JPS5821691A - α−及びβ−インタ−フェロンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイン＃−７エ四ンの精製方法に関する。イン＃
−７エーンは生体がウィルスに感染したとき、あるいは
生体内で免疫反応が生じたとき産生される蛋白質で、制
癌作用ルるいは抗ウィルス作用を有することが知られて
いる。

イン＃−７エーンの製造方法としては、従来、白血球あ
るいは自虐病細胞のような無限に増殖する白血球を培養
し、これにウィルスを感染させ、この白血球が生産する
イン＃−７エロンを取得する方法、同じくこれらの０１
１１球をレクチンで刺激してインターフェロンを生産す
る方決お上び線維芽細胞、を培養し、これに合成の核酸
などを加えてインターフェロンを製造する方法が知られ
ている。

さらに、最近ではｉＩｔ伝子組換え技術の進歩に−より
、白血球や纏維芽細胞の培養によらずに、白血球インタ
ー７エ！ンを産生する遺伝子又は線維井細胞のインター
フェロン産生遺伝子を大腸Ｉ！１１等の微生物に組込み
、この繭重培養することによってインターフェロンを取
得する方法も行なわれている。

一方、これらのインターフェロンはその由来によって５
楓類に分類されている。すなわち、白血球のウィルス刺
激によって生産されるα型、レクチン刺激によって生産
されるｒ掴、および纏維芽ｍ胞の生産するβ型の三種類
である。

近年、これらのインターフェロンについて制癌剤あるい
は抗ウィルス剤としての臨床試験がなされているが、現
在、臨床に供されているインター７エａン製剤の純度は
ａ、ｐｍとも１０１〜ｔａｇと極めて低く、不純物に基
づくと思われる副作用、例えば発熱、アレルギー等が報
告されているため、高純度インターフェロン製剤の開発
が熱値されている。

インター７エリンの精製方法としては従来、ＣＰＧ（Ｅ
ｄ７　　　Ｖ、Ｇ、ら、Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　、
、ＡＳ巻！＄１７〜５２１．１９７４年）、ｊｌｉ鉛＋
　レ−）　（ＥｄｙＶ、Ｇ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ　、　　
Ｃｈｅｍ、、２５２巻５９５４〜５９５５゜１９７７年
）、コンカナバリンＡ　（Ｄａｖｅｙ　　Ｍ、Ｗ。

ら、　Ｂｉｏｃｈａｍ、、　　１５巻７０４〜７１５．
１９７４年、ＣａｒｔｅｒＷ、Ａ、５　Ｐｈａｒｓｎｃ
　、Ｔｈｅｒ、　８巻３５９〜３７７、１９４１０年）
もしくは抗インター７エロ＞抗体（Ｂｅｒｇ　Ｋ。

ら、Ｊ、Ｉｍｍｕａｏｌ、、１１４巻４４０〜６４４，
１９７５年）などを用いて親和性クロマトグラフィー法
あるいは、Ｋ８ＣＮを用いた方法（Ｃａｎｔｅｌｌ　Ｋ
、ら。

Ｐｋａｒｍａｃ、〒ｈｅｒ、Ｃ，，１巻５６９頁、　１
９７７年）など多数の精製方法の研尭がなされてきた。

しかし、これらの方法はいずれも回収率および純度の両
−者を十分に満足させるものではなく、純度を高めると
回収率の低下を招き、逆に回収率を高めると純度の低下
を生じるという矛盾を含んでいたＯ このような状態に鑑み、本発明者らは永年研究を重ねた
結果、アクリロニトリルの高重合体を含有する担体がイ
ンターフェロンを特異的に吸着し、適当な緩衝液でこの
吸着されたインターフェロンを溶出することによって、
回収率１・０−で、高Ｓ度のインターフェロンが−■の
操作で容易に得られることを見出し本発明を完成した。

本発明によるインターフェロンの一般的精製方法は次の
通りである。すなわちインター７エ四ンを含有する溶液
をｐ　Ｈｔ口〜ａ５、望ましくはｐＨＬト４０に調整し
、アクリロニトリルの高重合体を含有する吸着担体にカ
ラムあるいはパッチ法にて接触させて吸着担体にインタ
ー７エ四ンを吸着させたのち、適当な溶出液によりイン
ターフェロンを闘収するものである。

本発明における吸着担体としてはアクリロニ）リルを含
を繊維が好ましいが、これに限定されるものではない。

アクリロニトリルを含む繊維は、わが国では品質表示規
定で、アクリロニトリルを５０重量−以上含有するもの
をアクリル、それ以下のものをアクリル系と称し、又、
アメリカなどでは６５重量襲以上アクリａｍ）リルを含
有するものをアクリル、５５〜６５未満外のものをモダ
アクリルと、称して区別しているが、本発明においては
いずれでありてもイン＃−７エーンを特異的に吸着、溶
出するので、これらを区別する必要はなくすべてを包含
する。

このような繊維としては日本のカシミーン′（旭化成）
、カネボウアクリル（鐘紡）、カネヵロン（鐘淵化学）
、ポンネル（三菱レイヨン）、エタスラン（８本エタス
ラン）、ペスロン（東邦ペス費ン）、）し１ン（東し）
、ヒユーロン（旭化ｍｌシルパロン（三菱レイラン）、
プｍｌッタス（東洋紡績）、アメリカのオーロン、アタ
リラン、タレスラン、ゼアチン、ベレル、ダイネル、ビ
；習ンＮ１イギリスのタールチル、テタツン、ドイツの
パン、ドラロン等を挙げることができる。繊維以外の形
状としてはスポンジ状、粉末状、フレーム状、多孔性顆
粒状、フィルム状、線状成形物あるいは゛これらの二次
的加工物を用いることができる。なお、アクリｍ；）リ
ルの高重合体においては、アクリロニトリル以外の共重
合成分としてはアクリル酸メチル、メタアクリル酸メチ
、ル、アクリル酸、メタアクリル酸、酢酸ビニル、塩化
ビニル、塩化ビニリデン等を含有することができる。

インターフェロン溶出液としては、アクリロニトリルの
高重合体を含有する吸着担一体からインターフェロンを
溶出させることが出来るものであるならば特に限定され
ないが、塩化す）リウム、塩化アンモニウム、リン酸塩
、酢酸塩、ｙｔノ酸、アルビール類、アルキレングリコ
ール類、ダリアルキレングリコール、＠、ジメチルスル
７オ午サイド等の一般的有機あるいは無機物質の水溶液
が良好な結果を与える。

溶出液のｐＨは一般的にはインターフェロンの安定性を
考慮に入れて、ｐＨ２〜ｐＨｔの範−が好ましいが、必
ずしもこのｐＨ＠Ｈにこだわる必要はなく、例えばｐＨ
１０の溶出液を用いて溶出させた場合には、すみやかに
溶出液のｐＨを中性付近に回復させれば問題とならない
。また溶出液中にヒト自涜フルプミン、ゼラチン等の蛋
白質を１１００５〜１％程度、あるいはシュークロース
、マンニトール、グルコース等の糖類全１〜１０襲程度
、あるいはグリシン、シスチン等のアミノ酸をａ０１〜
１％程度含有させ、溶出液中のイン＃−７エ四ンの安定
化を計ることも可能である。

次に実施例および従来の方法との比較を示すが、本発明
はこれに限定されるものではない。

なお実施例に用いたインターフェロンの生産は以下の如
く行なりた。

Ａ　ヒＦ纏艙芽細胞を１０％牛脂児血清含有イーダ謝ズ
ミエマムエッセンシャルメデイウム（以下ＭＥＭと略称
する）を用いてコンフルエント（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）
になるまで培養し、ＭｏｚｅｓＬ、Ｗ、ら　（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、　４５巻１００〜１１１，１９７５年）の方
法によりインターフェロンβ（ＩＦＮ−／、）を産生さ
せた。ＩＦＮ−βの含有量は６５００インターナシミナ
ルユニツト（ＩＵ）／ｍｔテｌｂりた。

Ｂ　ヒト白血球から、ストランダ−ら （Ｓｔｒａｎｄｅｒ　Ｈ，ｅｔａム、Ａｎｎ、Ｍｅｄ、
Ｅｘｐ、Ｆｅｎｎ、、４４巻。

２６５〜２７５．１９６，６　＊　）の方法によりイン
ターフェロンα（ＩＦＮ−９）を得た。ＩＦＮ−α　の
含有量は、ＨＩ４０００ＩＵ／ｍｔであった。

Ｃヒトリンパ芽球細胞株（Ｎａｍａｌｗａ）よりスラン
ダーら（Ｈ，８ｔｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）ノ方法
により、ＩＦＮ−５を主成分とするインターフェロン液
（１０２００ＩＵ／ｍｔ）　を得た。

実施例１ 人で得たＩＦＮ−β１００ｍＬ（瓜５Ｘ１０・ＩＵ）を
（ＬＳＮ酢酸にてｐＨ五〇に調整後ポリＴクリロニ）リ
ル纏維（商品名ボンネル、三艷レイヨン）ｓｔを充填し
たカラムを通過させ、ＩＦＮ−βを吸着させた。α１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ２４）ＳＯＯｍｔでカラムを洗浄後
、ＡＭ　ＮＨ４Ｃｌ　ＳＯＯｍｔにてＩＦＮ−βを溶出
させた。

実施例２ 人で得たＩＦＮ−β１００　ｏｍｚ（ｔｓＸｌｏｓｉｕ
）をα５Ｎアンモニア水にてｐ　Ｈ＆　０に調整後、ポ
リアクリロニトリル線維（商品名カシミロン、旭化成）
４４ｔを充填したカラムを通過させ、ＩＦ’Ｎ−βを吸
着させた。

ＩＭ　　ＮａＣｔ２００ｍｔでカラムを洗浄し、（Ｌ５
ＭＮａＣ１／ＳＯ襲エチレングリコール液１００ｍｔに
てＩＦＮ−／を溶出させた。

実施例５ 人で得たＩＦＮ−βｌｏｏｏｍｔをαＯＩＮ塩酸にてｐ
Ｈ１・に調整後、ダリアタリロニシリル線維（商品名）
レロン、東し）！ＳＰを充填したカラムを通過させ、Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１を含む１／１００Ｍリン酸緩衝液４５Ｏｍ
ｊで洗浄した。ツいでＩＭ　ＮａＣ１１４０％ブーピレ
ングリコール液１００ｍＬにて溶出させた。

嬉１表に従来法との比較を示した。

ｌｌ１１表 箇１表に示す様に、本発明の精製方法は、回収率、純度
の両点において、公知のものと比較し、優れた方法であ
ることは明らかである。

実施例４ Ｂで得たインターフェロンａ（ＩＦＮ−α）をａｌＮ　
　ＨＣｌにてｐＨ５，５とし、−ｆ（１）５０ｍ（５Ｘ
１０＠ＩＵ）にポリアクリロニトリルビーズｔ５ｆを加
え、６０分攪拌後、インター７エーンを吸着したビーズ
を回収した。１／１００Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
３０−で洗浄後、ｌｌＬ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＆ｏ　
）／［Ｌ５Ｍ　Ｎａ（４１０ｄでインターフェロンを溶
出した。

実施例５ Ｃで得たＩＦＮ−α　を主成分として含有する溶液２０
００ＴＩＩｔ（２０Ｘ１０・ＩＵ）をα１Ｎ酢酸にてｐ
　Ｈ４，０とし、ｌリアクリ四ニトリル線維５ノを充填
した力ツムを通過させ、１７１００Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４５）４００ｄで洗浄後、（ＬＯ５ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ１ｓ）／ａ５Ｍ　　ＮａＣ１／ｓｏ％ｘ４−レ＞
！９コール液１５０−で溶出した。

第２＃＆に従来の方法との比較を示した。

第１表と同様に、本発明の優位性は明らかである。

以上に示した様に、本発明の精製方法は、簡単な１回の
操作により、高純度のインターフェロンが回収率１００
％にて得られる優れたものである。本発明の精製方法は
、一般的なインターフェロンの精製方法であるから、哺
乳動物の細胞によって生産されるインターフェロンの精
製に限定されるものではなく、その他の手法、例えば遺
伝子組換え法によりて得られるインターフェロン等、い
かなる手法で得られたインターフェロンの精製にも適用
し得ることは言うまでもない。

（ほか１名）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. イン＃−７エロンを含有する溶液を、アクリロエト９＃
   の高重合体を含有する吸着担体に接触させて当該担体に
   イン＃−７エロンを吸着させた後溶出することを特徴と
   するイン＃−７エロンの精製方法。