KR890001128B1 - 조 임파구 인터페론의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 본 발명에 따르는 조 임파구 인터페론의 정제 공정도이다.
제2도는, 제3도 및 제4도는 Nu-Gel AC 컬럼, Nu-Gel P-DE 컬럼 및 세파댁스 G-75 컬럼으로부터의 인터페론의 용리 그래프이다.
본 발명은 항 바이러스 성 생리 물질인 사람의 임파구 인터페론(Human Lymph -oblastoid Inteferon)을 Nu-Gel AC와 Nu-Gel P-DE 및 세파덱스 G-75를 사용하여 정제하는 방법에 관한 것이다. 나말바(Namalva) 세포로부터 공지의 방법(A. Mizra -hi ; Meth. Enzymol. 78, 54(1981))으로 수득한 사람의 임파구 인터페론을 정제하는 방법으로는 여러가지가 알려져 있다.
즉, C.P.G.와 포타슘 티오시아나이드로 침전시킨 다음 울트로 겔 ACA 54 및 페닐 세파로오즈를 사용하여 정제하는 휘트먼등의 방법(J.Interferon, Res. 1, 305 ; 1981)은 비활성도가 2×107I.U/mg·P, 수율이 63%로 수율과 순도는 높으나, C.P.G .와 페닐 세파로오즈의 사용으로 인하여 정제 비용이 많이드는 단점이 있고, 초산 아연염을 사용하여 침전시켜 SP-세파덱스 컬럼크로마토그라피를 통과시킨 다음 포타슘티오시아나이드로 침전시키고 세파덱스 G-100을 통과시켜 정제하는 보도의 방법( Metho. Enzymol. 78, 69 ; 1981)은 수율이 28%, 비활성도가 0.4×107I.U/mg·P로 수율과 순도가 낮은 단점이 있었다. 또한, 세파덱스 G-25 컬럼, 다클론 항체컬럼, 세파덱스 G-150 컬럼, SP-세파덱스 컬럼 및 트립토필-트립토판 Affi 겔 10을 사용하여 정제하는 준의 방법(Meth. Enzymol. 78, 457 ; 1981)은 비활성도는 1.1×107I.U/ mg· P이나 수율이 10%로 수율면에서 극히 낮은 단점이 있었다. 따라서, 본 발명은 종래의 방법보다 간단하면서도 고순도의 인터페론을 고수율로 정제할 수 있는 경제적인 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서는 조 임파구 인터페론을 Nu-Gel AC 컬럼과 Nu-Gel P-DE컬럼 및 세파덱스 G-75 컬럼을 사용하여 정제함으로써(제1도 참조), 비활성도가 7.4×107I.U/mg·P인 고순도의 인터페론을 공정수율 45%의 높은 수율로 얻을 수 있었으며( 표1참조), 또한 100ml당 10
수준의 Nu-Gel AC수지 및 Nu-Gel P-DE수지를 사용함으로써 100ml당 132
수준의 C.P.G.와 100ml당 120
수준의 페닐 세파로 오즈를 사용하는 방법에 비하여 훨씬 경제적으로 인터페론을 정제할 수 있었던 것이다.
+항 바이러스 활성은 WISH-V.S.V. 시스템을 사용하여 측정하였다.
출발물질로 사용한 임파구 인터페론은 A. 마즈라히등의 방법(Meth. Enzymol. 78, 54 ; 1981)에 따라서, 나말바 세포를 소혈청이 포함된 RPM1 1640 배지에서 배양한후, 센다이(Sendai)바이러스로 유발시켜 수득하였다. 단백질 함량은 소혈청 알부민을 표준 물질로 하여 로우리 등의 방법(J. Bio1. Chem. 198, 265 ; 1951)에 따라서 측정하였으며, 정제도는 라에믈리 등의 방법(Nature, 227, 680 : 1970)에 따라서 SDS -폴리 아크릴 아마이드 전기영동 하여 측정하였다.
본 발명의 공정은 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명하였다.
[실시예 1]
7% 소혈청 배지에서 배양한 나말바 세포를 원심분리하여 무혈청 배지에서 조 인터페론을 유발시켰다. 유발된 조 인터페론(1-4×104I.U/ml)을 20mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.15M NaCl 포함)300ml를 사용하여 평형화 시킨 Nu-Gel AC 컬럼 (30 ml, 1.5×17cm)에 부하시켰다. 그런다음, 20mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.15M NaCl포함)300ml와 0.1M 트리스 완충액(pH 8.0, 0.25M M NH4C1포함)300ml를 각각 사용하여 컬럼을 세척한 후, 0.1M 트리스 완충액(pH 8.0 0.5M(CH3)4NC1 포함)을 사용하여 인터페론을 용리시켰다(제2도 참조). 용리된 인터페론 분획(34.6mg)을 반투과성 투석막(2.5×10cm)에 넣고, 1l의 인산염 완충액(20mM, pH 6.0)용액내에서 48시간동안 인산염 완충액을 1l씩 4회에 걸쳐 교환해 주면서 투석시킨후(4℃), 투석이 완료된 인터페론 분획을 150ml의 인산염 완충액(20mM, pH 6.0)을 사용하여 평형화 시킨 Nu-Gel P-DE컬럼(15ml, 1.0×19cm)에 부하시켰다. 그런다음, 20mM 인산염 완충액(pH 6.0)150ml와 0.15M NaCl을 포함하는 20mM인산염 완충액(pH 6.0)150ml를 차례로 사용하여 컬럼을 세척한 후, 1M NaC1을 포함하는 인산염 완충액(20mM, pH 6.0)을 사용하여 인터페론을 용리시켰다(제3도 참조). 용리된 인터페론 분획(4.7 mg)을 한외 여과장치를 통과시켜 농축시킨 후, 농축된 인터페론 분획을 3l의 인산염 완충액(20mM, pH 7.4,0.15M NaC1포함)을 사용하여 평형화시킨 세파덱스 G-75 컬럼(900ml, 2.6×180cm)에 부하시키고, 동일한 완충액을 사용하여 인터페론을 용리시켰다(제4도 참조). 용리된 인터페론 분획의 비활성도는 7.4×107I.U/ml·P였으며, 공정의 최종 수율은 47%였다(표1참조).
[실시예 2]
7% 소혈청 배지에서 배양한 나말바 세포를 무혈청 배지로 1:1희석(혈청농도 3. 5%)하여 인터페론을 유발시킨 후, 유발된 조 임파구 인터페론 용액(0.5-3×104I.U /ml)을 실시예1에서와 같은 방법으로 정제하였다. 정제결과 비활성도 5.0×107I.U/ mg·P의 인터페론을 40%의 수율로 얻었다.
[실시예 3]
1% 소혈청과 2-4%락토 알부민 가수 분해물을 포함하는 배지에서 배양한 나말바 세포를 원심분리하여 무혈청 배지에서 인터페론을 유발시킨후, 유발된 조 임파구 인터페론 용액(0.5~3×105I.U/ml)을 실시예1과 같은 방법으로 정제하였다. 정제결과, 비활성도 5.2×107I.U/mg·P의 인터페론을 42%의 수율로 얻었다.
Claims (8)
- 인산염 완충액을 사용하여 평형화 시킨 Nu-Gel AC 컬럼에 조 임파구 인터페론 용액을 부하시켜 수지와 접촉시킨후, 트리스 완충액으로 세척, 용리시키고, 용리된 인터페론 분획을 인산염 완충액으로 평형화시킨 Nu-Gel P-DE 컬럼에 부하시켜 수지와 접촉시킨 다음, 인산염 완충액으로 세척, 용리시켜 용리된 인터페론 분획을 인산염 완충액으로 평형화 시킨 세파덱스 G-75 컬럼에 부하시키고 동일한 완충액으로 용리시킴을 특징으로 하는 조 임파구 인터페론의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 인터페론이 부하된 Nu-Gel AC 컬럼을 0.1M 트리스 완충액 (pH 8.0, 0.25M NH4C1 포함)으로 세척함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 인터페론이 부하된 Nu-Gel AC 컬럼으로부터 0.1M 트리스 완충액(pH 8.0, 0.5M(CH3)4NC1 포함)을 사용하여 인터페론을 용리시킴을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 인터페론이 부하된 Nu-Gel P-DE컬럼을 20mM 인산염 완충액(pH 6.0, 0.15M NaC1포함으로 세척함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 인터페론이 부하된 Nu-Gel P-DE 컬럼으로 부터 20mM 인산염 완충액(pH 6.0, 1M NaC1포함)을 사용하여 인터페론을 용리시킴을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조 임파구 인터페론 용액은 7% 소혈청 배지에서 배양한 나말바 세포를 원심분리하여 무혈청 배지에서 유발시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조 임파구 인터페론 용액은 7% 소혈청 배지에서 배양한 나말바 세포를 무혈청 배지로 1:1 희석(혈청농도 3.5%)한 상태에서 유발시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조 임파구 인터페론 용액은 1% 소혈청과 2-4% 락토 알부민 가수분해물을 포함하는 배지에서 배양한 나말바 세포를 원심분리하여 무혈청 배지에서 유발시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 방법.
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