HU184972B

HU184972B - Process for preparing human gamma interferone

Info

Publication number: HU184972B
Application number: HU813594A
Authority: HU
Inventors: Ilona Beladi; Miklos Toth; Istvan Rosztoczy; Sandor Toth; Valeria Endresz
Original assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Priority date: 1981-12-01
Filing date: 1981-12-01
Publication date: 1984-11-28
Also published as: GB8320371D0; GB2123007A; FI74978C; FI832508L; JPS58502032A; FI74978B; DE3249215T1; AU1017483A; GB2123007B; CH658391A5; AU551964B2; SU1405691A3; FI832508A0; WO1983001899A1; DE3249215C2

Description

Találmányunk humán gamma-interferon új és javított előállítására vonatkozik.

Ismeretes, hogy a humán fehérvérsejtek mitogén ágensek hatására gamma-interferont (immun-interferon) termelnek. A gamma-interferon mind fizikokémiai, mind biológiai tulajdonságait tekintve különbözik a vírus hatására leukocitákban képezett, illetve vírus- vagy szintetikus polinukleotidok hatására fibroblast eredetű sejtekben termelt leukocita (alfa) vagy fibroblast (béta) interferontól. A gamma-interferon sejtosztódás gátló, továbbá az immún-rendszer sejtjeinek működését befolyásoló hatása kifejezetten kedvezőbb az alfa- és beta-interferonok aktivitásánál, ezért egyre elterjedtebb felhasználása várható a daganatos betegségek terápiájában [Natúré 294, 7, 1981 Cellular Immunology 49, 390, 1980].

A gamma-interferon előállítása oly módon történik, hogy a vér leukocita frakcióját (buffy coat) elválasztják, a vörösvérsejteket gradiens centrifuálással vagy előnyösen ammónium-kloridos hemolízissel eltávolítják, a tisztított leukocitákat inkubálják, majd megfelelő aspecifikus mitogénekkel kezelik, végül a termelt gamma-interferont a felülúszó (szupernatant) folyadékból elkülönítik. Az irodalom szerint mitogén ágensként Concanavalin A [Infect. Immun. 26, 36, 1979], Phytohaemagglutinin [Proc. Natl. Acad, Sci. USA 78, 1601, 1981], vagy Enterotoxin [Int. Rés. Commun. Sys. Med. Sci., 7, 595, 1979] alkalmazható.

Az irodalom szerint több próbálkozás történt a mitogének által stimulált gamma-interferon termelés fokozására. Az egyik módszer alapján a gamma-interferon termelést a fehérvérsejtek 12—0-tetradekanoil-phorbol-13-acetáttal történő előkezelésével fokozzák [Vilcek és tsai: Biochemical Characterization of Lymphokines (Academia, New York) 323. oldal, 1980]. A módszer hátránya, hogy a 12—0-tetradekanoil-phorbol-13-acetát kancerogén anyag, ezért a felhasználásával készített gamma-interferon a humán gyógyászatban aligha alkalmazható. Megkísérelték a gamma-interferon termelésnek a fehérvérsejtek nátrium-butiláttal vagy dexamethasonnal történő fokozását, e próbálkozások azonban nem jártak eredménnyel [Natúré, 292, 842. 1981],

Ismeretes, hogy az alfa-interferon termelése kb.

100 NE/ml alfa-interferonnal történő előkezeléssel fokozható. (ADVEXP MED Bioi. 110: Humán Interferon Production and Clinical Use (W. R. Stinebring és P. J. Chapple kiadók) Plenum, New York (1978) (C. A. 90

101 861); SYMP SER IMMUNBIQL STAND 1970, 14, 6-8 (C. A. 74 62 757); VOP VIRUSOL, 1970, 15 (4) 432—5 (C. A. 73 118 257); J. VIROL. 1971 7 (6), 792—801 (C. A. 75 6130), IGAKU NO AYUMI 1980, 113 (5), 303.5 (C. A. 93 65 374). Az alfa-és gamma-interferon azonban egymástól mind a fehérje-szerkezetben, mind a biológiai hatásban jelentős mértékben eltér, ezért a fenti irodalmi helyeken ismertetett eljárások gamma-interferon előállítására nem alkalmazhatók.

A 80—154 919 sz. közrebocsátott japán szabadalmi bejelentés (KOKAI) szerinti eljárásnál az interferon termelés fokozására gamma-interferont alkalmaznak 100 NE/ml mennyiségben. A sejteket a gamma-interferon termelés második napján Sendai-vírussal megfertőzik, és ily módon a gamma- és alfa-interferon együtt termelődik, amelyek egyedi titerét az interferonok egymás antivirális hatását erősen potencírozó aktivitása miatt nehéz pontosan meghatározni. A gamma-interferon termelése a fenti módszerrel számottevő mértékben nem fokozható.

Találmányunk célkitűzése a fehérvérsejtekből mitogén ágensek hatására történő gamma-interferon termelés fokozása, az egységszám növelése.

Találmányunk tárgya eljárás humán gamma-interferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukocyták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, valamely mitogén ágenssel történő kezelése, majd az interferon-tartalmú folyadéknak a sejtektől történő elválasztása útján, oly módon, hogy a fehérvértesteket a mitogén ágenssel történő kezelés előtt 200—20 000 NE/ml mennyiségű alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük.

Találmányunk alapja az a felismerés, hogy amennyiben a fehérvérsejteket a mitogén ágenssel való kezelés előtt alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelésnek vetjük alá, a gamma-interferon termelés lényegesen — kb. 500—1000%-kal — fokozódik.

Az alfa- vagy beta-interferont 200—20 000, előnyösen 500—5000 NE/ml mennyiségben alkalmazhatjuk.

Eljárásunk egyik előnyös foganatosítási módja szerint a kezelést 1000—2000, különösen előnyösen 1500 NE/ml mennyiségű alfa-interferonnal végezzük el.

Eljárásunk másik előnyös foganatosítási módja szerint az előkezeléshez 2000—3000, különösen előnyösen 2500 NE/ml mennyiségű beta-interferont alkalmazunk.

Az előkezelést előnyösen a mitogénnel történő kezelést megelőzően 1—12, célszerűen 2—8, különösen előnyösen 4 órával hajtjuk végre.

Az alfa- vagy beta-interferonnal történő kezelés időtartama 1—12, előnyösen kb. 4 óra. Az előkezelést 35—39 °C, előnyösen 37 °C-os hőmérsékleten végezzük el.

Az alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelés után, a mitogén ágens hozzáadása előtt, az interferont előnyösen eltávolítjuk, éspedig a sejtek kimosása útján. A mosáshoz előnyösen Hanks-féle oldatot alkalmazhatunk. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy az előkezeléshez használt interferont a sejtek tápfolyadékában hagyjuk. Ez esetben a termelt gamma-interferont az előkezelésnél alkalmazott alfa- vagy beta-interferontól el kell választani.

A szétválasztás önmagában ismert módon történhet pl. CPG üvegkromatográfiás módszerrel.

Az eljárásnál tápfolyadékként különböző aminosavakat és vitaminokat tartalmazó szövetkultúra-tápoldatok alkalmazhatók (pl. Eagle-féle MÉM, RPMI 1640, Dulbecco-féle MÉM, Glasgow-féle módosított MÉM) A fenti tápoldatok készítése a Flow Laboratórium évente kiadott katalógusa vagy a Gibco cég által kiadott katalógus alapján történik. Előnyösen alkalmazható továbbá az alábbi összetételű, olcsó, autoklávozható tápoldat :

Komponens Mennyiség kalcium-klorid 175—350 mg/1 kálium-klorid 300—500 mg/1 magnézium-szulfát vagy ekvivalens magnézium-klorid 175—500 mg/1 nátrium-klorid 5000—7000 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonát 200—3500 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfát 30—150 mg/1

-2184972

Komponens	Mennyiség
glükóz	500—5500 mg/1
ferri-nitrát	0—0,2 mg/1
szérum	0,5—10%

A gamma-interferon termelését különböző állati vagy emberi savó, illetve gammaglobulin mentesített savó (0,5—10%) jelenlétében végezzük el.

A találmányunk tárgyát képező eljárásnál kiindulási anyagként alvadásában gátolt, legfeljebb 72 órán át 0—8 °C-on tárolt emberi vérből származó fehérvérsejteket (buffy coat) alkalmazunk.

Alvadásgátlásra ACD-oIdatot (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy különböző bázisokkal (pl. adeninnel vagy guaninnal) kiegészített ACD-oldatot alkalmazhatunk. Az összegyűjtött fehérvértesteket gradiens-centrifugálással (pl. a Pharmacia svéd cég által forgalomba hozott Ficoll vagy Percoll segítségével) vagy előnyösen ammónium-kloriddal történő hemolízissel távolíthatjuk el. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a koncentrált fehérvérsejt-szuzsperiziót 0,5—1%-os — előnyösen 0,83%-os — 0—10 °C hőmérsékletű ammónium-klorid-oldattal elegyítjük 1: 3—20 előnyösen 1 : 5 térfogatarányban. A szuszpenziót 5—20 percen át — előnyösen kb. 10 percig — 0—8 °C-on keveréssel vagy anélkül inkubáljuk. A szétesett vörösvértestektől (pl. centrifugálással) elválasztjuk a leukocytákat. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az ammónium-kloridos kezelést megismételjük úgy, hogy 1 térfogatrész sejtszuszpenzióra 10 térfogatrész ammónium-klorid-oldatot alkalmazunk.

A tisztított fehérvérsejteket ezután megfelelő szövetkultúra tápfolyadékban (Eagle-féle MÉM, RPMI 1640, Dulbecco-féle MÉM, Glasgow-féle módosított MÉM) vagy az előzőekben ismertetett összetételű, olcsó, aminosavakat és vitaminokat nem tartalmazó tápoldatban szuszpendáljuk és a sejtszámot 10⁶—10⁸ sejt/ml értékre beállítjuk. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a sejtek újraszuszpendálásához és a sejtszám beállításához az előzőekben megadott összetételű, aminosavakat és vitaminokat nem tartalmazó tápoldatot alkalmazzuk. A felhasznált tápfolyadékot, illetve tápoldatot valamely állati vagy emberi szérummal vagy gamma-globulinmentesített szérummal, előnyösen emberi gamma-globulin-mentes szérummal egészítjük ki (0,5—-10%). A tápfolyadékhoz vagy tápoldathoz előnyösen valamely antibiotikumot is adunk, célszerűen neoimicint éspedig kb.

10—50 μβ/ηιΐ, előnyösen 25 μg/ml koncentrációban.

Ezután a sejteket alfa- vagy beta-interferonnal történő kezelésnek vetjük alá. E célra inducer-mentes (vírus vagy szintetikus polinukleotid) nyers vagy tisztított alfavagy beta-interferont alkalmazunk 200—20 000 NE/ml mennyiségben. Az előkezelés hőmérséklete 35—39 °C, előnyösen 37 °C, időtartama 1—12 óra, előnyösen 4 óra.

A sejtektől ezután az előkezelésre használt interferont előnyösen mosással elválasztjuk. A mosást célszerűen Hanks-oldattal végezzük el. Az interferon kimosása után a sejtkoncentrációt az eredeti mértékre állítjuk be, tápfolyadékban, vagy tápoldatban, mely emberi vagy állati szérumot vagy gammaglobulin-mentes szérumot, előnyösen humán gammaglobulin-mentes szérumot tartalmaz.

Az interferon kimosása nem elengedhetetlenül szüksé4 ges, minthogy az alfa- vagy beta-interferon jelenléte a gamma-interferon termelését nem zavarja. Ez esetben a termelt gamma-interferont a jelenlevő alfa- vagy betainterferontól utólag ismert módon választjuk el.

A sejteket ezután valamely interferon inducerrel hozzuk érintkezésbe. E célra — mint már említettük — előnyösen Concanavalin A, Phytohaemagglutinin, Staphyloccocus enterotoxin stb. alkalmazható. Eljárásunk előnyös foganatosítási módja szerint inducerként Concanavalin A-t alkalmazunk, előnyösen 2,5—30 με/πιΐ, különösen előnyösen 15 μg/ml koncentrációban.

Az indukció időtartama 5—48 óra, előnyösen 10—12 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35—39 ^QC, előnyösen 37 °C. Az inducert bizonyos idő (kb. 1 óra) elteltével kívánt esetben mosással eltávolíthatjuk; ez a művelet azonban elhagyható, minthogy az inducer jelenléte a gamma-interferon termelést nem zavarja. Az inducert általában nem távolítjuk el.

Ezután a sejteket a folyékony fázistól centrifugálással elválasztjuk. A felülúszó (szuszpematans) réteg tartalmazza a nyers gamma-interferont, melyet alacsony hőmérsékleten kb. —20 °C-on tárolhatunk, vagy ismert módszerekkel tisztíthatunk.

A találmányunk tárgyát képező eljárás előnye, hogy az alfa- vagy beta-interferonnal történő előkezelés hatására a termelt gamma-interferon mennyisége 5—10szeresére fokozódik. Az eljárásunkkal készített gammainterferon mind fizikokémiai tulajdonságait (pH 2 érzékenység, 56 °C-on és 37 °C-on mért stabilitás) mind biológiai aktivitását (antivirális és anticelluláris hatás) tekintve teljesen megegyezik az ismert módon előállított gamma-interferonnal.

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk :

1. példa

Véradóktól ACD oldattal (2% nátrium-citrát, 3% dextróz és 0,51% citromsav, desztillált vízben) levett vérmintákat 3 órán át +4 °C-on tárolunk, majd 2000— 3000 g-val 20—30 percig centrifugálunk. A fehérvérsejtekben gazdag „buffy coat” frakciót egy éjszakán át +4 °C-on tároljuk. Egy térfogatrész ily módon kapott fehérvérsejt-koncentrátumot 5 térfogatrész 0,83%-os +4 °C hőmérsékletű vizes ammónium-kloriddal elegyítünk. A szuszpenziót a vörösvértestek feloldódásáig (5—10 perc) +4 °C-on tartjuk, majd a leukocitákat 1500 g-vel +4 °C-on 10 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. A fehérvérsejteket az alábbi összetételű tápoldatban szuszpendáljuk:

Komponens	Koncentráció mg/1
kalcium-klorid	265
ferri-nitrát	0,1
kálium-klorid	400
magnézium-szulfát-heptahidrát	200
nátrium-klorid	6400
nátrium-hidrogén-karbonát	2750
nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát	140
glükóz	4500

-3184972

Ezután a vörösvértestek feloldását a fenti módszerrel megismételjük, azzal a változtatással, hogy 1 térfogatrész fehérvérsejt szuszpenzióra 10 térfogatrész 0,83%-os vizes ammónium-klorid-oldatot alkalmazunk. A leukocitákat az előzőekben ismertetett összetételű tápoldatban 5 szuszpendáljuk és a sejtszámot 10⁷ ml értékre állítjuk be.

A tápoldat 2 mg/ml humán aganuna-szérumot [„Agámmá szérum”=gamma globulin mentes szérum, mely a szérumok ammónium-szulfátos kezelésével állítható elő a J. gén Virol. 20, 9Ί—104, 1973-as irodalmi helyen kö- 10 zölt módszerrel] és 25 μg/ml neomicint tartalmaz.

A sejteket 4 órán át 37 °C-on állandó keverés mellett 1500 NE/ml pH 2 kezelt (Sendai vírus-mentesített) koncentrált alfa-interferonnal kezeljük. Ezután az előkezelésre használt alfa-interferont Hanks-oldattal történő 15 kétszeri mosással eltávolítjuk, majd a sejteket 15 μg/ml Concanavalin A-val kezeljük és 12 órán át állandó keverés mellett 37 °C-on inkubáljuk. A felülúszó (szupernatans) folyadék gamma-interferon tartalma 50 000 E/ml.

Összehasonlítás céljából a fenti eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy az inducer hozzáadása előtt a leukocitákat nem kezeljük alfa-interferonnal. A kapott gamma-interferon titere mindössze 6500 E/ml.

2. példa

Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy tápoldatként Glasgow-féle MÉM tápfolyadékot alkalmazunk [Virology 14, 359, 1961]. Az ily módon kapott nyers gamma interferon hatóanyagtartalma 48 000 E/ml.

Amennyiben a jelen példa szerinti eljárásnál az alfainterferonnal történő kezelést elhagyjuk, csupán 6200 E/ml hatóanyag-tartalmú nyers gamma-interferont kapunk.

3. példa

Az 1. példában leírt módon járunk el, azonban az előkezelésre használt alfa-interferont nem távolítjuk el.

Az alfa-interferonnal való kezelés után a sejteket 15 μ3/πι1 Concanavalin A-val 12 órán át 37 °C-on állandó keverés mellett inkubáljuk. A felülúszó folyadék interferon tartalma 52 000 E/ml.

Az ily módon kapott, alfa- és gamma-interferont tartalmazó anyagot CPG üvegkromatográfiás módszerrel választjuk szét komponenseire. A nyers terméket CPG 50 üveggel töltött oszlopra visszük fel, az alfa interferon a szennyezésekkel együtt az oszlopon áthalad, míg a gamma-interferon megkötődik. A gamma-interferon eluálását 20 térfogat/^ etilén-glikolt, 150 mmol nátrium-kloridot és 20 mmol foszfát-puffért tartalmazó vizes oldattal végezzük el.

4. példa

Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy az interferonos kezeléshez alfainterferon helyett 2500 NE/ml beta-interferont alkalmazunk. A kapott nyers termék gamma-interferon tartalma 56 000 E/ml.

Amennyiben a jelen példa szerinti eljárásnál a betainterferonnal történő kezelést elhagyjuk, 6800 E/ml hatóanyagtartalmú nyers gamma-interferont kapunk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

20 1. Eljárás humán gamma-interferon előállítására, a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukocyták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása 'valamely mitogén ágenssel történő kezelése, majd az interferon-tartalmú

25 folyadéknak a sejtektől történő elválasztása útján, azzal jellemezve, hogy a fehérvértesteket a mitogén ágenssel történő kezelés előtt 200—20 000 NE/ml mennyiségű alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód30 ja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 500—5000

NE/ml mennyiségű, alfa- vagy beta-interferonnal végezzük el.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 1000—

35 2000, előnyösen 1500 NE/ml mennyiségű alfa-interferonnal végezzük el.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 2000— 3000, előnyösen 2500 NE/ml mennyiségű beta-inter40 feronnal végezzük el.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést a mitogénnel történő kezelést megelőzően 1— 12, előnyösen 2—8, különösen előnyösen 4 órával végezzük el.
6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az alfavagy beta-interferonnal történő kezelést 1—12, előnyösen 4 órán át végezzük el.
7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítás ' módja, azzal jellemezve hogy az előkezeléshez használt alfa- vagy beta-interferont a mitogén ágenssel történő kezelés előtt mosással eltávolítjuk.