JP2511500B2 - 胎盤組織タンパク質pp▲下4▼の精製法 - Google Patents

胎盤組織タンパク質pp▲下4▼の精製法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗凝固性質を有する胎盤組織タンパク質PP4
の精製法に関する。
組織タンパク質PP4は西ドイツ特許公開明細書第33 15
000A1号(米国特許第4,507,229号)に下記パラメータ
ーを有することが記載されている。
−αおよびαグロブリンの間にある電気泳動移動
度; −等電点4.85±0.15; −ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−含有ポリアクリル
アミドゲル中で測定した分子量35,000±5,000; −炭水化物含量2.4±0.94%(g/100g)(マンノース0.3
±0.2%、ガラクトース0.4±0.2%、キシロース0.1±0.
04%、グルコース0.2±0.1%、グルコサミン1.0±0.2
%、ノイラミン酸0.4±0.2%)および −下記アミノ酸組成: 例えば免疫吸着、ゲル過等(Sohn氏他、1985,Arch.
Gynaecol.236,225〜233)のようなこれまでのPP4の精製
法は工業的規模でのPP4の単離には適さない。
それゆえ本発明の目的はPP4の精製法を開発すること
であった。
今、驚くべきことに、PP4がカルシウムイオンの存在
下にサツカライドのポリ硫酸エステルあるいは硫酸化糖
に対して親和性を有しており、そして担体に結合された
サツカライドポリ硫酸エステルあるいは硫酸化糖に結合
されうることが見出された。
従って本発明はPP4を含有する溶液をカルシウムイオ
ンの存在下に、担体と結合したサツカライドポリ硫酸エ
ステルまたは硫酸化糖と接触させ、上澄み液を除去し、
PP4が負荷された担体マトリツクスを場合により洗浄し
そしてPP4を溶離することからなるPP4の精製法に関す
る。
サツカライドポリ硫酸エステルあるいは硫酸化糖が共
有結合されうる水不溶性担体イトリツクスとしては、例
えば不溶性のアガロース、デキストラン、ポリアクリル
アミド、アミノ官能化担体樹脂、またはポリエチレング
リコール、ペンタエリトリトールおよびメタクリレート
からなる共重合体、あるいはそれらの組み合わせが使用
されうる。
かかる担体へのサツカライドポリ硫酸エステルあるい
は硫酸化糖の結合は知られた方法に従い、例えばCNBrま
たはエポキシドで予め活性化された担体樹脂との反応に
よるか、あるいはアミノ官能化された担体樹脂へのカル
ボジイミド結合により行われうる。
好ましい態様においては、好ましくは0.01〜50mg/ml
のPP4および例えば塩化カルシウム、酢酸カルシウムま
たは乳酸カルシウムの形態の0.001〜0.2モル/のカル
シウムイオンを含有するpH5.5〜9.5のPP4含有溶液を、
担体に結合したサツカライドポリ硫酸エステルあるいは
担体に結合した硫酸化糖、例えば担体に結合したヘパリ
ン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン
硫酸、ケラタン硫酸またはデルマタン硫酸と接触させ、
上澄み液を除去し、PP4が負荷された担体物質を0.001〜
0.2モル/のカルシウムイオンおよび0.001〜0.4モル
/の塩、例えばNaCl、KClまたはLiClを含有するpH5.5
〜9.5の緩衝液で場合により洗浄し、そして塩濃度を高
めながら段階的またはグラジエント溶離を行うことによ
りPP4を溶離する。
特に好ましい態様においては、0.003〜0.02モル/
のカルシウムイオンを含有するpH7.0〜9.0のPP4含有溶
液を、担体と結合したヘパリンまたはデキストラン硫
酸、特に好ましくは担体と結合したヘパリンと接触さ
せ、この混合物を例えば5〜300分間4〜30℃でインキ
ユベーシヨンし、PP4が負荷された担体樹脂から上澄み
溶液を除去し、0.003〜0.02モル/のカルシウムイオ
ンおよび0.05〜0.3モル/のNaCl、KClまたはLiClを含
有するpH7.0〜9.0の溶液で場合により洗浄し、そして段
階的またはグラジエント溶離により塩濃度を0.35〜1.5
モル/まで高めることによりPP4を担体樹脂から溶離
させる。
場合により例えば他の担体に結合したサツカライドポ
リ硫酸エステルまたは担体に結合した硫酸化糖を用いて
続いて再クロマトグラフイーすることもできる。
それゆえ本発明方法は、PP4が少ない工程で非常に高
純度および高収率で工業的規模で単離されうる点で優れ
ている。
本発明を以下の実施例により説明する。
実施例 1 DE−A−3643182号実施例1に記載されるようにして
調製されたフエニル−セフアロース(Sepharose )溶
出液(PP4160μg/ml)3を緩衝液A(50ミリモル/
のトリス/HCl、25ミリモル/のNaCl、5ミリモル/
のCaCl2、pH8.0)で透析した。この溶液にバツチ法でヘ
パリン−セフアロース(Pharmacia社製,Uppsala,Swede
n,オーダーNo.17−0467−01)300mlを混合し、室温で30
分間攪拌しそして上澄み溶液を除去した。次に吸着剤を
緩衝液Aで洗いそしてPP4を段階的NaCl−グラジエント
(NaCl180ミリモル/、3000ミリモル/および1.5モ
ル/)により溶離した。場合によりかくして得られた
PP4物質をCaCl2を含有しない緩衝液A中でデキストラン
硫酸セフアロースで再クロマトグラフイーしてさらに精
製することもできる。この方法で精製されたPP4からSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約32kDaを有
するバンドが得られた。
実施例 2 フエニル−セフアロース溶出液1(実施例1と同じ)
を緩衝液Aで透析した。この透析物を緩衝液Aで平衡と
なしたデキストラン硫酸−セフアロース(エポキシ活性
化セフアロース6B,デキストラン硫酸,Pharmacia製,Upps
ala,Sweden,オーダーNos・17−0480−01,17−0340−01;
物質の結合は知られた方法、例えばSundberg,L.氏他の
(1974),J.Chromatogr.90,87〜98による)200mlに適用
しそして洗浄した。PP4をNaClグラジエントにより溶離
した。PP4を含有するフラクシヨンを緩衝液Aで透析後
例えばヘパリン−セフアロースで再クロマトグラフイー
した。PP4物質からSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分子量約32kDaを有するバンドが得られた。

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】PP4を含有する溶液をカルシウムイオンの
    存在下に、担体と結合したサツカライドのポリ硫酸エス
    テルまたは硫酸化糖と接触させ、上澄み液を除去し、PP
    4が負荷された担体マトリツクスを場合により洗浄しそ
    してPP4を溶離することからなるPP4の精製法。
  2. 【請求項2】担体物質が不溶性のアガロース、デキスト
    ラン、ポリアクリルアミド、アミノ官能化された担体樹
    脂、またはポリエチレングリコール、ペンタエリトリト
    ールおよびメタクリレートからなる共重合体、あるいは
    それらの組み合わせであることからなる請求項1記載の
    方法。
  3. 【請求項3】サツカライドポリ硫酸エステルがヘパリ
    ン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン
    硫酸、ケラタン硫酸またはデルマタン硫酸であることか
    らなる請求項1記載の方法。
  4. 【請求項4】担体に結合したヘパリンまたはデキストラ
    ン硫酸、好ましくは担体に結合したヘパリンが使用され
    ることからなる請求項1記載の方法。
  5. 【請求項5】0.001〜0.2モル/のカルシウムイオンが
    存在することからなる請求項1記載の方法。
  6. 【請求項6】担体に結合したヘパリン、デキストラン硫
    酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸
    またはデルマタン硫酸が使用されることからなる請求項
    1記載の方法。
  7. 【請求項7】0.001〜0.2モル/好ましくは0.003〜0.0
    2モル/のカルシウムイオンおよび0.001〜0.4モル/
    好ましくは0.05〜0.3モル/のNaCl、KClまたはLiCl
    を含有するpH5.5〜9.5の緩衝液が洗浄に使用されること
    からなる請求項1記載の方法。
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