JPS58502032A - ヒトｒ−インタ−フェロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、ヒトγ−，インターフェロンの製造のだめの新規な、そして改良さ れた方法に関する。

背景技術 ヒト白血球が有糸分裂誘導剤（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）の影響の下に γ−インターフェロン（免疫インターフェロン）を生産することは良く知られて いる。しかしながら、γ−インターフェロンは、その生物学的性質において、ウ ィルス感染の結果白血球から生産される白血球（ロ））−インターフェロン、及 び繊維芽細胞由来の細胞中で合成ポリヌクレオチドの影響下で生成する繊維芽細 胞（ロ）−インターフェロンと異る。

細胞分裂阻害効果及び免疫系の細、抱の機能に影響を与える効果のために、γ− インターフェロンは、α−イアター７エロン及ヒβ−インターフェロンに比べて 有意に好ましい効果を有し、そして腫瘍性疾患の治療のためにますます広く使用 されるようになるであろう（Ｎａｔｕｒｅ　２９４，６（ｌ、９’、’８１年） 　、ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４９　＋　３９０　、（１９８， ０年）〕。

〕γ−インターフェロは、血液の白血球区分（軟層）を分離し、勾配遠心分離又 は好ましくは塩化アンモニウム処理による溶血によシ赤血球を除去し、純化され た白血球をイノキーベートし、これを適当な特異的な有糸分裂誘導剤によシ処理 し、そして最後にこうして生成せしめたγ−インターフェロンを上澄液から分離 することによシ製造することができる。従来技術によれば、コンカナバリン（Ｃ ｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　）Ａ　［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２６　ｔ　 ３６　（１９７’９年）〕９、フィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇ ｇｌｕｔｉｎｉｎ）　［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８　、１６０１　（１９８１年 ）〕又はエンテロトキシン（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）　［Ｉｎｔ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　Ｓｙｎ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、　７　、５９５　（１９７９年 ）〕を有糸分裂誘導剤として使用することができる。

従来技術によれば、有糸分裂誘導剤によシ誘導されるγ−インターフェロン生産 を増加するだめの幾つかの試みが行われている。ある方法によれば、白血球を１ ２−Ｏ−テトラデカノイルーホルボル−１３−アセテートによシ前処理すること によシγ−インターフェロンの生産が増加する〔ビルセフ（Ｖｉｌｃｅｋ）等、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙｍ ｐｈｏｋｉｎａｓ−Ａｃａｄｅｍｉ　ａ　、　＝　ｘ　−３−り、３２３頁、’ （１９８０年〕〕。

この方法の欠点は、１２−Ｏ−テトラデカノイルーホルボル−１３−アセテート は発癌性物質であシ、そし。

てこのためにこの方法によシ製造されたγ−インターフェロンは明らかにヒトの 治療に使用するのには−適当でないことである。他の文献［Ｎａｔｕｒｅ　２９ ２　＃８４２’（１９８１年）〕によれば、著者は、白血球を酪酸ナトリウム又 はデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）によシ処理することにょシγ− インターフェロンの生産を増加することを試みだが、この試みは不成功でこの発 明は、有糸分裂誘導剤により誘導される白血球のγ−インターフェロン生産を増 加し、そしてｍｌ当りのユニット数を上昇せしめることを目的とする。

この発明に従えば、血液の白血球区分（軟層）を分離し、赤血球を除去し、白血 球を適当な栄養培地に懸濁し、これを有糸分裂誘導剤により処理し、そしてイン ターフェロンを含有する液を細胞から分離することによりヒトγ−インターフェ ロンを製造する方法において、有糸分裂誘導剤による処理に先立ち、白血球を好 ましくは２００〜２００００■Ｕ／ｍｌの一α−インターフェロン又ハβ−イン ターフェロンで処理することを特徴とする方法が提供される。

この発明は、白血球を、有糸分裂誘導剤で処理するのに先立ち、α−インターフ ェロン又はβ−インターフェロンで前処理することによシ、γ−インターフェロ ンの生産が有意に一約５００〜１０００％−増加するという認識に基礎を置いて いる。

α−インターフェロン又はβ−インターフェロンましズは５００〜５　Ｑ　ＯＯ １，Ｕμ（ここでＩＵは国際単位）の量において使用する。

この発明の好ましい態様に従えば、前記の処理は、１０００〜２０００’ＩＵ／ ｄ、、特に１５００１Ｕ／ｍｅ　ノα−インターフェロンを用いて行う。

この発明の他の態様に従えば、前記の処理は２０００〜３０００ＩＵ／ｍＩ！、 特に２５００１Ｕ／ｍｌのβ−インターフェロンを用いて行う。

前処理は、有糸分裂誘導−割による処理に先立って、好ましくは１〜１２時間、 特に２〜８時間、特に好ましくは４時間行う。

α−インターフェロン又はβ−インターフェロンによる前処理は好ましくは約１ −１２時間、特に約４時間行う。この前処理の温度は好ましくは３５〜３９℃、 特に３７℃である。

α−インターフェロン又ハβ−インターフェロンによシ前処理した後有糸分裂誘 導剤を添加する前友インターフェロンを除去するのが好ましい。この段階は、好 ましくは細胞を洗浄することにより、特にハンクス（Ｈａｎｋｓ）溶液によシ洗 浄することにょシ行うことができる。前処理に使用したインターフェロンを細胞 培養培地中に残留せしめたままで実施することもできる。この場合には、γ−イ ンターフェロンを、前処理の段階で使用しだα−インターフェロン又はβ−イン ターフ−ロンから分離しなければならない。

分離は、ガラスクロマトグラフィーを用いてそれ自体公知の方法によシ行うこと ができる。

この発明の方法において使用する培養培地として、種々のアミノ酸及びビタミン を含有する組織培養栄養培地を使用することができる〔例えば、イーグル（Ｅａ ｇｌｅ）型ＭＥＭ　、　ＲＰＭＩ　１６４０　、ドゥルベコ（Ｄｕｌ−ｂｅｃｃ ｏ）型ＭＥＭ　、グラスゴー（Ｇｔａｓｇｏｗ）変形ＭＥＭ等）。

次の組成を有する栄養培地を使用するのが好ましい。

この栄養培地の利点は、これが高価で々く、簡単であり、そしてオートクレーブ に適用するのが容易な塩化カルシウム　１７５〜３５０　ｍｔ）７１塩化カリウ ム　３００〜５００　ｍり／１塩化ナトナトリウム　５０００〜７０００ｍ９／ １炭酸水素ナトリウム　２００〜３５００　ｍ９／　１燐酸二水素ナトリウム　 ３０〜１５０　ｍ＆／１グルコース　５００〜５５００　ｍ９／　１硝酸第二鉄 　Ｏ〜０．２　ｍり／１ 血　清　０５〜ｊＯｍり／１ γ−インターフェロンの生産は、種々の動物又はヒトの血清又はγ−グロブリン を含有しない血漿（０，５〜１０チ）の存在下で行う。

この発明の方法に従えば、０〜８℃において７２時間以内貯蔵された凝固防止処 理されたヒトの血液から得られた白血球（軟層）を出発材料として使用する。

ＡＣＤ溶液（クエン酸及びグルコースを含有する溶液）又は種々の塩基（例えば アデニン又はグアニン）を補給したＡＣＤ溶液を凝固防止剤として使用すること ができる。集められた白血球は勾配遠心分離〔例えば、フィコール（Ｆｉｃｏｌ ｌ）又はノＥ−コール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）−製造：ファルマシア・スウェｒデン 〕によシ、又は好ましくは塩化アンモニウムを用いる溶血により除去される。こ の方法は、濃縮された白血球懸濁液を、攪拌しながら、又は攪拌しないで０．５ 〜１％−好捷しくは０８３チーの塩化アンモニウム溶液と、０〜１０℃にてｌ： ３〜２０、好ましくはｌ：５の容量／容量比で混合することにより行うことがで きる。白血球を、破壊された赤血球から、例えば遠心分離によシ分離する。１重 量部の細胞懸濁液に対して１０容量部の塩化アンモニウム溶液を用いて塩化アン モニウム処理を反復するのが好ましい。

純化された白血球を、適当な組織培養栄養培地（例えば、イーグル型ＭＥＭ、　 ＲＰＭＩ　１６４０　、ドゥルベコ型ＭＥＭ　、グラスゴー変形ＭＥＭ等）又は 上記の安価な栄養培地（アミノ酸及びビタミンを含まない）に懸濁し、そして細 胞数を】０６〜１０８細胞／ａに調整する。この方法の有利な方式に従えば、細 胞の予備懸濁及び細胞数の調整のいずれにもアミノ酸及びビタミンを含有しない 前記の安価々栄養培地を使用する。使用する栄養培地又は栄養溶液には動物又は ヒトの血清又は好ましくはγ−グロブリンを含有しないヒトの血漿（０，５〜１ ０％）を補充する。栄養培地又は栄養溶液には抗生物質を加えるのが好１しく、 このためには約１０−５０　μｇ／ｍｌ、特に２５１４７ｍ１の濃度でネオマイ シンを用いるのが好ましい。

次に、細胞をα−インターフェロン又はβ−インターフェロンにより処理する。

このために誘導物を含有しない（ウィルス又は合成ポリヌクレオチドを含有しな い）組成の又は精製されたα−インターフェロン又ハβ−インターフェロンを、 ２００〜２００００１　Ｕ／ｍｌの量で用いることができる。この前処理は約３ ５〜３９℃、好１しくは３７℃の温度において、約１〜１２時間、特に４時間に わたって行う。

この前処理段階に用いるインターフェロンは、細胞から、好ましくは洗浄によシ 除去することができる。この段階は、・・ンクス溶液を用いて実施するのが好ま しい。インターフェロンを洗浄除去した後、細胞の濃度を、ヒト又は動物の血清 又はγ−グロブリンネ含血漿、好ましくはγ−グロブリンネ含ヒト血漿中元の値 に調整する。

α−インターフェロン又ハβ−インターフェロンの存在によシγ−インターフェ ロンの生産が不都合々影響を受けることはないから、インターフェロンを洗浄除 去することは必須では々い。この場合には、γ−インターフェロンヲ、α−イン ターフェロン又はβ−インターフェロンから公知の方法により除去する。

次に、細胞を適当々インターフェロン誘導物質と接触せしめる。このために、前 記のコンカナバリンＡ１フイトヘマグルチニン、スタイロコソカスのエンテロト キシン等を使用することができる。この発明の方法の好ましい態様に従えば、誘 導物質としてコンカナバリンＡを２５〜３０μｊｉ／ｍｌ　、特に１５μｇ／ｒ ａｌの濃度で用いるのが好ましい。

誘導は、約３５〜３９℃、好ましくは３７℃において、約５〜４８時間、好まし くは１０〜１２時間行う。一定の時間（約１時間）後、誘導物質を洗浄除去する ことができる。しかしながら、誘導物質の存在によってγ−インターフェロンの 生産が害されることはないから、この段階は省略することができる。従って、一 般には誘導物質の除去は行わない。

この後、遠心分離によシ上澄液から細胞を除去する０上澄層は粗γ−インターフ ェロンを含有しておシ、このものは但温（約−２０℃）において貯蔵することが でき、又は公知の方法で純化することもでこの発明の方法の利点は、α−インタ ー゛フェロン又はβ−インターフェロンによる前処理の結果としてγ−インター フェロンの生産が５〜１０倍増加することである。この発明の方法によシ製造さ れだγ−インターフェロンの物理化学的性質（ｐＨ２感受性、５６℃及び３７℃ において測定した安定性）及び生物学的活性（抗ウィルス作用及び抗細、抱作用 ）は、常法に従って製造されたγ−インターフェロンのそれと完全に同等であシ 、そして同じである。

次の例により、この発明をさらに詳細に説明する。

但しこの発明の範囲をこの例に限定するものではない。

例　Ｉ ＡＣＤ溶液（クエン酸及びグルコースを含有する水溶液）中に得られた血液を＋ ４℃にて３時間貯蔵する。「軟層」区分を遠心分離によシ集め、そして＋４℃に て一夜放置する。こうして得た白血球濃縮物ｌ容量部に５重量部の０８３係塩化 アンモニウム水溶液（温度＋４℃）を混合する。赤血球が溶解するまで（５〜１ ０分間）懸濁液を＋４℃に置き、そして遠心分離により白血球を分離する。白血 球を次の組成を有する栄養培地に懸濁する。

塩化カルシウム　２６５ 硝酸第二鉄　０１ 塩化カリウム　４００ 硫酸マグネシウム七水和物　２００ 塩化ナトリウム　６４００ 炭酸水素ナトリウム　２７５０ 燐酸二水素ナトリウムニ水和物　１４０グルコース　４５００ 上記の方法により赤血球の溶解を反復する。但し、ｌＯ容量部の０．８３％塩化 アンモニウム水溶液を使用する。白血球を上記の組成を有する栄養培地に懸濁し 、そして細、泡散を１０７／ｍ／！に調整する。栄養溶液には２　ｍ９７ｍ１の ヒトγ不含血清及び２５μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有せしめる。細胞を、３ ７℃にて一定の攪拌を行いながら４時間、１５００ＩＵ／ｍｌの量のＰＨ２処理 （センダイウィルスを除去する）した濃縮されたα−インターフェロンで処理す る。この後、前処理に使用したα−インターフェロンを、ハンクス溶液を用いる ２回の洗浄により除去する。細胞を１５μｆｉ／＋Ｉｌの量のコンカナバリンＡ で処理し、そして一定の攪拌を行いながら３７℃にて１２時間インキュベートス る。上澄液のγ−インターフェロン含量は５００００ＩＵ／Ｍとなる。

比較のため、誘導物質を添加する前にα−インターフェロンによシ白血球を処理 することなく、上記の例を実施する。こうして得られたγ−インターフェロン力 価は６５００　ＩＵ／ｍｌにすぎない。

例　２゜ 例１と同様に実施する。但し、栄養溶液としてグラスコ゛−型ＭＥＭ栄養培地を 使用する［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４　ｒ３５９　（１９６１年）〕。こうして得 られた粗γ−インターフェロンの活性成分含量は４８０００　ＩＵ／ｍｌとなる 。

α−インターフェロンによる処理を省略して上記の方法を実施する。こうして得 られた粗γ−インターフェロンの活性成分含量は６２００１Ｕ／ｍｌにすぎ例１ と同様に実施する。但し、前処理に使用したα−インターフェロンを除去しない 。α−インターフェロンによる処理が終了した後、３７℃にて１２時間一定の攪 拌を行いながら細胞をインキ−ベートする。上澄液のインターフェロン含ｉは５ ２０００Ｉ［Ｊ／ｍｌとなる。

こうして得られた、α−インターフェロン及びγ−インターフェロンを含有する 生成物を、ＧＰＧガラスクロマトグラフィーによりその成分に分離する。

粗生成物を、ＣＰＧガラスを充填したカラムに適用し、α−インターフェロン及 び汚染物質はカラムを通過せしめ、γ−インターフェロンは結合せしめる。γ− インターフェロンを、２０容量部のエチレングリコール、１５０ミリモルの塩化 ナトリウム及び２０ミリモルの燐酸緩衝液を含有する水溶液で溶出する。

例　４゜ 例１と同様に実施する。但し、前処理においてα−インターフェロンの代シに２ ５００ＩＵ／ｍｌのβ−インターフェロンを使用する。こうして得られた粗ケ成 物のγ−インターフェロン含量は５６０００ＩＵ／ｌｌｌ１となる。

β−インターフェロンによる処理を省略して上記の方法を反復する。こうして、 ６８００ＩＵ／１ｎｌの活性成分含量を有する粗γ−インターフェロンが得られ る。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　血液の白血球区分（軟層）を分離し、赤血球を除去し、白血球を適当な栄養 培地に懸濁し、これを有糸分裂誘導剤にょシ処理し、そしてインターフェロンを 含有する液を細胞から分離することにょシヒトγ−インターフェロンを製造する 方法において、有糸分裂誘導剤による処理に先立って白血球をα−インターフェ ロン又ハβ−インターフェロンによシ前処理することを特徴とする方法。 ２、　２００〜２００００ＩＵ／ｄ好ましくは５００〜５０００１Ｕ／ｍｌの量 のα−インターフェロン又はβ−インターフェロンにより前処理を行う請求の範 囲第１項記載の方法。 ３、　１０００〜２０００　工ＴＪ／ｍ／！、好ましくは１５００工Ｕ／ｍｌの 量のα−インターフェロンによシ前処理を行う請求の範囲第１項又は第２項記載 の方法。 ４、　２０００〜３０００１Ｕ／Ｔｌｌ、好ましくは２５００ＩＵ／ｄの量のβ −インターフェロンによシ前処理を行う請求の範囲第１項又は第２項記載の方法 。 ５　前処理を、有糸分裂誘導剤による処理に先立って、１〜１２時間、好ましく は２〜８時間、特に好ましくは４時間行う請求の範囲第１項〜第４項のいす和か １項に記載の方法。 ６、前処理を、α−インターフェロン又はβ−インターフェロンを用いて１〜１ ２時間、好ましくは４時間行う請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載 の方法。 ７、　前処理段階において使用しだα−インターフェロン又はβ−インターフェ ロンを有糸分裂誘導剤による処理に先立って洗浄除去する請求の範囲第１項〜第 ６項のいずれか１項に記載の方法。 ８、有糸分裂誘導剤としてコンカナバリンＡ１フイトヘマグルチニン又はエンテ ロトキシンを使用する請求の範囲第１項〜第７項のいずれが１項て記載の方法。 ９、赤血球を、塩化アンモニウムを用いる溶血によって軟層区分から除去する請 求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の方法。 １０、栄養培地として、１７５〜３５０ｍ９／ｌｋ　の塩化カルシウム、３００ 〜５００■／！の塩化カリウム、１７５〜５００　ｍ９７Ａの硫酸マグネシウム 又は等量の塩化マグネシウム、５０００〜７０００ｍ９／Ｉ、の塩化ナトリウム 、２００〜３５００　Ｔｎｌ／１３の炭酸水素ナトリウム、３０〜１５０ｍ９／ Ａの燐酸二水素ナトリウム、５００〜５５００７ｎ９７Ｊのグルコース及び場合 によっては０．０５〜０．２　ｍ９／Ａの硝駿第二鉄、並びに０５〜１０％の血 清を含有する水溶液を使用する請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載 の方法。