DE2954574C2 - Pharmazeutische Präparate enthaltend Human-Leukozyten-Interferon - Google Patents

Description

Die Reinigung von Proteinen ist seit langem ein Pro­ blem in der Peptidchemie. Die zu diesem Zweck angewandten Techniken umfassen die Präzipitation, Gelfiltration, Ionen­ austauschchromatographie, Gelelektrophorese, Affinitäts­ chromatographie und viele andere. Verfahren zur Isolie­ rung natürlich vorkommender, hochmolekularer Proteine, die in biologischem Material in extrem geringen Konzen­ trationen vorkommen, umfassen eine Vielzahl der vorstehend genannten Methoden. In vielen Fällen müssen außerordent­ lich große Mengen des Rohmaterials eingesetzt und ver­ arbeitet werden im Hinblick auf die großen Verluste wäh­ rend des gesamten Prozederes. Daraus ergibt sich, daß die Reinigungsverfahren für derartige Proteine außer­ ordentlich aufwendig und teuer sind. Ein gutes Beispiel stellen diesbezüglich die verschiedenen Versuche der Iso­ lierung und Charakterisierung des Interferons dar. Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von For­ schern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, die unternommen wurden, um es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Be­ stimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben würden.

Im U.S. Patent 3 699 222, welches die ersten Arbei­ ten von Isaacs und Lindenmann über das Interferon zum Gegenstand hat, besteht die Reinigung des aktiven Mate­ rials lediglich in einer Ammonsulfatfällung und anschließ­ ender Dialyse. Da ein derartiges Verfahren relativ un­ spezifisch ist, ist das erhaltene Produkt noch außerordent­ lich unrein.

Ein Mehrstufenverfahren zur Reinigung von Interferon wird in U.S. Patent 3 414 651 beschrieben, das die folgen den Schritte umfaßt: selektive Adsorption an amorphem Alumino-silikat, Elution mit Jod- oder Thiocyanat-Lösung, weitere Fällung Unerwünschter Proteine mit wäßriger HCl und wäßriger Natronlauge, Fällung des Interferons mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton und schließlich Chromatographie des wieder aufgelösten Interferons an einem Ionenaustauschharz wie 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose. Durch dieses Reinigungs­ verfahren konnte die spezifische Aktivität des Interferons um den Faktor 6000 erhöht werden. Als spezifische Inter­ ferone wurden in dem U.S. Patent Kücken- und Affen-Inter­ feron genannt.

Eine weitere Reinigungsmethode wird in U.S. Patent 3 975 344 beschrieben, gemäß dem eine Lösung von unge­ reinigtem Human-Fibroblasten-Interferon durch Dichtegra­ dient-Ultrazentrifugation gereinigt wurde. Es wurde ange­ geben, daß nach dieser Methode eine höhere Ausbeute und Reinheit erzielt wird als nach der Methode unter Verwendung von Säulenchromatographie an Sephadex G-100.

Die im folgenden aufgeführten Publikationen beschäfti­ gen sich ebenfalls mit der Reinigung und der versuchten Charakterisierung von Interferonen:
Knight, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 520-3 (1976);
Törmä, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251, 4810-6 (1976);
Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 252, 6585-7 (1977);
DeMaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-5 (1978);
Kawakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602 (1978);
Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-11 (1978);
Jankowski, W.J. et al., J. Virology 16, 1124-30 (1975);
Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251, 7620-5 (1976);
Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17, 196-200 (1978).

Obwohl in zahlreichen der oben genannten Publikatio­ nen behauptet wird, daß Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, ist weder einer der klassischen Nachweise der Homogenität von Pro­ teinen angegeben noch sind die Eigenschaften der angeb­ lich reinen Verbindungen beschrieben.

In Acta virol. 21, 359-364 (1977) wird von Taborsky et al. eine teilweise Reinigung (partial purification) von Human-Leukocyten-Interferon beschrieben. Bei den verwendeten Reinigungsmethoden handelt es sich um eine Gel-Chromatogra­ phie mit einer G-100 Sephadex-Säule, eine Disk-Elektropho­ rese in einem Polyacrylamidgel und um eine Natriumdodecyl­ sulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, wobei es sich jeweils um Reinigungsverfahren handelt, die bereits seit langer Zeit bekannt sind. Bei einem Vergleich der Ergebnisse fällt auf, daß die Molekulargewichte, die mit Hilfe der Gelchromatographie erhalten wurden, sich von den Molekular­ gewichten unterscheiden, die mit Hilfe der SDS-Gelelektro­ phorese erhalten wurden. Nach den Ergebnissen der Gel-Chromatographie weisen die Interferone Molekulargewichte von 12 000, 22 000, 37 000 (bzw. 31 000) 55 000 und 90 000 bis 100 000 Dalton auf (Seite 360, letzter Absatz). Nach den heute gesicherten wissenschaftlichen Erkenntnissen existieren aber Human-Leukocyten-Interferone mit den angegebenen Molekulargewichten nicht mit Ausnahme des Wertes von 22 000, wobei aber im Hinblick auf die dem System offensichtlich inhärenten Ungenauigkeiten auch diesem Wert keine besondere Bedeutung beigemessen werden kann und die Autoren führen selber in dem ersten Satz des letzten Absatzes auf Seite 363 aus, daß ein verläßlicher Vergleich der Molekulargewichte der Interferone durch die verwendeten Methoden nicht durchgeführt werden kann. Schließlich kann den Ergebnissen dieser Publikation nicht entnommen werden, daß in den Präparationen nicht auch noch Proteine ohne Interferonaktivität enthalten sind.

Auch bei den von Havell et al. in Archives of Virology 55, 121-129 (1977) beschriebenen Human-Leukocyten-Interferonen handelt es sich nicht um homogene Verbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung, sondern entweder klarerweise um Gemische oder um Fraktionen, die im Hinblick auf ihre spezi­ fischen Aktivitäten an Human- und Rinderzellen nicht zu den erfindungsgemäß erhältlichen homogenen Interferonen zu rechnen sind. Die Komponente mit pI 6.2 ist ein Gemisch von 2 Bestandteilen, die Molekulargewichten von etwa 17 500 und 23 000 entsprechen (Seite 126, letzte Zeile - Seite 127, erste Zeile) und bei den Komponenten mit pI 7.0 handelt es sich um ein Gemisch aus Leukozyten- und Fibroblasten-Inter­ feronen (letzter Absatz der Diskussion). Das Verhältnis der Interferon-Titer auf Humanzellen zu dem auf Rinderzellen beträgt bei den von Havell et al. beschriebenen Verbindungen 1.5 (pI 5.5, entspricht MG 17 500) bis 4.0 (pI 6.6, ent­ spricht MG 23 000) und ist bei den erfindungsgemäßen Human-Leukocyten-Interferonen kleiner als oder etwa gleich 1.

Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato­ graphie (HPLC) zur Reinigung von Proteinen ist in der Fachwelt allgemein bekannt, wobei besonders Ionenaustausch- und Ausschluß-Chromatographie beschrieben werden [siehe z. B. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sci. 14, 316-20 (1976) und Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)].

In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z. B. Lichro­ sorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifiziertem SiO₂) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie β-Endorphin, verwendet [siehe z. B. Rubinstein, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 4969-72 (1977)].

Schließlich wurde die teilweise Charakterisierung von drei Interferon-Spezies aus Ehrlich Ascites-Tumorzellen von Mäusen (MW = 33 000, 26 000 und 20 000) durch Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254, 3681-4 (1979), beschrieben.

Berg et al. beschreiben in Texas Reports on Biology and Medicine, Vol. 35 (1977) S. 187 die Reinigung von Human-Interferon mittels Antikörper-Affinitätschromatographie. Mittels dieser Technik konnte eine spezifische Aktivität für Leukozyten-Interferon ohne die Zugabe von SDS von nur 1,6×10⁷ IFU/mg Protein erzielt werden. Eine weitere Auftrennung erfolgte im SDS-Gel, jedoch kann das Natriumdodecylsulfat (SDS) von dem Leukozyten-Interferon nicht mehr abgetrennt werden.

Lin et al. berichtete bei dem jährlichen Treffen der "American Society for Microbiology" in Las Vegas, May 1978 (Abstracts No. 202) von einer Reinigungsmethode von Human-Leukozyten-Interferon, bei der eine milde Oxidation mit Natriumperjodat erfolgte. Es wurde berichtet, daß hierbei eine spezifische Aktivität von etwa 3×10⁸ U/mg Protein erreicht worden sein soll. Ein Wissenschaftler aus dieser Arbeitsgruppe, W. E. Stewart II berichtet jedoch in dem nachveröffentlichten Werk "The Interferon System", 2. Auflage, 1981, Springer-Verlag Wien, New York s. 164-S. 179, daß auch eine milde Perjodoxidation Interferon inaktivieren bzw. modifizieren kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Präparate enthaltend mindestens ein nicht durch Perjodat oxidiertes Human- Leukozyten-Interferon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in homogener Form vorliegt, frei von Natriumdodecylsulfat ist und eine spezifische Aktivität von 0,9×10⁸-4×10⁸ Einheiten/mg an der Rinder-Zell-Linie MDBK aufweist.

Die Herstellung von Human-Leukocyten-Interferonen in homogener Form, die die Basis für die Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate sind, kann dadurch erfolgen, daß man eine wäßrige Lösung eines noch unreinen Human-Leukocyten-Interferons durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octade­ cyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen SiO₂-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so daß es schließlich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird.

Dieses Verfahren ermöglichte es, Leukocyten-Interferon bis zur Homogenität zu reinigen, und zwar in Mengen, die ausreichend sind, um erstmals eine chemische Charakterisierung dieser medizinisch wertvollen Substanz zu erlauben. Die Möglichkeit, Interferon chemisch zu charakterisieren, stellt einen bemerkens­ werten Fortschritt in der Entwicklung dieser Substanz dar, da dies eine Voraussetzung dafür ist, die Substanz zu synthetisieren, sei es durch konventionelle Peptidsynthese, sei es auf dem Wege der Genmanipulation unter Zuhilfenahme geeigneter Organismen, vorzugsweise von Bakterien.

In einer speziellen Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man

• A) eine wäßrige Lösung von Interferon in unreinem Zu­ stand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puf­ fer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octyl­ gruppen modifizierten SiO₂-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem stei­ genden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungs­ mittels in einem Puffer eluiert wird, so daß es in be­ stimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
• B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktio­ nen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten SiO₂- Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so daß es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Frak­ tionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
• C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedin­ gungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO₂- Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wäßrigen Puffers eluiert wird, so daß man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält und gewünschtenfalls den Schritt C) wiederholt, um äußerste Reinheit des Produktes zu erzielen.

HPLC-Säulen auf der Basis von durch Octyl- oder Gly­ cerylgruppen modifizierter poröser SiO₂-Matrix (Partikel­ größe = 10 µ; mittlere Porengröße = 100 Å), die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden, sind Handelsartikel, erhältlich z. B. von EM Laboratories of Elmsford, N.Y., USA, unter der Markenbezeichnung Lichrosorb RP-8 und Lichrosorb-Diol. Äquivalente Octyl-mo­ difizierte poröse SiO₂-Säulen (Chromegabond C-8 bezeich­ net) sind erhältlich von E.S. Industries, Marlton, N.J., USA.

Ein geeignetes HPLC-System, in dem die vorstehend genannten Säulen verwendet werden können, sind in U.S. Patent No. 4 116 046 beschrieben.

Bei der Ausführung des Reinigungsverfahrens wird die Lösung des unreinen Interferons, vorzugsweise in Gegenwart eines wäßrigen Puffers mit einem geeigneten pH, durch die SiO₂-Säule geschickt. Normalerweise geschieht dies unter Druck, vorzugsweise im Be­ reich von etwa 50-5000 psi (3,4-340 Atm). Das auf der Säulen­ füllung adsorbierte Protein wird dann schrittweise und selektiv unter Verwendung eines Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind z. B. Alkanole, wie -n-Propanol, 2-Propanol, Äthanol, Methanol, tert.-Butanol, oder cyclische Äther, wie Dioxan. Die Fraktionierung des Eluats erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei der Gehalt der einzelnen Fraktionen an dem aktiven Protein durch hochempfindliche Monitoren bestimmt wird. Ein für diesen Zweck geeignetes System wird von Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975), beschrieben. Es ist empfehlenswert, die Anwesenheit des biologisch aktiven Materials durch einen geeigneten Bioassay zu überwachen.

Es stellte sich heraus, daß bei der Reinigung des Human-Leuko­ zyten-Interferons die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn man die unreine Interferon-Lösung zunächst durch eine Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modi­ fizierten SiO₂-Matrix (Umkehrphasen-Chromatographie) unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 7,5 (vorzugsweise 1 M Natriumacetat/Essigsäure) schickt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert, dann die gesammelten aktiven Fraktionen durch eine Säule auf der Basis einer mit Glycerylgruppen modifizierten SiO₂-Ma­ trix in einem 0,1 M Natriumacetat-Puffer schickt und mit einem fallenden n-Propanol-Gradienten eluiert und schließ­ lich die getrennten Interferon-Komponenten auf eine Säule auf der Basis einer mit Octylgruppen modifizierten SiO₂-Ma­ trix unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 4,0, vorzugsweise 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure, aufgibt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert. Auf diese Weise kann jede der drei getrennten Human-Leukozy­ ten-Interferone (α, β und γ) weiteraufgetrennt werden, wobei im Chromatogramm scharf voneinander getrennte Peaks erhalten werden, die die homogenen Proteine darstellen. Durch das gesamte Reinigungsverfahren, beginnend mit dem Inkubationsmedium bis hin zur Chromatographie an der zweiten durch Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix wurde eine Steigerung des Reinheitsgrades um den Faktor 60′000 bis 80′000 erreicht.

In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens zur Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon werden die in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den Hauptpeaks entsprechen, vereinigt, zur Entfernung des n-Propanols mit n-Hexan extrahiert und von Spuren n-Hexan befreit bevor Schritt C) durchgeführt wird.

Die wie beschrieben gereinigten, homogenen Human-Leukozyten- Interferon-Spezies sind gekennzeichnet durch einen scharfen Peak an den vorstehend genannten HPLC-Säulen sowie durch eine einzige enge Bande bei der Polyacrylamid-Gelelektro­ phorese an Natriumdodecylsulfat (NaDodSO₄) in Gegenwart von 2-Mercaptoäthanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen scharfen Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Die spezifischen Aktivitäten der reinen Interferon-Spezies liegen im Bereich von etwa 2,6-4,0 × 10⁸ Einheiten/mg mit MDBK-Zellen (epitheliale Nierenzellen von Rindern) und im Bereich von 1,5-4 × 10⁸ Einheiten/mg mit der Human-Zellinie Ag 1732. Die Molekulargewichte lagen zwischen etwa 16′000 und 21′000 (vgl. Tabelle 4, Seite 22). Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt (Seite 25).

Interferone besitzen antivirale, antitumor-, wachs­ tumshemmende- und immunsuppressive Aktivität. Diese Ak­ tivitäten konnten sogar in klinischem Maßstab festge­ stellt werden bei Verabreichung von 1-10 × 10⁶ Einhei­ ten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger als 1% Human-Interferon enthielten. Gemäß vorliegender Erfindung werden die gereinigten, homogenen Interferon-Spezies, einzeln oder in Gemischen miteinander, in bekannter Weise zur Her­ stellung von Interferon-Präparaten verwendet unter Anpassung der Dosierung an den erreichten Reinheitsgrad.

Derartige Gemische können entweder durch Vermischen der iso­ lierten Spezies erhalten werden oder durch Unterbrechung des Reinigungsverfahrens an einer Stelle, an der mehrere Interferon- Spezies aber keine Interferon-inaktiven Proteine vorhanden sind. Die Herstellung der Präparate erfolgt dadurch, daß man

• A) eine wäßrige Lösung von Interferon in unreinem Zu­ stand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgrup­ pen modifizierten SiO₂-Matrix schickt, wobei das Inter­ feron zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so daß es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
• B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktio­ nen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten SiO₂- Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so daß es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Frak­ tionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
• C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedin­ gungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiO₂- Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wäßrigen Puffers eluiert wird, so daß man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält und gewünschtenfalls den Schritt C) wiederholt, um äußerste Reinheit des Produktes zu erzielen.

Die Induktion der Interferon-Produktion, die Erst­ konzentration und Fraktionierung des Interferons einschließ­ lich der Gelfiltration können nach an sich bekannten Metho­ den durchgeführt werden.

Beispiel 1 Homogenes Human-Leukozyten-Interferon von normalen Spen­ dern A. Herstellung des Interferons

Interferon wurde hergestellt durch 16-stündige Inkuba­ tion von Human-Leukozyten aus dem Blut normaler Spender (10⁷ Zellen/ml) mit Newcastle-Krankheit-Virus (15 Häm­ agglutinin-Einheiten/ml) in einem serumfreien Minimal­ medium, das 10 mg/ml Casein enthielt. Es wurde ein mitt­ lerer Interferon-Titer von 5000 Einheiten/ml erhalten. Die angewandten Methoden entsprachen den von Mogensen, K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369- 381; Wheelock, E.F., J. Bacteriol. 92, 1415-1421 (1966) und Cantell, K. et al., Appl. Microbiol. 22, 625-628 (1971) angegebenen mit einigen geringfügigen Änderungen. Die Interferon-Titer wurden mit einem Assay auf der Basis der Hemmung des Cytopathischen Effekts, der innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden konnte, bestimmt. Alle Interferon-Titer sind in Einheiten/ml angegeben, kali­ briert gegen den Referenzstandard für Human-Leukozyten Interferon vom National Institute of Health (USA).

B. Konzentrierung und erste Fraktionierung von Interferon

Sofern nicht anders angegeben, wurde bei einer Tempe­ ratur von 0-4°C gearbeitet. Nach beendeter Inkubation wurden die Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugieren (15 Minuten, 500×g) entfernt. Casein wurde durch An­ säuern mit HCl auf pH 4,0 präzipitiert. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch zentrifugiert (10 Minuten, 12 000×g) und der Niederschlag verworfen. Der Überstand (10 l) wurde auf einen Gehalt von 1,5% (w/v) Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Präzipitat abzentri­ fugiert (10 Minuten, 12000×g) und in 50 ml 0,1 M NaHCO₃ wieder aufgelöst. Nach Zusatz von 0,5 g Triton X-100 und 1,5 ml Essigsäure (tropfenweise unter Rühren) wurde das Gemisch 1 Stunde bei 0°C und anschließend 16 Stunden bei -20°C aufbewahrt. Nach Auftauen wurde 10 Minuten mit 17 000× g zentrifugiert. Der Rückstand wurde verworfen und der Überstand auf 4% Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12000×g zentrifugiert und der Niederschlag in 5 ml 0,5 M NaHCO₃ aufgelöst.

C. Gelfiltration

Die erhaltene konzentrierte Interferon-Lösung wurde mit 1,5 g Harnstoff versetzt und auf eine Säule von Sepha­ dex G-100 fein (2,6 × 90 cm), voräquilibriert mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetatpuffer, aufgebracht. Die Säule wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflußrate von 0,5 ml/Min. mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetat, pH 7,5, eluiert. Es wurden Fraktionen von 12,5 ml gesam­ melt. Interferon-Aktivität wurde in den Fraktionen 19-23 eluiert.

D. HPLC

Die vereinigten Fraktionen 19-23 von der Sephadex G-100-Säule wurden direkt über die Pumpe auf eine Lichro­ sorb RP-8-Säule (10 µ, 4,6 × 250 mm) gegeben. Die Säule wurde voräquilibriert mit einem 1 M Natriumacetatpuffer (pH 7,5), der 0,01% (v/v) Thiodiglycol enthielt, und mit einem linearen Gradienten von n-Propanol in dem glei­ chen Puffer [1 Stunde, 0-20%; 3 Stunden, 20-40% (v/v)] bei einer Durchflußrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen von 0,75 ml gesammelt. Das Inter­ feron wurde in den Fraktionen 23-40 [25-30% (v/v) n-Propanol] eluiert.

Die Fraktionen 27-33, die den größten Anteil der Interferon-Aktivität enthielten, wurden kombiniert, mit n-Propanol bis zu einer Endkonzentration von 80% (v/v) versetzt und direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb-Diol-Säule (10 µ, 4,6 × 250 mm) gegeben, die voräquilibriert wurde mit einer Lösung von 0,1 M Natrium­ acetat mit einem Gehalt von 80% (v/v) n-Propanol. Die Säule wurde dann während 4 Stunden mit einem linearen Gradienten von 72-50% (v/v) n-Propanol in 0,1 M Na­ triumacetat bei einer Durchflußrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,75 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in Form von drei deutlichen Hauptpeaks, die quantitativ von Präparat zu Präparat vari­ ierten, eluiert. Diese Peaks wurden in der Reihenfolge ihrer Elution α, β und γ genannt. Die α-Fraktion wurde bei einer Konzentration von 68% n-Propanol eluiert, die β-Fraktion bei einer Konzentration von 66,5% n-Pro­ panol und die γ-Fraktion bei einer Konzentration von 65,5% n-Propanol. Die gesamte Ausbeute an Interferon-Akti­ vität war größer als 80%.

Die zu jedem Peak gehörenden Fraktionen wurden ver­ einigt und in Folgestufen weitergereinigt. Da der Peak γ der bei weitem größte war und von anderen Komponen­ ten am besten getrennt zu sein schien, wurde er für die weitere Reinigung ausgesucht. Die Fraktionen 54-56 von der Diolsäule, die den Peak γ enthielten, wurden vereinigt und das n-Propanol wurde durch zwei Extraktionen mit glei­ chen Mengen Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Amei­ sensäure zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung wurde auf einer Lichrosorb RP-8-Säule (10 µ; 4,6 × 250 mm), voräquilibriert mit 1 M Pyridin und 2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgegeben. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen Gradienten von n-Propanol (20-40%) in 1 M Pyridin/Formiat-Puffer bei einer Durchflußrate von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Frak­ tionen zu 0,6 ml gesammelt. Der Hauptpeak der Aktivität stimmte überein mit einem Proteinpeak. Die Fraktionen 45 und 46 (32% (v/v) Propanol) die diesem Peak ent­ sprachen, wurden vereinigt und unter gleichen Bedingungen rechromatographiert. Interferon wurde in Fraktion 31 elu­ iert (32% (v/v) Propanol). Die spezifische Aktivität dieser Fraktion wurde mit 4 × 10⁸ Einheiten/mg berechnet verglichen mit Rinderserumalbumin. Dieses Material wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Fluoreszenzprofile der HPLC waren so gut reproduzierbar, daß sie einen ständigen Fingerprint des gesamten Verfahrens lieferten.

Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 zu­ sammengefaßt. Die gesamte Reinigung, ausgehend vom In­ kubationsmedium bis zur zweiten RP-8-Säule war 60 000- bis 80 000fach. Die kumulative Ausbeute von Stufe 1 bis zur Diolstufe lag bei 30-50%. Nach dieser Stufe wur­ de jeder der drei Interferon-Peaks separat weiter gerei­ nigt.

E. Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

Interferon-Proben (1,5 × 10⁵ Einheiten) wurden mit NaDodSO₄ und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde nach Färbung mit Coomassie-Blau eine einzige scharfe Bande erhalten. Das scheinbare Molekulargewicht wurde mit 17 500 (im Vergleich zu Standardproteinen) bestimmt. Das Gel wurde in Streifen von 1 mm geschnitten, jeder Streifen wurde in 0,4 ml 0,5 M NaHCO₃/0,1% NaDodSO₄ homogeni­ siert und auf Interferon-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein einziger Peak mit antiviraler Aktivität gefun­ den, der mit der einzigen Proteinbande übereinstimmte.

F. Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse des homogenen Human-Leukozy­ ten-Interferons (Peak γ) wurde mit dem Fluorescamin-Amino­ säure-Analysator an 0,5 bis 1 µg Proben von nativem und S-carboxymethyliertem Interferon durchgeführt. Zur Be­ stimmung des Cystein/Cystin-Verhältnisses wurde natives Interferon carboxymethyliert und dann in 6 M HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1% Thioglycolsäure) hy­ drolysiert. Unter diesen Bedingungen wird Cystein als S-Carboxymethylcystein und Cystin als freies Cystein ge­ messen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabel­ le 2 zusammengefaßt. Die spezifische Aktivität, berechnet auf den Aminosäuregehalt, wurde mit 2-4 × 10⁸ Einheiten/mg bestimmt.

Tabelle 2

Aminosäurezusammensetzung von Human-Leukozyten-Interferon

Beispiel 2 Homogenes Human-Leukozyten-Interferon aus Leukozyten von leukämischen Patienten

Das Interferon wurde erhalten durch Inkubation von Human-Leukozyten, isoliert aus dem Blut von leukämischen Patienten (chronische myelogene Leukämie, CML) durch Leuko­ phoresis mit Newcastle-Krankheit-Virus in einem serumfreien, caseinhaltigen Medium. Die Interferon-Titer lagen bei 5000-40 000 Einheiten/ml.

Das Reinigungsverfahren war das gleiche wie das in Beispiel 1 beschriebene für Interferon aus Blut von nor­ malen Spendern und umfaßte die selektive Präzipitation durch 0,5 M Essigsäure in Gegenwart von Triton X-100, Gelfiltration an Sephadex G-100 in 4 M Harnstoff, HPLC bei pH 7,5 an Lichrosorb RP-8, HPLC an Lichrosorb-Diol und HPLC an Lichrosorb RP-8 bei pH 4,0.

Die Fraktionen, die den α-, β- und γ-Peaks der Lichro­ sorb-Diolsäule entsprachen, wurden zusammengefaßt und dann getrennt voneinander in weiteren Schritten gerei­ nigt.

Aus den vereinigten Fraktionen 43-46 (α-Peak) wurde n-Propanol durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen n-Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisen­ säure bis zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 µ, 4,6 × 250 mm), die voräquilibriert war mit 1 M Pyridin/2 M Amei­ sensäure (pH 4,0), aufgebracht. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen n-Propanol-Gradienten (20- 40%, v/v) in 1 M Pyridinformiat-Puffer bei einer Durch­ flußgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivi­ tät wurde in breiten Peaks bei Konzentrationen zwischen 31 und 35% (v/v) n-Propanol eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert und unter gleichen Bedingungen rechroma­ tographiert. Die Interferon-Aktivität, wurde in zwei Haupt­ peaks (α₁ und α₂) bei 31 und 32% (v/v) n-Propanol eluiert. Untergeordnete Komponenten wurden bei einer Kon­ zentration von 34% (v/v) n-Propanol eluiert.

Die vereinigten Fraktionen 47-50 (Peak β) der Lichro­ sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbei­ tet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak α beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks eluiert: β₂ bei 32% (v/v) n-Propanol und β₃ bei 34% (v/v) n-Propanol. Rechromato­ graphie war in diesem Falle nicht nötig. In einigen Prä­ paraten konnte ein Peak β₁ bei 31% (v/v) n-Propanol festgestellt werden.

Die vereinigten Fraktionen 52-54 (Peak γ) der Lichro­ sorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbei­ tet und an Lichrosorb RP-8 chromatographiert wie sie für den Peak α beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in fünf Hauptpeaks eluiert: γ₁ (bei 31% n-Pro­ panol, v/v), γ₂ (bei 32% n-Propanol, v/v), γ₃ (bei 34% n-Propanol, v/v), γ₄ (bei 35% n-Propanol, v/v) und γ₅ (bei 35,5% n-Propanol, v/v). Rechromatographie war in diesem Fall nicht notwendig.

Die Ergebnisse der Reinigung zur Herstellung der einzel­ nen Interferon-Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Die Spezies α₂ und β₂ können ferner unterschieden werden durch ihre Elutionscharakteristiken an Lichrosorb- Diol: α₂ wird eluiert mit 68%igem (v/v) n-Propanol und β mit 66,5%igem (v/v) n-Propanol.

Proben der Interferon-Spezies (1,5 × 10⁵ Einheiten) wurden mit NaDodSO₄ und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach Elektrophorese lieferten die Peaks α₁, α₂, β₂, γ₁, γ₂ und γ₄ jeweils eine einzige Bande, während die Peaks β₃, γ₃ und γ₅ jeweils zwei Banden lieferten. Die scheinbaren Molekulargewichte lagen zwischen 16 000 und 18 000 mit Ausnahme von β₃, das eine Bande bei 16 500 und eine bei 21 000 aufwies und γ₄, das eine Bande bei 21 000 lieferte (siehe Tabelle 4).

Die Aminosäureanalyse der gereinigten Human-Leuko­ zyten-Interferon-Fraktionen wurde mit einem Fluoresca­ min-Aminosäure-Analysator an 0,1-1 µg Proben durchgeführt. Die Hydrolyse wurde in 6N HCl unter reduzierenden Bedin­ gungen (0,1% Thioglycolsäure) durchgeführt. Die Ergeb­ nisse der Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.

Trypsin-Spaltung und HPLC der Fragmente

Jeweils 300 pMol der gereinigten Human-Leukozyten- Interferon-Spezies wurden in wäßrigem Natriumbicarbonat (50 mMol, pH 8, 50 µl) gelöst. Nach Zusatz von jeweils 0,1 µg Trypsin in 2 µl HCl (pH 3) wurde 14 Stunden bei 37°C inkubiert, mit 5 µl Essigsäure versetzt und das Gemisch auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (Teilchengröße 10 µ; 4,6 × 250 mm) aufgebracht. Die Säule wurde während einer Stunde mit einem linearen Gradienten von 0-40% (v/v) n-Propanol in einem 0,1 M Ameisensäure/0,03 M Pyridin-Puffer (pH 3) bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/min eluiert.

Die Fragmente wurden nach der Fluorescamin-Methode nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammen­ gefaßt, wobei die Position der Peaks als % n-Propanol und die relative Größe der Fragmente angegeben sind (S = klein; M = mittelgroß; L = groß):

Tryptische Peptide der Human-Leukozyten-Interferone
Spezies
Elution bei % n-Propanol
α₁
3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 20S, 21S, 22,5S, 29M
α₂	3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 27S, 29M
β₂	3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S, 18M, 29M
β₃	3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M
γ₁	3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5M, 18M, 29M
γ₂	3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S, 16S, 18L, 29M
γ₃	3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M, 16S, 18L, 20S, 32M
γ₅	3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S

Die gereinigten Human-Leukozyten-Interferon-Spezies wurden einer Aminozuckeranalyse unterworfen mit der Amino­ zucker im Bereich von 50-100 pMol festgestellt werden können. In allen Fällen wurde weniger als ein Rest Glucos­ amin, Galactosamin bzw. Mannosamin pro Molekül gefunden. In den meisten Fällen interferierte eine Anzahl kleiner Peptide, die in der Nähe der Aminozucker eluiert wurden, mit der Analyse. Es ist daher möglich, daß die den Ami­ nozuckern zugeordneten Peaks teilweise oder sogar ganz Peptiden zuzuordnen sind.

Schließlich lieferte ein Versuch, 1 nMol reines γ₂ Interferon durch einen manuellen Edman-Abbau, der Rückhy­ drolyse und Aminosäureanalyse unter Verwendung von Fluor­ escamin beinhaltet, zu sequenzieren, keine Aminosäuren in den ersten beiden Zyklen. Die Behandlung von 100 pMol reinem γ₂ Human-Leukozyten-Interferon mit Leucinamino­ peptidase und Aminopeptidase M während 20 Stunden bei 37°C beeinflußte die biologische Aktivität nicht; im Inkubationsmedium konnten keine Aminosäuren festgestellt werden. Durch Behandlung des Überstandes eines Induk­ tionsmediums (Leukozyten und Newcastle-Krankheit-Virus in Minimalmedium) mit Aminopeptidase M konnte ein Verlust an Interferon-Aktivität nicht beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, daß das Interferon-Molekül bereits vor dem Reinigungsverfahren eine blockierte aminoendstän­ dige Aminosäure enthält. Zur Kontrolle wurden rohes In­ terferon, reines Interferon und die β-Kette von Insulin gemeinsam mit Aminopeptidase M inkubiert. Während Insu­ lin teilweise abgebaut wurde (Aminosäuren nachweisbar) trat kein Verlust an Interferon-Aktivität auf.

Beispiel 3

• (a) 3 mg homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit einer spezifischen Aktivität von 2 × 10⁸ Einheiten/mg wurde in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter fil­ triert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 × 10⁶ Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Am­ pullen werden bis zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei -20°C) aufbewahrt.
• (b) Eine wäßrige Lösung, enthaltend 1,5 mg der vereinig­ ten homogenen Human-Leukozyten-Interferon-Spezies α₁, α₂, β₂, γ₁ und γ₂ (jedes etwa im Verhältnis zu seiner natürlichen Häufigkeit), mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 × 10⁸ Einheiten/mg, und 100 mg normales Human-Serumalbumin, wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die Lösung aseptisch auf 100 Ampullen gleichmäßig verteilt. Jede Ampulle enthält etwa 3 × 10⁶ Einheiten reines Human-Leukozyten-Interferon und 1 mg Serumalbumin. Die Ampullen, die für parenterale Applikation geeignetes Interferon enthalten, werden zweckmäßigerweise kühl (-20°C) gelagert.

Claims (1)

1. Pharmazeutische Präparate enthaltend mindestens ein nicht durch Perjodat oxidiertes Human-Leukozyten-Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß es in homogener Form vorliegt, frei von Natriumdodecylsulfat ist und eine spezifische Aktivität von 0,9×10⁸-4×10⁸ Einheiten/mg an der Rinder-Zell-Linie MDBK aufweist.