JPS60243028A - インタ−フエロンの可溶化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロンの可溶化方法および水に易
溶なインターフェロン含有組成物に関する。

インターフェロンは、抗ウィルス、抗ガン等の生物学的
活性のゆえに医薬としての用途が期待されている生理活
性物質であり、生理学的、理化学的性質ならびに起源に
より、α型、β型、Ｔ型などの分類がなされている。従
来、インターフェロンは動物とくに、ヒトの細胞を培養
することによって製造されてきたが、供給量に限りがあ
るため、組換えＤ’ＮＡ技術により、インターフェロン
遺伝子をクローン化し、微生物、たとえば大腸菌に導大
して、その微生物を培養することによりインターフェロ
ンを生産する方法が開発された。

インターフェロンはいずれも、永に難溶性であるため、
培養物中から単離・精製することが困難であり、インタ
ーフェロンを可溶化する手段がめられている。

インターフェロン−βを精製する際、ブルーセファロー
スカラムを用いる方法が知られており、この方法では溶
出液中にはエチレングリコールを用いてインターフェロ
ンの可溶化を行っている［Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ、　Ｗ、
Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５
５１８２（１９７６）、Ｋｎｉｇｈｔ、Ｂ、　Ｊｒ、　
５ｃｉｅｎｃｅ　２０７．５２５（１９８０）　）が、
いまだ充分な成果は得られていない。

本発明者らは、インターフェロンの可溶化について種々
研究を重ねた結果、アルギニン、ヒスチジンなどのアミ
ノ酸類を用いることにより、インターフェロンの溶解性
を著しく増大することができることを見出し、本発明を
完成した。これらのアミノ酸類は、生体に無害な物質で
あり、インターフェロン製剤にもそのまま利用できるの
で、非常に便利である。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、インターフェロンの溶解性を、アミノ酸類を
用いて増大させる方法を提供する。

インターフェロンとしては、天然のインターフェロン、
動物細胞の培養によって製造されるインターフェロン、
組換えＤＮＡ技術によって得られる微生物によって製造
されるインターフェロンなどが含まれる。またα、β、
Ｔのいずれの型のインターフェロンも含まれる。

本発明ではとくに、組換えＤＮＡ技術によって得られる
インターフェロン−Ｔ（以下”　Ｇ　−ｒ　−ＩＦＮ”
と略記する）において優れた効果が得られる。

アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン。

リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、ｒ−アミノブ
チル酸、ε−アミノカプロイン酸またはそれらの塩など
が用いられるが、とくにアルギニン。

ヒスチジン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチンは
可溶化効果が著しい。

インターフェロンの可溶化効果はインターフェロン１０
０万単位当り約５Ｘ１０−６モル−約５×１０−３モル
のアミノ酸を添加することにより現れるが、約２．５Ｘ
１０−５モル−約２Ｘ１０−３モルで効果が著しい。

アミノ酸類は、血清アルブミン、無機塩類、多糖類、界
面活性剤、抗生物質、キレート剤などと併用することに
より著しく効果を増大することができる。

従来の血清アルブミン添加のＧ−ｒ−ＩＦＮ凍結乾燥品
は、水で溶解後、２５℃、゛６時間で溶液中に白色の不
溶性物質を生じる。しかし、３％（Ｉｌｌ／Ｖ）のアミ
ノ酸溶液を用いて溶解するとき、２５℃、６時間後でも
、不溶性物質を生じない。

また、アルブミンとアミノ酸を添加したＧ−ｒ−ＩＦＮ
凍結乾燥品を水に溶解するとき、２５℃、６時間後でも
不溶性物質は生じない。

本発明は、可溶化剤としてアミノ酸類を含む、インター
フェロン含有組成物を提供する。

組成物中のインターフェロンおよびアミノ酸類、ならび
に無機塩類の添加量などについては上記可溶化方法の場
合と同様である。該組成物中には医薬品として許容され
る、一般的保存剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、
湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁
化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張剤、塑性剤、
プラスチック界面活性剤などを含ませることができる。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１．′ 試料の調製 Ｇ−ｒ−ＩＦＮ（下記参考例の方法により製造した。以
下同じ）３Ｘ１０６単位に対し、血清アルブミン５川ｇ
を添加したものを凍結乾燥した。

不溶性物質の測定 Ｇ−ｒ−ＩＦＮ凍結乾燥品の溶解液中の不溶性物質量を
、４００１ｍの吸光度を測定することによりｔた。

溶解は、溶液５ｍｌを用いて行い、溶解後２５℃の恒温
槽に入れ６時間後に溶液をｌ　Ｃｍ石英セルに入れ４０
０１ｍの吸光度を測定した。

結果を表１に示す。

表１ 実施例２゜ Ｃ，−Ｔ−ＩＦＮ３Ｘ１０６単位に血清アルブミン５ｍ
ｇ１アミノ酸類を５０ｍｇ添加し凍結乾燥した３凍結乾
燥品を蒸留水５ｍｌで溶解し２５℃の恒温槽に入れ、６
時間後に４００ｎｍの吸光度を測定した。

結果を表２に示す。

表２ 実施例３゜ 溶解液中のアミノ酸類の濃度を変えて、実施例１と同様
にＧ−γ−ＩＦＮ凍結乾燥品の溶解後、２５℃、６時間
後の４００１ｍの吸光度を測定した。

結果を表３に示す。

表３ 実施例４ Ｇ−７−−ｊＦＮ　３Ｘ１０’単位に血清アルブミン５
ｍｇ添加したものを凍結乾燥した。蒸留水、アルブミン
溶液およびアルブミンとアミノ酸の混合溶液を５ｍｌ用
いて上記凍結乾燥品を溶解し、２５℃恒温槽に入れ６時
間後に４００ｎｍの吸光度を測定した。結果を表４に示
す。

表４ 実施例５ Ｇ−ｒ−ＩＦＮ　３Ｘ１０６単位に血清アルブミン５ｍ
ｇおよびアルギニン３０ｍｇ添加し、溶液の量を２１１
１１になるよう蒸留水で調整し、バイアルに入れ、凍結
乾燥した。

実施例６ Ｇ−ｒ−ＩＦＮ　３Ｘ１０６単位に血清アルブミン５ｍ
ｇおよび塩化ナトリウム５ｍｇおよびアルギニン３０ｍ
ｇ添加し、溶液の量を２ｍｌになるよう蒸留水で調整し
、バイアルに入れ凍結乾燥した。

実施例７゜ Ｇ−ｒ−ＩＦＮ　３Ｘ１０６単位に血清アルブミン５ｍ
ｇおよびリジン塩酸塩３０ｍｇ添加し溶液の量を２ｍｌ
になるよう蒸留水で調整し、バイアルに入れ、凍結乾燥
した。

参考例 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　Ｇ　Ｋ　Ａ　
−２によるインターフェロン−Ｔの生産： 組換え体プラスミドｐＧＫＡ−２をもつＥｓｃｈｅ−ｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ−２（ＦＥＲＭ　ＢＰ　
−４９６）をＬＧ培地〔トリプトファン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣ４２５ｇ、グルコース２ｇを水１１に
とかしＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３７セー
　１　＋１１［１ｍ＋１Ｊ’１ｍ羞ｉ−、−の協ｉ１−
炸Ａｍ１ｆ；−’）　ｎ　ｌ１ｍ１のＭＣＧ培地ＣＮａ
２１１Ｐ０．０．６％、ＫＩＩ２Ｐ０．０．３％１Ｎａ
ＣＩ　０．５％、Ｎ）１４ｃＩ　０．１％、グルｖ−ｙ
、０．５％。

カザミノ酸　０．５％、Ｍｇ、ＳＯｓ　１　ｍＭ、ビタ
ミンＢ　＋４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７，２）に接種し、３０
℃で４〜８時間培養後、トリプトファン遺伝子のインデ
ューサーであるインドールアクリル酸を１０μｇ／ｍ１
加え、さらに２〜１２時間培養を続ける。培養液を８，
０００ｒｐｍ、　１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭＮ
ａ（１’ｌ、３　ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ
７，５＞緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩衝液２０
ｍ１に懸濁し、４ｍｇのリゾチーム、０．２５Ｍ　ＥＤ
ＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）を０．１…１加
えて３０分間０℃に放置した後、凍結・融解を３回くり
返して菌体をこわす。これを１５．ＤＯＯｒｐｍ　、３
９分間遠心して上清を得、上清を硫安沈殿、セファデッ
クスＧ−７５によるゲル濾過およびイオン交換クロマト
クラフィーなどの処理をして、インターフェロン−Ｔ約
２Ｘ１０’単位を得る。

特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社手続ネ山正
四 １　事イ′ｒの表示 昭和５９年特許願第８６９７２号 ２　発明の名称 インターフェロンの可溶化方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区人手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（’Ｔ　Ｅ　Ｌ　：　
０３−２０４−７２１１内線２７５１＞）゛ 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５　補正の内容 １）明細書第４頁１４行、第６頁〜８頁の表１〜４甲、
第９＠３行および８〜９行［−アルギニンｊを「アルギ
ニン２）同古第４貞１５（Ｊ、第６頁衣ＩＬｉ］ｊ、ｊ
よび第８貝表３甲「リジン」を１リジンｍＭｊＭＪに訂
正する。

３）同書第４白１５・〜・′１６イゴ心よび第６・〜・
８與の表１〜３中］オルニチン」を１オルニチンアｔ？
−ｙ−ト」に８’Ｊ正Ｊる。

４）同書第６白表１甲のノロピレノグリ−１−ルのＯ，
Ｄ４００ｎｍの値１６．２３１Ｊを１０．２３１Ｊに訂
正づる。

５）同吉第７頁表２中１リジン・ｌ−ＩＣＭを１リジン
ｊ傷酸塩」に訂正する。

手続補正書（自発） 昭和６０年６月２１日 １事件の表示 昭和５９年特許順第８６９７２号 ２、発明の名称 インターフェロンの可溶化方法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（ＴＢＬ　：　０３−
２０１−７２１１　内線３３９１）５、補正の内容 明細書第９頁１５行と１６行の間に次の文章を加入する
。

ギニン塩酸塩Ｑｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ添
加したものを凍結乾燥した。

Ｇ−γ−■ＦＮ凍結乾燥品を６０℃恒温槽中、１力月お
よび６力月し、その保存安定性試験を行った。

インターフェロン活性の測定は、ＦＬ細胞を用いた５ｉ
ｎｄｂｉｓウイルスによる細駒変性阻止、色素取り込み
法〔別冊、蛋白質・核酸・酵素Ｎｏ、２５インターフエ
ロン研究の進歩、３３５−３６３　（１９８１））を用
い、標準Ｇ−γ−ＩＦＮを同時に測定して相対力価をめ
た。

結果を表５に示す。

表　５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）可溶化剤としてアミノ酸を用いるインターフェロ
   ンの可溶化方法 （２）アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、
   ヒドロキシリジン、オルニチン、グルタミン、Ｔ−アミ
   ノブチル酸、ε−アミノカプロイン酸、およびそれらの
   塩から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 （３）　インターフェロンカ、インターフェロン−α。 インターフェロン−βおよびインターフェロン−ｒから
   選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 （４）インターフェロン１００万単位に対し、アミノ酸
   を約５　Ｘ　１０−’モル−約５×１０〜３モル用いる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）可溶化剤としてアミノ酸を含む、インターフェロ
   ン含有組成物。 （６）アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、
   ヒドロキシリジン、オルニチン、グルタミン、Ｔ−アミ
   ノブチル酸、ε−アミノカプロイン酸、およびそれらの
   塩から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第５項
   記載の組成物。 〔７〕インターフエロンがインターフェロン−α。 インターフェロン−β、イインーフェロンーＴから選ば
   れることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の組成
   物。 （８）インターフェロン１００万単位に対し、アミノ酸
   を１＋ｎｇ−５００ｍｇ　（約５Ｘ１０−６モル−約５
   Ｘ１０−３モル）含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第５項記載の組成物。