DE3249215C2

DE3249215C2 - Verfahren zur herstellung von humanem gamma-interferon.

Info

Publication number: DE3249215C2
Application number: DE19823249215
Authority: DE
Inventors: Ilona Beladi; Miklos Toth; Istvan Rosztoczy; Sandor Toth; Valeria Endresz
Original assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Current assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Priority date: 1981-12-01
Filing date: 1982-11-30
Publication date: 1990-06-13
Anticipated expiration: 2002-12-01
Also published as: GB2123007A; CH658391A5; FI74978C; AU1017483A; FI74978B; SU1405691A3; FI832508A0; AU551964B2; WO1983001899A1; HU184972B; DE3249215T1; FI832508L; GB2123007B; JPS58502032A; GB8320371D0

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von humamem gamma-Interferon. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, daß humane Leukozyten unter Einwirkung von mitogenen Mitteln gamma-Interferon (Immuninterferon) erzeugen. Das gamma-Interferon unterscheidet sich von dem unter Einwirkung von Virus in den Leukozyten gebildeten bzw. durch Virus oder synthetische Polynukleotide induzierten in Fibroblastzellen produzierten Leukozyteninterferon (alpha-Interferon) und Fibroblastininterferon (beta-Interferon) sowohl in seinen physikochemischen als auch biologischen Eigenschaften. Die zellenteilungshemmende Aktivität und die Fiktion der Zellen des Immunsystems beeinflussende Wirkung des gamma-Interferons ist ausgeprägt günstiger als die entsprechenden Aktivitäten des alpha- oder beta-Interferons. Deshalb kann mit einer immer sehr verbreiteten Verwendung des gamma-Interferons in der Therapie durch tumoröse Krankheiten gerechnet werden [Nature 294, 7, (1981), Cellular Immunology 49, 390 (1980)].

Das gamma-Interferon wird auf bekannte Weise so hergestellt, daß man die Leukozytenfraktion des Blutes abtrennt, die Erythrozyten durch Gradientzentrifugieren oder vorteilhaft durch Haemolyse mit Ammoniumchlorid entfernt, die gereinigten Leukozyten inkubiert, mit einem geeigneten aspezifischen mitogenen Mittel behandelt und schließlich das erzeugte gamma- Interferon aus der supernatierenden Flüssigkeit isoliert. Als mitogenes Mittel kann Concanavalin A [Infect. Immun. 26, 36 (1979)], Phytohaemagglutinin [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1601 (1981) oder Enterotoxin [Int. Res. Comm. Sys. Med. Sci., 7, 595 (1979) eingesetzt werden.

Nach der Fachliteratur wurden zur Erhöhung der durch mitogene Mittel stimulierten gamma-Interferon- Produktion verschiedene Versuche durchgeführt. Nach einer Methode wird die gamma-Interferon-Produktion durch Vorbehandlung der Leukozyten mit 12-0-Tetradekanoyl- phorbol-13-acetat erhöht [Vilcek und Mitarbeiter: Biochemical Characterization of Lymphokines (Academia New York), Seite 323 (1980)]. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß das 12-0-Tetradekanoyl-phorbol- 13-acetat karzinogen ist und das unter dessen Verwendung erzeugte gamma-Interferon zur Anwendung in der Therapie kaum geeignet ist. Es wurde versucht, die gamma-Interferon-Produktion durch Vorbehandlung der Leukozyten mit Natriumbutylat oder Dexamethason zu steigern; diese Versuche blieben jedoch ohne Erfolg. [Nature 292, 842 (1981)].

Das Ziel der Erfindung ist bei der aus Leukozyten durch mitogene Mittel induzierte gamma-Interferon-Erzeugung die Erhöhung der Produktion und die Steigerung der Einheitzahl.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von humanem gamma-Interferon, durch Trennung der Leukozytenfraktion des Blutes, Entfernung der Erythrozyten, Suspendieren der Leukozyten in einer geeigneten Nährlösung, Behandlung derselben mit einem geeigneten mitogenen Mittel und Abtrennung der interferonhaltigen Lösung von den Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel einer Vorbehandlung mit 200-20 000 IE/ml alpha- oder beta-Interferon unterwirft.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß falls man die Leukozyten vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel einer Vorbehandlung mit alpha- oder beta-Interferon unterwirft, die gamma-Interferon-Produktion wesentlich - um etwa 500-1000% - erhöht wird.

Das alpha- oder beta-Interferon kann in einer Menge von 200-20 000 IE/ml eingesetzt werden.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Vorbehandlung mit 1000-2000 IE/ml - insbesondere 1500 IE/ml - alpha-Interferon durchgeführt.

Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Vorbehandlung mit 2000-3000 IE/ml - insbesondere 2500 IE/ml - beta- Interferon durchgeführt.

Die Vorbehandlung kann vorteilhaft 1-12, besonders vorteilhaft 2-8, insbesondere 4 Stunden vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel durchgeführt werden.

Die Zeitdauer der Vorbehandlung mit alpha- oder beta-Interferon beträgt 1-12 Stunden, insbesondere etwa 4 Stunden. Die Temperatur der Vorbehandlung liegt im Bereich von 35-39°C, kann man besonders vorteilhaft bei 37°C arbeiten.

Nach der Vorbehandlung und vor der Zugabe des mitogenen Mittels wird das alpha- oder beta-Interferon vorteilhaft entfernt (z. B. durch Waschen der Zellen). Zum Auswaschen des alpha- oder beta-Interferons kann eine Hanks-Lösung dienen. Das bei der Vorbehandlung verwendete alpha- oder beta-Interferon kann jedoch auch in der Nährflüssigkeit der Zellen bleiben. In diesem Falle muß das erzeugte gamma-Interferon von dem bei der Vorbehandlung verwendeten alpha- oder beta-Interferon nachträglich getrennt werden.

Die obige Trennung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden (z. B. durch Glaschromatographie mit CPG).

Bei dem Verfahren können als Nährflüssigkeit verschiedene Aminosäuren und Vitamine enthaltende Gewebekulturnährlösungen verwendet werden (z. B. Eagle-MEM, RPMI 1640, Dulbecco-MEM, Glasgow-modifizierte MEM usw.). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine einfache, nicht kostspielige, im Autoklav verwendbare Nährlösung folgender Zusammensetzung Verwendung finden:

Komponente
Menge
Kalciumchlorid
175-350 mg/ml
Kaliumchlorid	300-500 mg/ml
Magnesiumsulfat oder eine äquivalente Menge Magnesiumchlorid	175-500 mg/ml
Natriumchlorid	5000-7000 mg/ml
Natriumbicarbonat	200-3500 mg/ml
Natriumdihydrogenphosphat	30-150 mg/ml
Glukose	500-5500 mg/ml
Ferrinitrat	0-0,2 mg/ml
Serum	0,5-10%

Die Erzeugung des gamma-Interferons wird in Anwesenheit eines Serums durchgeführt. Zu diesem Zweck sind verschiedene Seren menschlichen und tierischen Ursprungs geeignet. Es kann auch ein gamma-globulinfreies Serum eingesetzt werden. Die Menge des Serums liegt zwischen 0,5 und 10%.

Als Ausgangsstoff für das erfindungsgemäße Verfahren dienen die aus einem in der Blutgerinnung gehemmten, höchstens 72 Stunden lang bei 0-8°C gelagerten menschlichen Blut gewonnenen Leukozyten.

Als koagulationshemmendes Mittel kann eine ACD-Lösung (Zitronensäure und Dextrose enthaltende Lösung) oder durch verschiedene Basen (z. B. Adenin oder Guanin) ergänzte ACD-Lösung verwendet werden. Die gesammelten Erythrozyten werden durch Gradientzentrifugieren (z. B. mit Hilfe der durch die schwedische Firma Pharmacia in Verkehr gebrachte Produkte Ficoll oder Percoll) oder vorteilhaft durch Haemolyse mit Ammoniumchlorid entfernt. Man kann vorteilhaft so verfahren, daß man die konzentrierte Leukozytensuspension mit einer 0,5-1%igen - vorteilhaft 0,83%igen - Ammoniumchloridlösung (Temperatur: 0-10°C) in einem Volumenverhältnis zwischen 1 : 3 und 1 : 20 - vorteilhaft 1 : 5 - vermischt. Die erhaltene Suspension wird 5-20 Stunden lang - vorteilhaft etwa 10 Minuten lang - bei 0-8°C unter oder ohne Rühren inkubiert. Die Leukozyten werden von den zerfallenen Erythrozyten getrennt (z. B. durch Zentrifugieren). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Behandlung mit Ammoniumchlorid wiederholt und in diesem Falle werden auf 1 Volumenteil der Zellensuspension gerechnet, 10 Volumenteile Ammoniumchloridlösung eingesetzt.

Die gereinigten Leukozyten werden in einer geeigneten Zellenkulturnährlösung (z. B. Eagle-MEM, RPMI 1640, Dulbecco- MEM, Glasgow-modifizierte MEM; oder die oben beschriebene einfache, nichtkostspielige, keine Aminosäure und Vitamine enthaltende Nährlösung) suspendiert und die Zellenzahl wird auf 10⁶-10⁸ Zellen/ml eingestellt. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird zum wiederholten Suspendieren der Zellen und Einstellung der Zellenzahl die oben erwähnte, einfache, nichtkostspielige, keine Aminosäuren und Vitamine enthaltende Nährlösung verwendet. Die eingesetzte Nährflüssigkeit bzw. Nährlösung wird mit einem Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einem gamma-globulinfreien Serum - vorteilhaft mit menschlichem, gamma-globulinfreien Serum - ergänzt. die Menge des Serums beträgt 0,5-10%. Der Nährflüssigkeit oder Nährlösung kann vorzugsweise ein Antibiotikum zugefügt werden. Zu diesem Zweck kann vorteilhaft Neomycin Verwendung finden, und zwar in einer Menge von etwa 10-50 µg/ml, insbesondere 25 µg/ml.

Danach werden die Zellen der erfindungsgemäßen Behandlung mit alpha- oder beta-Interferon unterworfen. Zu diesem Zweck kann induzerfreies (virus- oder polynukleotidfreies) rohes oder gereinigtes alpha- oder beta- Interferon verwendet werden. Die alpha- oder beta-Interferon- Konzentration beträgt 200-20 000 EI/ml. Die Temperatur der Vorbehandlung liegt zwischen 35°C und 39°C und ist vorteilhaft 37°C. Die Zeitdauer der Vorbehandlung liegt zwischen 1 und 12 Stunden und beträgt vorteilhaft 4 Stunden.

Das bei der Vorbehandlung eingesetzte Interferon kann von den Zellen vorteilhaft durch Waschen abgetrennt werden. Zum Waschen kann vorteilhaft eine Hankslösung verwendet werden. Nach dem Auswaschen des alpha- oder beta-Interferons wird die Zellenkonzentration auf den ursprünglichen Wert eingestellt: diese Maßnahme wird in einer, ein Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs oder ein gamma-globulinfreies Serum, vorteilhaft humanes gamma-globulinfreies Serum enthaltenden Nährlösung durchgeführt.

Das Auswaschen des alpha- oder beta-Interferons ist keine unbedingt notwendige Maßnahme, da die Anwesenheit des alpha- oder beta-Interferons die Erzeugung des gamma-Interferons nicht stört. In diesem Falle wird das erzeugte gamma-Interferon von dem anwesenden alpha- oder beta-Interferon nach bekannten Methoden getrennt.

Die Zellen werden danach mit einem Interferoninduzer in Kontakt gebracht. Zu diesem Zweck können bekannte und übliche Interferoninduzer verwendet werden (z. B. Concanavalin A, Phytohaemagglutinin, Staphylococcus enterotoxin usw.). Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird als Induzer Concanavalin A in einer Konzentration von vorteilhaft 2,5-30 µg/ml - insbesondere 15 µg/ml - eingesetzt.

Die Zeitdauer der Induktion beträgt 5-48 Stunden, vorteilhaft 10-12 Stunden. Die Temperatur liegt zwischen 35°C und 39°C und beträgt vorteilhaft 37°C. Nach Abklingen einer bestimmten Zeitdauer (z. B. eine Stunde) kann das Induzer erwünschtenfalls durch Waschen entfernt werden, Diese Maßnahme ist jedoch nicht obligatorisch, da die Anwesenheit des Induzers die gamma-Interferon-Erzeugung nicht stört. Im allgemeinen wird das Induzer nicht entfernt.

Die Zellen werden danach von der supernatierenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren getrennt. Diese supernatierende Schicht enthält das rohe gamma-Interferon und kann bei niedriger Temperatur (etwa -20°C) gelagert oder nach bekannten Methoden gereinigt werden.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die mit alpha- oder beta-Interferon durchgeführte Vorbehandlung eine fünffache bis zehnfache Erhöhung der gamma-Interferon-Produktion zur Folge hat. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte gamma-Interferon ist mit den nach bekannten Methoden hergestellten gamma-Interferonen sowohl in der physikochemischen Eigenschaft (pH 2 Empfindlichkeit, bei 56°C und 37°C gemessene Stabilität) als auch in der biologischen Aktivität (antivirale und antizellulare Wirkung) vollständig gleichwertig.

Weitere Einzelheiten der Erfindung sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1

Das entnommene Blut wird in einer ACD-Lösung (Zitronensäure und Dextrose enthaltende wäßrige Lösung) bei +4°C 3 Stunden lang gelagert. Die Leukozytenfraktion wird durch Zentrifugieren gesammelt und über Nacht bei +4°C stehengelassen. 1 Vol.-Teil des so erhaltenen Leukozytenkonzentrates wird mit 5 Vol.-Teilen einer 0,83%igen wäßrigen Ammoniumchloridlösung (Temperatur +4°C) vermischt. Die Suspension wird bis Auflösung der Erythrozyten (5-10 Minuten) bei +4°C gehalten und die Leukozyten werden durch Zentrifugieren isoliert. Die Leukozyten werden in einer Nährlösung folgender Zusammensetzung suspendiert:

Komponente
Konzentration, mg/l
Kalciumchlorid
265
Ferrinitrat	0,1
Kaliumchlorid	400
Magnesiumsulfatheptahydrat	200
Natriumchlorid	6400
Natriumcarbonat	2750
Natriumdihydrogenphosphat-dihydrat	140
Glukose	4500

Das Auflösen der Erythrozyten wird nach der obigen Methode mit der Modifizierung wiederholt, daß 10 Vol.- Teile einer 0,83%igen wäßrigen Ammoniumchloridlösung, auf 1 Vol.-Teil Leukozytensuspension bezogen, verwendet werden. Die Leukozyten werden in der Nährlösung obiger Zusammensetzung suspendiert und die Zellenzahl wird auf 10⁷ Zellen/ml eingesetellt.

Die Nährlösung enthält 2 mg/ml humanes Agammaserum und 25 µg/ml Neomycin. Die Zellen werden 4 Stunden lang bei 37°C unter ständigem Rühren mit 1500 IE/ml konzentriertem alpha-Interferon behandelt (bei pH 2 behandeltes, vom Sendai-Virus freies Interferon). Danach wird das verwendete alpha-Interferon durch zweimaliges Waschen mit einer Hankslösung entfernt, die Zellen werden mit 15 µg/ml Concanavalin A, bei 37°C, 12 Stunden lang unter ständigem Rühren inkubiert. Der gamma-Interferon-Gehalt der supernatierenden Schicht beträgt 50 000 IE/ml.

Als Vergleich wird das obige Verfahren mit der Modifizierung wiederholt, daß die Behandlung der Leukozyten mit alpha-Interferon vor der Zugabe des Induzers weggelassen wurde. Der Titer des erhaltenen gamma-Interferons beträgt nur 6500 IE/ml.

Beispiel 2

Man verfährt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß als Nährlösung eine Glasgow-MEM Nährflüssigkeit verwendet wird (Virology 14, 359/1961/). Der Wirkstoffgehalt des so erhaltenen rohen gamma-Interferons beträgt 48 000 IE/ml.

Das obige Verfahren wird so wiederholt, daß die Behandlung mit alpha-Interferon weggelassen wurde. Der Wirkstoffgehalt des so erhaltenen rohen alpha-Interferons beträgt nur 6200 IE/ml.

Beispiel 3

Man verfährt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß das bei der Vorbehandlung verwendete alpha-Interferon nicht entfernt wird. Nach der Behandlung mit alpha-Interferon werden die Zellen mit 15 µg/ml Concanavalin A, bei 37°C, unter ständigem Rühren 12 Stunden lang inkubiert. Die oben schwimmende (supernatierende) Flüssigkeit enthält 52 000 IE/ml Interferon.

Die so erhaltene, alpha, beta- und gamma-Interferon enthaltende Mischung wird nach Glaschromatographie (CPG) auf die Komponenten getrennt. Das Rohprodukt wird auf eine mit CPG-Glas gefüllte Säule geführt. Das alpha- Interferon und die Verunreinigungen gehen durch die Säule und das gamma-Interferon bleibt an der Säule gebunden. Das gamma-Interferon wird von der Säule mit einer, 20 Vol.-% Äthylenglykol, 150 Millimol Natriumchlorid und 20 Millimol Phosphatpuffer enthaltenden wäßrigen Lösung eluiert.

Beispiel 4

Man verfährt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß man anstatt alpha-Interferon 2500 IE/ml beta-Interferon verwendet. Der Interferongehalt des erhaltenen Rohproduktes beträgt 56 000 IE/ml.

Zum Vergleich wird das obige Verfahren so wiederholt, daß der Behandlung mit beta-Interferon weggelassen wurde. Der gamma-Interferon-Gehalt des erhaltenen Rohproduktes beträgt 6800 IE/ml.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von humanem gamma-Interferon durch Trennung der Leukozytenfraktion des Blutes, Entfernung der Erythrozyten, Suspendieren der Leukozyten in einer geeigneten Nährlösung, Behandlung derselben mit einem geeigneten mitogenen Mittel und Abtrennung der interferonhaltigen Lösung von den Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel einer Vorbehandlung mit 200-20 000 IE/ml alpha- oder beta-Interferon unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorbehandlung mit 500-5000 IE/ml alpha- oder beta-Interferon durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorbehandlung mit 1000-2000, vorteilhaft 1500 IE/ml alpha-Interferon durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorbehandlung mit 2000-3000, vorteilhaft 1500 IE/ml beta-Interferon durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorbehandlung 1-12, vorteilhaft 2-8, insbesondere 4 Stunden vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel durchführt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der Vorbehandlung verwendete alpha- oder beta-Interferon vor der Behandlung mit dem mitogenen Mittel durch Waschen entfernt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man als mitogenes Mittel Concanavalin-A, Phytohaemagglutinin oder Enterotoxin verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Leukozytenfraktion die Erythrozyten durch Haemolyse mit Ammoniumchlorid entfernt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährlösung eine 175-350 mg/l Calciumchlorid, 300-500 mg/l Kaliumchlorid, 175-500 mg/ml Magnesiumsulfat oder eine äquivalente Menge Magnesiumchlorid, 5000-7000 mg/l Natriumchlorid, 200-3500 mg/l Natriumbicarbonat, 30-150 mg/l Natriumdihydrogenphosphat, 500-5500 mg/l Glukose und gegebenenfalls 0,05-0,2 mg/l Ferrinitrat und 0,5-10 % Serum enthaltende wäßrige Nährlösung verwendet.