リポコルチン含有溶液を透析し、担体に
結合されたヘパリン上でバッチ法によりカルシウムイオ
ンを加えた後にトリス−ＨＣｌ、pH８.５、０.０１〜
０.０５モル／ｌ好ましくは０.０２モル／ｌ含有の緩衝
液中で吸着させ、吸着剤を洗浄し次に各タンパク質を段
階的な勾配を用いて溶離しついで透析することができ
る。透析物はＥＤＴＡ ０.０１〜２０ミリモル／ｌ好ま
しくは１ミリモル／ｌと混合し、好ましくはもう一度担
体に結合されたヘパリンと接触させ次いでリポコルチン
を透析する。
【００１８】アフィニティークロマトグラフィーは一般
的には担体に結合された、サッカリドのポリ硫酸エステ
ルまたは硫酸化糖例えば担体に結合されたヘパリン、デ
キストランサルフェート、ヘパランサルフェート、コン
ドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェートまたは
デルマタンサルフェート好ましくはヘパリン−RSepharo
seもしくは−RFractogelまたはデキストランサルフェー
ト−RSepharoseもしくは−RFractogel上で、pH６.５〜
９.５好ましくはpH６.８〜８.５で、トリス、ＨＥＰＥ
Ｓまたはグリシン０.０１〜０.１モル／ｌを含有しかつ
好ましくはカルシウム５ミリモル／ｌを含有する緩衝溶
液から吸着しそして吸着されたタンパク質を前記のイオ
ン交換体クロマトグラフィーの場合と同様にイオン強度
を増加させることによって実施され得る。カルシウムの
不在下またはキレート試薬の存在下では、ｒＰＰ４、ｒ
ＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４−デルタはこれらの吸収剤に
結合しない。
的には担体に結合された、サッカリドのポリ硫酸エステ
ルまたは硫酸化糖例えば担体に結合されたヘパリン、デ
キストランサルフェート、ヘパランサルフェート、コン
ドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェートまたは
デルマタンサルフェート好ましくはヘパリン−RSepharo
seもしくは−RFractogelまたはデキストランサルフェー
ト−RSepharoseもしくは−RFractogel上で、pH６.５〜
９.５好ましくはpH６.８〜８.５で、トリス、ＨＥＰＥ
Ｓまたはグリシン０.０１〜０.１モル／ｌを含有しかつ
好ましくはカルシウム５ミリモル／ｌを含有する緩衝溶
液から吸着しそして吸着されたタンパク質を前記のイオ
ン交換体クロマトグラフィーの場合と同様にイオン強度
を増加させることによって実施され得る。カルシウムの
不在下またはキレート試薬の存在下では、ｒＰＰ４、ｒ
ＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４−デルタはこれらの吸収剤に
結合しない。
【００１９】それ以上の精製はRAerosilまたはカオリン
特にRAerosil ２００（Serva社製）もしくはカオリン
（Serva社製）上で、大腸菌発酵培地（前記参照）から
またはトリス、ＨＥＰＥＳもしくはグリシン０.０１〜
０.１モル／ｌおよびカルシウム１〜２０ミリモル／ｌ
を含有するpH６.５〜９.５の緩衝溶液から吸着させるこ
とによって実施され得る。吸着されたタンパク質は前記
のイオン交換体クロマトグラフィーの場合と同様にイオ
ン強度を増加させることによりそして／またはキレート
化試薬好ましくはＥＤＴＡ １〜２０ミリモル／ｌまた
はクエン酸塩０.０１〜０.２モル／ｌまたは混合物を用
いることにより溶離され得る。
特にRAerosil ２００（Serva社製）もしくはカオリン
（Serva社製）上で、大腸菌発酵培地（前記参照）から
またはトリス、ＨＥＰＥＳもしくはグリシン０.０１〜
０.１モル／ｌおよびカルシウム１〜２０ミリモル／ｌ
を含有するpH６.５〜９.５の緩衝溶液から吸着させるこ
とによって実施され得る。吸着されたタンパク質は前記
のイオン交換体クロマトグラフィーの場合と同様にイオ
ン強度を増加させることによりそして／またはキレート
化試薬好ましくはＥＤＴＡ １〜２０ミリモル／ｌまた
はクエン酸塩０.０１〜０.２モル／ｌまたは混合物を用
いることにより溶離され得る。
【００２０】好ましい操作としては、大腸菌発酵混合物
からのまたはトリス／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳもしくはグリ
シン０.０１〜０.１モル／ｌからなるpH６.５〜９.５の
緩衝溶液からのリポコルチン含有溶液とカルシウムとを
混合して最終濃度１〜１０ミリモル／ｌにし、それを撹
拌下にカオリン、RAerosil ２００またはリン酸カルシ
ウムと接触させ、液体を分離し、吸着剤を洗浄しそして
吸着したタンパク質をキレート化試薬好ましくはＥＤＴ
Ａまたはクエン酸塩または混合物を用いて溶出する。溶
出物の透析後に、これらタンパク質のそれ以上の精製を
前記のようなヘパリン−樹脂上への吸着により継続す
る。
からのまたはトリス／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳもしくはグリ
シン０.０１〜０.１モル／ｌからなるpH６.５〜９.５の
緩衝溶液からのリポコルチン含有溶液とカルシウムとを
混合して最終濃度１〜１０ミリモル／ｌにし、それを撹
拌下にカオリン、RAerosil ２００またはリン酸カルシ
ウムと接触させ、液体を分離し、吸着剤を洗浄しそして
吸着したタンパク質をキレート化試薬好ましくはＥＤＴ
Ａまたはクエン酸塩または混合物を用いて溶出する。溶
出物の透析後に、これらタンパク質のそれ以上の精製を
前記のようなヘパリン−樹脂上への吸着により継続す
る。
【００２１】リン酸カルシウム上でのタンパク質の吸着
および溶出は、RAerosilおよびカオリン上への吸着につ
いて記載したように実施されるが、しかしカルシウムの
存在は結合に必要ではない。
および溶出は、RAerosilおよびカオリン上への吸着につ
いて記載したように実施されるが、しかしカルシウムの
存在は結合に必要ではない。
【００２２】特に好ましい操作は実施例１に記載のよう
に、組合せ（ＥＤＴＡ／RTriton）ＤＥＡＥ交換体、次
にＣａ2+によるヘパリンクロマトグラフィーそして次に
ＥＤＴＡによるヘパリンクロマトグラフィーである。
に、組合せ（ＥＤＴＡ／RTriton）ＤＥＡＥ交換体、次
にＣａ2+によるヘパリンクロマトグラフィーそして次に
ＥＤＴＡによるヘパリンクロマトグラフィーである。
【００２３】全ての該操作工程は室温で実施され得る。
例外は特記されているとおりである。
例外は特記されているとおりである。
【００２４】本明細書の記載で使用されている略記は下
記のとおりである。
記のとおりである。
【００２５】RAerosil ２００：二酸化珪素 ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸 Kaolin：水化珪酸アルミニウム ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＰ４：胎盤タンパク質４ Ｑ：第４アミノR Rivanol：６,９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン
ラクテート ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＶＡＣ：血管の抗凝血剤
Ｎ′−２−エタンスルホン酸 Kaolin：水化珪酸アルミニウム ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＰ４：胎盤タンパク質４ Ｑ：第４アミノR Rivanol：６,９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン
ラクテート ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＶＡＣ：血管の抗凝血剤
【００２６】
【実施例】以下に本発明を実施例により説明する。
【００２７】実施例１ ａ） リン脂質結合タンパク質の可溶化 トリス／ＨＣｌ ０.０５モル／ｌ、pH７.５、ＥＤＴＡ
５ミリモル／ｌ中にｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタ
１.０mg／mlを含有する遠心分離された大腸菌リゼイト
１.０ｌにRTritonＸ−１００を混合して最終濃度１.０
％にし、撹拌下において室温で１０分間インキュベート
しついで遠心分離した。
５ミリモル／ｌ中にｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタ
１.０mg／mlを含有する遠心分離された大腸菌リゼイト
１.０ｌにRTritonＸ−１００を混合して最終濃度１.０
％にし、撹拌下において室温で１０分間インキュベート
しついで遠心分離した。
【００２８】ｂ） イオン交換体クロマトグラフィー 遠心分離後の上澄液をトリス／ＨＣｌ ０.０２モル／
ｌ、pH７.５（カラム緩衝液１）と平衡状態にあるＤＥ
ＡＥ−RSepharose（“樹脂物質”）３００mlと撹拌下で
１時間接触させ、液体を濾過により除去し、吸着剤をカ
ラム緩衝液１で洗浄しそして樹脂物質をカラム中に充填
した。吸着されたタンパク質をＮａＣｌ０.２５モル／
ｌを含有するカラム緩衝液１で溶離した。
ｌ、pH７.５（カラム緩衝液１）と平衡状態にあるＤＥ
ＡＥ−RSepharose（“樹脂物質”）３００mlと撹拌下で
１時間接触させ、液体を濾過により除去し、吸着剤をカ
ラム緩衝液１で洗浄しそして樹脂物質をカラム中に充填
した。吸着されたタンパク質をＮａＣｌ０.２５モル／
ｌを含有するカラム緩衝液１で溶離した。
【００２９】ｃ） 担体に結合されたヘパリン上への吸
着（＋カルシウム） 透析後イオン交換体溶出液（３００ml）を、ＣａＣｌ2
添加後のｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタのタンパク質
濃度が０.２〜３.０mg／mlになるように調整して最終濃
度５ミリモル／ｌにし、トリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.
０２モル／ｌ、ＣａＣｌ2 ５ミリモル／ｌ（カラム緩衝
液２）と平衡状態にあるヘパリン−RFractogel ７０ml
と撹拌下で１時間接触させ、上澄液を▲▼去し、樹脂を
カラム緩衝液２で洗浄し次に吸着されたタンパク質を
０.３モルのＮａＣｌ緩衝液を用いてイオン強度を増加
させることにより溶離した。
着（＋カルシウム） 透析後イオン交換体溶出液（３００ml）を、ＣａＣｌ2
添加後のｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタのタンパク質
濃度が０.２〜３.０mg／mlになるように調整して最終濃
度５ミリモル／ｌにし、トリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.
０２モル／ｌ、ＣａＣｌ2 ５ミリモル／ｌ（カラム緩衝
液２）と平衡状態にあるヘパリン−RFractogel ７０ml
と撹拌下で１時間接触させ、上澄液を▲▼去し、樹脂を
カラム緩衝液２で洗浄し次に吸着されたタンパク質を
０.３モルのＮａＣｌ緩衝液を用いてイオン強度を増加
させることにより溶離した。
【００３０】ｄ） ヘパリンクロマトグラフィー（＋Ｅ
ＤＴＡ） 透析後ヘパリン溶出物（１００ml）とＥＤＴＡとを混合
して最終濃度１ミリモル／ｌにし、次にカラム中におい
てトリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.０２Ｍ、ＥＤＴＡ １m
M（カラム緩衝液３）と平衡状態にあるヘパリン樹脂５
０mlと接触させそしてｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタ
を含有するフロースルー（flow-through）をトリス／Ｈ
Ｃｌ、pH６.８〜８.５、０.０２Ｍの溶液に対して透析
しついで凍結乾燥した。凍結乾燥物を適当量の蒸留水ま
たは緩衝液中に溶解した後に、回収された生物活性は凍
結乾燥前の物質の活性の９５〜１００％であった。
ＤＴＡ） 透析後ヘパリン溶出物（１００ml）とＥＤＴＡとを混合
して最終濃度１ミリモル／ｌにし、次にカラム中におい
てトリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.０２Ｍ、ＥＤＴＡ １m
M（カラム緩衝液３）と平衡状態にあるヘパリン樹脂５
０mlと接触させそしてｒＰＰ４またはｒＰＰ４−デルタ
を含有するフロースルー（flow-through）をトリス／Ｈ
Ｃｌ、pH６.８〜８.５、０.０２Ｍの溶液に対して透析
しついで凍結乾燥した。凍結乾燥物を適当量の蒸留水ま
たは緩衝液中に溶解した後に、回収された生物活性は凍
結乾燥前の物質の活性の９５〜１００％であった。
【００３１】ｒＰＰ４−ヘパリンフロースルー（ｄ）の
純度は＞９５％であった。収率は出発物質を基準にして
約５５％でありそしてｒＰＰ４−デルタに関しては約４
０％であった。
純度は＞９５％であった。収率は出発物質を基準にして
約５５％でありそしてｒＰＰ４−デルタに関しては約４
０％であった。
【００３２】実施例２ ａ） リン脂質結合タンパク質の可溶化 全タンパク質濃度が約２０mg／mlで、ｒＰＰ４−Ｘ ０.
８mg／mlを含有する、トリス／ＨＣｌ、pH６.８、０.０
２Ｍ中の遠心分離された大腸菌リゼイト１.０ｌにTrito
nＸ−１００を混合して最終濃度１.０％にし、振とう下
で１０分間インキュベートしついで遠心分離した。
８mg／mlを含有する、トリス／ＨＣｌ、pH６.８、０.０
２Ｍ中の遠心分離された大腸菌リゼイト１.０ｌにTrito
nＸ−１００を混合して最終濃度１.０％にし、振とう下
で１０分間インキュベートしついで遠心分離した。
【００３３】ｂ） イオン交換体クロマトグラフィー 遠心分離後の上澄液を撹拌下で、トリス／ＨＣｌ、pH
６.８、０.０２Ｍと平衡状態にあるＤＥＡＥ−Sepharos
e ３００mlと接触させ、液体を濾過により除去し、吸着
剤を洗浄しついで樹脂物質をカラム中に充填した。吸着
されたタンパク質は１.５Ｍ ＮａＣｌ含有の緩衝液で溶
出された。
６.８、０.０２Ｍと平衡状態にあるＤＥＡＥ−Sepharos
e ３００mlと接触させ、液体を濾過により除去し、吸着
剤を洗浄しついで樹脂物質をカラム中に充填した。吸着
されたタンパク質は１.５Ｍ ＮａＣｌ含有の緩衝液で溶
出された。
【００３４】インキュベーション後にイオン交換体樹脂
を用いて▲▼去されたｒＰＰ４−Ｘ含有溶液をpH８.５
に調整し、ＣａＣｌ2 ５ミリモル／ｌと混合し、担体に
結合されたヘパリンとともにインキュベートし、吸着剤
をトリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.０２Ｍの溶液で洗浄
し、吸着されたタンパク質を溶出し、溶出液を透析し次
にＥＤＴＡ １ミリモル／ｌを添加後に再び前記実施例
１のｃおよびｄに記載のようにヘパリン樹脂を用いてイ
ンキュベートした。
を用いて▲▼去されたｒＰＰ４−Ｘ含有溶液をpH８.５
に調整し、ＣａＣｌ2 ５ミリモル／ｌと混合し、担体に
結合されたヘパリンとともにインキュベートし、吸着剤
をトリス／ＨＣｌ、pH８.５、０.０２Ｍの溶液で洗浄
し、吸着されたタンパク質を溶出し、溶出液を透析し次
にＥＤＴＡ １ミリモル／ｌを添加後に再び前記実施例
１のｃおよびｄに記載のようにヘパリン樹脂を用いてイ
ンキュベートした。
【００３５】驚くべきことに、ｒＰＰ４−Ｘはこれらの
条件下で陰イオン交換体に結合しないことが見出され
た。それにもかかわらず、大腸菌タンパク質の一部分が
樹脂上に吸着されたがために相当な精製効果が達成され
た。ヘパリンクロマトグラフィー処理後の収率は出発物
質を基準にして約６０％であった。すなわち＞９５％の
純度を有するｒＰＰ４−Ｘが約４８０mg得られた。
条件下で陰イオン交換体に結合しないことが見出され
た。それにもかかわらず、大腸菌タンパク質の一部分が
樹脂上に吸着されたがために相当な精製効果が達成され
た。ヘパリンクロマトグラフィー処理後の収率は出発物
質を基準にして約６０％であった。すなわち＞９５％の
純度を有するｒＰＰ４−Ｘが約４８０mg得られた。
【００３６】実施例３ カオリン、RAerosil ２００またはリン酸カルシウム上
への吸着 ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸまたはｒＰＰ４−デルタ１.０m
g／mlを含有し、全タンパク含量が約２０mg／mlであ
る、トリス／ＨＣｌ、pH７.５、０.０５Ｍからの遠心分
離された大腸菌リゼイトをＣａＣｌ2 ５mMと混合し、次
に別個の混合物で各場合においてタンパク質溶液１ml当
たりカオリンまたはRAerosil ２００の２５mgを用いて
撹拌下で１時間インキュベートしそして吸着剤をトリス
／ＨＣｌ、pH８.０、０.０２モル／ｌの溶液で洗浄し
た。結合のためにカルシウムの存在が不必要である以外
は上記と同じ条件下でリン酸カルシウム上への吸着を実
施した。吸着されたタンパク質はＥＤＴＡ ０.０２モル
／ｌまたは０.０１Ｍ ＥＤＴＡと０.１Ｍクエン酸ナト
リウムとの混合物を含有する０.０２Ｍトリス／ＨＣ
ｌ、pH８.０の溶液で溶出した。
への吸着 ｒＰＰ４、ｒＰＰ４−ＸまたはｒＰＰ４−デルタ１.０m
g／mlを含有し、全タンパク含量が約２０mg／mlであ
る、トリス／ＨＣｌ、pH７.５、０.０５Ｍからの遠心分
離された大腸菌リゼイトをＣａＣｌ2 ５mMと混合し、次
に別個の混合物で各場合においてタンパク質溶液１ml当
たりカオリンまたはRAerosil ２００の２５mgを用いて
撹拌下で１時間インキュベートしそして吸着剤をトリス
／ＨＣｌ、pH８.０、０.０２モル／ｌの溶液で洗浄し
た。結合のためにカルシウムの存在が不必要である以外
は上記と同じ条件下でリン酸カルシウム上への吸着を実
施した。吸着されたタンパク質はＥＤＴＡ ０.０２モル
／ｌまたは０.０１Ｍ ＥＤＴＡと０.１Ｍクエン酸ナト
リウムとの混合物を含有する０.０２Ｍトリス／ＨＣ
ｌ、pH８.０の溶液で溶出した。
【００３７】溶出液を０.０２Ｍトリス／ＨＣｌ、pH８.
５の緩衝溶液に対して透析した後に、タンパク質の精製
を実施例１のｃおよびｄに記載のように担体に結合され
たヘパリン上への吸着によって継続した。これらのヘパ
リンクロマトグラフィー処理後における＞９５％純粋な
タンパク質ｒＰＰ４およびｒＰＰ４−Ｘの収率は出発物
質を基準にして５０〜６０％であった。
５の緩衝溶液に対して透析した後に、タンパク質の精製
を実施例１のｃおよびｄに記載のように担体に結合され
たヘパリン上への吸着によって継続した。これらのヘパ
リンクロマトグラフィー処理後における＞９５％純粋な
タンパク質ｒＰＰ４およびｒＰＰ４−Ｘの収率は出発物
質を基準にして５０〜６０％であった。
【００３８】前記各実施例に記載のようにして精製され
たタンパク質ｒＰＰ４およびｒＰＰ４−Ｘをそれらの物
理化学的および生物学的性質について試験した。全ての
それらの性質は胎盤から単離された対応するタンパク質
の性質と同一であった。
たタンパク質ｒＰＰ４およびｒＰＰ４−Ｘをそれらの物
理化学的および生物学的性質について試験した。全ての
それらの性質は胎盤から単離された対応するタンパク質
の性質と同一であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＢＥ ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エゴン・アマン ドイツ連邦共和国デー−3550マルブルク. ザクセンリング８ (72)発明者 マテイーアス・グローテ ドイツ連邦共和国デー−3550マルブルク. グラデンバヒエルヴエーク65
Claims (9)
- 【請求項１】 陰イオン交換体でリポコルチン溶液を処
理することによるリポコルチンの精製において、該溶液
にキレート化剤および清浄剤を加え、その溶液を陰イオ
ン交換体と接触させそして液体を分離することからなる
上記のリポコルチンの精製方法。 - 【請求項２】 交換体を清浄剤不含緩衝溶液で清浄しそ
してリポコルチンを溶離する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 リポコルチンを液体から得る請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 リポコルチンが遺伝子操作で製造された
リポコルチンである請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 リポコルチンがｒＰＰ４、ｒＰＰ４−Ｘ
またはｒＰＰ４−デルタである請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 リポコルチン含有溶液を大腸菌、酵母菌
または動物の細胞培養から得る請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 リポコルチンが固定化された、サッカリ
ドのポリ硫酸エステル上でまたは担体に結合された硫酸
化糖上でのクロマトグラフィーによってさらに精製され
る請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 リポコルチンがカルシウムイオンの存在
下次いでＥＤＴＡの存在下における固定化された、サッ
カリドのポリ硫酸エステル上でのまたは担体に結合され
た硫酸化糖上でのクロマトグラフィーによりさらに精製
される請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 リポコルチンがカオリン、エーロシルま
たはリン酸カルシウム上への吸着によりさらに精製され
る請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4003773.8 | 1990-02-08 | ||
| DE4003773A DE4003773A1 (de) | 1990-02-08 | 1990-02-08 | Verfahren zur reinigung von lipocortinen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0795894A true JPH0795894A (ja) | 1995-04-11 |
Family
ID=6399691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3036501A Pending JPH0795894A (ja) | 1990-02-08 | 1991-02-07 | リポコルチンの精製方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0441274A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0795894A (ja) |
| KR (1) | KR910015699A (ja) |
| AU (1) | AU7083191A (ja) |
| CA (1) | CA2035927A1 (ja) |
| DE (1) | DE4003773A1 (ja) |
| IE (1) | IE910410A1 (ja) |
| PT (1) | PT96693A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3910240A1 (de) * | 1989-03-30 | 1990-10-04 | Behringwerke Ag | Pp4-delta, seine herstellung und verwendung |
| DE3911629A1 (de) * | 1989-04-10 | 1990-10-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur abtrennung von toxinen aus proteinloesungen |
| GB2542391A (en) | 2015-09-17 | 2017-03-22 | Annexin Pharmaceuticals Ab | Process of manufacture |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3315000A1 (de) * | 1983-04-26 | 1984-10-31 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)4(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3643182A1 (de) * | 1986-12-18 | 1988-06-30 | Behringwerke Ag | Arzneimittel enthaltend das gewebeprotein pp4, verfahren zur herstellung von pp4 und zu seiner pasteurisierung sowie die verwendung von pp4 |
| JP2660514B2 (ja) * | 1987-02-20 | 1997-10-08 | 興和株式会社 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
| EP0286830A3 (de) * | 1987-03-13 | 1990-01-24 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Verfahren zur Extraktion von Protein PP4 aus Geweben und die Verwendung von Citronensäure für diesen Zweck |
| DE3724726A1 (de) * | 1987-07-25 | 1989-02-02 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung des plazentaren gewebeproteins pp4 |
| DE3911629A1 (de) * | 1989-04-10 | 1990-10-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur abtrennung von toxinen aus proteinloesungen |
-
1990
- 1990-02-08 DE DE4003773A patent/DE4003773A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-02-02 EP EP19910101409 patent/EP0441274A3/de not_active Withdrawn
- 1991-02-06 KR KR1019910001997A patent/KR910015699A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-02-07 JP JP3036501A patent/JPH0795894A/ja active Pending
- 1991-02-07 AU AU70831/91A patent/AU7083191A/en not_active Abandoned
- 1991-02-07 CA CA002035927A patent/CA2035927A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-07 PT PT96693A patent/PT96693A/pt unknown
- 1991-02-07 IE IE041091A patent/IE910410A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE910410A1 (en) | 1991-08-14 |
| CA2035927A1 (en) | 1991-08-09 |
| DE4003773A1 (de) | 1991-08-14 |
| KR910015699A (ko) | 1991-09-30 |
| PT96693A (pt) | 1991-10-31 |
| EP0441274A2 (de) | 1991-08-14 |
| EP0441274A3 (en) | 1991-12-18 |
| AU7083191A (en) | 1991-08-15 |
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