JPS59167597A - 純すいな組換えインタフェロンの製造方法 - Google Patents
純すいな組換えインタフェロンの製造方法Info
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- JPS59167597A JPS59167597A JP59036369A JP3636984A JPS59167597A JP S59167597 A JPS59167597 A JP S59167597A JP 59036369 A JP59036369 A JP 59036369A JP 3636984 A JP3636984 A JP 3636984A JP S59167597 A JPS59167597 A JP S59167597A
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- Japan
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- recombinant
- resin
- copper
- purifying
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換えインターフェロンを金属キレート樹脂
を用いて精製する方法および組換えインターフェロンの
精製のためにある種の金属キレート樹脂を使用すること
に関する。
を用いて精製する方法および組換えインターフェロンの
精製のためにある種の金属キレート樹脂を使用すること
に関する。
・インターフェロンとは、体に対して特異的でありかつ
抗ウィルス活性および免疫調節活性を有するタンパク質
の１群であると解される。抗ウィルス作用はウィルス自
体への直接の影響ではなく、ウィルスの感染に対する保
護の意味におけるウィルスの標的細胞への作用によって
達成される。インターフェロンは癌腫瘍へ客観化可能な
作用を及はすことができ、このためインターフェロンは
癌の治療に適当であり、そして、たとえば、インターフ
ェロンはマクロファージおよびＮＫ細胞を活性化し、そ
して細胞膜の種々の免疫学的に意味のある構成成分の発
現を増強する。
抗ウィルス活性および免疫調節活性を有するタンパク質
の１群であると解される。抗ウィルス作用はウィルス自
体への直接の影響ではなく、ウィルスの感染に対する保
護の意味におけるウィルスの標的細胞への作用によって
達成される。インターフェロンは癌腫瘍へ客観化可能な
作用を及はすことができ、このためインターフェロンは
癌の治療に適当であり、そして、たとえば、インターフ
ェロンはマクロファージおよびＮＫ細胞を活性化し、そ
して細胞膜の種々の免疫学的に意味のある構成成分の発
現を増強する。
今１−１、ヒトインターフェロン（α、βおよびγ）は
、組換えＤＮＡ技術のおかげで微生物学的方法において
、最大限に努力しても天然物質（白血球、線維芽細胞、
リンパ＃：）からの単離および精製によっては人手する
ことができない量で生産することができる。
、組換えＤＮＡ技術のおかげで微生物学的方法において
、最大限に努力しても天然物質（白血球、線維芽細胞、
リンパ＃：）からの単離および精製によっては人手する
ことができない量で生産することができる。
この新規な技術は、初めて、インターフェロンの徹底的
な臨床試験および可能な広い範囲の治療′ネ的使用のた
めの道を開き、そして活性物質の適９）な供給はこの活
性物質を用いての処置を探究する人／７にどってａ１能
であるように思われる。
な臨床試験および可能な広い範囲の治療′ネ的使用のた
めの道を開き、そして活性物質の適９）な供給はこの活
性物質を用いての処置を探究する人／７にどってａ１能
であるように思われる。
インターフェロン−ｃＤＮＡｃｙ）クローニングおよび
、ことにＥ、ｃｏ ｌ ｉ中の、その直接発現の詳ａｌ
ｌは、しばらくして、多くの刊行物の主題となった。し
かして、たとえば、組換えインターフェロンの生産は、
たとえば、次の文献から知られている：Ｊ、Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ。
、ことにＥ、ｃｏ ｌ ｉ中の、その直接発現の詳ａｌ
ｌは、しばらくして、多くの刊行物の主題となった。し
かして、たとえば、組換えインターフェロンの生産は、
たとえば、次の文献から知られている：Ｊ、Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ。
ユ（１９８１） 、３８１−３９０ （Ｗｅｔｚｅ １
ｅｔ ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ ２８４ （１９８
０）、３１６−３’２０（Ｎａｇａｔａ ｅｔａｌ、
）、Ｎｕｃｌ’ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、８ （
１９８０）、４０５７−４０７４−（Ｇ。
ｅｔ ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ ２８４ （１９８
０）、３１６−３’２０（Ｎａｇａｔａ ｅｔａｌ、
）、Ｎｕｃｌ’ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、８ （
１９８０）、４０５７−４０７４−（Ｇ。
ｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ、）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ、土０ （１９８２）、２４８７−２
５０１（Ｄｅｖｏｓ ｅｔ ａｌ、）、Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９５（１９８２）、５０３−５０８ （Ｇｒａ
ｙ ｅｔ ａｌ、）、ならびにドイツ国公開明細書
第３１ ２５ ７０６号、同第３１３８ ０９６号およ
び同第３１ ４４ ４６９吋。
ｉｄｓ Ｒｅｓ、土０ （１９８２）、２４８７−２
５０１（Ｄｅｖｏｓ ｅｔ ａｌ、）、Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９５（１９８２）、５０３−５０８ （Ｇｒａ
ｙ ｅｔ ａｌ、）、ならびにドイツ国公開明細書
第３１ ２５ ７０６号、同第３１３８ ０９６号およ
び同第３１ ４４ ４６９吋。
組換えインターフェロンは、微生物源である（たとえば
、組換えインターフェロンは好ましくはＥ、ｃｏｌｊか
ら誘導される）ので、微生物または培地からの単離後、
初め一連の微生物不純物によりなお汚染されており、そ
れらの汚染物の存在は、このように生産されたインター
フェロンの治療学的使用のために阻害的である。したが
って、組換え物質の精製はとくに重要な役割を演する。
、組換えインターフェロンは好ましくはＥ、ｃｏｌｊか
ら誘導される）ので、微生物または培地からの単離後、
初め一連の微生物不純物によりなお汚染されており、そ
れらの汚染物の存在は、このように生産されたインター
フェロンの治療学的使用のために阻害的である。したが
って、組換え物質の精製はとくに重要な役割を演する。
従来、組換えインターフェロンの精製において、多数の
異る方法、ことにりＵマドグラフィーか使用されてきて
おり、そして互いに組み合わされてきた（たとえば、ド
イツ国特許出願公開明細書第３１ ２５ ７０６号）。
異る方法、ことにりＵマドグラフィーか使用されてきて
おり、そして互いに組み合わされてきた（たとえば、ド
イツ国特許出願公開明細書第３１ ２５ ７０６号）。
なかでも、免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎ
ｔｓ）、すなわち、抗インターフェロン抗体を用いるク
ロマトゲラフイーは価値ある助剤であることが証明され
た。しかして、モノクローナル抗体による組換えヒト白
血球インターフェロン（ＨｕＩＦＮ−α）の精製は、た
とえば、Ｓｔ ａｅｈｅ Ｉ ｉ ｎｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２５６（１９８１）、９７５
０−９７５４および５ｅｅｈｅｒ ’ｅｔ ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ ２ ８ ５（１９８０）、４４６−
４５０に記載されている。これらの免疫吸着剤の高い特
異性に関すると、これから、このように精製された物質
は汚染物質を事実上含有せず、そして高度の純度を有す
ることを仮定しなくてはならない。
ｔｓ）、すなわち、抗インターフェロン抗体を用いるク
ロマトゲラフイーは価値ある助剤であることが証明され
た。しかして、モノクローナル抗体による組換えヒト白
血球インターフェロン（ＨｕＩＦＮ−α）の精製は、た
とえば、Ｓｔ ａｅｈｅ Ｉ ｉ ｎｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２５６（１９８１）、９７５
０−９７５４および５ｅｅｈｅｒ ’ｅｔ ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ ２ ８ ５（１９８０）、４４６−
４５０に記載されている。これらの免疫吸着剤の高い特
異性に関すると、これから、このように精製された物質
は汚染物質を事実上含有せず、そして高度の純度を有す
ることを仮定しなくてはならない。
しかしながら、モノクローナル抗体により大量の組換え
白血球インターフェロンを精製する場合において、精製
された物質はインターフェロンの断片（末端アミノ酸配
列の一部分が失われたインターフェロン）を含有するば
かりではなく、かつまたインターフェロンのオリゴマー
、たとえば、二量体を含有することがわかった。これら
の望ましくない副生物は、抗体に対する匹敵する親和性
をもつ純粋なインターフェロンの生物学的活性の一部分
を有するにすぎない。
白血球インターフェロンを精製する場合において、精製
された物質はインターフェロンの断片（末端アミノ酸配
列の一部分が失われたインターフェロン）を含有するば
かりではなく、かつまたインターフェロンのオリゴマー
、たとえば、二量体を含有することがわかった。これら
の望ましくない副生物は、抗体に対する匹敵する親和性
をもつ純粋なインターフェロンの生物学的活性の一部分
を有するにすぎない。
弐 寮′
人中、Ｍｅはコバ１し１・、ニッケル、亜鉛または銅を
意味する、 の樹脂［Ｎａｔｕｒｅ ２５８ （１９７５）、５９
８−５９９ （Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ、）から
知られているコによるヒト線維芽細胞インターフェロン
を精製する方法は、今回ヨーロッパ特許明細８第１１４
３５−５に記載されている。さらに、Ｅｄｙ ｅｔ
ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ 、ん互ヱ（１９
７７）、５９３４−５９３５には、前述の亜鉛キレート
樹脂によるＨｕＩＮＦ−βの有効な精製が記載されてい
る。引き続いて、Ｃｈａｄｈａ ｅｔ ａｌ、、Ｊ
、ｇｅｎ。
意味する、 の樹脂［Ｎａｔｕｒｅ ２５８ （１９７５）、５９
８−５９９ （Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ、）から
知られているコによるヒト線維芽細胞インターフェロン
を精製する方法は、今回ヨーロッパ特許明細８第１１４
３５−５に記載されている。さらに、Ｅｄｙ ｅｔ
ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ 、ん互ヱ（１９
７７）、５９３４−５９３５には、前述の亜鉛キレート
樹脂によるＨｕＩＮＦ−βの有効な精製が記載されてい
る。引き続いて、Ｃｈａｄｈａ ｅｔ ａｌ、、Ｊ
、ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、４３ （１９７９）、７０１−７０６は
、ＨｕＩＮＦ−βの場合において有効に使用される亜鉛
銅キレート樹脂でＨｕＩＮＦ−αは精製不可能であこと
を示し、しかしてＥｄｙ ｅｔａｌ、（ｌｏｃ、ｃｉ
ｔ、）により前になされた観Ａｌｌ＋を確証した。
、ＨｕＩＮＦ−βの場合において有効に使用される亜鉛
銅キレート樹脂でＨｕＩＮＦ−αは精製不可能であこと
を示し、しかしてＥｄｙ ｅｔａｌ、（ｌｏｃ、ｃｉ
ｔ、）により前になされた観Ａｌｌ＋を確証した。
未発明によれば、インターフェロンがＩＮＦ−α、Ｉ
’Ｎ Ｆ−βまたはＩＮＦ−γのいずれかであるかとは
無関係に、組換えインターフェロンの精製は、Ｐｏｒａ
ｔｈ ｅｔ ａｌ、に記載されている金属キレート
樹脂の代わりに、式 式中、Ｍｅは銅またはニッケルを意味する、の樹脂を使
用することにより実施できることが、今回発見された。
’Ｎ Ｆ−βまたはＩＮＦ−γのいずれかであるかとは
無関係に、組換えインターフェロンの精製は、Ｐｏｒａ
ｔｈ ｅｔ ａｌ、に記載されている金属キレート
樹脂の代わりに、式 式中、Ｍｅは銅またはニッケルを意味する、の樹脂を使
用することにより実施できることが、今回発見された。
前記樹脂は、原理的には、ＰＯｒａｔ’ｈ ｅｔ
ａｌ、の樹脂に構造的に類似するが、アカロースマトリ
ックスとイミノニ酢酸基との間の距離が短いことによっ
てＰｏ ｒａｔ ｈｅｔ ａｌ、の樹脂と区別される
。この樹脂およびその製造方法は、たとえば、Ｊ、Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １旦８ （１９８０）、
２４７−２５５ （ＨｕｂｅｒおよびＰｏｒａｔｈ）か
らすでに知られている。しかしながら、著者らはオリゴ
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの分別についての
実用性をもっばら記載している。オリゴヌクレオチドお
よびポリヌクレオチドは、インターフェロンと大きく異
なる化合物の部類であるので、未発りｊにおける樹脂を
組換えインターフェロンの精製、ことに相同の（ｈｏｍ
ｏｌｏｇｏｕｓ）＋Ｖ列断片およびそれに関連するオリ
ゴマーからの組換えインターフェロンの分離に際しての
現在の問題の解決に使用することは、ｈ業者にとって明
らかな方法ではなかった。
ａｌ、の樹脂に構造的に類似するが、アカロースマトリ
ックスとイミノニ酢酸基との間の距離が短いことによっ
てＰｏ ｒａｔ ｈｅｔ ａｌ、の樹脂と区別される
。この樹脂およびその製造方法は、たとえば、Ｊ、Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １旦８ （１９８０）、
２４７−２５５ （ＨｕｂｅｒおよびＰｏｒａｔｈ）か
らすでに知られている。しかしながら、著者らはオリゴ
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの分別についての
実用性をもっばら記載している。オリゴヌクレオチドお
よびポリヌクレオチドは、インターフェロンと大きく異
なる化合物の部類であるので、未発りｊにおける樹脂を
組換えインターフェロンの精製、ことに相同の（ｈｏｍ
ｏｌｏｇｏｕｓ）＋Ｖ列断片およびそれに関連するオリ
ゴマーからの組換えインターフェロンの分離に際しての
現在の問題の解決に使用することは、ｈ業者にとって明
らかな方法ではなかった。
したがって、本発明は、予備精製されたインターフェロ
ン溶液を、次の構造式 式中、Ｍｅは銅または二・ンケルを意味する、の金ｊ５
ｄキレー１−樹脂と接触させ、そしてイ１石工された前
記樹脂を洗浄用液体で処理すること番こより。
ン溶液を、次の構造式 式中、Ｍｅは銅または二・ンケルを意味する、の金ｊ５
ｄキレー１−樹脂と接触させ、そしてイ１石工された前
記樹脂を洗浄用液体で処理すること番こより。
１ｉｊ記仁ンターフエロンを純粋な形態で溶がすること
からなる、ｉＶｌ換えインターフェロンのＩｈ製Ｊｊ法
、および絹換えインターフェロンの才り製のためにこの
金属キレート樹脂を使用すること番こ１男する。
からなる、ｉＶｌ換えインターフェロンのＩｈ製Ｊｊ法
、および絹換えインターフェロンの才り製のためにこの
金属キレート樹脂を使用すること番こ１男する。
本発明に従い使用可能な金属キレート樹１１旨ｔ±。
既知の方法、たとえば、ＨｕｂｅｒｔおよびＰ。
ｒａｔｈ、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、１９８ （１９８
０）、２４７に記載する方法におｌ、）で、アカ′ロー
スをエビクロロヒドリンで処理し、生ずるエポキシドを
イミノニ酢酸ニナト１ノウム塩と反応させ、そしてこの
生成物を銅（ＩＩ ）塩また４土二・ンケル塩、たとえ
ば、硫酸銅または塩化二・ンケルで洗浄してｔ１塩また
はニ・ソケル塩に転化すること番こよりＶ＝することが
できる。エビブロモヒドリンをエビクロロヒドリンの代
わりに使用できる。アカロースとして、標準化された製
品、好ましくはセフ７ｏ−スｅ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ’
ｂ）（Ｐｈａｒｍｃｉａ、スウェーデン、ウプサラ）が
便利番こ使［１］される。セファロース（Ｔ９４ Ｂが
ことに好ましい。
０）、２４７に記載する方法におｌ、）で、アカ′ロー
スをエビクロロヒドリンで処理し、生ずるエポキシドを
イミノニ酢酸ニナト１ノウム塩と反応させ、そしてこの
生成物を銅（ＩＩ ）塩また４土二・ンケル塩、たとえ
ば、硫酸銅または塩化二・ンケルで洗浄してｔ１塩また
はニ・ソケル塩に転化すること番こよりＶ＝することが
できる。エビブロモヒドリンをエビクロロヒドリンの代
わりに使用できる。アカロースとして、標準化された製
品、好ましくはセフ７ｏ−スｅ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ’
ｂ）（Ｐｈａｒｍｃｉａ、スウェーデン、ウプサラ）が
便利番こ使［１］される。セファロース（Ｔ９４ Ｂが
ことに好ましい。
適当な銅キレート樹脂の製造を以後に詳述する。
１文のアカロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＠４Ｂ、Ｐ
ｈａｒｍｃｉａ）をガラスフリ、ット」−で各ｊＭＩ
１文の水で２回洗浄し、４文言の反応器に移し、そして
水で体積を１０００ｍ文にした。１５０ｍＭの４ＮのＮ
ａＯＨおよび４０＋ｎ４（７）ｍビクロロヒドリンを添
加した後、この混合物を３０°Ｃで５時間かきまぜた。
ｈａｒｍｃｉａ）をガラスフリ、ット」−で各ｊＭＩ
１文の水で２回洗浄し、４文言の反応器に移し、そして
水で体積を１０００ｍ文にした。１５０ｍＭの４ＮのＮ
ａＯＨおよび４０＋ｎ４（７）ｍビクロロヒドリンを添
加した後、この混合物を３０°Ｃで５時間かきまぜた。
この活性化された樹脂をカラスフリット上で中性になる
まで水洗し、６５０ｍ文の水性２ＮのＮａ２ＣＯ３溶液
で処理し、そして水で体積を２０００ｍ４にした。次い
で、１００ｇのイミノニ酢酸二ナトリウム塩を添加し、
そしてこの混合物を６５℃で２０時間かきまぜた。この
樹脂を引き続いてカラム中で順次に、各場合、２００＋
ｎＱの水、水性Ｃｕ５Ｏ４ａ５Ｈ２０（０，５取量％）
、水、０．２モルの酢酩（０、２モルのＮａＣ１，０，
１重量／容量％のＴｗｅｅｎ２０）および水で洗浄した
。銅イオン濃度は約９ミクロモル、／ｍ父の樹脂になっ
た。
まで水洗し、６５０ｍ文の水性２ＮのＮａ２ＣＯ３溶液
で処理し、そして水で体積を２０００ｍ４にした。次い
で、１００ｇのイミノニ酢酸二ナトリウム塩を添加し、
そしてこの混合物を６５℃で２０時間かきまぜた。この
樹脂を引き続いてカラム中で順次に、各場合、２００＋
ｎＱの水、水性Ｃｕ５Ｏ４ａ５Ｈ２０（０，５取量％）
、水、０．２モルの酢酩（０、２モルのＮａＣ１，０，
１重量／容量％のＴｗｅｅｎ２０）および水で洗浄した
。銅イオン濃度は約９ミクロモル、／ｍ父の樹脂になっ
た。
インターフェロンを負荷する前に、金属キレートのカラ
ムを便利には水性緩衝液（ｐＨ約５〜８）と平衡化する
。この緩衝液はそれ自体銅またはニンケルとキレ−１・
を形成せず、好ましくはリンＩｖ塩緩衝液ｐＨ７である
。平衡化緩衝液（およびまた溶離緩衝液）は、安定剤ま
たは乳化油、たとえば、ポリオキシエチレン−脂肪族ア
ルコールエーテル型、ポリオキシソルビタン−脂肪酸エ
ステル型またはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）の安定剤また
は乳化剤を含イ１することができる。このような安定剤
の添加は、高いインターフェロン濃度においてさえ、問
題を生じない手順を提供する。
ムを便利には水性緩衝液（ｐＨ約５〜８）と平衡化する
。この緩衝液はそれ自体銅またはニンケルとキレ−１・
を形成せず、好ましくはリンＩｖ塩緩衝液ｐＨ７である
。平衡化緩衝液（およびまた溶離緩衝液）は、安定剤ま
たは乳化油、たとえば、ポリオキシエチレン−脂肪族ア
ルコールエーテル型、ポリオキシソルビタン−脂肪酸エ
ステル型またはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）の安定剤また
は乳化剤を含イ１することができる。このような安定剤
の添加は、高いインターフェロン濃度においてさえ、問
題を生じない手順を提供する。
金属キレート樹脂は、同様な方法においてニッケル塩（
たとえば、ＮｉＣ１□）を使用して製造することができ
る。
たとえば、ＮｉＣ１□）を使用して製造することができ
る。
＃離は、それ自体既知の方法において、銅またはニッケ
ルとキレートを形成しない水性緩衝液、好ましくはリン
酸塩または酢酸塩の緩衝液を用いて実施する、ここでイ
ンターフェロンの断片、インターフェロンのモノマーお
よびオリゴマーの保持はｐ）（値およびイオン強度の関
数である。ｐＨ値を低下しかつイオン強度を増加すると
、まずインターフェロン断片が溶離され、次いでモノマ
ーのインターフェロンが溶離され、最後に、たとえば、
希酢酸で、オリゴマーが溶離される。ある限界、これは
当業者にとって自明である、の範囲内で、ｍ離用緩衝液
のイオン強度を高くすると、そのｐＨ値も高くなること
がある。緩衝液のイオン強度は、ＮａＣ１のような中性
塩の添加により増加させることができる。断片およびオ
リゴマーを含有子るインターフェロン溶液のｐＨ値を、
たとえは、ｐＨ約５、に適当に調整することにより、モ
ノマーおよびオリゴマーのみが吸着され、一方断片は流
過する。
ルとキレートを形成しない水性緩衝液、好ましくはリン
酸塩または酢酸塩の緩衝液を用いて実施する、ここでイ
ンターフェロンの断片、インターフェロンのモノマーお
よびオリゴマーの保持はｐ）（値およびイオン強度の関
数である。ｐＨ値を低下しかつイオン強度を増加すると
、まずインターフェロン断片が溶離され、次いでモノマ
ーのインターフェロンが溶離され、最後に、たとえば、
希酢酸で、オリゴマーが溶離される。ある限界、これは
当業者にとって自明である、の範囲内で、ｍ離用緩衝液
のイオン強度を高くすると、そのｐＨ値も高くなること
がある。緩衝液のイオン強度は、ＮａＣ１のような中性
塩の添加により増加させることができる。断片およびオ
リゴマーを含有子るインターフェロン溶液のｐＨ値を、
たとえは、ｐＨ約５、に適当に調整することにより、モ
ノマーおよびオリゴマーのみが吸着され、一方断片は流
過する。
溶離は−・定のｐＨ値において、あるいは直線的にまた
は不連続に低下するｐＨ勾配を用いて実施することがで
きる。最適な溶離条件は存在する不純物の博および種類
、精製すべき物質の量、カラムの寸法などに依存し、そ
して場合に応じて便利に決定される。
は不連続に低下するｐＨ勾配を用いて実施することがで
きる。最適な溶離条件は存在する不純物の博および種類
、精製すべき物質の量、カラムの寸法などに依存し、そ
して場合に応じて便利に決定される。
溶離用緩衝液が安定剤を含有する場合、安定剤は溶離液
を適当な担体、たとえば、セルロースを用いるクロマト
グラフィーに付すことより、除去することができる。本
発明に従って精製され６インターフエロンは、最後にポ
リエチレングリコール／水から結晶化することができる
。
を適当な担体、たとえば、セルロースを用いるクロマト
グラフィーに付すことより、除去することができる。本
発明に従って精製され６インターフエロンは、最後にポ
リエチレングリコール／水から結晶化することができる
。
白血球インターフェロンの精製は好ましくは銅キレート
カラムで実施し、そして線維芽細胞インターフェロンの
精製は好ましくはニッケルキレートカラムで実施する。
カラムで実施し、そして線維芽細胞インターフェロンの
精製は好ましくはニッケルキレートカラムで実施する。
次の実施例により、本発明の方法をさらに説明する。
出・産物質として使用した組換え白血球ヒトインターフ
ェロン（ｒ Ｉ ＦＮ−ｃｃＡ）は、５ｔａｅｈｅｌｉ
ｎ ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｂ１１ｏ１．Ｃｈｅｍ、２
．５６ （１９８１）、９７５０−９７５４に記載され
ている方法に従いモノクローナル抗体で精製することに
より得た。
ェロン（ｒ Ｉ ＦＮ−ｃｃＡ）は、５ｔａｅｈｅｌｉ
ｎ ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｂ１１ｏ１．Ｃｈｅｍ、２
．５６ （１９８１）、９７５０−９７５４に記載され
ている方法に従いモノクローナル抗体で精製することに
より得た。
Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、８．４０５７−４０７４（１
９８０）に従って調製し、出発物質として使用した、ヒ
ト線維芽細胞インターフェロン（ｒＩＮＦ−β）を、Ｆ
ｒ１ｅｓｅｎ ｅｔａｌ 、、Ａｒｃｈ、Ｂｉ ｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２０６，４３２−４５０ （
１９８１）の方法に従い不動化されたトリアジン着色物
質（たとえば、Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂｔｎｌｓ、ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＢｌｕｅＴ
ｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ（ｍ、ＬＫＢ）のクロマトグラ
フィーにより予備精製した。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、８．４０５７−４０７４（１
９８０）に従って調製し、出発物質として使用した、ヒ
ト線維芽細胞インターフェロン（ｒＩＮＦ−β）を、Ｆ
ｒ１ｅｓｅｎ ｅｔａｌ 、、Ａｒｃｈ、Ｂｉ ｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２０６，４３２−４５０ （
１９８１）の方法に従い不動化されたトリアジン着色物
質（たとえば、Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂｔｎｌｓ、ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＢｌｕｅＴ
ｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ（ｍ、ＬＫＢ）のクロマトグラ
フィーにより予備精製した。
タンパク質含酸の定量は、ｔｏｗ、ｒｙ 、ｅｔａｌ
、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、より３（１９５１）、２
６５−２７５の方法に従い標準としてアルブミ〉′を使
用して実施した。
、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、より３（１９５１）、２
６５−２７５の方法に従い標準としてアルブミ〉′を使
用して実施した。
不純物（断片またはオリゴマー）の定量は、Ｌａｅｍｍ
ｌｉ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ２７７ （
１９７０）、６８０−６８５に記載されているように５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより実施し、ただし電気泳動は非還元
性条件（すなわち、試料に２−メルカプトエタノールを
添加しない）のちとに実施するように変更した。
ｌｉ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ２７７ （
１９７０）、６８０−６８５に記載されているように５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより実施し、ただし電気泳動は非還元
性条件（すなわち、試料に２−メルカプトエタノールを
添加しない）のちとに実施するように変更した。
一災族例ユー
銅キレートカラｚ、（１６９ｍＪＪ、５Ｘ８．５ｍ文）
を５ＱＯｍ文のリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ７
，０，０，１重職／容１ｔ％のツイーン２０’）で平衡
化した。この方ラムに５ｔａｅｈ’ｅ１ｉｎ ｅｔ
ａｌ、（ｌｏｃ、ｃｉｔ、）に従い得た千ツクローナ
ルｒＩＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの１４８０ｍ文の
溶離液を４℃で負荷した。この溶離液は、０．２８ｍｇ
／ｍｕのタンパク質（２３，５ｉｉ％に１５ｋｄのイン
ターフェロン断片で汚染されていた）を含有しかつ４Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ７に調整されていた。このカラムを
順次に、３００ｍ５Ｌの平衡化用緩衝液、３００＋ｎＪ
１のＯ−２モンレのＮａＣｌをさらに含有する平衡化用
緩衝液、および３００ｍ文の０２０５モルの酢酸塩緩衝
液ＰＨ５，６（０，２モルのＮａＣ１および０．１％の
ツイーン２０を含有した）で洗浄した。インターフェロ
ン断片をまず０９０５モルの酢酸塩緩衝液（０，２モル
のＮａＣｌおよび０，１％のツイーン２０を含有する）
で５゜６から４．０に低下するＰＨ勾配において溶離し
た６次いで、２５６ ｍ ｇの七ツマ−のインターフェ
ロン（純度〉９５％）を同一の酢酸塩緩衝液、ｐＨ４，
０で溶離した。
を５ＱＯｍ文のリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ７
，０，０，１重職／容１ｔ％のツイーン２０’）で平衡
化した。この方ラムに５ｔａｅｈ’ｅ１ｉｎ ｅｔ
ａｌ、（ｌｏｃ、ｃｉｔ、）に従い得た千ツクローナ
ルｒＩＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの１４８０ｍ文の
溶離液を４℃で負荷した。この溶離液は、０．２８ｍｇ
／ｍｕのタンパク質（２３，５ｉｉ％に１５ｋｄのイン
ターフェロン断片で汚染されていた）を含有しかつ４Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ７に調整されていた。このカラムを
順次に、３００ｍ５Ｌの平衡化用緩衝液、３００＋ｎＪ
１のＯ−２モンレのＮａＣｌをさらに含有する平衡化用
緩衝液、および３００ｍ文の０２０５モルの酢酸塩緩衝
液ＰＨ５，６（０，２モルのＮａＣ１および０．１％の
ツイーン２０を含有した）で洗浄した。インターフェロ
ン断片をまず０９０５モルの酢酸塩緩衝液（０，２モル
のＮａＣｌおよび０，１％のツイーン２０を含有する）
で５゜６から４．０に低下するＰＨ勾配において溶離し
た６次いで、２５６ ｍ ｇの七ツマ−のインターフェ
ロン（純度〉９５％）を同一の酢酸塩緩衝液、ｐＨ４，
０で溶離した。
０ 、１ ＩＴＬｒ＠： ／容φ％のツイーンを含有す
る千ツマ−のインターフェロンの溶液を、ＣＭ５２セル
ロースカラムのクロマトグラフィーに付し、０゜１モル
の酢酸塩アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で溶離して安定
剤を除去した。
る千ツマ−のインターフェロンの溶液を、ＣＭ５２セル
ロースカラムのクロマトグラフィーに付し、０゜１モル
の酢酸塩アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で溶離して安定
剤を除去した。
実施例２
実施例１と同一の平衡化した銅キレートカラムに、５ｔ
ａｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ、（１’。
ａｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ、（１’。
ｃ、ｃｉｔ、）に従い得たモノクローナルｒＩＮＦ−α
Ａ−抗体のカラムからの２１６８＋ｎ４の溶離液を４℃
で負荷した。この溶離液は、０．３３ｍ ｇ／ ｍＪＪ
のタンパク質（２７玉量％に１５ｋｄのインターフェロ
ン断片で汚染されていた）を含有しかつ４ＮのＮａ１ｌ
（でｐＨ４，５に調整されていた。次いで、この方ラム
を０．０５モルの酢酸塩基緩衝液（ｐＨ５、６； ０
、２モルのＮａＣ１および０１１％のツイーン２ｏを含
有した）で洗浄した。これらの条件のもとで、全体の１
８．５ｋｄｃ７）ｒＩＮＦ−ａｆｉｒｙ）みが吸着され
たが、Ｌ５ｋｄの断片は吸着されず、引き続いて０．０
５モルの酢酸塩緩衝液（ｐ、Ｈ４，０，２モルのＮａＣ
１および０．１％のツイーン２０）で溶Ｍした。４０２
ｍ ｇのインターフェロン、純度〉９５％が得られた
。
Ａ−抗体のカラムからの２１６８＋ｎ４の溶離液を４℃
で負荷した。この溶離液は、０．３３ｍ ｇ／ ｍＪＪ
のタンパク質（２７玉量％に１５ｋｄのインターフェロ
ン断片で汚染されていた）を含有しかつ４ＮのＮａ１ｌ
（でｐＨ４，５に調整されていた。次いで、この方ラム
を０．０５モルの酢酸塩基緩衝液（ｐＨ５、６； ０
、２モルのＮａＣ１および０１１％のツイーン２ｏを含
有した）で洗浄した。これらの条件のもとで、全体の１
８．５ｋｄｃ７）ｒＩＮＦ−ａｆｉｒｙ）みが吸着され
たが、Ｌ５ｋｄの断片は吸着されず、引き続いて０．０
５モルの酢酸塩緩衝液（ｐ、Ｈ４，０，２モルのＮａＣ
１および０．１％のツイーン２０）で溶Ｍした。４０２
ｍ ｇのインターフェロン、純度〉９５％が得られた
。
ユ■
実施例１と同一の平衡化した銅キレートカラムに、５ｔ
ａｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａ ｌ 、（Ｉ 。
ａｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａ ｌ 、（Ｉ 。
ｃ、ｃｉｔ、）に従いイ１ｔたモノクローナＡｙ ｒ
Ｉ ＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの１２６０ｍＪＬの
溶離液を４°Ｃで負荷した。この溶離液は、０．５ｍｇ
／ ｍ 又のタンパク質（３４重量％にインターフェ
ロンのオリゴマー； ３７ｋｄのタイマー、５５．５Ｒ
ｇのトリマーおよび７４ｋｄのテ）・ラマーで汚染され
ていた）を含有しがっ４ＮのＮａＯＨでｐＨ７に調整さ
れていた。この方ラムを初め３００ｍ文の０．０５モル
のリン酸塩緩衝液（ｐＨ７：０．１％のツイーン）で洗
浄し、引き続いて０．０５モルの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４
。
Ｉ ＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの１２６０ｍＪＬの
溶離液を４°Ｃで負荷した。この溶離液は、０．５ｍｇ
／ ｍ 又のタンパク質（３４重量％にインターフェ
ロンのオリゴマー； ３７ｋｄのタイマー、５５．５Ｒ
ｇのトリマーおよび７４ｋｄのテ）・ラマーで汚染され
ていた）を含有しがっ４ＮのＮａＯＨでｐＨ７に調整さ
れていた。この方ラムを初め３００ｍ文の０．０５モル
のリン酸塩緩衝液（ｐＨ７：０．１％のツイーン）で洗
浄し、引き続いて０．０５モルの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４
。
７；０．２モルのＮａＣ１および０．１％のツイーン２
０を含有した）で溶離し、９５％の純度のモノマーのイ
ンターフェロンが得られた。１５０ ｍ ｇの′二埴体
のインターフェロンは０．０５モルのｐＨ４，０の酢酸
塩緩衝液（０，２モルのＮａＣ１および０．１％のツイ
ーン２０）で溶離され、そしてより高いオリゴマーは０
．２モルの酢酸（０，２モルのＮａＣ１および０．１％
のツイーン２０を含有した）で溶離された。
０を含有した）で溶離し、９５％の純度のモノマーのイ
ンターフェロンが得られた。１５０ ｍ ｇの′二埴体
のインターフェロンは０．０５モルのｐＨ４，０の酢酸
塩緩衝液（０，２モルのＮａＣ１および０．１％のツイ
ーン２０）で溶離され、そしてより高いオリゴマーは０
．２モルの酢酸（０，２モルのＮａＣ１および０．１％
のツイーン２０を含有した）で溶離された。
−爽施湾Ａ−
銅キレートカラム（２９５ｍｊＱ、５Ｘ１５ｃｍ）を６
００ｍｕ （０，０５モル、ｐＨ７，０゜１％のツイー
ン）で平衡化した。この方ラムを、５ｔａｅｈｅｌｉｎ
ｅｔ ａｌ、（ｌｏ’ｃ、ｃｉｔ、）に従い得た
モノクローナルｒＩＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの３
２００ｍ９．の溶離液を４°Ｃで負荷した。この溶離液
は０ 、３３ ｍ ｇ ／ ｍ文のタンパク質（２４重
量％に１５ｋｄのインターフェロンの断片でおよび１１
重量％にインターフェロンのオリゴマーで汚染されてい
た）を含有した。１５ｋｄの断片は０．０’０５モルの
酢醇ｔ＝ａｍ液（ＰＨ４；０．２５モルのＮａＣ１およ
び０．１％のツイーン２０）で洗浄除去した。
００ｍｕ （０，０５モル、ｐＨ７，０゜１％のツイー
ン）で平衡化した。この方ラムを、５ｔａｅｈｅｌｉｎ
ｅｔ ａｌ、（ｌｏ’ｃ、ｃｉｔ、）に従い得た
モノクローナルｒＩＮＦ−αＡ−抗体のカラムからの３
２００ｍ９．の溶離液を４°Ｃで負荷した。この溶離液
は０ 、３３ ｍ ｇ ／ ｍ文のタンパク質（２４重
量％に１５ｋｄのインターフェロンの断片でおよび１１
重量％にインターフェロンのオリゴマーで汚染されてい
た）を含有した。１５ｋｄの断片は０．０’０５モルの
酢醇ｔ＝ａｍ液（ＰＨ４；０．２５モルのＮａＣ１およ
び０．１％のツイーン２０）で洗浄除去した。
モノマーのインターフェロンを０．０２５モルの酢酸塩
緩衝液（ｐＨ３、４； ０ 、２５モル（７）Ｎ ａＣ
ｌおよび０．１％のライ−７２０）で溶離し。
緩衝液（ｐＨ３、４； ０ 、２５モル（７）Ｎ ａＣ
ｌおよび０．１％のライ−７２０）で溶離し。
〉９５％の純度の合計４７０ ｍ ｇが得られた。
実施例５
銅キレートカラム（ｌｏｏＯｍＭ、１１０Ｘ１３グ）を
２５００ｍ文のリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ５
，０、２モル（１）Ｎ ａＣ１，０，１り６のツイーン
２０）で−Ｉ［ｌ衡化し、そしてこのカラ１、に５ｔａ
ｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａ １ 、（ｌ 。
２５００ｍ文のリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ５
，０、２モル（１）Ｎ ａＣ１，０，１り６のツイーン
２０）で−Ｉ［ｌ衡化し、そしてこのカラ１、に５ｔａ
ｅｈｅｌｉｎ ｅｔ ａ １ 、（ｌ 。
ｃ、ｃｉｔ、）に従い得たモノクローナルｒＩＮＦ−α
Ａ−抗体のカラムからの１０．０００ｍ文の溶離液を４
°Ｃで負荷した。この溶離液は、０゜２１ ｍ ｇ ／
ｍ父のタンパク質（３重量％に１５ｋｄのインターフ
ェロン断片でおよび７垂部％に１５ｋｄのインターフェ
ロンのオリゴマーで汚染されていた）を含有しかつ６Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ７に調整されていた。この断片を平衡
化用緩衝液の洗浄により除去した。１７００ｍｇのモノ
マーの・インターフェロン（純度〉９５％）は、０．０
５モルの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５，０，２５モルのＮ
ａＣ１および０．１％のツイーン２０）で溶離された。
Ａ−抗体のカラムからの１０．０００ｍ文の溶離液を４
°Ｃで負荷した。この溶離液は、０゜２１ ｍ ｇ ／
ｍ父のタンパク質（３重量％に１５ｋｄのインターフ
ェロン断片でおよび７垂部％に１５ｋｄのインターフェ
ロンのオリゴマーで汚染されていた）を含有しかつ６Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ７に調整されていた。この断片を平衡
化用緩衝液の洗浄により除去した。１７００ｍｇのモノ
マーの・インターフェロン（純度〉９５％）は、０．０
５モルの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５，０，２５モルのＮ
ａＣ１および０．１％のツイーン２０）で溶離された。
オリゴマーは０．２モルの酢酸（０゜２モルのＮａＣ１
および０．１％のツイーン２０）でｆ８離することによ
りイツられた。０．１重１１！／容ｊ１１％のツイーン
をｅ縮しかつ除去するため、モノマーのインターフェロ
ンの溶液をＣＭ５２セルロースカラムのクロマトグラフ
ィーに伺し、０．１モルの酢酸アンモニ□ウム緩衝液（
ｐＨ５）で溶離した。
および０．１％のツイーン２０）でｆ８離することによ
りイツられた。０．１重１１！／容ｊ１１％のツイーン
をｅ縮しかつ除去するため、モノマーのインターフェロ
ンの溶液をＣＭ５２セルロースカラムのクロマトグラフ
ィーに伺し、０．１モルの酢酸アンモニ□ウム緩衝液（
ｐＨ５）で溶離した。
４．８．７ｍＭのポリエチレングリコール４０００ （
０、３ｇ／ｍｕ） ｃ７）水溶液を、ゆっくり４°Ｃに
お嗅１てわｆかにかきまぜながら、４ｍｇ、７ｍＭのタ
ンパク質を含有するセルロースカラムからの１９５ｍ父
の溶離液に添加した。約５１１４間後、最初の結晶が形
成し、これを冷時に３日後に遠心により」、澄みから分
離し、冷たい水性ポリエチレングリコール４０００ （
０、３ｇ／ｍＪＩＤで洗浄し、そして減圧乾燥した。収
量：５２０ｍｇ、数個の結晶を０．１モルの酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ５）中に溶解して得られた試料のゲ
ル電解泳動および生物検定により、得られた結晶は無傷
のｒｌＮＦ−αＡであることが立証された。
０、３ｇ／ｍｕ） ｃ７）水溶液を、ゆっくり４°Ｃに
お嗅１てわｆかにかきまぜながら、４ｍｇ、７ｍＭのタ
ンパク質を含有するセルロースカラムからの１９５ｍ父
の溶離液に添加した。約５１１４間後、最初の結晶が形
成し、これを冷時に３日後に遠心により」、澄みから分
離し、冷たい水性ポリエチレングリコール４０００ （
０、３ｇ／ｍＪＩＤで洗浄し、そして減圧乾燥した。収
量：５２０ｍｇ、数個の結晶を０．１モルの酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ５）中に溶解して得られた試料のゲ
ル電解泳動および生物検定により、得られた結晶は無傷
のｒｌＮＦ−αＡであることが立証された。
−裏羞例６
１ト−イオンを銅キレートカラム（２０ｍ ｌ、］、、
６Ｘ６ｍ父）から２０ｍ文のエチレンジアミン四耐酪二
すトリウム塩の水溶液で、次いで１００ｍＭの水で洗浄
除去した。この方ラムを引きｈ′ｌ−いて順次に各場合
３６ｍ文の０．０５モルのＮｉＣｌ２の水溶液、水、０
．０５モルの酢酸（０，５モルのＮａＣ１を含有した）
で洗浄した。
６Ｘ６ｍ父）から２０ｍ文のエチレンジアミン四耐酪二
すトリウム塩の水溶液で、次いで１００ｍＭの水で洗浄
除去した。この方ラムを引きｈ′ｌ−いて順次に各場合
３６ｍ文の０．０５モルのＮｉＣｌ２の水溶液、水、０
．０５モルの酢酸（０，５モルのＮａＣ１を含有した）
で洗浄した。
このようにして得られたニッケルキレートカラムを３６
ｍ文のリン酸塩緩衝液（Ｃ１，０５モル、ｐ Ｈ’７
、２．１０重量／容墨％のエチレングリコール、０．２
モルのＮａＣ１）で平衡化した。
ｍ文のリン酸塩緩衝液（Ｃ１，０５モル、ｐ Ｈ’７
、２．１０重量／容墨％のエチレングリコール、０．２
モルのＮａＣ１）で平衡化した。
Ｇｏｅｄｄｌ ｅｔ ａｌ、、（ｌｏｃ、ｃｉｌ、
）に従い得られたブルー−セファロース（知（Ｂｌｕｅ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅ＠）カラムからの３８ｍ文の溶離
液は、０．１２ｍｇ／ｍ文のタンパク質を含有し、これ
を１５２ｍｊｌのリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ＰＨ
７，２）で希釈し、４°Ｃにおいてニッケルキレートカ
ラムに添加した。このカラムを７２ｍ文の酢酸塩緩衝液
（０゜０５モル、ｐＨ７，２，１０屯−ψ／容−♀：％
のプロピレングリコールおよび０．２モルのＮａＣ１）
で洗浄し、次いで酢酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ３
，５，１０重＜７ｋ ／容、１ｊ１％のプロピレングリ
コールおよび０．３モルのＮａＣ１）で溶離した。３．
７５ｇ純粋な（純度〉９５％）の線維芽畜旧抱インター
フェロンがイ１）られた。この方ラムを０．０５モルの
酢酸（０，５モルのＮａＣ１を含有した）で洗浄し、そ
してこの方ラムは再使用できる状態であった・ 特許出願人 エフ・ホフマン・う・ロシュ・ウント−
コンパニーΦアクチェンゲゼル
）に従い得られたブルー−セファロース（知（Ｂｌｕｅ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅ＠）カラムからの３８ｍ文の溶離
液は、０．１２ｍｇ／ｍ文のタンパク質を含有し、これ
を１５２ｍｊｌのリン酸塩緩衝液（０，０５モル、ＰＨ
７，２）で希釈し、４°Ｃにおいてニッケルキレートカ
ラムに添加した。このカラムを７２ｍ文の酢酸塩緩衝液
（０゜０５モル、ｐＨ７，２，１０屯−ψ／容−♀：％
のプロピレングリコールおよび０．２モルのＮａＣ１）
で洗浄し、次いで酢酸塩緩衝液（０，０５モル、ｐＨ３
，５，１０重＜７ｋ ／容、１ｊ１％のプロピレングリ
コールおよび０．３モルのＮａＣ１）で溶離した。３．
７５ｇ純粋な（純度〉９５％）の線維芽畜旧抱インター
フェロンがイ１）られた。この方ラムを０．０５モルの
酢酸（０，５モルのＮａＣ１を含有した）で洗浄し、そ
してこの方ラムは再使用できる状態であった・ 特許出願人 エフ・ホフマン・う・ロシュ・ウント−
コンパニーΦアクチェンゲゼル
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■、予備精製されたインターフェロン溶液を、次の構造
式 式中、Ｍｅは銅またはニッケルを意味する、の金属キレ
ート樹脂に接触させ、そして負荷された前記樹脂を洗浄
用液体で処理することにより、前記インターフェロンを
純粋な形態で溶離することを特徴とする組換えインター
フェロンの精製方法。 ２、銅キレート樹脂を使用する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３、ニッケルキレート樹脂を使用する特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ４、アガロースがセファロース（秒（Ｓｅｐｈａｒ ｏ
、ｓ ｅ （ｌｕ） ４Ｂである特許請求の範囲第２ま
たは３項記載の方法。 ５、組換え白血球インターフェロンを精製する特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ６、組換え線維芽細胞インターフェロンを使用する特許
請求の範囲第３項記載の方法。 ７、純粋なインターフェロンを勾配溶離によりイ１．）
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ８、ｎｉｊ記溶離が５．６から４．０に低下するＰＨ勾
配を用いて実施する特許請求の範囲第５または７項記載
の方法。 ９、溶離はｐＨ３，５の酢酸塩緩衝液を用いて実施する
特許請求の範囲第３項記載の方法。 １０、組換えインターフェロンを精製するための、構造
式 − ｌｌ 式中、Ｍｅは銅またはニッケルを意味する、の金属キレ
ート樹脂の使用。 １１、白血球インターフェロンを精製するための特ｔ１
−請求の範囲第１０項記載の銅キレ−）・樹脂の使用。 １２、線維芽細胞インターフェロンを精製するための特
許請求の範囲第１０項記載のニンケルキレート樹脂の使
用。 １３、＃！ｒ訂請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載
の方？Ｊｉまたはその明らかな同等の方法により製造さ
れた組換えインターフェロン。 １４、特許請求の範囲第１項記載の方法またはその明ら
かな同等方法により製造された組換え白血球インターフ
ェロン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH115183 | 1983-03-03 | ||
| CH1151/83-8 | 1983-03-03 | ||
| CH6642/83-8 | 1983-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59167597A true JPS59167597A (ja) | 1984-09-21 |
| JPS6411640B2 JPS6411640B2 (ja) | 1989-02-27 |
Family
ID=4203669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59036369A Granted JPS59167597A (ja) | 1983-03-03 | 1984-02-29 | 純すいな組換えインタフェロンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59167597A (ja) |
| KR (1) | KR860001150B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA841395B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6178799A (ja) * | 1984-09-26 | 1986-04-22 | Takeda Chem Ind Ltd | 蛋白質の相互分離方法 |
| JP2007528835A (ja) * | 2003-02-28 | 2007-10-18 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 金属キレートアフィニティリガンドの合成方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5668691A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of human fibroplastic interferon |
| JPS5668690A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of human fibroplastic interferon |
| JPS5668689A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of interferon |
| JPS5668692A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of human fibroplastic interferon |
-
1984
- 1984-02-24 ZA ZA841395A patent/ZA841395B/xx unknown
- 1984-02-29 JP JP59036369A patent/JPS59167597A/ja active Granted
- 1984-03-03 KR KR1019840001084A patent/KR860001150B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS5668689A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of interferon |
| JPS5668692A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Toray Ind Inc | Method for concentration and purification of human fibroplastic interferon |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6178799A (ja) * | 1984-09-26 | 1986-04-22 | Takeda Chem Ind Ltd | 蛋白質の相互分離方法 |
| JP2007528835A (ja) * | 2003-02-28 | 2007-10-18 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 金属キレートアフィニティリガンドの合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6411640B2 (ja) | 1989-02-27 |
| KR840008290A (ko) | 1984-12-14 |
| KR860001150B1 (ko) | 1986-08-18 |
| ZA841395B (en) | 1984-10-31 |
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