KR20230060524A - 재조합 단백질의 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
재조합 단백질, 특히 재조합 인간 알부민의 정제 방법으로서, (a) 재조합 단백질을 함유하는 샘플에 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 첨가하는 단계; 및 (b) 얻은 샘플을 크로마토그래피하는 단계로서, 상기 크로마토그래피는 아미노구아니딘을 함유하는 크로마토그래피 완충 용액으로 선택적으로 수행하는 것인, 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 재조합 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 단백질, 특히 재조합 인간 알부민을 함유하는 샘플로부터 재조합 단백질을 효율적으로 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.
인간 알부민은 심장 모양의 구조를 가진 단일 사슬의 비당화 단백질(non-glycosylated protein)로, 585개의 아미노산, 17쌍의 이황화 결합, 하나의 유리 설프히드릴기를 가지고 있으며 분자량은 66438 달톤이다. 인간 알부민의 인체 내 반감기는 19 내지 21일이다. 인간 알부민의 심장 모양 구조는 3개의 주요 구조 도메인과 17개의 이황화 결합으로 둘러싸인 6개의 하위 도메인으로 구성되어 있으며, 반 데르 발스의 힘(Van der Waals' force)에 의해 함께 느슨하게 결합되어 있다. 결정 구조에서 알 수 있듯이, 이황화 가교(disulfide bridges)는 나선형 구형 구조에 강성을 부여하고 충분한 유연성을 제공함으로써, 주변 매질의 변화에 대응하여 단백질의 구조적 변화를 가능하게 한다.
인간 알부민은 일반적으로 인간 혈청으로부터 분리 및 정제하여 생성되며, 총칭하여 인간 혈청 알부민으로 알려져 있다. 인간 혈액-유래 인간 알부민은 혈장 공급원의 양이 제한적이며 혈장 기증자의 바이러스 오염뿐만 아니라 개별 항체 및 단백질 차이에 의해 영향을 받기 때문에 임상 사용에 위험하다. 그러므로, 많은 국가에서 사람의 혈액 알부민 사용 지침으로 바이러스 안전 문구를 포함하고 있고, 예로: "사람의 혈액이나 혈장 제품의 사용으로 인한 감염을 예방하기 위해 취해지는 표준 조치로는, 헌혈자 선택, 단일 혈액 공급의 선별 또는 특정 감염 마커에 대한 혈장 풀의 선별 및 바이러스의 비활성화/감염을 위한 효과적인 생성 공정의 사용을 포함한다. 그렇더라도, 혈액이나 혈장에서 제조된 의약품을 선택하여 사용하는 경우에는 감염원에 의한 감염 가능성을 배제할 수는 없다. 여기에는 알려지지 않았거나 새로 출현한 바이러스 및 기타 병원체를 포함한다."가 있다. 그러므로, 바이러스 오염이 없는 알부민을 효율적으로 얻기 위해서는 유전자 재조합 방법을 사용하는 것이 최선의 방법이다.
현재, 효모 발현 시스템은 대규모 생산을 달성할 수 있는 재조합 미생물에 의한 인간의 알부민 발현에 가장 많이 사용되는 방법이며, 그 중에서도 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris를 사용한 발현 시스템이 가장 발달했다. 단, 인간 알부민은 고용량 주사제이기 때문에 주사 당 용량은 5 내지 30g까지 가능하다. 그러므로, 생성 과정에서 오염 물질에 대한 ELISA 시험 결과와 숙주 세포 단백질의 총 잔류량은 주사 용량 당 1 ng/ml(200 mg/ml-rHA)를 초과하지 않아야 한다. 재조합 인간 알부민을 생성하기 위해 사용되는 방법에 관계없이, 그 면역원성(immunogenicity)은 또한 당화, 산화, 다량체화 및 응집 등과 같은 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)을 포함한다. 그러므로, 효율적이고 특이적인 정제는 고순도 재조합 인간 알부민을 얻기 위한 핵심 과정 요소이다.
이전의 정제 과정은 기존의 정제 매질을 사용해왔는데, 이는 과정이 복잡하고, 통상 초고순도 재조합 인간 알부민을 얻지 못한다. 중국 특허 출원 CN1127299는 효모 활성 프로테아제(protease)를 불활성화하기 위해 발효액(fermentation broth)을 박테리아 세포와 함께 가열하는 것을 개시하고 있으며, Sepharose-Streamline-SP의 농축 정제의 첫 번째 단계에서 나타나는 약 20 내지 30% 이상의 이량체(dimer)가 사용되고, 이량체는 환원 및 탈중합(depolymerize) 되기 위해 가열되어야 하며, 그 다음 HIC 소수성 크로마토그래피로 45 KDa 알부민 단편이 제거되며 Sepharose-DEAE 크로마토그래피로 색소가 제거된다. 본 출원에서는 프로테아제를 불활성화를 위해 발효액과 세균세포를 58 내지 65°C 이상에서 가열하고, 그 결과 열충격단백질(heat shock protein)들이 효모 내의 숙주단백질 및 인간 알부민과 교차 결합되며, 이는 후속 크로마토그래피 정제를 어렵게 만든다. 한편, 유동층(fluidized bed)의 Sepharose-Streamline-SP 크로마토그래피를 통해 세균세포와 발효액을 동축(co-flowing)하는 것은, 분리 정제 및 실행 효율이 매우 낮다.
중국 특허 출원 CN101768206 및 CN1854155 및 CN1496993은, 발효액에서 재조합 인간 알부민을 농축 및 포획하기 위한 내염성(salt tolerance)이 높은Sepharose HSL 양이온 매질의 사용, 이어서 알부민 단편을 제거하기 위한 Sepharose 페닐 HIC 매질의 사용, 및 다음으로 수율을 향상시키기 위한 Sepharose DEAE를 대체할 Sepharose 아미노부틸 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 사용을 개시한다.
중국 특허 출원 CN1810834 및 CN1550504 및 CN1880334는 재조합 인간 알부민을 포획 및 농축하기 위한 Sepharose SP FF의 사용을 개시하고, 이어서 45 KDa 알부민 단편 및 효모의 숙주 단백질을 제거하기 위해 알부민을 흡수하는 델타 블루 컬럼 친화성 크로마토그래피(Delta blue column affinity chromatography)의 사용을 개시하며; 블루 컬럼의 단점은 청색 염료의 안전성과 리간드 박리(ligand shedding)이며, 친화성 크로마토그래피에 의해 재조합 인간 알부민을 분리하는 과정 설계는 정제 효율의 감소로 이어진다. 분자 체(molecular sieve) S-200HR의 뒤 이은 사용은 또한 낮은 정제 효율을 유발하는 단계이다.
상기 세 종류의 개시된 특허들은 보다 높은 순도를 갖는 재조합 인간 알부민을 효과적으로 얻을 수 있으나, 전-정제(pre-purification) 단계에서 포획 농축 과정 동안 발생하는 중합체의 양이 많아 중합체는 재해중합(re-depolymerize)이 필요하며, 해중합 과정은 미스매치나 다른 면역원성 재조합 인간 알부민을 유발할 수 있다.
그러므로, 당 분야에서 재조합 단백질, 특히 재조합 인간 알부민을 효율적으로 정제하여, 따라서 중합체 생성을 감소시키고, 숙주 단백질, 색소 및 탄수화물과 재조합 단백질의 상호작용을 억제하는 방법에 대한 요구가 계속되고 있다.
요약
본 발명의 일 양태는 재조합 단백질, 특히 재조합 인간 알부민의 정제 방법을 제공하는 것으로서,
(a) 재조합 단백질을 함유하는 샘플에 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 첨가하는 단계; 및
(b) 얻은 샘플을 크로마토그래피하는 단계로서, 상기 크로마토그래피는 아미노구아니딘을 함유하는 크로마토그래피 완충 용액으로 선택적으로 수행되는 단계
를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 재조합 단백질을 함유하는 샘플은 발효 상층액이다. 바람직하게는, 원심분리, 고액분리(solid-liquid separation), 가열 불활성화, 중공사 한외여과(hollow fiber ultrafiltration) 및/또는 심층 여과 정화(deep filtration clarification) 및 분리와 같은 통상적인 기술에 의해, 발효액으로부터 얻은 깨끗한 상층액이다.
본 발명의 일 양태에서, 고액 분리는 원심분리기에 의해 수행되며, 원심분리기는 발효된 세균 세포를 상층액으로부터 신속하게 분리하여 발효액을 일관되게 유지할 수 있게하며; 발효액의 고액분리 후, 다시 고액 분리를 하기 위해 옥탄산나트륨(sodium octanoate) 및 기타 열 안정제의 존재 하에 발효 상층액은 55 내지 68℃내로 가열될 수 있고; 그 이후 300 내지 500 KDa 막 패키지(membrane package) 또는 중공사 또는 0.1 내지 2 μm 이내의 막 기공 크기를 가진 중공사와 함께 사용하여 정화가 수행된다. 정화 처리는 가열 불활성화 전과 후에 1회 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 상기 (a) 단계의 아미노구아니딘의 농도는 2 내지 100 mmol/g(재조합 단백질)이고, 바람직하게는, 아미노구아니딘의 농도는 3 내지 80 mmol/g(재조합 단백질)이다.
본 발명의 일 양태에서, 중-장쇄 지방산은 옥탄산(octanoic acid), 카프르산(capric acid), 미리스트산(myristic acid)(C14:0), 팔미트산(palmitic acid)(C16:0), 스테아르산(stearic acid)(C18:0), 올레산(oleic acid)(C18:1), 리놀레산(linoleic acid)(C18:2), 리놀렌산(linolenic acid)(C18:3), 아라키돈산(arachidonic acid)(C20:4) 및 이들의 염 중에서 하나 이상 선택된다. 일 양태에서, 중-장쇄 지방산의 농도는 2 내지 300 mmol/g(재조합 단백질)이다. 바람직하게는 중-장쇄 지방산의 농도는 6 내지 150 mmol/g(재조합 단백질)이다.
본 발명의 일 양태에서, 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 포함한다.
다른 양태에서, 재조합 단백질은 또한 G-CSF, GLP-1, 인터페론, 성장 호르몬, 인터류킨, 이들의 유사체, 및 언급한 단백질과 알부민의 융합 단백질일 수 있다.
종래 기술과 달리, 본 출원의 발명자들은 재조합 인간 알부민을 함유하는 샘플에 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 첨가하고 이어서 양이온 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피(아미노구아니딘-함유 크로마토그래피 완충 용액와 함께 선택적으로 수행됨)를 함으로써 몇 가지 예기치 않은 효과가 발생할 수 있음을 발견하였다. 첫째, 아미노구아니딘은 이량체(dimer), 다합체(multimer) 및 이형중합체(heteromer)를 생성하는 양이온 교환 매질의 이전의 경향(previous tendency)을 방지하고 감소시킬 수 있으며; 중-장쇄 지방산은 대부분의 숙주 단백질, 색소, 탄수화물이 알부민과 상호작용하는 것을 억제하는 강력한 리간드로서 작용한다. 따라서, 본 발명의 양태는 양이온 교환 크로마토그래피에서 널리 사용되는 중합체(polymer), 이형중합체, 색소 및 숙주 단백질을 현저하게 감소시킨다. 둘째, 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산의 존재는 분자량이 45 KDa인 재조합 알부민 단편 사이의 상호 이황화 결합의 중합을 억제하고, 따라서 비접힘단백질(unfoldable protein) 단편의 소수성 영역의 더 많이 노출되도록 촉진하여, 재조합 인간 알부민의 작은 분자 단편과 소수성 크로마토그래피에 의한 다수의 소수성 불순물을 더 철저하게 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 강한 소수성 구조를 가진 효모 색소를 제거할 수 있게 한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액(chromatographic balanced solution), 세척 용액(wash solution) 또는 용출 완충 용액(elution buffer solution) 중의 아미노구아니딘은 1 내지 200 mmol/L의 농도를 가지며, 바람직하게는 크로마토그래피 균형 용액, 세척 용액 또는 용출 완충 용액 중의 아미노구아니딘은 1 내지 150 mmol/L의 농도를 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은 pH 값이 4.0 내지 6.0, 바람직하게는 4.0 내지 5.5이고, 용출액(eluent)은 pH 값이 7.0 내지 9.5, 바람직하게는 7.0 내지 8.5이다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은 15 ms/cm 이하, 바람직하게는 10 ms/cm 이하의 전도도를 가지며, 용출액은 30 ms/cm 이하, 바람직하게는 25 ms/cm 이하의 전도도를 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은 인산 또는 아세트산 또는 트리스 완충 용액(Tris buffer solution)이며, 바람직하게는 인산 또는 아세트산 완충 용액이다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 매질 기판(medium substrate)은 폴리아크릴레이트 기판(polyacrylate substrate), 폴리스티렌-디비닐 벤젠 기판(polystyrene-divinyl benzene substrate), 아가로스 기판, 개질된 셀룰로오스 기판이다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 매질은 소수성 양이온 리간드와 결합되며, 소수성 양이온 리간드는 내염성이 높은 Sepharose Capto MMC를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 매질은 Uni-SP 시리즈, UniGel-SP 시리즈, NanoGel-SP 시리즈, MonoMix-HC SP 시리즈, MonoMix-MC SP 시리즈 및 아가로스의 Sepharose 시리즈 또는 Bestarose 시리즈 중에서 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 소수성 크로마토그래피용 매질은 페닐 또는 부틸 시리즈의 소수성 리간드와 결합된, 친수성으로 개질된 아가로스, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌-디비닐 벤젠 기판 마이크로스피어(microspheres)이거나; 소수성 크로마토그래피용 매질은 페닐 또는 부틸 시리즈의 소수성 리간드와 결합된, 친수성 폴리메타크릴레이트 매트릭스(polymethacrylate matrix) 이다.
본 발명의 일 양태에서, 소수성 크로마토그래피용 매질은 UniHR 페닐 시리즈, NanoHR 페닐 시리즈, UniHR 부틸 시리즈, NanoHR 부틸 시리즈, MomoMix-MC 부틸 시리즈, MonoMix-MC 페닐 시리즈 및 아가로스의 Sepharose 시리즈 또는 Bestarose 시리즈 중에서 선택된다.
양이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피의 경우, 친수성 표면으로 개질된 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 또는 폴리메타크릴레이트 기판 마이크로스피어와 결합된 소수성 리간드 분리 매질 또는 양이온 리간드 분리 매질이 바람직하다.
본 발명에서 채용되는 폴리아크릴레이트 중합체 마이크로스피어에 의해 친수성으로 개질된 기판 분리 매질은 나아가, 예를 들어, 친수성으로 개질된 폴리메타크릴레이트의 Fractogel®이온 교환, 및 Merk Millipore사가 제조한 친화성 크로마토그래피 필러 제품의 소수성 기판이며, 양이온 교환 매질 Fractogel® EMD SO3 - (S) 수지 또는 Fractogel® SO3 - (strong CEX) 또는 Fractogel® SE Hicap (strong CEX) 또는 Eshmuno®S(strong CEX) 등의 시리즈를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 동일한 기판 매질의 합성 후 친수성으로 개질된 양이온성 및 소수성 분리 매질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명은 Merck Millipore사에서 제조한 폴리메타크릴레이트의 상기 Fractogel® 친수성 개질 기판 분리 매질 및 Suzhou NanoMicro Technology Co. Ltd. 또는 Sepax Technologies, Inc.에서 제조한 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐 벤젠 마이크로스피어의 상기 친수성 개질 결합 분리 매질(hydrophilic modified coupling separation medium)을 사용하며; 가장 바람직하게는, Suzhou NanoMicro Technology Co. Ltd. 또는 Sepax Technologies, Inc. 에서 제조한 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐베젠 마이크로스피어의 상기 친수성 개질 결합 분리 매질을 사용한다.
본 발명의 다양한 크로마토그래피 단계 중 완충 용액의 교체 및 응축 과정은, 분리 기공 크기가 1 KDa-30 KDa 분자량인 편평막(flat membrane) 및 중공사막(hollow fiber membrane) 패키지 등의 장치 및 장비를 사용하여 구현될 수 있으며, 이들을 순차적 또는 교대로 사용하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 크로마토그래피 단계 중 완충 용액의 교체는 Sephadex G25 또는 Superdex G75를 사용하여 수행될 수도 있다.
더욱이, 본 출원의 발명자들은 더 예기치 않게 상기 크로마토그래피에서, 직경이 10 내지 150 μm인 폴리스티렌-디비닐벤젠 마이크로스피어 또는 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였고; 친수성 코팅에 의해 개질된 후 양이온성 및 소수성 리간드는 접목(graft)되었으며, 예를 들어, 양이온 교환 매질로는 Uni-SP 시리즈, UniGel-SP 시리즈 또는 NanoGel-SP 시리즈, MonoMix-HC SP 또는 MonoMix-MC SP 시리즈 등이 있고; 소수성 크로마토그래피로는 UniHR 페닐 시리즈, NanoHR 페닐 시리즈, UniHR 부틸 시리즈 및 NanoHR 부틸 시리즈, MonoMix-MC 부틸 시리즈 또는 MonoMix-MC 페닐 시리즈가 있다. 이러한 종류의 분리 정제 매질은 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 자체 또는 그 코팅의 소수성을 일정 정도 유지하고 있고, 따라서 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 함유하는 재조합 인간 알부민과 결합하여 크로마토그래피에서 색소와 숙주 단백질을 제거하는 것을 더 쉽게 만든다.
본 발명의 일 양태에서, 소수성 크로마토그래피는 pH 값은 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8.0이다.
본 발명의 일 양태에서, 소수성 크로마토그래피의 전도도는 30 ms/cm 이하, 바람직하게는 25 ms/cm 이하이다.
본 발명의 일 양태에서, 소수성 크로마토그래피용 로딩 용액(loading solution) 중의 아미노구아니딘의 농도는 1 내지 100 mmol/g의 재조합 단백질이다.
본 발명의 일 양태에서, 아미노구아니딘은 그 염의 형태, 바람직하게는 그 염산염의 형태이다.
본 발명의 방법은 효모 발현 발효 상층액의 전-정제 과정에 주로 적용되어 발효액을 농축하는 과정을 용이하게 하고 정제 정확도를 향상시킴으로써, 추후 정련(refinement) 및 정제 시 효율을 향상시키고 수율을 증가시키며 비용을 절감할 수 있게 한다.
본 발명의 방법은 재조합 인간 알부민의 다른 과정에도 적용될 수 있으며, 이는 정련 과정, 중간 정제 과정에서의 응용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 구체적인 양태에서, 친수성으로 개질된 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠의 중합체성 마이크로스피어는 기공 직경이 300 내지 3000 Å이고, 마이크로스피어의 직경은 10 내지 150 μm이다.
본 발명의 일부 구체적인 양태에서, 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체로 구성된 10 내지 150 μm의 마이스로스피어는, 100 내지 800 mm, 바람직하게는 250 내지 600 mm 이내로 채워진 고강도 중합체성 물질 컬럼층(column beds)에 속한다.
본 발명의 일부 구체적인 양태에서, 폴리아크릴레이트 중합체 마이크로스피어 또는 폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체 마이크로스피어는, 균일한 직경 분포와 상대적으로 낮은 역압(counterpressure)을 가지며, 연속 흐름 크로마토그래피(continuous flow chromatography)의 분리 및 정제 방법을 따른다.
본 발명에서 설명하는 크로마토그래피 조건은 일반적인 가이드북에 따라 어느 정도 조정 및 변경이 가능하다.
본 명세서에 기재된 크로마토그래피용 투석, 한외여과(ultrafiltration) 및 저온 살균 단계에는, 본 발명의 구현 효과에 영향을 미치지 않는 몇몇 다른 일반적인 방법들이 사용될 수 있다.
재조합 인간 알부민의 정제를 위하여, 전술한 크로마토그래피의 최종 완료 후, 100 KDa 및/또는 30 KDa 및/또는 10 KDa의 막 패키지는 고분자 응집체를 트랩(trap)하고 지속적인 정제를 위하여 작은 분자들을 제거하기 위해 선택적으로 사용될 수 있으며, 완충 용액은 재조합 인간 알부민 저장 용액(stock solution)으로 대체 및 농축되고, 저장 용액의 농도는 20% 초과이다. 대안적으로, 재조합 인간 단백질을 발현하는 숙주 세포는 효모, 사카로미세스(Saccharomyces)속 계통을 포함하는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베리세스(Kluyveromyces)속 계통, 한세눌라(Hansenula)속 계통 및 비치아(Bichia)속 계통을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다툼이 발생할 경우, 본 출원의 명세서에 따라야 한다. 바람직한 방법 및 재료는 아래에 설명되어 있고; 본 발명을 구현하거나 시험하기 위해 본 발명에 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐, 한정하려는 의도는 아니다.
본 명세서 전체에서, "재조합 인간 알부민"이라는 용어는 "재조합 인간 혈청 알부민" 및/또는 "재조합 인간 혈액 알부민" 및/또는 "rHA" 및/또는 "rHSA"로 지칭될 수 있다. "인간 혈청 알부민"은 인간 혈청에서 추출된 인간 알부민을 지칭하며, "인간 혈액 알부민(human blood albumin)" 및/또는 "HSA", "HA" 및/또는 "pdHSA"로도 지칭될 수 있다.
도 1은 아미노구아니딘을 사용하지 않은 정제 과정으로 농축 정제의 첫 번째 단계가 수행될 때의 중합체의 생산을 도시한다;
도 2는 본 발명의 일 양태의 방법에 따른 이량체, 중합체 및 이형중합체의 생산을 방지 및 감소시키기 위한, 아미노구아니딘의 첨가를 도시한다;
도 3은 중-장쇄 지방산을 첨가하지 않은 소수성 크로마토그래피에서의 수집 용액의 HPLC-C4 검출 크로마토그램을 도시한다;
도 4는 중-장쇄 지방산을 첨가한소수성 크로마토그래피에서의 수집 용액의 HPLC-C4 검출 크로마토그램을 도시하며, 이는 중-장쇄 지방산이 대부분의 숙주 단백질, 색소 및 탄수화물이 알부민과 상호 작용하는 것을 억제하는 강력한 활성 리간드로서 작용하는 것을 나타낸다;
도 5와 도 6은 각각 실시예 4의 방법에 따라 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용한 정제 과정 및 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용하지 않은 정제 과정, 이 두 가지 정제 과정으로 정제된 항-HCP-웨스턴 블랏 환원 크로마토그램(anti-HCP-Western Blotting reduction chromatogram)과 비환원 크로마토그램(non-reduction chromatogram)을 보여준다; 레인 1-6은 각각 양이온 교환 수집 용액-1, 양이온 교환 수집 용액-3, 양이온 교환 수집 용액-4, 양이온 교환 수집 용액-5, 양이온 교환 수집 용액-6 및 양이온 교환 수집 용액-7을 의미하고, (모든 로딩 부피는 0.14 ul), 여기서 숫자 라벨은 정제 과정 서브 배치(sub-batch) 번호이며, -2는 실험 과정동안 다른 실험을 위해 예약된 샘플을 의미한다; -1/-3/-4는 아미노구아니딘을 사용하지 않은 생성 과정에 의해 생성된 샘플이고, -4/-5/-6은 본 발명에 따라 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 첨가한 생성 과정에 의해 생성된 샘플이다;
도 7은 실시예 4의 방법에 따라 동일한 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액을 사용한 두 정제 과정을 비교 분석한 비환원 전기영동 SDS-PAGE 크로마토그램을 도시하며; 본 실험에서는 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액과 동일한 배치가 취해지며, 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 함유하는 과정 및 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산이 없는 과정인 두 가지 정제 과정을 사용하여 단백질을 정제하고 중합체의 생성을 비교한다; -1은 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용하지 않은 정제 생성 과정에 의해 정제된 샘플을 의미하고; 2는 본 발명에 따라 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 첨가한 생성 과정에 의해 정제된 샘플을 의미하며, 레인 1~10의 샘플 로딩 조건은 다음과 같다;
1 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액 0.2 ul
2 소수성 크로마토그래피 로딩 유동(flow-through)-1 5 ul
3 소수성 크로마토그래피 표적 수집 용액-1 0.2 ul
4 소수성 크로마토그래피 세척 용액-1 1 ul
5 소수성 크로마토그래피 세정액(cleansing solution)-1 5 ul
6 소수성 크로마토그래피 로딩 유동 샘플 #1-2 5ul
7 소수성 크로마토그래피 로딩 유동 샘플 #2-2 0.5 ul
8 소수성 크로마토그래피 표적 수집 용액-2 0.2 ul
9 소수성 크로마토그래피 세척 용액-2 2 ul
10 소수성 크로마토그래피 세정액-2 2 ul
도 2는 본 발명의 일 양태의 방법에 따른 이량체, 중합체 및 이형중합체의 생산을 방지 및 감소시키기 위한, 아미노구아니딘의 첨가를 도시한다;
도 3은 중-장쇄 지방산을 첨가하지 않은 소수성 크로마토그래피에서의 수집 용액의 HPLC-C4 검출 크로마토그램을 도시한다;
도 4는 중-장쇄 지방산을 첨가한소수성 크로마토그래피에서의 수집 용액의 HPLC-C4 검출 크로마토그램을 도시하며, 이는 중-장쇄 지방산이 대부분의 숙주 단백질, 색소 및 탄수화물이 알부민과 상호 작용하는 것을 억제하는 강력한 활성 리간드로서 작용하는 것을 나타낸다;
도 5와 도 6은 각각 실시예 4의 방법에 따라 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용한 정제 과정 및 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용하지 않은 정제 과정, 이 두 가지 정제 과정으로 정제된 항-HCP-웨스턴 블랏 환원 크로마토그램(anti-HCP-Western Blotting reduction chromatogram)과 비환원 크로마토그램(non-reduction chromatogram)을 보여준다; 레인 1-6은 각각 양이온 교환 수집 용액-1, 양이온 교환 수집 용액-3, 양이온 교환 수집 용액-4, 양이온 교환 수집 용액-5, 양이온 교환 수집 용액-6 및 양이온 교환 수집 용액-7을 의미하고, (모든 로딩 부피는 0.14 ul), 여기서 숫자 라벨은 정제 과정 서브 배치(sub-batch) 번호이며, -2는 실험 과정동안 다른 실험을 위해 예약된 샘플을 의미한다; -1/-3/-4는 아미노구아니딘을 사용하지 않은 생성 과정에 의해 생성된 샘플이고, -4/-5/-6은 본 발명에 따라 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 첨가한 생성 과정에 의해 생성된 샘플이다;
도 7은 실시예 4의 방법에 따라 동일한 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액을 사용한 두 정제 과정을 비교 분석한 비환원 전기영동 SDS-PAGE 크로마토그램을 도시하며; 본 실험에서는 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액과 동일한 배치가 취해지며, 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 함유하는 과정 및 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산이 없는 과정인 두 가지 정제 과정을 사용하여 단백질을 정제하고 중합체의 생성을 비교한다; -1은 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 사용하지 않은 정제 생성 과정에 의해 정제된 샘플을 의미하고; 2는 본 발명에 따라 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 첨가한 생성 과정에 의해 정제된 샘플을 의미하며, 레인 1~10의 샘플 로딩 조건은 다음과 같다;
1 양이온 교환 크로마토그래피 수집 용액 0.2 ul
2 소수성 크로마토그래피 로딩 유동(flow-through)-1 5 ul
3 소수성 크로마토그래피 표적 수집 용액-1 0.2 ul
4 소수성 크로마토그래피 세척 용액-1 1 ul
5 소수성 크로마토그래피 세정액(cleansing solution)-1 5 ul
6 소수성 크로마토그래피 로딩 유동 샘플 #1-2 5ul
7 소수성 크로마토그래피 로딩 유동 샘플 #2-2 0.5 ul
8 소수성 크로마토그래피 표적 수집 용액-2 0.2 ul
9 소수성 크로마토그래피 세척 용액-2 2 ul
10 소수성 크로마토그래피 세정액-2 2 ul
본 발명의 발효는 선형 증폭이 양호한 10 cm, 45 cm, 120 cm 컬럼 직경의 정제 스케일에서 10 L, 20 L, 3,000 L, 10,000 L 장비의 스케일로 각각 구현되었다. 본 양태들은 상기 스케일들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이하 양태들은 첨부된 도면들과 함께 본 발명의 특징들 및 장점들에 대한 추가적인 이해를 제공하지만, 본 발명의 나머지를 어떠한 방식으로도 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1 발효 및 고액(solid-liquid)분리
발효는 Pichia pastoris 균주와 최적화된 매질 및 배양 파라미터를 구성하는 특허 CN 102190722의 방법에 따라 수행되었으며, 300시간 발효 후 재조합 인간 알부민의 12 g/L 발효액을 얻었다. 발효액을 원심분리하여 세균세포를 분리하고 상층액을 거두어들인 후 프로테아제를 비활성화 시키기 위하여 안정제가 첨가되고 60분 동안 64°C에서 가열(옥탄산나트륨 최종농도 20mM, 아미노구아니딘 최종농도 30mM, 시스테인 최종농도 10mM, N-아세틸트립토판(N-acetyltryptophan) 최종농도 5mM)되었다. 0.22 μm의 중공사막으로 여과 및 정화되고 주입수(injection water)로 세척된 후, 용액은 아세트산으로 pH 값을 4.0 내지 4.5로 조정되었다.
UniGel SP는 컬럼층 높이 400 mm로 로딩되고, 크로마토그래피 컬럼은 50 mM HAc + 50 mM NaCl + 10 mM 아미노구아니딘의 균형 용액(pH=4.1)으로 균형이 맞추어졌으며, 정화되고 분리된 발효액(30 mmol/g 옥탄산나트륨 알부민 함유)이 로딩되었고; 크로마토그래피 컬럼은 균형 용액으로 세척되고; 그 다음 표적 단백질은 50 mM PB + 170 mM NaCl + 10 mM 아미노구아니딘 용출액(pH=8.3)으로 용출되었으며, 용출 완료 후 매질은 1 M NaCl + 0.5 M NaOH 용액과 물로 충분히 세척 및 재생되었다.
실시예 2 소수성 크로마토그래피
실시예 1에서 수집된 용출액은 50 mM PB + 160 mM NaCl pH 7.8 + 10 mM 아미노구아니딘의 균형 용액으로 균형 잡힌 소수성 크로마토그래피 컬럼(UniHR Phenyl-80L, 컬럼층높이: 400 mm)에 직접 로딩되었으며, 그리고 크로마토그래피 컬럼은 균형 용액을 사용하여 세척되고, 재조합 인간 알부민을 함유하는 샘플이 수집되었으며, 매질은 0.01 M NaOH와 물로 충분히 세척 및 재생되었다.
실시예 3 한외여과에 의한 아미노구아니딘 제거
실시예 2에서 수집된 단백질 용액은 30 KDa 및/또는 10 KDa 막 패키지로 교체되었고, 따라서 아미노구아니딘 및 다른 안정제를 제거하고 정제를 계속하였다; 그리고 용액은 교체되고 20% 초과의 농도를 가지는 재조합 인간 알부민 저장 용액(stock solution)으로 응축되었다.
실시예 4 본 발명의 정제 과정과 아미노구아니딘 및 중-장쇄 지방산을 사용하지 않은 정제 과정의 비교
동일한 발효 과정으로 제조된 발효액이 아미노구아니딘과 중-장쇄 지방산을 첨가하지 않은 정제 조건에서 정제되었고; 정제는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 방법에 따라 아미노구아니딘과 올레산나트륨(sodium oleate)을 첨가하는 조건으로 수행되었다. 정제 효과, 액체 크로마토그래피 분석(도 1, 도 2, 도 3 및 도 4), 전기영동 검출 비교(도 5, 도 6 및 도 7), 당 검출 결과 (표 1)를 통해 비교해보면 명백한 차이가 있다.
표1
실시예 5 단백질 정제 시 품질관리 항목 검출 방법
1. HPLC 검출 방법: 크로마토그래피 1의 주요 검출 방법은 HPLC-SEC 검출 방법/HPLC-C4 검출 방법이었다:
검출 방법: 해당 검출 방법은 3121 A Method for Determining Human Blood Albumin Polymers, General Rules, Volume III of the Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2015 edition을 참조하여 수립되었으며, 따라서 재조합 인간 알부민 용액 중의 중합체(중합체 및 이량체 포함 중합체)를 측정한다;
검출 방법: 해당 검출 방법은 0512 High Performance Liquid Chromatography, General Rules, Volume III of the Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2015 edition을 참조하여 수립되었으며, 따라서 재조합 인간 알부민 용액 중의 부분당-결합단백질(partial sugar-binding protein) 및 색소-결합 단백질(pigment-binding protein)을 측정한다.
2. 전기영동 검출방법: 소수성 크로마토그래피의 주요 검출방법은 SDS-PAGE 전기영동 (Polyacrylamide gel electrophoresis)이었다:
검출 방법: 샘플 검출은 (0541 Method Five SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, General Rule), Volume IV of the Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2015 edition을 참조하여 수행되었으며;
관련 샘플 검출은 (3401 Western Blotting, General Rule), Volume IV of the Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2015 edition을 참조하여 수행되었다.
3. PAS 방법에 의한 당 함량 검출:
시험 용액은 취해지고 염산용액에 첨가되어 pH를 산성으로 만들고, 과요오드산나트륨(sodium periodate)이 첨가되고 충분히 혼합되었으며, 다당류 중의 시스-에틸렌 글리콜(cis-ethylene glycol) 그룹은 상온 중에서 알데히드로 시험 샘플 내에서 산화되고, 그 후 얼음 배스(ice bath)로 상기 반응은 종료되고, 얼음 황산 아연과 수산화 나트륨이 첨가되어 단백질을 침전시켰으며, 15분간 8,000rpm으로 원심분리 후, 상층액은 96-well 플레이트에 흡수되었고, 그 후 새로 제조된 아세틸아세톤-암모늄 아세테이트(acetylacetone-ammonium acetate) 혼합물이 첨가되었고, 96-well 플레이트는 37°C에서 1시간 동안 배양되었다. 당 함량은 전자동 마이크로플레이트 판독기(fully automatic microplate reader)의 405 nm 파장에서 비색 분석(colorimetric analysis)을 통해 계산되었다.
비록 본 발명의 특정한 특징들이 본 명세서에서 설명되고 묘사되었지만, 많은 개질, 치환, 개조 및 등가물들은 당업자에 의해 구상될 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 본 발명의 진정한 의도의 범위에 속하는 이러한 모든 개질 및 개조를 다루는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (21)
- 재조합 단백질 정제 방법으로서,
(a) 재조합 단백질을 함유하는 샘플에 아미노구아니딘(aminoguanidine) 및 중-장쇄 지방산(medium-long chain fatty acid)을 첨가하는 단계; 및
(b) 얻은 샘플을 크로마토그래피하는 단계로, 상기 크로마토그래피는 아미노구아니딘을 함유하는 크로마토그래피 완충 용액으로 선택적으로 수행하는 것인, 단계;
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a)단계의 상기 아미노구아니딘은 2 내지 100 mmol/g(재조합 단백질)의 농도를 갖는 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 중-장쇄 지방산은 옥탄산(octanoic acid), 카프르산(capric acid), 미리스트산(myristic acid)(C14:0), 팔미트산(palmitic acid)(C16:0), 스테아르산(stearic acid)(C18:0), 올레산(oleic acid)(C18:1), 리놀레산(linoleic acid)(C18:2), 리놀렌산(linolenic acid)(C18:3), 아라키돈산(arachidonic acid)(C20:4) 및 이들의 염 중에서 하나 이상 선택되는 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 중-장쇄 지방산은 2 내지 300 mmol/g(재조합 단백질), 바람직하게는 6 내지 150 mmol/g(재조합 단백질)의 농도를 갖는 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 포함하는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액(chromatographic balanced solution), 세척 용액(wash solution) 또는 용출 완충 용액(elution buffer solution) 중의 아미노구아니딘은 1 내지 200 mmol/L의 농도를 갖는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은, pH 값 4.0 내지 6.0, 바람직하게는 4.0 내지 5.5을 가지고,
용출액(eluent)은 pH 값 7.0 내지 9.5, 바람직하게는 7.0 내지 8.5을 갖는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은, 15 ms/cm 이하, 바람직하게는 10 ms/com 이하의 전도도를 가지고,
용출액은 30 ms/cm 이하, 바람직하게는 25 ms/cm 이하의 전도도를 갖는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 균형 용액 및 세척 용액은, 인산 또는 아세트산 또는 트리스 완충 용액(Tris buffer solution), 바람직하게는 인산 또는 아세트산 완충 용액인 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 매질 기판(medium substrate)은, 폴리아크릴레이트 기판(polyacrylate substrate), 폴리스티렌-디비닐 벤젠 기판(polystyrene-divinyl benzene substrate), 아가로스 기판, 또는 개질된 셀룰로오스 기판 중에서 선택되고; 바람직하게는 친수성 개질된 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌-디비닐 벤젠 기판 중에서 선택되는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 매질은 소수성 양이온 리간드와 결합되고, 상기 소수성 양이온 리간드는 내염성(salt tolerance)이 높은 Sepharose Capto MMC를 포함하는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피용 매질은, Uni-SP 시리즈, UniGel-SP 시리즈, NanoGel-SP 시리즈, MonoMix-HC SP 시리즈, MonoMix-MC SP 시리즈, 아가로스의 Sepharose 시리즈 또는 Bestarose 시리즈 중에서 선택되는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 소수성 크로마토그래피용 매질은, 페닐 또는 부틸 시리즈의 소수성 리간드와 결합된, 친수성으로 개질된 아가로스, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌-디비닐 벤젠 기판 마이크로스피어(microspheres)이거나; 또는
상기 소수성 크로마토그래피용 매질은 페닐 또는 부틸 시리즈의 소수성 리간드와 결합된, 친수성 폴리메타크릴레이트 매트릭스(polymethacrylate matrix) 인 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 소수성 크로마토그래피용 매질은, UniHR 페닐 시리즈, NanoHR 페닐 시리즈, UniHR 부틸 시리즈, NanoHR 부틸 시리즈, MonoMix-MC 부틸 시리즈 또는 MonoMix-MC 페닐 시리즈, 및 아가로스의 Sepharose 시리즈 또는 Bestarose 시리즈 중에서 선택되는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 소수성 크로마토그래피는 pH 값이 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8.0을 갖는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 소수성 크로마토그래피는 30 ms/cm 이하, 바람직하게는 25 ms/cm 이하의 전도도를 갖는 것인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 소수성 크로마토그래피용 로딩 용액(loading solution) 중의 아미노구아니딘은 1 내지 100 mmol/g 재조합 단백질의 농도를 갖는 것인, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아미노구아니딘은 이의 염 형태, 바람직하게는 이의 염산염 형태인 것인, 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 재조합 인간 알부민인 것인, 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 G-CSF, GLP-1, 인터페론, 성장 호르몬, 인터류킨 및 이들의 유사체 및 상기 단백질과 알부민의 융합 단백질인 것인, 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질을 함유하는 상기 샘플은 발효 상층액(fermentation supernatant)인 것인, 방법.
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