WO2021262041A1 - Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека - Google Patents

Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека Download PDF

Info

Publication number
WO2021262041A1
WO2021262041A1 PCT/RU2021/050171 RU2021050171W WO2021262041A1 WO 2021262041 A1 WO2021262041 A1 WO 2021262041A1 RU 2021050171 W RU2021050171 W RU 2021050171W WO 2021262041 A1 WO2021262041 A1 WO 2021262041A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sorbent
protein
content
less
target protein
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050171
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Рахим Рахманкулыевич ШУКУРОВ
Николай Алексеевич ШАМОНОВ
Антон Николаевич МОРОЗОВ
Роман Владимирович ТИХОНОВ
Равиль Авгатович ХАМИТОВ
Александр Михайлович ШУСТЕР
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Publication of WO2021262041A1 publication Critical patent/WO2021262041A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, and in particular to the problem of developing highly efficient production technologies that make it possible to obtain highly purified drugs for medical use.
  • the invention relates to the development of a technology for the production of an active pharmaceutical substance of a recombinant human C 1-esterase inhibitor.
  • the invention can be used in the pharmaceutical industry, namely, when creating a drug for the treatment of hereditary angioedema (angioedema).
  • a drug is used based on a recombinant inhibitor of human C 1-esterase obtained from the milk of genetically modified rabbits, Rukonest®, as well as a drug isolated from donor plasma, Berinert®.
  • the recommended dose for these drugs is 500 IU as a slow intravenous injection or infusion.
  • the inventors proposed a technology for obtaining a highly purified drug.
  • Application EA201591278 discloses a method of treating or preventing a disorder associated with a deficiency of a C 1 esterase inhibitor by administering a composition containing a C 1 esterase inhibitor, wherein the inhibitor is present at a concentration of 400 U / ml or more.
  • the compositions are administered subcutaneously, intravenously.
  • the inhibitor can be plasma-derived or recombinantly produced.
  • the data given in the patent do not disclose production technologies and do not allow assessing the quality of the product obtained.
  • Application WO2015131154 discloses a method of treating acute attacks of HAO by administering sequential doses of a recombinant C 1 esterase inhibitor at a dose of 50 U / kg body weight, relates to the therapeutic use of a drug. This solution does not disclose the technological aspects of producing a drug based on a recombinant human C1-esterase inhibitor.
  • WO 1992022320 discloses a method for the treatment of systemic inflammatory diseases in mammals, incl. preeclampsia, the introduction of a therapeutically effective amount of C1-INH or its variants, without disclosing aspects of the production technology.
  • Application WO 2017/087882 A1 discloses a large number of aspects related to medical use, pharmaceutical composition and technology for the production of a human C 1 esterase inhibitor.
  • This solution discloses the process of cultivating a producer strain both in perfusion mode and in a fed-batch mode in a bioreactor with a volume of 5 liters; 10 l; 200 l; 500 l; 500 l; 1000 l; 2000 l; 5000 l; 10000 l; 15,000 l or 20,000 l with the final productivity in the culture liquid at the level of 5, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 , 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, or 300 mg per day (in perfusion mode).
  • the application also indicates that one or more methods based on the use of affinity chromatography, gel filtration, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, multimodal chromatography, hydrophobic chromatography, as well as non-chromatographic methods (centrifugation, ethanol precipitation, etc.) .) With obtaining a preparation of a Cl-esterase inhibitor with a purity of at least 90% (the method for assessing the purity is not specified).
  • the description indicates general approaches to the removal of contaminants: proteins of the producer strain, DNA, viruses using chromatographic methods with different principles of action.
  • compositions containing, as an active ingredient, an inhibitor of human C 1 esterase and auxiliary substances from the following categories: salts, salts with buffering properties, alcohols, various sugars, amino acids, etc. These compositions can have different pH values, as well as different format: solution or lyophilisate.
  • Application WO2017 / 087882 is the closest to the claimed invention, affecting the technological aspects of the production of a medicinal product.
  • the purification method known from the application WO2017 / 087882 can include various chromatography steps routinely used in protein purification, such as affinity, ion-exchange, anion-exchange, cation-exchange, multimodal, hydrophobic chromatography on the POROS XS sorbent, as well as mandatory are the stages of viral inactivation and diafiltration.
  • affinity affinity, ion-exchange, anion-exchange, cation-exchange, multimodal, hydrophobic chromatography on the POROS XS sorbent
  • the authors of the application did not manage to achieve the final purity of the drug necessary for the drug: the HCP content after all stages of purification was about 1960 ng / mg. The yield of the monomeric form was about 90%.
  • the residual DNA content after all stages of purification ranged from 5 to 13 pg / mg.
  • the above chromatographic purification technology makes it possible to obtain a preparation with a low DNA content, however, during the production of a batch under GMP conditions, the obtained DNA level was 13 pg / mg, which almost corresponds to the declared upper border of the norm (14 pg / mg), and indicates the variability of the process with T.Z. removing DNA.
  • the technical result to be achieved by the claimed invention is to develop a method for producing a highly purified recombinant human C 1-esterase inhibitor for medical use, with a high yield of biologically active monomeric form of the protein relative to the target protein content in the culture liquid.
  • a highly efficient technology for producing an active pharmaceutical substance of a recombinant human C1-esterase inhibitor was developed, scaled up and transferred to production, which makes it possible to obtain a drug containing no more than 10 ng / mg of proteins of the producer strain; no more than 5 pg / mg DNA; not less than 99.0% of the monomeric form of the protein; not less than 99.5% of the basic form according to reverse-phase HPLC and specific activity not less than 9.0 IU / mg.
  • the claimed production technology makes it possible to obtain an active pharmaceutical substance suitable for use in clinical trials and commercial release.
  • the combination of the above conditions made it possible to obtain a protein solution with a protein content of the producer strain at the level of 5000 ng / mg; DNA at the level of 7000-8000 pg / mg; the content of the monomeric form of the protein at the level of 95.0%; while the protein yield from stage amounted to about 95% of its content in the culture fluid.
  • Heparin Sepharose FF affinity sorbent can significantly reduce the content of proteins of the producer strain and DNA. It was found that at a pH value of 7.0 to 8.0 and a conductivity of 0.1 to 10.0 mS / cm (mS / cm) of the applied protein solution, as well as the elution of the target protein by increasing the sodium chloride content in the mobile phase to values 0.2 - 0.4 M, the protein content of the producer strain decreases to a level of about 3000 ng / mg, and the DNA content to a level of less than 50 pg / mg. Table 4 shows data for screening elution conditions on Heparin Sepharose FF.
  • a purification stage was developed that allows one to significantly reduce the amount of proteins of the producer strain in the eluate of the target protein - to a level of less than 3000 ng / mg, while bringing the DNA content to a level of less than 50 pg / mg.
  • the protein content of the producer strain is not more than 10 ng / mg
  • DNA content of the producer strain is not more than 5 pg / mg; ⁇ Specific specific activity not less than 9.0 IU / mg.
  • the yield of the target protein relative to its content in the culture fluid was about 80% (500 mg of the target protein from 1 liter of the culture fluid).
  • Phenyl Sepharose FF, Tosoh Butyl 650M, Capto Phenyl, as well as other commercially available sorbents with a similar principle of action can be used as a suitable hydrophobic sorbent containing phenyl groups.
  • the culture liquid with a volume of 1 L was applied to a column with an IMAC Sepharose sorbent (column volume (CV) 0.2 L), previously activated with 2 CV of 0.1 M zinc chloride solution and equilibrated with a buffer solution of 20 mM Tris, pH 7.2. After application, the sorbent was washed with 3 CV of the same buffer solution. The column was washed with 3 CV buffer solution of 20 mM Tris, 15 mM imidazole, pH 7.5. The target protein bound to the sorbent was eluted with a buffer solution of 20 mM Tris, 150 mM imidazole, pH 7.2. Viral inactivation was performed using a solvent-detergent method.
  • the obtained protein fraction was diluted 2-fold with water and applied to a Heparin Sepharose (CV 0.1 L) column pre-equilibrated with 20 mM Tris buffer, pH 7.2. After application, the sorbent was washed with 3 CV of the same buffer solution. The target protein bound to the sorbent was eluted with a buffer solution of 20 mM Tris, 200 mM sodium chloride, pH 7.2.
  • the next stage of purification was carried out on a column with a Q Sepharose FF sorbent (CV 0.1 L), which was pre-equilibrated with a buffer solution of 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.0.
  • a protein solution was applied in a 50% gradient of purified water to a balanced column.
  • the sorbent with adsorbed protein was washed with a buffer solution of 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.2.
  • Elution of the target protein was performed with a gradient of a buffer solution of 20 mM HEPES, 200 mM sodium chloride, pH 7.5 in a buffer solution of 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.5 (from 0 to 100% in 10 column volumes).
  • the next stage of purification was carried out on a Capto Phenyl High Sub sorbent.
  • the column volume was 10 ml.
  • the target protein load is not more than 50 g of the target protein per 1 liter of sorbent.
  • the Capto Phenyl High Sub column was pre-equilibrated with 20 mM HEPES, 2 M sodium chloride, pH 7.0 buffer.
  • the target protein for application was prepared by adding a 5 M sodium chloride solution to a conductivity of 145-155 mS / cm. Next, the protein solution was applied to the balanced column, collecting the filtrate containing the target protein. After loading, the column was washed with 20 mM HEPES, 2 M sodium chloride, pH 7.0 buffer solution while continuing to collect the filtrate.
  • Antiviral nanofiltration of the obtained protein fraction was carried out on a Planova 15N filter, then the filtrate was concentrated on a VIVAFLOW 200 tangential filtration membrane with a pore diameter of 30 kDa and dialyzed against a buffer solution of 9.4 g / L glycine, 2.9 g / L sodium citrate, 8 g / l sodium chloride, pH 7.0.
  • the resulting protein solution was filtered through a sterilizing filter with a pore size of 0.22 ⁇ m into a sterile container under aseptic conditions.
  • the total yield of the purified protein was about 500 mg from 1 liter of culture fluid.
  • the resulting active pharmaceutical ingredient has the following quality characteristics: 99.7% of the monomeric form of the target protein; 99.8% basic form by reverse phase HPLC; 1.9 pg / mg DNA of the producer strain; 2.9 ng / mg protein producer strain; specific activity 9.3 IU / mg.
  • the preparation of the column was carried out by washing with 25.0 L of 0.5 M zinc chloride solution, followed by washing with a starting buffer solution: 20 mM Tris, pH 7.2.
  • the culture fluid was not subjected to preliminary preparation.
  • the culture liquid was applied to the prepared sorbent, after which the sorbent was sequentially washed with a starting buffer solution and a buffer solution of 20 mM Tris, 5 mM imidazole, pH 7.2.
  • the target protein was eluted from the column with a buffer solution of 20 mM Tris, 150 mM imidazole, pH 7.2.
  • viral inactivation of the resulting solution was carried out by adding detergents: polysorbate 80 to 1%; tributyl phosphate to a concentration of 0.3%.
  • the incubation time was at least 1 hour at room temperature.
  • the target protein was purified on the Heparin Sepharose FF affinity sorbent.
  • a column with Heparin Sepharose FF (column volume (CV) 12.0 L) was pre-equilibrated with 20 mM Tris buffer, pH 7.5.
  • a protein solution was applied in a 50% gradient of purified water to a balanced column.
  • the sorbent with adsorbed protein was washed with a buffer solution of 50 mM Tris, pH 7.5. Elution of the target protein was performed with a buffer solution of 50 mM Tris, 200 mM sodium chloride, pH 7.5
  • the next stage of chromatographic purification was carried out on a Q Sepharose FF sorbent.
  • the column volume was 2 liters.
  • the target protein load is not more than 70 g of the target protein per 1 liter of sorbent.
  • the column with Q Sepharose FF was pre-equilibrated with buffer 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.5.
  • a protein solution was applied in a 50% gradient of purified water to a balanced column.
  • the sorbent with adsorbed protein was washed with a buffer solution of 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.2.
  • Elution of the target protein was performed with a gradient of a buffer solution of 20 mM HEPES, 200 mM sodium chloride, pH 7.0 in a buffer solution of 20 mM Tris, 50 mM sodium chloride, pH 7.5 (from 0 to 100% in 10 column volumes).
  • the next stage of purification was carried out on a Capto Phenyl High Sub sorbent.
  • the column volume was 2 liters.
  • the target protein load is not more than 50 g of the target protein per 1 liter of sorbent.
  • the Capto Phenyl High Sub column was pre-equilibrated with 20 mM HEPES, 2 M sodium chloride, pH 7.0 buffer.
  • the target protein for application was prepared by adding a 5 M sodium chloride solution to a conductivity of 145-155 ⁇ S / cm. Next, the protein solution was applied to the balanced column, collecting the filtrate containing the target protein. After application, the target protein was washed with a buffer solution of 20 mM HEPES, 2 M sodium chloride, pH 7.0.
  • diafiltration was performed using Sartorius diafiltration cassettes, PES material, with a cut-off size of 50 kDa.
  • the cassettes were previously washed with a buffer solution of 125 mM glycine, 11.2 mM sodium citrate, 136.8 mM sodium chloride, pH 7.0.
  • the diafiltration process was carried out at a protein concentration of 50 mg / ml. After completion of the diafiltration process, the protein concentration was brought to a value of 15-18 mg / ml.
  • antiviral nanofiltration of the resulting protein solution was carried out on a Millipore Virosolve filter.
  • the filter was pre-washed with a buffer solution of 125 mM glycine, 11.2 mM sodium citrate, 136.8 mM sodium chloride, pH 7.0.
  • the protein solution was subjected to a prepared antiviral filter.
  • the resulting protein solution was filtered through a sterilizing filter with a pore size of 0.22 ⁇ m into a sterile container under aseptic conditions.
  • the total yield of the purified protein was about 500 mg from 1 liter of culture fluid.
  • the resulting active pharmaceutical ingredient has the following quality characteristics: 99.8% of the monomeric form of the target protein; 99.9% basic form by reversed phase HPLC; 1.0 pg / mg DNA of the producer strain; 5.0 ng / mg proteins of the producer strain; specific activity 9.5 IU / mg.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к проблеме создания эффективных технологий получениях высокоочищенных белковых лекарственных препаратов для медицинского применения. Предложена новая схема очистки рекомбинантного ингибитора С1-эстеразы человека, позволяющая получать лекарственное средство с содержанием белков штамма продуцента на уровне не более 10 нг/мг, ДНК штамм-продуцента на уровне не более 5 пг/мг, мономерной формы – не менее 99,0 %, основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ не менее 99,5 %, удельной активностью не менее 9,0 МЕ/мг. Выход целевого белка от содержания в культуральной жидкости составляет не менее 80 %, что обеспечивает низкую себестоимость получаемого препарата. Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности, а именно, при создании лекарственного препарата для терапии наследственного ангионевротического отека (отека Квинке).

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО
ИНГИБИТОРА С1-ЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к проблеме разработки высокоэффективных технологий производства, позволяющих получать высокоочищенные лекарственные средства для медицинского применения. В частности, изобретение относится к разработке технологии производства активной фармацевтической субстанции рекомбинантного ингибитора С 1-эстеразы человека. Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности, а именно, при создании лекарственного средства для терапии наследственного ангионевротического отека (отека Квинке).
В настоящее время при терапии вышеперечисленных заболеваний применяется препарат на основе рекомбинантного ингибитора С 1-эстеразы человека, получаемого из молока генетически модифицированных кроликов, «Руконест®», а также препарат, выделенный из плазмы доноров, «Беринерт®». Рекомендуемая доза данных препаратов составляет 500 ME в виде медленной внутривенной инъекции или инфузии. С целью улучшения качества жизни пациентов, снижения частоты проявления нежелательных явлений, связанных, в основном, со степенью чистоты используемого препарата, авторы изобретения предложили технологию получения высокоочищенного лекарственного средства. В качестве критических параметров качества были использованы: содержание белков штамма-продуцента, содержание ДНК, содержание мономерной формы действующего вещества, содержание основной формы белка по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ, специфическая активность. Описание чертежей.
Рис. 1. Схема очистки рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека.
Из уровня техники известны следующие решения для технологии производства ингибитора Cl -эстеразы человека.
Заявка ЕА201591278 раскрывает способ лечения или профилактики расстройства, ассоциированного с дефицитом ингибитора С 1 -эстеразы, введением композиции, содержащей ингибитор С 1-эстеразы, где ингибитор присутствует в концентрации 400 ед/мл или более. Композиции вводят подкожно, внутривенно. Ингибитор может быть получен из плазмы или продуцирован рекомбинатным способом. Данные, приведенные в патенте, не раскрывают технологии производства и не позволяют оценить качество получаемого препарата.
Заявка WO2015131154 раскрывает способ лечения острых приступов НАО введением последовательных доз рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы в дозе 50 ед/кг веса тела, относится к терапевтическому применению лекарственного средства. В данном решении не раскрываются технологические аспекты получения лекарственного средства на основе рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека.
Заявка WO 1992022320 раскрывает способ лечения системных воспалительных заболеваний млекопитающих, в т.ч. преэклампсии, введением терапевтически эффективного количества C1-INH или его вариантов, не раскрывая аспекты технологии производства.
Заявка WO 2017/087882 А1 (Recombinant human Cl esterase inhibitor and uses thereof) раскрывает большое количество аспектов, связанных медицинским применением, фармацевтической композицией и технологией производства ингибитора С 1 -эстеразы человека. В данном решении раскрывается процесс культивирования штамма-продуцента как в режиме перфузии, так и в режиме fed-batch в биореакторе объемом 5 л; 10 л; 200 л; 500 л; 500 л; 1000 л; 2000 л; 5000 л; 10000 л; 15000 л или 20000 л с конечной продуктивностью в культуральной жидкости на уровне 5, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, или 300 мг в день (в режиме перфузии). В заявке также указывается, что для очистки целевого продукта могут применяться один или более метод, основанный на применении аффинной хроматографии, гель-фильтрационной, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, гидрофобной хроматографии, а также нехроматографические методы (центрифугирование, преципитация этанолом и др.) с получением препарата ингибитора Cl -эстеразы с чистотой не менее 90 % (метод оценки чистоты не указывается). В описании указываются общие подходы к удалению контаминантов: белков штамма-продуцента, ДНК, вирусов с применением хроматографических методов с различным принципом действия. Дополнительно заявка раскрывает фармацевтические композиции, содержащие в качестве действующего вещества ингибитор С 1 -эстеразы человека и вспомогательные вещества из следующих категорий: соли, соли с буферными свойствами, спирты, различные сахара, аминокислоты и др. Указанные композиции могут иметь различные значения pH, а также различный формат: раствор или лиофилизат. Заявка WO2017/087882 является наиболее близкой к заявленному изобретению, затрагивая технологические аспекты производства лекарственного средства.
Основными недостатками решений, раскрытых в заявке WO2017/087882, являются:
- описаны только общие подходы к производству, которые могут быть применены к производству любого лекарственного средства на основе белка, без привязки к конкретному продукту; описываемая в примерах технология очистки не имеет отношения к производственному процессу, а носит характер научно-исследовательской работы. При этом применяются методы элюции на сорбентах POROS XS, GigaCap Q с пофракционным анализом, которые являются нетехнологичными и требуют значительного количества ресурсов для реализации стратегии внутрипроизводственного контроля;
- авторы решения провели большой объем исследований с целью снижения уровня белков штамма-продуцента и ДНК в финальном препарате, однако полученные результаты свидетельствуют о крайне высоком уровне данных контаминантов в конечном продукте. В частности, стадия фильтрации через мембрану Sartobind STIC, заявляемая авторами в качестве основной для очистки белков штамма-продуцента, не является достаточно эффективной, что подтверждается приведенными в патенте результатами (таблица 1). Уровень снижения белков штамма-продуцента составил 0,21 Log, что позволило получить в финальном препарате содержание белков штамма-продуцента на уровне около 2000 нг/мг.
Таблица 1. Оценка уровня снижения белков штамма-продуцента после проведения очистки целевого белка на стадии Sartobind STIC, WO2017/087882
Figure imgf000006_0001
Известный из заявки WO2017/087882 способ очистки может включать в себя различные стадии хроматографии, рутинно применяемые при очистке белков, такие как аффинная, ион-обменная, анион-обменная, катион-обменная, мультимодальная, гидрофобная хроматографии на сорбенте POROS XS, а также обязательными являются стадии вирусной инактивации и диафильтрации. Несмотря на разнообразие применяемых подходов, авторам заявки не удалось добиться необходимой для лекарственного средства финальной чистоты препарата: содержание НСР после всех стадий очистки составило около 1960 нг/мг. Выход мономерной формы составлял около 90%. Содержание остаточной ДНК после всех стадий очистки составляло от 5 до 13 пг/мг.
Полученные авторами решения результаты по содержанию ДНК приведены в таблице
2.
Таблица 2. Оценка уровня ДНК по стадиям очистки, WO2017/087882
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000007_0001
Таким образом, авторам WO2017/087882 не удалось создать высокоэффективную технологию, позволяющую получать препарат с минимальным количеством контаминантов. Для более полного устранения НСР авторы заявленного изобретения существенно изменили условия очистки на гидрофобном сорбенте, использовав сорбент с фенильными группами. Данная модификация представляет собой неожиданный технический шаг, так как, насколько это известно из уровня техники (см.ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, N° 3, с. 378-383), очистка белка на фенилсефарозе позволяет получить только около 73% мономерной формы белка. Столь низкая доля мономерной формы теоретически является препятствием для использования фенилсодежащих сорбентов в очистке терапевтического белка, так как в случае ингибитора С1 именно данная форма проявляет биологическую активность. Тем не менее авторы применили данные сорбенты при очистке ингибитора С1 в одной из финальных стадий хроматографии, где они неожиданно показали высокую эффективность, при сохранении высокого выхода мономерной формы. При введении в процедуру очистки ингибитора С 1 -эстеразы стадии хроматографии на различных гидрофобных сорбентах, содержащих фенильную группу, авторы получили неожиданно высокий выход мономерной формы - 99%, при очень высокой чистоте по НСР (содержание менее 10 нг/мг) и по ДНК ( менее 1.0 пг/мг). Применение гидрофобных сорбентов с фенильной группой для повышения чистоты ингибитора С 1 -эстеразы неизвестно из уровня техники, неочевидно для специалиста и непосредственно влияет на получение нового технического результата - получение ингибитора С 1 -эстеразы высокой степени очистки от белков клетки-хозяина и ДНК с высоким выходом целевого белка в его биологически активной мономерной форме.
Приведенная технология хроматографической очистки позволяет получать препарат с низким содержанием ДНК, однако, в процессе производства серии в GMP условиях полученный уровень ДНК составил 13 пг/мг, что почти соответствует заявленной верхней границе нормы (14 пг/мг), и свидетельствует о вариабельности процесса с т.з. удаления ДНК.
Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в разработке способа получения высокоочигценного рекомбинантного ингибитора С 1-эстеразы человека для медицинского применения, с высоким выходом биологически активной мономерной формы белка относительно содержания целевого белка в культуральной жидкости.
Для достижения указанных технических результатов была разработана, масштабирована и перенесена на производство высокоэффективная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека, позволяющая получать лекарственное средство, содержащее не более 10 нг/мг белков штамма-продуцента; не более 5 пг/мг ДНК; не менее 99,0 % мономерной формы белка; не менее 99,5 % основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ и удельной активностью не менее 9,0 МЕ/мг.
Заявляемая технология производства позволяет получать активную фармацевтическую субстанцию, пригодную для применения в клинических испытаниях и коммерческого выпуска.
Разработка высокоэффективной технологии производства осуществлялась с учетом следующих критериев:
• обеспечение приемлемых ключевых параметров качества конечного препарата;
• высокий выход конечного биологически активного очищенного белка относительно содержания белка в культуральной жидкости;
• низкая стоимость производства.
Осуществление изобретения
Очистка на металл-хелатном сорбенте
Авторы изобретения впервые показали, что для целей заявленного изобретения при захвате целевого белка из культуральной жидкости наилучшым образом подходят металл-хелатные сорбенты. При выборе сорбента для захвата оценивали следующие параметры процесса:
• выход целевого белка со стадии; • содержание мономерной формы целевого белка в элюате;
• содержание белков штамма-продуцента в элюате;
• содержание ДНК в элюате;
• степень окрашивания сорбента компонентами культуральной жидкости и возможность регенерации сорбента;
• емкость сорбента по целевому белку.
Полученные результаты по скринингу сорбентов для стадии захвата представлены в таблице 3.
Таблица 3. Эффективность различных сорбентов для стадии захвата рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека из культуральной жидкости
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Полученные данные продемонстрировали, что наилучшие результаты могут быть достигнуты при применении металл-хелатных сорбентов, к примеру, IMAC Sepharose или EMD Chelate. При этом экспериментально обнаружено, что при очистке ингибитора С1 эстеразы сорбенты с катионобменными и гидрофобными свойствами недостаточно эффективны, так как имеют крайне низкую емкость, а при использовании сорбентов с анионообменными свойствами уровень контаминантов в элюате (белки штамма-продуцента и ДНК) находится на высоком уровне. Для данной стадии дополнительно разработан этап промывки буферным раствором, содержащим от 5 до 50 мМ имидазола, значение pH от 5,5 до 8,5 ед., при этом допускается добавление в промывочный буферный раствор хлорида натрия в концентрации от 200 мМ до 1 М. Также разработан состав элюирующего буферного раствора, содержащего от 100 мМ до 1 М имидазола, значение pH от 5,5 до 8,5 ед.
Комбинация вышеприведенных условий позволила получить раствор белка с содержанием белков штамма-продуцента на уровне 5000 нг/мг; ДНК на уровне 7000-8000 пг/мг; содержание мономерной формы белка на уровне 95,0 %; при этом выход белка со стадии составил около 95 % от его содержания в культуральной жидкости.
Очистка на аффинном сорбенте
На следующем этапе была разработана стадия очистки с использованием аффинного сорбента Heparin Sepharose FF. Данный сорбент позволяет значительно снизить содержание белков штамма-про дуцента и ДНК. Установлено, что при значении pH от 7,0 до 8,0 и проводимости от 0,1 до 10,0 mS/cm (мСм/см) наносимого раствора белка, а также элюции целевого белка путем увеличения содержания хлорида натрия в подвижной фазе до значения 0,2 - 0,4 М содержание белков штамма-продуцента снижается до уровня около 3000 нг/мг, а содержание ДНК до уровня менее 50 пг/мг. В таблице 4 приведены данные по скринингу условий элюции на Heparin Sepharose FF.
Таблица 4. Результаты скрининга условий очистки целевого белка на сорбенте Heparin Sepharose FF
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Таким образом, была разработана стадия очистки, позволяющая значительно снизить количество белков штамма-продуцента в элюате целевого белка - до уровня менее 3000 нг/мг, содержание ДНК при этом довести до уровня менее 50 пг/мг.
Разработка финальной стадии очистки от ДНК штамма-продуцента Для удаления ДНК штамма-продуцента применен стандартный подход с использованием анионообменного сорбента. Показано, что проведение процесса на сорбенте Q Sepharose FF в условиях низкой проводимости элюирующего буферного раствора и значения pH от 6,0 до 8,5 ед. позволяет снизить содержание остаточной ДНК до уровня ниже 5 пг/мг. Результаты скрининга условий элюции на Q Sepharose FF представлены в таблице 5. Таблица 5. Скрининг условий элюции на сорбенте Q Sepharose FF
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000014_0001
Разработка финальной стадии очистки от белков штамма-продуцента
Для удаления белков штамма-продуцента был выбран подход, основанный на высокой гидрофильности целевой молекулы, позволяющий проводить очистку целевого белка в режиме фильтрации через колонку с сорбентом. Была проведена экспериментальная проверка возможности применения гидрофобных сорбентов в различных условиях для снижения содержания белков штамма-продуцента в конечном продукте до уровня ниже 10 нг/мг. Результаты исследований неожиданно показали, что, вне зависимости от нагрузки на сорбент, выход мономерной формы белка был неожиданно высок. При содержании хлорида натрия в наносимом растворе белка менее 3 моль\литр общий выход целевого белка составлял не менее 80%. Результаты скрининга условий проведения гидрофобной хроматографии представлены в таблице 6.
Таблица 6. Скрининг условий проведения финишной очистки целевого белка методом гидрофобной хроматографии
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Таким образом, была разработана стадия процесса хроматографической очистки, позволяющая снизить содержание белков штамма- продуцента до уровня менее 10 нг/мг.
Дополнительно в схему очистки были внесены этапы вирусной инактивации после стадии очистки на металл-хелатном сорбенте, а также нанофильтрации и диафильтрации для перевода в финальный буферный раствор. Финализированная схема очистки приведена на рисунке 1. Данная схема очистки позволяет получать активную фармацевтическую субстанцию со следующими характеристиками:
• содержание мономера не менее 99 %; • содержание основной формы целевого белка по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ не менее 99,5 %;
• содержание белков штамма-продуцента не более 10 нг/мг;
• содержание ДНК штамма-продуцента не более 5 пг/мг; · удельная специфическая активность не менее 9,0 МЕ/мг.
Выход целевого белка относительно его содержания в культуральной жидкости составил около 80 % (500 мг целевого белка с 1 л культуральной жидкости).
В качестве подходящего гидрофобного сорбента, содержащего фенильные группы, могут быть использованы Phenyl Sepharose FF, Tosoh Butyl 650M, Capto Phenyl, а также иные коммерчески доступные сорбенты с аналогичным принципом действия.
Пример 1.
Проведение хроматографической очистки.
Культуральную жидкость объёмом 1 л наносили на колонку с сорбентом IMAC Sepharose (объем колонки (CV) 0,2 л), предварительно активированную 2 CV 0,1 М раствора хлорида цинка и уравновешенную буферным раствором 20 мМ трис, pH 7,2. После нанесения сорбент промывали 3 CV того же буферного раствора. Колонку промывали 3 CV буферного раствора 20 мМ трис, 15 мМ имидазол, pH 7,5. Связанный с сорбентом целевой белок элюировали буферным раствором 20 мМ трис, 150 мМ имидазол, pH 7,2. Вирусную инактивацию проводили сольвент-детергентным методом. Во фракцию белка добавляли при перемешивании 20% раствор полисорбата-80 до 1% (1/20 часть от объема фракции) и трибутилфосфат до 0,3% (3/1000 части от объема элюата). Инкубировали при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 1 часа.
Полученную фракцию белка разбавляли водой в 2 раза и наносили на колонку с Heparin Sepharose (CV 0,1 л), предварительно уравновешенную буферным раствором 20 мМ трис, pH 7,2. После нанесения промывали сорбент 3 CV того же буферного раствора. Связавшийся с сорбентом целевой белок элюировали буферным раствором 20 мМ трис, 200 мМ натрия хлорид, pH 7,2.
Следующий этап очистки осуществляли на колонне с сорбентом Q Sepharose FF (CV 0,1 л), которую предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,0. Далее наносили раствор белка в 50 % градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну. После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,2. Элюцию целевого белка производили градиентом буферного раствора 20 мМ HEPES, 200 мМ натрия хлорид, pH 7,5 в буферном растворе 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,5 (от 0 до 100 % за 10 колоночных объемов). Следующий этап очистки осуществляли на сорбенте Capto Phenyl High Sub. Объем колонны составлял 10 мл. Нагрузка по целевому белку не более 50 г целевого белка на 1 л сорбента.
Колонну с Capto Phenyl High Sub предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, pH 7,0. Целевой белок для нанесения подготавливали путем добавления раствора 5 М натрия хлорида до проводимости 145-155 мСм/см. Далее наносили раствор белка на уравновешенную колонну, собирая фильтрат, содержащий целевой белок. После нанесения колонну промывали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, pH 7,0, продолжая собирать фильтрат.
Проводили противовирусную нанофильтрацию полученной фракции белка на фильтре Planova 15N, затем фильтрат концентрировали на мембране для тангенциальной фильтрации VIVAFLOW 200 с диаметром пор 30 кДа и диализовали против буферного раствора 9,4 г/л глицин, 2,9 г/л натрия цитрат, 8 г/л натрия хлорид, pH 7,0.
Полученный раствор белка фильтровали через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильную емкость в асептических условиях. Общий выход по очищенному белку составил около 500 мг с 1 л культуральной жидкости.
Полученная активная фармацевтическая субстанция имеет следующие качественные характеристики: 99,7 % мономерной формы целевого белка; 99,8 % основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ; 1,9 пг/мг ДНК штамма-продуцента; 2,9 нг/мг белков штамма-продуцента; удельная активность 9,3 МЕ/мг.
Пример 2.
Проведение хроматографической очистки в промышленном объеме. На первом этапе очистки культуральную жидкость объёмом 250 л наносили на колонку с IMAC Sepharose (объем колонки (CV) 25,0 л).
Подготовку колонны осуществляли путем промывки 25,0 л 0,5 М раствора хлорида цинка с последующей промывкой стартовым буферным раствором: 20 мМ трис, pH 7,2.
Культуральную жидкость не подвергали предварительной подготовке. На подготовленный сорбент наносили культуральную жидкость, после чего последовательно промывали сорбент стартовым буферным раствором и буферным раствором 20 мМ трис, 5 мМ имидазол, pH 7,2.
Целевой белок элюировали с колонны буферным раствором 20 мМ трис, 150 мМ имидазол, pH 7,2. На следующем этапе осуществляли вирусную инактивацию полученного раствора путем добавления детергентов: полисорбат 80 до 1%; трибутилфосфат до концентрации 0,3 %. Время инкубации составляло не менее 1 часа при комнатной температуре.
На следующем этапе осуществляли очистку целевого белка на аффинном сорбенте Heparin Sepharose FF. Колонну с Heparin Sepharose FF (объем колонки (CV) 12,0 л) предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, pH 7,5. Далее наносили раствор белка в 50 % градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну.
После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 50 мМ трис, pH 7,5. Элюцию целевого белка производили буферным раствором 50 мМ трис, 200 мМ натрия хлорид, pH 7,5
Следующий этап хроматографической очистки осуществляли на сорбенте Q Sepharose FF. Объем колонны составлял 2 л. Нагрузка по целевому белку не более 70 г целевого белка на 1 л сорбента.
Колонну с Q Sepharose FF предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,5. Далее наносили раствор белка в 50 % градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну. После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,2. Элюцию целевого белка производили градиентом буферного раствора 20 мМ HEPES, 200 мМ натрия хлорид, pH 7,0 в буферном растворе 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, pH 7,5 (от 0 до 100 % за 10 колоночных объемов).
Следующий этап очистки осуществляли на сорбенте Capto Phenyl High Sub. Объем колонны составлял 2 л. Нагрузка по целевому белку не более 50 г целевого белка на 1 л сорбента. Колонну с Capto Phenyl High Sub предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, pH 7,0. Целевой белок для нанесения подготавливали путем добавления раствора 5 М натрия хлорида до проводимости 145-155 мкСм/см. Далее наносили раствор белка на уравновешенную колонну, собирая фильтрат, содержащий целевой белок. После нанесения отмывали целевой белок буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, pH 7,0.
Для перевода полученного белка в конечный буферный раствор проводили диафильтрацию с использованием диафильтрационных кассет Sartorius, материал PES, с размером отсечения 50 кДа. Предварительно осуществляли промывку кассет буферным раствором 125 мМ глицина, 11,2 мМ цитрата натрия, 136,8 мМ натрия хлорида, pH 7,0. Процесс диафильтрации осуществляли при концентрации белка 50 мг/мл. После завершения процесса диафильтрации доводили концентрацию белка до значения 15-18 мг/мл.
Далее проводили противовирусную нанофильтрацию полученного раствора белка на фильтре Millipore Virosolve. Предварительно промывали фильтр буферным раствором 125 мМ глицина, 11,2 мМ цитрата натрия, 136,8 мМ натрия хлорида, pH 7,0. Далее подвергали раствор белка через подготовленный противовирусный фильтр.
Полученный раствор белка фильтровали через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильную емкость в асептических условиях.
Общий выход по очищенному белку составил около 500 мг с 1 л культуральной жидкости. Полученная активная фармацевтическая субстанция имеет следующие качественные характеристики: 99,8 % мономерной формы целевого белка; 99,9 % основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ; 1,0 пг/мг ДНК штамма-продуцента; 5,0 нг/мг белков штамма-продуцента; удельная активность 9,5 МЕ/мг.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ очистки рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека, включающий вирусную инактивацию, металл-хелатную хроматографию, аффинную хроматографию и анион-обменную хроматографию, отличающийся тем, что для снижения в продукте содержания остаточных белков клетки-хозяина до уровня ниже 10 нг/мг проводят финишную гидрофобную хроматографию с использованием сорбента, содержащего фенильные группы.
2. Способ по п.1, где для предварительной очистки продукта от белков клетки -хозяина используют аффинную хроматографию.
3. Способ по п.1, где финишную гидрофобную хроматографию проводят после того, как достигнуто снижение содержания белков штамма-продуцента до уровня приблизительно 3000 нг/мг и менее.
4. Способ по п.З, где финишную гидрофобную хроматографию проводят после того, как достигнуто снижение содержания ДНК до уровня приблизительно 50 пг/мг и менее.
5. Способ по п. 1, где выход мономерной формы ингибитора Cl-эстеразы человека, составляет не менее 99%.
6. Способ по п.1, где в качестве гидрофобного сорбента используется Phenyl Sepharose FF, Tosoh Butyl 650M, Capto Phenyl или иной сорбент с аналогичным принципом действия.
7. Способ по п.1, где содержание хлористого натрия в растворе очищаемого белка, наносимого на сорбент, содержащий фенильные группы, находится в диапазоне приблизительно от 2 до 3 моль/л.
8. Способ по п.1, где нагрузка по целевому белку на сорбент, содержащий фенильные группы, находится в диапазоне от 50 до 200 мг\мл.
9. Способ по п. 1, где предпочтительная нагрузка по целевому белку на сорбент, содержащий фенильные группы, находится в диапазоне от 50 до 100 мг\мл.
10. Способ по п.1, где в качестве металл-хелатного сорбента при захвате целевого белка из культуральной жидкости используется IMAC Sepharose FF, EMD Chelate или иной сорбент с аналогичным принципом действия.
11. Способ по п.1 , где в качестве аффинного сорбента используется Heparin Sepharose, POROS Heparin, Heparin Hyper D или иной сорбент с аналогичным принципом действия.
12. Способ по п.1, где для вирусной инактивации используется сольвент-детергентный метод или метод инактивации низким значением pH.
13. Способ по п.1, где при проведении финишной гидрофобной хроматографии уровень проводимости целевого белка в образце для нанесения составляет 140-160 мСм/см, предпочтительно 145-155 мСм/см.
14. Способ по п. 1, где очищенный белок переводят в конечный буферный раствор с использованием диафильтрации.
15. Применение способа по п.1 для получения активной фармацевтической субстанции со следующими характеристиками: содержание мономерной формы рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека не менее 99,0 %; содержание основной формы рекомбинантного ингибитора С 1 -эстеразы человека по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ не менее 99,5 %; содержание остаточных белков штамма-продуцента не более 10 нг/мг; содержание ДНК штамма-продуцента не более 5 пг/мг; специфическая активность не менее 9,0 МЕ/мг.
PCT/RU2021/050171 2020-06-23 2021-06-18 Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека WO2021262041A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020120894 2020-06-23
RU2020120894A RU2769201C2 (ru) 2020-06-23 2020-06-23 Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека для медицинского применения

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021262041A1 true WO2021262041A1 (ru) 2021-12-30

Family

ID=79281603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050171 WO2021262041A1 (ru) 2020-06-23 2021-06-18 Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2769201C2 (ru)
WO (1) WO2021262041A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0101935A1 (de) * 1982-07-30 1984-03-07 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung des C1-Inaktivators und seine Verwendung
RU2256464C1 (ru) * 2004-03-12 2005-07-20 Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" Способ получения с1-эстеразного ингибитора человека и продукт для использования в медицине
WO2017087882A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Recombinant human c1 esterase inhibitor and uses thereof
WO2020079108A1 (en) * 2018-10-17 2020-04-23 Csl Behring Gmbh Process for purifying c1-inh

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0101935A1 (de) * 1982-07-30 1984-03-07 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung des C1-Inaktivators und seine Verwendung
RU2256464C1 (ru) * 2004-03-12 2005-07-20 Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" Способ получения с1-эстеразного ингибитора человека и продукт для использования в медицине
WO2017087882A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Recombinant human c1 esterase inhibitor and uses thereof
WO2020079108A1 (en) * 2018-10-17 2020-04-23 Csl Behring Gmbh Process for purifying c1-inh

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020120894A3 (ru) 2021-12-23
RU2769201C2 (ru) 2022-03-29
RU2020120894A (ru) 2021-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4359347B2 (ja) 抗体の高収率精製およびウイルス不活性化のためのクロマトグラフイー法
US4629567A (en) Alpha-1-antiprotease purification
RU2567811C2 (ru) Способ очистки фактора свертывания крови viii
CZ287186B6 (en) Process for preparing concentrate free of aggregation of immunoglobulins G
JPH06107561A (ja) 静脈内相容性免疫グロブリン− ｇ− 製剤の製造方法
CN103732610A (zh) 纯化天然或突变体形式的白喉毒素的方法
JP2644946B2 (ja) ＩｇＧ− モノクロナール抗体の精製方法及びその使用方法
JPS6098988A (ja) Ｌｐｆ−ｈａの精製法
JP2009173945A (ja) Ｇｂｓトキシン／ｃｍ１０１の精製方法
CN109929027B (zh) 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法
CN107849086A (zh) 源自血浆的乙型肝炎人免疫球蛋白的制备方法
US7041798B1 (en) Method for the chromatographic fractionation of plasma or serum, preparations, so obtained, and their use
US4612283A (en) Method for purification of HBs antigen
JP3360315B2 (ja) ヒト血清アルブミンの高度精製方法
EP0446582B1 (en) Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal
IL302701A (en) A method for the production of recombinantly produced trimeric RSV proteins
RU2769201C2 (ru) Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека для медицинского применения
JP3805378B2 (ja) ｒＤＳＰＡα１の製造の方法
JP3840674B2 (ja) 遺伝子操作に由来するヒト血清アルブミンの精製方法
KR20230060524A (ko) 재조합 단백질의 정제 방법
FI96864B (fi) Ei-terapeuttisesti käytettävä HIV:n glykoproteiini GP 160 ja menetelmä sen valmistamiseksi
CN114945582A (zh) 纯化肉毒杆菌毒素的方法
JP5086093B2 (ja) 組換え型ヒトｘｉｉｉ因子の精製
CN105541994B (zh) 一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法
JP4016999B2 (ja) 遺伝子操作に由来するヒト血清アルブミンの精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21829617

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21829617

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 03/08/2023)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21829617

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1