JP3476242B2

JP3476242B2 - インフルエンザｈａ蛋白の精製方法

Info

Publication number: JP3476242B2
Application number: JP07777494A
Authority: JP
Inventors: 誠司石山; 潔井桁; 玲郎島村; 雄野村; 欣之佐伯; 治雄牧野
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Katakura Industries Co Ltd
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Katakura Industries Co Ltd
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1994-03-25
Publication date: 2003-12-10
Anticipated expiration: 2018-12-10
Also published as: JPH07258291A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術を用
い、昆虫または昆虫培養細胞で発現させて得られ、イン
フルエンザワクチンとして利用される精製インフルエン
ザＨＡ蛋白の製造法並びに当該蛋白製造用カラムに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】インフルエンザは、インフルエンザウイ
ルスにより引き起こされる疾患であるが、現在の所、直
接ウイルスに作用する医薬は見出されておらず、ワクチ
ンによる予防接種以外有効な予防・治療方法はない。こ
のインフルエンザワクチンとしては、現在、ウイルスの
外被膜であるインフルエンザＨＡ（ヘムアグルチニン）
蛋白とインフルエンザＮＡ（ノイラミニダーゼ）蛋白
（以下、それぞれ「ＨＡ蛋白」、「ＮＡ蛋白」と略称す
る）が広く利用されている。

【０００３】最近、組換えＤＮＡ技術を用い、ＨＡ蛋白
やＮＡ蛋白を昆虫、例えばカイコやヨトウガやそれらの
培養細胞で発現させて得る試みがなされている（特開平
３−１０８４８０号公報、Kazumichi Kuroda et al. Th
e EMBO Jounal 5,(6),PP 1359--1365,1986.）。この方
法によれば、効率よくＨＡ蛋白等が産生されることが知
られているが、これらの分離、精製に問題があり、精製
度が高いＨＡ蛋白、つまり精製ＨＡ蛋白は得られなかっ
た。すなわち、上記方法では昆虫体液や昆虫細胞液から
ＨＡ蛋白等を分離する必要があるが、昆虫細胞等に起源
をもつ核酸等の不純物はＨＡ蛋白等と分離しにくく、精
製ＨＡ蛋白が得られず、経済性や抗原性等の安全性の面
から問題となっていた。

【０００４】ＨＡ蛋白等の精製に関しては、例えば、セ
ルロース硫酸エステルや架橋ポリサッカライドを用いる
方法が既に知られている（特公昭６２−３０７５２
号）。しかしながら、この方法を組換えＤＮＡ技術によ
り得られるＨＡ蛋白に適用した場合、スルホニル基と結
合する化合物もカラム中に残存するため、ＨＡ蛋白等が
特異的に得られるわけではなく、種々の夾雑物が含まれ
る可能性があり、抗原性等の面からみて安全性に問題が
ないわけではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、昆虫またはそ
の細胞を利用する組換えＤＮＡ技術により、経済的でか
つ安全性の高いインフルエンザワクチンを提供するため
には、ＨＡ蛋白やＮＡ蛋白を高度に精製する方法の提供
が必要であり、特に、インフルエンザウイルスの主要な
感染防御抗原であるＨＡ蛋白については、よりその要求
が強かった。

【０００６】

【発明を解決するための課題】本発明者らは、上記実情
に鑑み精製ＨＡ蛋白の製造について鋭意研究を行った結
果、ＨＡ蛋白は特定の配列を有する糖鎖に特異的に吸着
され、しかも簡単な溶離処理によって容易にこの糖鎖か
ら離脱すること、さらにＤＮＡ等の夾雑物が効率よく除
去されるので精製ＨＡ蛋白が製造できることを見出し本
発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、昆虫または昆虫培養細
胞を用いる組換えＤＮＡ技術により得られるインフルエ
ンザＨＡ蛋白含有液を、担体に固定化された遊離末端が
ＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−である
少なくとも３個以上の糖分子を有する化合物に吸着させ
た後、インフルエンザＨＡ蛋白を溶離、回収することを
特徴とする精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法を提供
するものである。

【０００８】本発明の製造法において用いられる、末端
がＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−であ
る少なくとも３個以上の糖分子を有する化合物（以下、
「シアロ糖鎖保有化合物」という）としては、シアリル
ラクト系型糖鎖（ＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇａｌβ１,
３（４）ＧｌｃＮＡｃβ１,３Ｇａｌβ１−）を有する
化合物、シアリルガングリオ系糖鎖（ＮｅｕＡｃα２,
３Ｇａｌβ１,３ＧａｌＮＡｃβ１,４Ｇａｌβ１−）を
有する化合物、ヘマシド系糖鎖（ＮｅｕＡｃα２,３Ｇ
ａｌβ１,４Ｇｌｃβ１−）を有する化合物が挙げら
れ、これらは糖類、糖蛋白または糖脂質の何れであって
も良い。このうち、好ましく使用されるシアロ糖鎖保
有化合物の具体例としては、フェチュイン、グリコホリ
ン、ガングリオシド等が挙げられ、特に好ましくはフェ
チュインが挙げられる。

【０００９】一方、シアロ糖鎖保有化合物の固定化に用
いられる担体としては、アガロースゲル、セルロースゲ
ル、デキストリンゲル等の多糖類ゲルや、シリカゲル、
ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジ
ビニルベンゼンポリマー、ポリメタクリレート等の多孔
性ポリマーが利用され、このうち、セファローズ等の商
品名で販売されているアガロースゲルを用いることがよ
り好ましい。

【００１０】シアロ糖鎖保有化合物の固定化は、利用す
る担体に応じ、常法（例えば、「新生化学実験講座・タ
ンパク質１」Ｐ２２７〜２３７, 東京化学同人発行
等）に従って実施されるが、例えば、多糖類を担体とし
て用いる場合には、多糖類ゲル状の導入基にリガンドと
してのシアロ糖鎖保有化合物の官能基を結合させること
により行われる。

【００１１】多糖類ゲルとシアロ糖鎖保有化合物の結合
に当っては、シアロ糖鎖保有化合物の官能基に対応する
導入基を有する多糖類ゲルを選択することが必要であ
る。すなわち、官能基がアミノ基の場合は、臭化シアン
で活性化されたイミノ基、ω−カルボキシアルキル基、
活性化カルボキシル基（カルボキシフタレート基）、
エポキシ基等を導入基として有する多糖類ゲルを、官能
基がカルボキシル基の場合は、ω−アミノアルキル基、
チオール基等を導入基として有する多糖類ゲルを、官能
基がアルコール性水酸基である場合は、エポキシ基を導
入基として有する多糖類ゲルをそれぞれ選択することが
必要である。

【００１２】また、多孔質ポリマーを利用する場合は、
シアロ糖鎖保有化合物を多孔質に吸着させることにより
固定化することができる。

【００１３】以上のようにして作成したシアロ糖鎖保有
化合物が固定化された担体（以下、「シアロ糖鎖結合担
体」という）をインフルエンザＨＡ製造用カラムとして
用いた。精製ＨＡ蛋白を得るには、ＨＡ蛋白含有液を
シアロ糖鎖結合担体に付し、ＨＡ蛋白を選択的に吸着さ
せた後洗浄し、最後にＨＡ蛋白を溶離せしめれば良い。

【００１４】本発明で用いるＨＡ蛋白含有液としては、
カイコ、ヨトウガ等の昆虫にＨＡ蛋白で組換えた核多角
体病ウイルスを感染させた後、これらから得た体液や、
これらの昆虫培養細胞にＨＡ蛋白発現用核多角体病ウイ
ルスを感染させ、更に培養して得たホモジュネート等
を、エーテルもしくはエタノール等による有機溶媒処理
または界面活性剤処理し、インフルエンザ外被膜または
細胞膜からＨＡ蛋白を可溶化させた溶液を利用すること
ができる。

【００１５】ＨＡ蛋白含有溶液をシアロ糖鎖結合担体へ
付すには、通常のカラムクロマトグラフィーの手法（ま
たはバッチ法）にしたがって行えば良い。すなわち、例
えば、まずシアロ糖鎖結合担体をカラムに充填し、リン
酸緩衝液（ｐＨ７.０）等の緩衝液を用いて平衡化す
る。

【００１６】次いで、濾過、遠心分離等により固型物を
除去したＨＡ蛋白含有液を、適当な緩衝液等を用いてｐ
Ｈ６〜１１程度、好ましくはｐＨ６.５〜１０程度に調
整した後、平衡化したシアロ糖鎖結合担体カラムに、１
０ｃｍ／ｈ程度の流速（線流速）で注入し、ＨＡ蛋白を
吸着させる。この時のＨＡ蛋白含有液のイオン強度
は、透析等の手段により界面活性剤を除去した場合は、
０.００１〜２程度、好ましくは０.００１〜０.５程度
であり、また、ＨＡ蛋白含有液に界面活性剤が含まれて
いる場合の好ましいイオン強度は０.００１〜０.１であ
る。ここで使用される緩衝液の具体例としては、１５０
ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）や０.１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.２）が挙げられる。

【００１７】更に、このカラムをＨＡ蛋白の吸着に用い
たｐＨと同じか高いｐＨの洗浄液、あるいはより高いイ
オン強度、例えば０.００１〜２程度、好ましくは０.０
０１〜０.５程度、より好ましくは０.００１〜０.２程
度のイオン強度の洗浄剤でカラムを洗浄し、夾雑物を除
去する。使用される洗浄剤の例としては、０.１％ト
リトンＸ−１００を含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１
０.０）や１ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）が挙げられる。

【００１８】最後に、カラムの平衡化や洗浄に用いた緩
衝液より、イオン強度が大となるような適当な緩衝液を
用いてＨＡ蛋白をカラムから溶離する。この緩衝液に
は、０.０５〜５％程度の界面活性剤、例えばトリトン
ＸシリーズやトリトンＮシリーズとして知られているポ
リオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等の非イオ
ン系界面活性剤を含むことが好ましく、そのイオン強度
は０.１〜８程度、特に０.２〜２程度とすることが好ま
しい。このような緩衝液の例としては、４ＭＮａＣｌ
を含むリン酸緩衝液、０.１％トリトンＸ−１００と２
００ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液、０.１
％トリトンＸ−１００を含む１００ｍＭホウ酸緩衝液
等が挙げられる。

【００１９】また、上記の緩衝液に代え、５０ｍＭ以上
のＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含む緩衝液
またはデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）等のイオ
ン性界面活性剤を含む緩衝液を使用することもできる。
これらの場合の緩衝液のｐＨは、６〜１１程度、特に
６.５〜１０程度が好ましい。また、ＤＯＣ等のイオン
性界面活性剤は、０.２％以上、特に０.５％以上とする
ことが好ましい。

【００２０】この溶出したＨＡ蛋白画分は、そのままで
もかなり精製されているが、再度同じカラムクロマトグ
ラフィーにより更に精製しても良く、また、必要により
透析、イオン交換クロマトグラフィー等の手段により更
に精製しても良い。特に、精製をＤＥＡＥ−セファロフ
ァイン等の陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行
うと、極めて純度の高い精製ＨＡ蛋白を製造することが
できるので有利である。

【００２１】このようにして得られた精製ＨＡ蛋白は、
その精製度が高く、ＤＮＡ等の夾雑物がほとんど含まれ
ていないので、安全なインフルエンザワクチンとして使
用できるものである。本願精製インフルエンザＨＡ蛋白
をマウスに投与したところ、インフルエンザワクチンと
して使用するに十分なインフルエンザに対する抗体が産
生できた。

【００２２】

【作用】本発明は、ＨＡ蛋白がシアロ糖鎖に特異的に結
合し、この結合は高塩濃度かつ高ｐＨ条件（必要により
更に界面活性剤存在下）で容易に解離することを利用す
るものである。

【００２３】すなわち、まず、ＨＡ蛋白含有液を、ほぼ
中性条件下でシアロ糖鎖結合担体を充填したカラムに付
すと、ＨＡ蛋白は特異的にシアロ糖鎖に結合する。一
方、夾雑物のうち、正に帯電している蛋白質は、負に帯
電しているシアロ糖鎖に非特異的に結合し、負に帯電し
ている蛋白質は結合できず、溶出する。次いで、高ｐＨ
の洗浄液でＨＡ蛋白を結合したカラムを洗浄すると、大
部分の結合夾雑蛋白は、負から正に変化し、カラムから
溶離され、強く負に帯電している夾雑蛋白および特異的
に結合しているＨＡ蛋白のみがカラムに残存する。更
に、洗浄液と同じｐＨで、イオン強度が高い高塩濃度溶
液をカラムに注入すると、精製インフルエンザＨＡ蛋白
と少量の夾雑蛋白がカラムから溶離される（精製インフ
ルエンザＨＡ蛋白溶離液）。

【００２４】この状態の溶離液でもＨＡ蛋白の精製度は
高いが、更に陰イオン交換クロマトグラフィー等に付せ
ば、ＨＡ蛋白がカラムに吸着され、強く負に帯電した夾
雑蛋白は溶離されるので、吸着させたＨＡ蛋白を回収す
ると極めて精製度の高い精製インフルエンザＨＡ蛋白が
得られる（精製インフルエンザＨＡ蛋白回収液）。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。

【００２６】実施例１（１）ＨＡ蛋白発現用組換ウイルスを１０倍希釈し、カ
イコ幼虫（秋光×竜白；５齢、１日目）に５０μｌ／頭
接種した。接種後、５〜６日目に動かなくなったもの
を回収、凍結保存し、これをＨＡ蛋白発現用ウイルス感
染カイコとした。このＨＡ蛋白発現用ウイルス感染カイ
コ１００頭をホモジェナイズし、３９,８００×ｇで１
５分間高速遠心した。得られた沈澱を、２％トリトン
Ｘ−１００（和光純薬製）を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７.０）で可溶化し、この可溶化物を１４１,
０００×ｇ,で１時間超遠心し、上清（超遠心上清）を
得た。

【００２７】（２）得られた上清を、ＣＮＢｒ活性化セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社製）とフェチュイン
（シグマ社製ＮＯＦ２３７９）をマニュアルに従いカ
ップリングさせ、調製したフェチュイン−セファロース
カラム（ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ１ｍｌに
対し、１０ｍｇのフェチュインを結合させたもの）にア
プライした。このカラムを、まず１０倍容の０.１％ト
リトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７.０）、次いで０.１％トリトンＸ−１００を含む１０
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０.０）で洗浄した。０.
１％トリトンＸ−１００を含む１００ｍＭホウ酸緩衝
液で溶出したピーク部を集め、精製インフルエンザＨＡ
蛋白溶離液とした。

【００２８】（３）得られた精製インフルエンザＨＡ蛋
白溶離液を、０.１％トリトンＸ−１００を含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液に対して透析し、この透析液を更にフ
ェチュイン−セファロースカラムに付し、以下（２）
と同様にしてピーク部を回収し、透析回収物とした。得
られた透析回収物を２倍希釈してＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕ
ｌｏｆｉｎｅＡ−８００に吸着させ、トリトンＸ−１
００を含まない２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
２）で洗浄し、トリトンＸ−１００を除いた後、２００
ｍＭＮａＣｌを滴下することにより精製インフルエン
ザＨＡ回収液を得た。

【００２９】（４）次に、上記の各工程におけるＨＡ蛋
白濃度、液量、ＨＡ蛋白量および総蛋白量を表１に、こ
れらから求めた回収率、精製度および純度を表２にそれ
ぞれ示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【００３２】この結果から明らかなように、本発明方法
により精製度の高い精製インフルエンザＨＡ蛋白が高回
収率で得られた。すなわち、フェチュイン−セファロ
ースカラムの１回の処理でかなり高精製度の精製インフ
ルエンザＨＡ蛋白溶離液を得ることができ、また、ＤＥ
ＡＥ−セルロファインカラムと組合せることにより極め
て精製度の高い精製インフルエンザＨＡ蛋白回収液が得
られた。

【００３３】比較例（１）担体に固定化された遊離末端がＮｅｕＡｃα２,
３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−であり、糖分子が２個
の化合物について、試験した結果を次に示す。遊離末端
がＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−で、
糖分子２個の化合物としては、ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ／Ｇ
ａｌＮＡｃの構造式を持つムチン型糖タンパク質を用い
た。（２）実施例１と同様の方法で、ＨＡ蛋白発現用ウイル
ス感染カイコ１０頭をホモジナイズし、３９,８００×
ｇで１５分間高速遠心した。得られた沈澱を２％トリ
トン×１００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７.０）で可溶化し、この可溶化物を１４１,０００×ｇ
１時間超遠心して上清を得た。

【００３４】（３）得られた上清液をＣＮＢｒ活性化セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社製）とムチン型糖タン
パク質（シグマ社製）をマニュアルに従いカップリング
させ、調製したムチン−セファロースカラム（ＣＮＢｒ
活性化セファロース４Ｂ１ｍｌに対し、１０ｍｇのムチ
ン型糖タンパク質を結合させたもの）にアプライした。（４）次に０.１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液で洗浄し、２ＭＮａＣｌ緩衝液で溶
出させた。それぞれの工程におけるＨＡ蛋白質をエンザ
イム・イムノアッセイ法により測定した結果を表３に示
す。

【００３５】

【００３６】（５）表３の結果からカラム流出液中にＨ
Ａ蛋白量の７５％以上が含まれ、ムチン−セファロース
カラムのＨＡ蛋白に対する吸着性は殆どないことが理解
できる。なお、他の可溶化条件として種々の緩衝液、例
えば１０ｍＭリン酸緩衝液等を用いても同様の結果であ
った。（６）従って、担体に固定化された遊離末端がＮｅｕ
Ａｃα２,３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−であっても、
糖分子が３個未満の化合物は、精製インフルエンザＨＡ
蛋白の製造には適さないものと言える。

【００３７】実施例２実施例１で得られた精製インフルエンザＨＡ回収液中に
含まれる核酸量を、抗ＤＮＡ抗体を用いたスレッシュホ
ールドシステム（モレキュラーデバイス社）にて測定し
た。表４にその結果を示す。

【００３８】

【００３９】ワクチンとして使用できるＨＡ抗体価が、
市販のインフルエンザＨＡワクチンと同等以上に上昇す
る１回投与量（１ｓｈｏｔ）で換算すると、約３〜４ｐ
ｇの核酸含量となる。

【００４０】組換えＤＮＡ技術により作られた医薬品に
おいて、核酸の混入の安全性に対する懸念は、癌遺伝子
をワクチン投与時に摂取者に移入する危険性にあるが、
世界保険機構（ＷＨＯ）の委員会のまとめによれば、異
種核酸１００ｐｇ／ｓｈｏｔという核酸含量は、摂取者
に腫瘍を発生させる危険性が無視できるレベルであると
されている（ＷＨＯＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｐｏｒｔ
Ｎｏ.７４７、１９８７.およびＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＳｔａｎｄａｒｄｓ,６８：４
３−４９、１９８７）。

【００４１】一方、わが国の生物学的製剤基準によるイ
ンフルエンザワクチンの国家検定法では、１ｍｌ当り２
４０μｇ以上の蛋白質を含んではならないことになって
いるが（田村・倉田「感染・炎症・免疫」２１−
（１）、１〜１０.１９９１）、本発明の方法で得られ
た精製インフルエンザＨＡ蛋白回収液の、この最大蛋白
量２４０μｇ／ｍｌ中に含まれる核酸含量は約３〜４ｐ
ｇであり、十分に低いと考えられる。つまり、本発明の
方法で得られた精製インフルエンザＨＡ蛋白回収液は核
酸含量が著しく低く、安全性においても非常に優れてい
ることが分かる。

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、種々の夾雑物を含むＨ
Ａ蛋白含有溶液から精製ＨＡ蛋白を高純度に精製するこ
とができ、しかもこれを高回収率で取得することができ
る。また、実施例にも示したように、本発明により製造
された精製インフルエンザＨＡ蛋白は、核酸の混入がき
わめて少なく、混入する異種または同種ＤＮＡに由来す
る発癌遺伝子等組換えＤＮＡ技術により作られた医薬品
としては安全性が高いということができる。従って、本
発明の製造法によれば安全性および有効性の高いインフ
ルエンザワクチンを経済的に得ることが可能となる。以上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者井桁潔長野県松本市中央４丁目５−25 片倉工業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者島村玲郎埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者野村雄埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者佐伯欣之東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者牧野治雄熊本県菊池郡旭志村川辺財団法人化学及血清療法研究所菊池研究所内 (56)参考文献特開平３−108480（ＪＰ，Ａ) ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．256，ＮＯ．16（1981）, ｐ．8357−8363 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/005 - 14/19 C07K 1/14 - 1/22 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えＤＮＡ技術を用い、昆虫または昆
虫培養細胞で発現させて得られるインフルエンザＨＡ蛋
白含有液を、担体に固定化された遊離末端がＮｅｕＡｃ
α２,３（６）Ｇａｌβ１,３（４）−である少なくとも
３個以上の糖分子を有する化合物に吸着させた後、イン
フルエンザＨＡ蛋白を溶離、回収することを特徴とする
精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項２】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇ
ａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖分
子を有する化合物が、糖類、糖蛋白または糖脂質である
請求項１記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項３】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇ
ａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖分
子を有する化合物がフェチュイン、グリコホリンまたは
ガングリオシドから選ばれるものである請求項１または
２記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項４】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）Ｇ
ａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖分
子を有する化合物がフェチュインである請求項１〜３の
何れかの記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項５】担体が多糖類ゲルまたは多孔質ポリマー
である請求項１〜４の何れかの項記載の精製インフルエ
ンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項６】担体の多糖類ゲルが、アガロースゲル、
セルロースゲルまたはデキストリンゲルから選ばれるも
のである請求項１〜５の何れかの項記載の精製インフル
エンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項７】担体の多孔質ポリマーが、シリカゲル、
ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジ
ビニルベンゼンポリマーまたはポリメタクリレートから
選ばれるものである請求項１〜５の何れかの項記載の精
製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項８】担体が、アガロースゲルである請求項１
〜６の何れかの項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の
製造法。
【請求項９】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、吸着
時よりも高イオン強度及び高ｐＨで行う請求項１〜８の
何れかの項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造
法。
【請求項１０】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、界
面活性剤を含む緩衝液により行う請求項１〜９の何れか
の項記載のインフルエンザＨＡ蛋白の精製法。
【請求項１１】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、非
イオン系界面活性剤を含む緩衝液により行う請求項１〜
１０の何れかの項記載のインフルエンザＨＡ蛋白の精製
法。
【請求項１２】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、ポ
リオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含む緩衝
液により行う請求項１〜１１の何れかの項記載のインフ
ルエンザＨＡ蛋白の精製法。
【請求項１３】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、デ
オキシコール酸塩を含む緩衝液により行う請求項１〜１
０の何れかの項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製
造法。
【請求項１４】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離を、Ｎ
−アセチルノイラミン酸を含む緩衝液により行う請求項
１〜１０の何れかの項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋
白の製造法。
【請求項１５】インフルエンザＨＡ蛋白含有液が、昆
虫核多角体病ウイルスをベクターとする蛋白発現系によ
り生産したものである請求項１〜１４の何れかの項記載
の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項１６】インフルエンザＨＡ蛋白含有液が、カ
イコ核多角体病ウイルスをベクターとする蛋白発現系に
より生産したものである請求項１〜１５の何れかの項記
載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項１７】インフルエンザＨＡ蛋白の溶離液を陰
イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、インフル
エンザＨＡ蛋白を回収する請求項１〜１６の何れかの項
記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項１８】陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーがＤＥＡＥを結合させた担体である請求項１７記載の
精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項１９】陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーがＤＥＡＥ−セルロファインである請求項１７または
１８記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造法。
【請求項２０】請求項１〜１６の何れかの項記載の方
法で得られるインフルエンザＨＡ蛋白を含有する溶離
液。
【請求項２１】請求項１〜１９の何れかの項記載の方
法で得られるインフルエンザＨＡ蛋白を含有する回収
液。
【請求項２２】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）
Ｇａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖
分子を有する化合物を担体に固定化してなるインフルエ
ンザＨＡ蛋白の製造用カラム。
【請求項２３】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）
Ｇａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖
分子を有する化合物が、フェチュイン、グリコホリンま
たはガングリオシドから選ばれるものである請求項２２
記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造用カラム。
【請求項２４】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）
Ｇａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖
分子を有する化合物が、フェチュインである請求項２２
または２３記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造用
カラム。
【請求項２５】担体が多糖類ゲルまたは多孔質ポリマ
ーである請求項２２〜２４の何れかの項記載の精製イン
フルエンザＨＡ蛋白の製造用カラム。
【請求項２６】担体の多糖類ゲルが、アガロースゲ
ル、セルロースゲルまたはデキストリンゲルから選ばれ
るものである請求項２２〜２５の何れかの項記載の精製
インフルエンザＨＡ蛋白の製造用カラム。
【請求項２７】担体の多孔質ポリマーがシリカゲル、
ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジ
ビニルベンゼンポリマーまたはポリメタクリレートから
選ばれるものである請求項２２〜２５の何れかの項記載
の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造用カラム。
【請求項２８】担体がアガロースゲルである請求項２
２〜２６の何れかの項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋
白の製造用カラム。
【請求項２９】遊離末端がＮｅｕＡｃα２,３（６）
Ｇａｌβ１,３（４）−である少なくとも３個以上の糖
分子を有する化合物がフェチュインであり、固定させる
担体がアガロースゲルである請求項２２〜２４の何れか
の項記載の精製インフルエンザＨＡ蛋白の製造用カラ
ム。