JPS59164727A - Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法Info
- Publication number
- JPS59164727A JPS59164727A JP3983783A JP3983783A JPS59164727A JP S59164727 A JPS59164727 A JP S59164727A JP 3983783 A JP3983783 A JP 3983783A JP 3983783 A JP3983783 A JP 3983783A JP S59164727 A JPS59164727 A JP S59164727A
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- Japan
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- antigen
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（以下、ＨＢｓ抗
原と略称する）の精製法、さらに詳しく、は架橋ポリサ
ッカライドを硫酸エステル化して得られる架橋ポリサッ
カライド硫酸エステルを用いて力１ラムクロマトグラフ
ィーによりＨＢｓ抗原を高度に精製する方法に関する。
原と略称する）の精製法、さらに詳しく、は架橋ポリサ
ッカライドを硫酸エステル化して得られる架橋ポリサッ
カライド硫酸エステルを用いて力１ラムクロマトグラフ
ィーによりＨＢｓ抗原を高度に精製する方法に関する。
Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するＤＮＡ型の核
酸を持つ直径４２ ｎｍのウィルスによ、って引き起こ
される。このＢ型肝炎ウィルスは急性肝炎を引き起こす
だけでなく、ウィルスの持続感染により慢性肝炎、肝硬
変、また恐らく肝細胞ガンをも引き起こす。Ｂ型肝炎は
世界中に広く分布し、全く自覚症状なしに長い間ウィル
スを保持している潜在的ウィルス保菌者（以下単にキャ
リアという）も非常に多く存在する。そのウィルスのキ
ャリアは日本人の総人口の２〜３％、すなわち２００〜
３００万人いると言われ、東南アジア・アフリカではそ
の住民の１０〜１５％に達しており、世界中では約２億
人がこのウィルスのキャリアであると推定されている。
酸を持つ直径４２ ｎｍのウィルスによ、って引き起こ
される。このＢ型肝炎ウィルスは急性肝炎を引き起こす
だけでなく、ウィルスの持続感染により慢性肝炎、肝硬
変、また恐らく肝細胞ガンをも引き起こす。Ｂ型肝炎は
世界中に広く分布し、全く自覚症状なしに長い間ウィル
スを保持している潜在的ウィルス保菌者（以下単にキャ
リアという）も非常に多く存在する。そのウィルスのキ
ャリアは日本人の総人口の２〜３％、すなわち２００〜
３００万人いると言われ、東南アジア・アフリカではそ
の住民の１０〜１５％に達しており、世界中では約２億
人がこのウィルスのキャリアであると推定されている。
Ｂ型肝炎を予防するには、通常高度に精製したＨＢｓ抗
原を不活化してＢ型肝炎ワクチンとして用いる方法が有
効であり、このようなり型肝炎ワクチンは医療従事者等
のＢ型肝炎に感染する危険性が高い人々をＢ型肝炎の感
染から守るだけでなく、キャリアの新しい発生を防ぎ、
最終的には地上からＢ型肝炎を消滅させることも期待さ
れる。
原を不活化してＢ型肝炎ワクチンとして用いる方法が有
効であり、このようなり型肝炎ワクチンは医療従事者等
のＢ型肝炎に感染する危険性が高い人々をＢ型肝炎の感
染から守るだけでなく、キャリアの新しい発生を防ぎ、
最終的には地上からＢ型肝炎を消滅させることも期待さ
れる。
ところでこのＨＢｓ抗原は３種類のＢ型肝炎ウィルス関
連粒子、すなわち直径４２ｎｍで核酸を含有する直径２
７０ｍのコアを内部に持つＢ型肝炎ウィルスそのもので
あるディン（Ｄａｎｅ ）粒子、核酸を含まない直径２
２ ｎｍで長さ数十〜数百ｎｍの桿状粒子、および直径
２２ ｎｍの小型球型粒子の表面に保有されており、こ
のＨＢｓ抗原に対する抗体が該Ｂ型肝炎ウィルスの防御
抗体となり、かかる作用機構を利用してＢ型肝炎ワクチ
ンとして用いられる。
連粒子、すなわち直径４２ｎｍで核酸を含有する直径２
７０ｍのコアを内部に持つＢ型肝炎ウィルスそのもので
あるディン（Ｄａｎｅ ）粒子、核酸を含まない直径２
２ ｎｍで長さ数十〜数百ｎｍの桿状粒子、および直径
２２ ｎｍの小型球型粒子の表面に保有されており、こ
のＨＢｓ抗原に対する抗体が該Ｂ型肝炎ウィルスの防御
抗体となり、かかる作用機構を利用してＢ型肝炎ワクチ
ンとして用いられる。
従来技術
このようなり型肝炎ワクチンを製造するには、Ｂ型肝炎
ウィルスキャリアの血漿、遺伝子操作技術を利用した組
換え体の培養物や培養上澄などからＨＢｓ抗原を高度に
精製する必要がある。このＨＢｓ抗原の精製には一般に
その操作上高度の熟練を要し、それが工業的規模でのワ
クチンの製造を阻害する大きな原因となっている。
ウィルスキャリアの血漿、遺伝子操作技術を利用した組
換え体の培養物や培養上澄などからＨＢｓ抗原を高度に
精製する必要がある。このＨＢｓ抗原の精製には一般に
その操作上高度の熟練を要し、それが工業的規模でのワ
クチンの製造を阻害する大きな原因となっている。
現在ＨＢｓ抗原の最も一般的な精製法として知られてい
るものに密度勾配遠心法ＣＶｙａ ｓ 、 Ｇ、 Ｎ等
、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、 １０８ 、１１１
４ （１９７２） ；Ｈｉｒｓｈｍａｎ Ｓ、Ｚ、 Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、 ７１ 、３
３４５（１９７４）〕があるが、この方法には多量の塩
化セシウムおよび蔗糖を必要とするほか、超遠心機なら
びに精製段階およびその規模に応じて各種のローターを
必要とし、多量の経費がかかる欠点を有する。
るものに密度勾配遠心法ＣＶｙａ ｓ 、 Ｇ、 Ｎ等
、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、 １０８ 、１１１
４ （１９７２） ；Ｈｉｒｓｈｍａｎ Ｓ、Ｚ、 Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、 ７１ 、３
３４５（１９７４）〕があるが、この方法には多量の塩
化セシウムおよび蔗糖を必要とするほか、超遠心機なら
びに精製段階およびその規模に応じて各種のローターを
必要とし、多量の経費がかかる欠点を有する。
また抗原抗体反応を利用したアフィニティークロマトグ
ラフィーによりＨＢｓ抗原を精製する方法（Ｈｏｕｗｅ
ｎ 、 Ｂ等、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ、ｓ、１８５（１９７５）
）も提案されており、この方法は精製効率がきわめて良
好である反面、工業的規模で行なう場合にはクロマトグ
ラフィーゲル用Ｉ−ＴＢｓ抗体を得るために大量のｌｌ
Ｂｓ抗体陽性人血清が必要であるうえ、さらにＨＢｓ抗
体を一精製し、シアノゲンブロマイドなどを用いてゲル
マトリックスに結合させアフィニティーゲルを作らなく
てはならない。またこのアフィニティーゲルを用いたカ
ラムクロマトグラフィーでは、ＨＢｓ抗体とゲルとの結
合が比較的弱いためにＨＢｓ抗体およびＨＢｓ抗体−抗
原反応物が溶出時に脱離する恐れがある。これらがワク
チンに混入した場合には自己免疫疾患や、腎臓病を引き
起こす恐れがある。
ラフィーによりＨＢｓ抗原を精製する方法（Ｈｏｕｗｅ
ｎ 、 Ｂ等、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ、ｓ、１８５（１９７５）
）も提案されており、この方法は精製効率がきわめて良
好である反面、工業的規模で行なう場合にはクロマトグ
ラフィーゲル用Ｉ−ＴＢｓ抗体を得るために大量のｌｌ
Ｂｓ抗体陽性人血清が必要であるうえ、さらにＨＢｓ抗
体を一精製し、シアノゲンブロマイドなどを用いてゲル
マトリックスに結合させアフィニティーゲルを作らなく
てはならない。またこのアフィニティーゲルを用いたカ
ラムクロマトグラフィーでは、ＨＢｓ抗体とゲルとの結
合が比較的弱いためにＨＢｓ抗体およびＨＢｓ抗体−抗
原反応物が溶出時に脱離する恐れがある。これらがワク
チンに混入した場合には自己免疫疾患や、腎臓病を引き
起こす恐れがある。
また他の方法として、スルホン基を有する多糖類のデキ
ストラン硫酸、コンドロイチン硫−、ヘパリンなどをシ
アノゲンブロマイドを用いてセファロースＣＬ−４Ｂ（
スウェーデン・ファルマシア社製）あるいはセファロー
スＣＬ −６’ Ｂ （同上）に結合させてアフィニテ
ィーゲルとし、これを用いてＨＢｓ抗原を精製する方法
が提案されているが（Ｍ、 Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等 Ｖ
□ｘ Ｓａｎｇ 、 ４１ 、９１〜９７（１９８１）
；米国特許第４，１３８，２８７号；特開昭５２−１１
４０１８）、そのようなアフィニティーゲルはその製造
工程が複雑であり、またシアノゲンブロマイドを取り扱
うことには危険が伴ない、工業的規模での製造には問題
がある。またデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、
ヘパリンなどは高価であるうえに、これらの化合物をセ
ファロースなどの担体ゲルに結合させるには限界があり
、均一な品質のアフィニティーゲルおよび高度精製度を
もたらすゲルは得がたい。さらにシアノゲンブロマイド
を用いた結合は、その結合が比較的弱いので、スルホン
基を有する多糖類が脱離し、精製ＨＢｓ抗原に混入する
恐れもある。
ストラン硫酸、コンドロイチン硫−、ヘパリンなどをシ
アノゲンブロマイドを用いてセファロースＣＬ−４Ｂ（
スウェーデン・ファルマシア社製）あるいはセファロー
スＣＬ −６’ Ｂ （同上）に結合させてアフィニテ
ィーゲルとし、これを用いてＨＢｓ抗原を精製する方法
が提案されているが（Ｍ、 Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等 Ｖ
□ｘ Ｓａｎｇ 、 ４１ 、９１〜９７（１９８１）
；米国特許第４，１３８，２８７号；特開昭５２−１１
４０１８）、そのようなアフィニティーゲルはその製造
工程が複雑であり、またシアノゲンブロマイドを取り扱
うことには危険が伴ない、工業的規模での製造には問題
がある。またデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、
ヘパリンなどは高価であるうえに、これらの化合物をセ
ファロースなどの担体ゲルに結合させるには限界があり
、均一な品質のアフィニティーゲルおよび高度精製度を
もたらすゲルは得がたい。さらにシアノゲンブロマイド
を用いた結合は、その結合が比較的弱いので、スルホン
基を有する多糖類が脱離し、精製ＨＢｓ抗原に混入する
恐れもある。
発明の目的
本発明者等は、カラムクロマトグラフィーにより、より
簡単により安価にＨＢｓ抗原を精製する方法を見い出す
べく種々研究を重ねた結果、架橋ポリサツカライドを硫
酸エステル化して得られる架橋ポリサッカライド硫酸エ
ステルがＨＢｓ抗原と特異的に親和性を有することを見
い出し、この架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用い
て血清および血漿などの生化学物質からＨＢｓ抗原を精
製すると、きわめて高い精製度かつ高収率で、しかもき
わめて簡単に目的とする高度精製ＨＢｓ抗原が得られる
ことを知り、本発明を完成するに至った。すなわち本発
明はＢ型肝炎ワクチンの工業的な製造に有用なＨＢ ｓ
抗原の改良精′製法を提供するものであり、架橋ポリサ
ッカライド硫酸エステルを用いカラムクロマトグラフィ
ーによるＨＢｓ抗原の高度精製法を提供するものである
。
簡単により安価にＨＢｓ抗原を精製する方法を見い出す
べく種々研究を重ねた結果、架橋ポリサツカライドを硫
酸エステル化して得られる架橋ポリサッカライド硫酸エ
ステルがＨＢｓ抗原と特異的に親和性を有することを見
い出し、この架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用い
て血清および血漿などの生化学物質からＨＢｓ抗原を精
製すると、きわめて高い精製度かつ高収率で、しかもき
わめて簡単に目的とする高度精製ＨＢｓ抗原が得られる
ことを知り、本発明を完成するに至った。すなわち本発
明はＢ型肝炎ワクチンの工業的な製造に有用なＨＢ ｓ
抗原の改良精′製法を提供するものであり、架橋ポリサ
ッカライド硫酸エステルを用いカラムクロマトグラフィ
ーによるＨＢｓ抗原の高度精製法を提供するものである
。
本発明はＢ型肝炎ウィルスキャリアの血清または血漿、
遺伝子操作を利用した組換え体の培養物や培養上澄液な
どのＨＢｓ抗原含有液をカラムクロマトグラフィーによ
りＨＢｓ抗原を分離精製する方法において、クロマトグ
ラフィー用ゲルとして架橋ポリサッカライドを硫酸エス
テル化して得られる架橋ポリサッカライド硫酸エステル
を用いることを特徴とする。
遺伝子操作を利用した組換え体の培養物や培養上澄液な
どのＨＢｓ抗原含有液をカラムクロマトグラフィーによ
りＨＢｓ抗原を分離精製する方法において、クロマトグ
ラフィー用ゲルとして架橋ポリサッカライドを硫酸エス
テル化して得られる架橋ポリサッカライド硫酸エステル
を用いることを特徴とする。
本発明で用いられる架橋ポリサッカライ°ド硫酸エステ
ルとは、デキストラン、セルロース類、アガロースなど
のポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジ
クロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレングリコー
ルビスエポキシプロピルエーテル等の架橋剤で架橋して
得られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得
られるものである。架橋ポリサッカライドはすでに市販
されており例えば、架橋デキストランとしてセファデッ
クスＧ−１０、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００（ファ
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとしてセフ
ァローズＣＬ−２Ｂ、ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−５Ｂ（ファル
マシア社製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロ
ファインＧＣＬ−２５、ＧＣＬ ｇＱ（チッソ社製）
などがある。
ルとは、デキストラン、セルロース類、アガロースなど
のポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジ
クロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレングリコー
ルビスエポキシプロピルエーテル等の架橋剤で架橋して
得られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得
られるものである。架橋ポリサッカライドはすでに市販
されており例えば、架橋デキストランとしてセファデッ
クスＧ−１０、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００（ファ
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとしてセフ
ァローズＣＬ−２Ｂ、ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−５Ｂ（ファル
マシア社製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロ
ファインＧＣＬ−２５、ＧＣＬ ｇＱ（チッソ社製）
などがある。
これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下
クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させることによ
り所望の架橋ポリサッカライド硫酸エステルが得られる
。
クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させることによ
り所望の架橋ポリサッカライド硫酸エステルが得られる
。
この架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いてカラム
クロマトグラフィーによってＨＢｓ抗原を精製するには
通常のカラムクロマトグラフィーで採用される操作が適
用されるが、例えばカラムに該架橋ポリサッカライド硫
酸エステル（好ましくは球状粒子に成形したゲル）を充
填し、これをイオン強度が０．００１〜１．０程度であ
る適当な緩衝液、例えば、ツキルヘ７ （Ｍｃ１１ｖａ
ｉｎｅ’ｓ ）緩衝液（ＰＨ５，０）あるいは０．ＯＩ
Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＨ７，２）、０．１Ｍ食塩を含
むクエン酸緩衝液（ｐＨ７，２）などで平衡化したのち
に、カラムにＨＢｓ抗原含有液を通してＨＢｓ抗原を吸
着させ、上記平衡化に用いた緩衝液にて洗浄する。この
あとイオン強度が０．１〜５．０程度で、そのイオン強
度が上記平衡化、洗浄時に用いた緩衝液のイオン強度よ
り大である適当な緩衝液（ｐＨ５〜１０）、例えば０．
６Ｍ食塩を含むマツキルベン緩衝液（ｐＨ４〜８）、０
．６食塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）な△ どにて溶出することにより、高度に精製されたＨＢｓ抗
原が得られる。
クロマトグラフィーによってＨＢｓ抗原を精製するには
通常のカラムクロマトグラフィーで採用される操作が適
用されるが、例えばカラムに該架橋ポリサッカライド硫
酸エステル（好ましくは球状粒子に成形したゲル）を充
填し、これをイオン強度が０．００１〜１．０程度であ
る適当な緩衝液、例えば、ツキルヘ７ （Ｍｃ１１ｖａ
ｉｎｅ’ｓ ）緩衝液（ＰＨ５，０）あるいは０．ＯＩ
Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＨ７，２）、０．１Ｍ食塩を含
むクエン酸緩衝液（ｐＨ７，２）などで平衡化したのち
に、カラムにＨＢｓ抗原含有液を通してＨＢｓ抗原を吸
着させ、上記平衡化に用いた緩衝液にて洗浄する。この
あとイオン強度が０．１〜５．０程度で、そのイオン強
度が上記平衡化、洗浄時に用いた緩衝液のイオン強度よ
り大である適当な緩衝液（ｐＨ５〜１０）、例えば０．
６Ｍ食塩を含むマツキルベン緩衝液（ｐＨ４〜８）、０
．６食塩を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）な△ どにて溶出することにより、高度に精製されたＨＢｓ抗
原が得られる。
本発明の精製法によれば、用いる架橋ポリサッカライド
硫酸エステルは架橋ポリサッカライドのマトリックスに
直接スルホン基が結合しており、このためスルホン基含
量も高く、ＨＢＳ抗原の特異的吸着能にすぐれ、ＨＢｓ
抗原の精製度は数十倍に及び、しかもカラムクロマトグ
ラフィーによるＨＢｓ抗原の回収率は９０％以上１００
％近くに達する。この方法は工業的規模においても簡単
な操作で行ないうるうえ、特別の高価な試薬も必要とせ
ず、きわめて安価にＨＢｓ抗原の工業的精製を行なうこ
とができ、ゲルの安定性にもすぐれ、しかも得られる製
品に従来法におけるような抗原抗体反応物などの不純物
が混入する恐れのない利魚を合わせ有する。本発明の方
法は従来の技術である超遠心分離あるいはイオン交換ク
ロマトグラフィーと組み合わせることも可能であり、そ
の際は従来の結果に比して非常にすぐれた結果を得るこ
とが出来る。
硫酸エステルは架橋ポリサッカライドのマトリックスに
直接スルホン基が結合しており、このためスルホン基含
量も高く、ＨＢＳ抗原の特異的吸着能にすぐれ、ＨＢｓ
抗原の精製度は数十倍に及び、しかもカラムクロマトグ
ラフィーによるＨＢｓ抗原の回収率は９０％以上１００
％近くに達する。この方法は工業的規模においても簡単
な操作で行ないうるうえ、特別の高価な試薬も必要とせ
ず、きわめて安価にＨＢｓ抗原の工業的精製を行なうこ
とができ、ゲルの安定性にもすぐれ、しかも得られる製
品に従来法におけるような抗原抗体反応物などの不純物
が混入する恐れのない利魚を合わせ有する。本発明の方
法は従来の技術である超遠心分離あるいはイオン交換ク
ロマトグラフィーと組み合わせることも可能であり、そ
の際は従来の結果に比して非常にすぐれた結果を得るこ
とが出来る。
実施例
つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。 ） 参考例１ ０℃以下の温度にてピリジン２００ ｍｅにクロルスル
ホン酸１１−を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を
加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にエピクロル
ヒドリン架橋デキストランであるセファデックスＧ−５
０（ファルマシア社製）７．５ｙを加え、攪拌下６５〜
７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、水酸
化すｌ−ＩＪウム水溶液を加えて中和する。ゲルを沖過
分離し、０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液で充分に洗浄し
て架橋デキストラン硫酸エステルを得る。
的に説明する。 ） 参考例１ ０℃以下の温度にてピリジン２００ ｍｅにクロルスル
ホン酸１１−を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を
加熱し、６５〜７０℃に昇温する。この中にエピクロル
ヒドリン架橋デキストランであるセファデックスＧ−５
０（ファルマシア社製）７．５ｙを加え、攪拌下６５〜
７０℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、水酸
化すｌ−ＩＪウム水溶液を加えて中和する。ゲルを沖過
分離し、０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液で充分に洗浄し
て架橋デキストラン硫酸エステルを得る。
参考例２
前記参考例１と同様にして調製したピリジン−クロルス
ルホン酸混液２１０ ｄに、架橋セルロースゲルである
セルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の乾燥物７
．５ノを加え、６５〜ｂて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する
。ゲルを沖過分離し、０．ＯＩＭＵン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル７．２ｙを得
る。
ルホン酸混液２１０ ｄに、架橋セルロースゲルである
セルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の乾燥物７
．５ノを加え、６５〜ｂて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する
。ゲルを沖過分離し、０．ＯＩＭＵン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル７．２ｙを得
る。
参考例３
前記参考例１と同様にして調製したピリジン−クロルス
ルホン酸混液２１０ ｍｌに、架橋子ｆｆ ｏ −スゲ
ルであるセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
のピリジン包含体３０−を加え、６５〜７０℃にて４時
間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム
水溶液を加えて中和する。
ルホン酸混液２１０ ｍｌに、架橋子ｆｆ ｏ −スゲ
ルであるセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
のピリジン包含体３０−を加え、６５〜７０℃にて４時
間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム
水溶液を加えて中和する。
ゲルを沖過分離し、０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３ｍｅを得
る。
分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３ｍｅを得
る。
実施例１
前記参考例１と同様にして得られた架橋デキストラン硫
酸エステルをカラム（２６，４ｍ０Ｘ１８２ｆｆ）に充
填し、これを０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
７Ｍマツキルベレ緩衝液（ｐＨ７，４１”）で平衡化す
る。このカラム′にＨＢｓ抗原陽性人血清ＣＨＢＩＩ抗
原力価１ ： １６，０ＯＯＲＰ）（Ａ（逆受身血球凝
集反応）、蛋白質含量７０．θり／ ｍｅ （ローリ−
法）、比活性（ＲＰＨＡ／蛋白質含量）２２９）３．０
−を通液したのち、上記緩衝液で充分に洗浄し、ついで
０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍマツキルベ
ン緩衝液（ｐＨ７，３８）で溶出して、溶出画分４３．
２ｄを得る。
酸エステルをカラム（２６，４ｍ０Ｘ１８２ｆｆ）に充
填し、これを０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
７Ｍマツキルベレ緩衝液（ｐＨ７，４１”）で平衡化す
る。このカラム′にＨＢｓ抗原陽性人血清ＣＨＢＩＩ抗
原力価１ ： １６，０ＯＯＲＰ）（Ａ（逆受身血球凝
集反応）、蛋白質含量７０．θり／ ｍｅ （ローリ−
法）、比活性（ＲＰＨＡ／蛋白質含量）２２９）３．０
−を通液したのち、上記緩衝液で充分に洗浄し、ついで
０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍマツキルベ
ン緩衝液（ｐＨ７，３８）で溶出して、溶出画分４３．
２ｄを得る。
この溶出画分のＨＢｓ抗原力価は１：１，０２４ＲＰ）
ＬＡ、蛋白質含量０．４１ ｔｑ／ｍｅ Ｔ：比活性２
．４９８であった。ＨＢｓ抗原の回収率は９２．２％で
、精製度（溶出画分の比活性／原料血清の比活性）は１
０．９倍に達した。
ＬＡ、蛋白質含量０．４１ ｔｑ／ｍｅ Ｔ：比活性２
．４９８であった。ＨＢｓ抗原の回収率は９２．２％で
、精製度（溶出画分の比活性／原料血清の比活性）は１
０．９倍に達した。
実施例２
前記参考例３と同様にして得られた架橋アガロース硫酸
エステルゲルをカラム（２６，４ｍＪ２’Ｘ４７、 Ｏ
，ｍ ）に充填し、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０２７Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７，３６）で平衡化し
たのち、ＨＢｓ抗原陽性人血清（ＨＢｓ抗原力価１ ：
３２，０ＯＯＲＰＨＡ、蛋白質含量７０．０■／−１
比活性４５７）０．５−を通したのち、上記緩衝液で充
分洗浄する。通過液および洗浄流出液〔計１０．７５
ｍｅ ）のＨＢｓ抗原力価は３２ＲＰＨＡ、蛋白質含量
１，１１８り／−１比活性２８．７であった。ついで０
．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＩ−Ｉ ７．２３ ）で溶出して溶出画分８．０
０．ｒを得る。この溶出画分のＨＢｓ抗原力価２．０４
８ＲＰＨＡ、蛋白質含量０．２１７ｒｒｖ／ｍｅ、比活
性９４３７．８で、ＨＢｓ抗原の回収率は８５，２％で
あり、精製度は１６，０倍に達した。
エステルゲルをカラム（２６，４ｍＪ２’Ｘ４７、 Ｏ
，ｍ ）に充填し、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０２７Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７，３６）で平衡化し
たのち、ＨＢｓ抗原陽性人血清（ＨＢｓ抗原力価１ ：
３２，０ＯＯＲＰＨＡ、蛋白質含量７０．０■／−１
比活性４５７）０．５−を通したのち、上記緩衝液で充
分洗浄する。通過液および洗浄流出液〔計１０．７５
ｍｅ ）のＨＢｓ抗原力価は３２ＲＰＨＡ、蛋白質含量
１，１１８り／−１比活性２８．７であった。ついで０
．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＩ−Ｉ ７．２３ ）で溶出して溶出画分８．０
０．ｒを得る。この溶出画分のＨＢｓ抗原力価２．０４
８ＲＰＨＡ、蛋白質含量０．２１７ｒｒｖ／ｍｅ、比活
性９４３７．８で、ＨＢｓ抗原の回収率は８５，２％で
あり、精製度は１６，０倍に達した。
実施例３
前記参考例２と同様にして得られた架橋セルロース硫酸
エステルをカラム（２６，４ｓｍ＊Ｘ１０５−）に充填
し、これに０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７
Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７，３９）を通し平衡化する。
エステルをカラム（２６，４ｓｍ＊Ｘ１０５−）に充填
し、これに０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７
Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７，３９）を通し平衡化する。
このカラムにＨＢｓ抗原陽性人血漿２０−を上記緩衝液
で倍量に希釈したものを通液する。その後、上記緩衝液
で充分に洗浄する。ついで０．６Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．０２７Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７，３９）で溶出
する。この′結果を第１表に示す。
で倍量に希釈したものを通液する。その後、上記緩衝液
で充分に洗浄する。ついで０．６Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．０２７Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７，３９）で溶出
する。この′結果を第１表に示す。
第１表に示すように、ＨＢｓ抗原は溶出画分にほぼ回収
され、比活性および精製度は共に約１７倍に上昇した。
され、比活性および精製度は共に約１７倍に上昇した。
第１表
×）ラジオイムノアッセイ（ダイナボット社製、オーセ
リアｌｌ−１２５）で測定。
リアｌｌ−１２５）で測定。
（黒用正身、斉藤晴−： Ｊａｐａｎ 、 Ｊ 、Ｍｅ
ｄ 、Ｓｃｉ 。
ｄ 、Ｓｃｉ 。
Ｂｉｏｌ、、 ３２ 、４７〜５２（１９７９）を参照
）なお、上記精製したＨＢｓ抗原の一部を超遠心分析し
た。すなわち、日立７０Ｐ−７２超遠心機およびＲＰ
Ｓ ４０Ｔローターを用い、塩化セシウム密度勾配を作
り、これにサンプルをのせ、４０．００Ｏｒｐｍで１５
時間遠心したところ、このＨＢｓ抗原はＰ＝１．２付近
に鋭いピークを示した。これは精製されたＨＢｓ抗原が
単一のものであることを示すものである。
）なお、上記精製したＨＢｓ抗原の一部を超遠心分析し
た。すなわち、日立７０Ｐ−７２超遠心機およびＲＰ
Ｓ ４０Ｔローターを用い、塩化セシウム密度勾配を作
り、これにサンプルをのせ、４０．００Ｏｒｐｍで１５
時間遠心したところ、このＨＢｓ抗原はＰ＝１．２付近
に鋭いピークを示した。これは精製されたＨＢｓ抗原が
単一のものであることを示すものである。
比較例１
架橋セルロースゲルであるセルロファインＧＣＬ−２５
をカラム（２６，４鱈Ｊ２’Ｘ１２０鯖）に充填し、こ
れを０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍクエ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，４０）で平衡化する。このカラム
に実施例３で用いたＨＢｓ抗原陽性人血漿と同一ロット
の血漿２０．０−を上記緩衝液で２倍に希釈して通液し
、同緩衝液でカラムを充分に洗浄する。ついで０．６Ｍ
塩化す） ＩＪウムを含む０．０２７Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ７，４０）で溶出した。ＨＢｓ抗原の９８．２％
は素通り画分に回収され、また蛋白質もほぼ完全に（９
６，７％）素通り液に回収された。溶出画分に吸光度の
ピークは観察されず、またＨＢｓ抗原価は１：２以下（
ＲＰＨＡ）であり、ＨＢｓ抗原は全く精製出来なかった
。
をカラム（２６，４鱈Ｊ２’Ｘ１２０鯖）に充填し、こ
れを０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍクエ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，４０）で平衡化する。このカラム
に実施例３で用いたＨＢｓ抗原陽性人血漿と同一ロット
の血漿２０．０−を上記緩衝液で２倍に希釈して通液し
、同緩衝液でカラムを充分に洗浄する。ついで０．６Ｍ
塩化す） ＩＪウムを含む０．０２７Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ７，４０）で溶出した。ＨＢｓ抗原の９８．２％
は素通り画分に回収され、また蛋白質もほぼ完全に（９
６，７％）素通り液に回収された。溶出画分に吸光度の
ピークは観察されず、またＨＢｓ抗原価は１：２以下（
ＲＰＨＡ）であり、ＨＢｓ抗原は全く精製出来なかった
。
実施例４
参考例３と同様にして調製した架橋セルロース硫酸エス
テルをカラム（２６，４ｍＪ２’Ｘ １２５鱈）に充填
し、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２０）で平
衡化する。ＨＢｓ抗原陽性人血清を硫安塩析後、密度勾
配ゾーナル遠心機（日立７０Ｐ−７２）を用いて精製（
日立ＲＰＺ−３５−Ｔローター使用、蔗糖密度勾配置０
〜４５％ｗ／ｗ、３０．００ Ｏｒｐｍ、２０時間およ
び日立ＲＰ Ｚ −４８△ローター使用、蔗糖密度２０
〜５０％ｗ／ｗ、４２．００ Ｏｒｐｍ、２０時間）し
たのちに０．ＯＩＭＵン酸緩衝食塩液に透析したＨＢｓ
抗原含有液４０ ｔｎｅ （ＨＢｓ抗原力価１：３２．
０ＯＯＲＰＨＡ、免疫電気交差法で正常人血清陽性）を
上記カラムに通液する。０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液
（ｐＨ７，２０）で洗浄後、０，６Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２０）で
溶出し、溶出画分１２．９ ｍｅを得た。この溶出液は
ＨＢｓ抗原力価１ ：１０２４００ で免疫電気交差
法でＨＢｓ抗原以外の血漿蛋白は検出されず、ＨＢ ｓ
抗原はほぼ完°全に精製され、回収率は９６．０％であ
った。
テルをカラム（２６，４ｍＪ２’Ｘ １２５鱈）に充填
し、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２０）で平
衡化する。ＨＢｓ抗原陽性人血清を硫安塩析後、密度勾
配ゾーナル遠心機（日立７０Ｐ−７２）を用いて精製（
日立ＲＰＺ−３５−Ｔローター使用、蔗糖密度勾配置０
〜４５％ｗ／ｗ、３０．００ Ｏｒｐｍ、２０時間およ
び日立ＲＰ Ｚ −４８△ローター使用、蔗糖密度２０
〜５０％ｗ／ｗ、４２．００ Ｏｒｐｍ、２０時間）し
たのちに０．ＯＩＭＵン酸緩衝食塩液に透析したＨＢｓ
抗原含有液４０ ｔｎｅ （ＨＢｓ抗原力価１：３２．
０ＯＯＲＰＨＡ、免疫電気交差法で正常人血清陽性）を
上記カラムに通液する。０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液
（ｐＨ７，２０）で洗浄後、０，６Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２０）で
溶出し、溶出画分１２．９ ｍｅを得た。この溶出液は
ＨＢｓ抗原力価１ ：１０２４００ で免疫電気交差
法でＨＢｓ抗原以外の血漿蛋白は検出されず、ＨＢ ｓ
抗原はほぼ完°全に精製され、回収率は９６．０％であ
った。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原含有液をカラムクロマ
トグラフィーにかけて精製Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原を
得る方法において、クロマトグラフィー用ゲルとして架
橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いることを特徴と
するＢ型肝炎ウィルス表面抗原の精製方法。 （２）架橋ポリサッカライド硫酸エステルが架橋セルロ
ース硫酸エステルおよヒ架橋アガロース硫酸エステルお
よび架橋デキストラン硫酸エステルから選ばれる１種で
ある前記第（１）項記載の方法。 ＋３１ 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋セルロース硫酸エステルである前記第（２）
項記載の方法。 ＋４１ 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋アガロース硫酸エステルである前記第（２）
項記載の方法。 （５）架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロルヒド
リン架橋デキストラン硫酸エステルである前記第（２）
項記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3983783A JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
| US06/586,702 US4515714A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-06 | Method for purification of hepatitis B virus surface antigen |
| CA000449009A CA1216790A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| AT84102501T ATE38152T1 (de) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Verfahren zur reinigung des hepatitis-b-virusoberfl|chenantigens. |
| KR1019840001160A KR880002586B1 (ko) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 |
| DE8484102501T DE3474775D1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| EP84102501A EP0118885B1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| SG88/89A SG8889G (en) | 1983-03-09 | 1989-02-14 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3983783A JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59164727A true JPS59164727A (ja) | 1984-09-17 |
| JPH0585527B2 JPH0585527B2 (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=12564073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3983783A Granted JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59164727A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52114018A (en) * | 1976-03-18 | 1977-09-24 | Kabi Ab | Purification and isolation of hepatisis virus for producing vaccine |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP3983783A patent/JPS59164727A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52114018A (en) * | 1976-03-18 | 1977-09-24 | Kabi Ab | Purification and isolation of hepatisis virus for producing vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0585527B2 (ja) | 1993-12-07 |
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