DE3149360C2 - - Google Patents

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DE3149360C2
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Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Reinigung und/oder Phytohaemagglutinin-Abtrennung von Human-Interleukin-2. Die Ansprüche 2 bis 4 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens. Anspruch 5 betrifft die Verwendung des nach den Ansprüchen 1 bis 4 erhaltenen Produkts. Interleukin-2, abgekürzt IL-2, früher als T-Zell-Wuchs- Faktor, abgekürzt TCGF, bezeichnet, ein Lymphokin-Protein- Molekül, synthetisiert durch von Antigen oder Mitogen stimulierten Lymphozyten, nimmt eine zentrale Stellung innerhalb der zellulären Immunabwehr ein. Ihm wird die klonale Vermehrung von vorher durch Antigen oder Mitogen aktivierten Lymphozyten zugeschrieben.
In Fig. 1 wird ein Modell der T-Zell-Aktivierung dargestellt.
Interleukin-2 (TCGF) wird danach von TCGF-Produzenten (T-Zell-Subpopulation) gebildet. Der Faktor wirkt dann auf sogenannte TCGF-Responder, die nach Antigen oder Lektin-Stimulation TCGF-Rezeptoren gebildet haben. Diese cytotoxischen Helfer- oder Suppressor T-Zellen können sich nun nur in Gegenwart von TCGF beliebig vermehren.
Für eine in-vitro-Vermehrung (Klonierung) sowie in vivo tierexperimentellen oder klinischen Studien und Kultivierung dieser cytotoxischen Helfer- oder Suppressor T-Zellen ist ein Interleukin-2 erforderlich, das praktisch frei von Phytohaemagglutinin (PHA) ist.
Es wird vermutet, daß zahlreiche Störungen in der Immunabwehr (immunologische Krankheiten) auf das Fehler von Interleukin-2 Produzenten bzw. einer zu geringen IL-2-Produktion oder auf das nicht oder zu wenig Ausbilden von IL-2-Rezeptoren zurückzuführen sind und in vielen Fällen durch Verabreichung von Interleukin-2 verbessert werden könnten.
Zur Diagnostizierung derartiger Zustände ist es erforderlich, monoklonale Antikörper gegen Interleukin-2 herzustellen, um damit ein Diagnose-Kit auf Radioimmun-Assy oder Enzym- Immuno-Sorbent-Assay Basis aufzubauen.
Neuere Untersuchungen haben ferner gezeigt, daß die Interleukin-2-Bildung mit zunehmendem Alter stark abnimmt. Mit Interleukin-2 wäre ein therapeutisches Mittel an die Hand gegeben, durch das Krankheiten, die durch gestörte Interleukin-2-Produktion verursacht werden, geheilt oder gelindert werden könnten.
Es wurde ferner nachgewiesen, daß einige Tumorzellen Oberflächenantigene besitzen, die eine Immunstimulierung von T-Zellen in vitro hervorrufen können. Eine potentielle Verwendung von Interleukin-2 würde Mengen von spezifischen cytotoxischen T- Zellen erzeugen. Das Vermischen von malignen Zellen mit antologen normalen Lymphozyten wird zur Aktivierung der normalen T-Zellen führen. Diese ihrerseits könnten in Kultur mit Interleukin-2 vermehrt werden und einige dieser T-Zellen könnten cytotoxische T-Zellen sein. Die cytotoxischen T-Zellen könnten dann verwendet werden, um die Tumorzellen in vivo zu töten. Mit Interleukin-2 wäre somit ein Krebstherapeutikum an die Hand gegeben.
Für alle diese letztgenannten Zwecke ist ein sehr reines Interleukin-2 erforderlich, das außer von PHA auch frei von anderen Verunreinigungen sein muß.
Die Gewinnung von rohem Human-Interleukin-2 wird in
  • 1. Ruscetti FW, Gallo RC: Regulation of the production and release of human T cell growth factor, J. Supramol Biol. 13: 1980;
  • 2. Bonnard GD, Yakasa K. Maca RD: Continued growth of functional human T. lymphocyts: Production of human T cell growth factor. Cell Immunol 51: 390-410, 1980;
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  • 4. Ruscetti FW, Gallo RC: Human T Lymphozyte Growth Factor: Regulation of Growth an Function of T Lymphocyts, Blood 57: 379 (1981) und
  • 5. Lindsay P., Schwulera U. und Sonneborn H. H., The Species Specificity of Interleukin-2, 3. internationaler Lymphokin- Kongress, 14.-17. Oktober 1981, Dallas, Texas,
beschrieben.
Dieses Rohprodukt enthält jedoch eine Anzahl von Substanzen, die entweder inhibierende oder stimulierende Wirkung auf das Zellwachstum ausüben, wie beispielsweise
Phytohaemagglutinin (PHA), andere mitogene Faktoren,
Interferon,
und andere noch nicht näher charakterisierte Faktoren.
Die mitogene Wirkung von PHA z. B. stört viele biologische Testsysteme, weil der zu untersuchende Effekt von Interleukin-2 mit der mitogenen Wirkung von PHA interferriert und nicht entschieden werden kann, auf was ein Effekt zurückzuführen ist. Die Abtrennung von PHA ist ein schwieriges, biochemisches Problem, weil PHA kein einheitliches Molekül ist, sondern aus 5 verschiedenen Molekülen besteht mit Molekulargewichten zwischen 33 000-128 000 Dalton (vgl. Monsigny M., Roche A. C. und Kieda C.: "Lectins as tools to study cell surface membranes", Pharmaindustrie (L′Industrie Biologique Francaise), (1978).
Bisher wurden in der Literatur zahlreiche Reinigungsverfahren, jedoch vorwiegend für Interleukin-2 von verschiedenen Tier- Spezies, beschrieben wie beispielsweise:
Ammoniumsulfat-Fällung
Gelfiltration
DEAE-Anionen-Austauscher-Chromatographie
CM bzw. SP-Kation-Austauscher-Chromatographie
hydrophobe Chromatographie
Präparative Polyacrylamid-Gel-Eltrophorese
Präparative Iso-Elektro-Fokussierung
(vgl. 6. Mier J. W. und Gallo R. C.: "Purification and some characteristics of human T-cell growth factor from phytohemagglutinin- stimulated lymphocyte-conditioned media", Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 6134 (1980) und 4.).
Dieses Human-Interleukin-2 läßt sich nicht mit einem Reinigungsschritt isolieren; es sind mehrere Reinigungsschritte nötig, die mehr oder weniger effektiv sind und oft das Protein teilweise denaturieren. Dies liegt z. T. an den Eigenschaften von Interleukin-2. Interleukin-2 (human) ist ein kleines Molekül, hat ein Molekulargewicht von 17 000 Dalton und ist negativ geladen. Es ist leicht hydrophob und scheint sich an Plastik-Glas-Dialyseschlauchwänden anzulagern, oder mit sich selbst zu aggregieren. Starke Verluste treten auf beim Sterilfiltrieren, und auch das Dialysieren ist nur unter bestimmten Umständen möglich. Die Proteinkonzentration ist sehr niedrig, es verhält sich wie ein Hormon, und ist in ng-Mengen noch hoch wirksam im Testsystem. Je reiner das Produkt ist, desto instabiler wird es; deshalb muß bei jedem Reinigungsschritt das Molekül stabilisiert werden.
Von den oben beschriebenen Verfahren sind die ersten beiden unter bestimmten Bedingungen protein-schonend; beide hintereinander geschaltet führen jedoch noch nicht zu einem reinen Produkt.
Alle anderen Reinigungsverfahren, die bisher beschrieben wurden, sind stark protein-denaturierend. Es werden oft 50 bis 95% an Enzymaktivität bei einem einzigen Schritt verloren.
In 6., S. 6137 wird folgendes Verfahren zur Reinigung von Human-Interleukin-2 beschrieben.
Ein auf diese Weise gereinigtes Produkt ist jedoch stark inaktiviert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein proteinschonendes Reinigungsverfahren für Human-Interleukin-2 bereitzustellen, unter Erzielung eines PHA-freien bzw. sehr reinen, aktiven und stabilen Produktes.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Interleukin-2 Rohextrakt in einer einzigen oder einer zusätzlichen von mehreren Reinigungsstufen einer gruppenselektiven Farbligand- Adsorptionschromatographie unter Verwendung eines Matrix Gel-Mediums, bestehend aus einem an ein Matrix-Gel gebundenen blauen Farbliganden Blue A oder einer Variante desselben oder grünen Farbliganden Green A in einer Konzentration von etwa 1,5 bis 3,0 mg/ml gequollene Matrix unterwirft, bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 8,5, einer Temperatur von etwa 4 bis 40°C, einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 10 bis 100 ml/Std. und unter Verwendung eines Elutionsmittels.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Erzielung eines PHA-freien Interleukin-2 Produktes und/oder eines sehr reinen Interleukin-2-Produktes, mit dem man einen diagnostischen Test-Set, z. B. über monoklonale Antikörper auf RIA oder EIA-Bases aufbauen kann.
Zwar wurde die Farb-Ligand-Chromatographie mit den Farbliganden Blue A und Green A schon für die Reinigung einer Reihe von Enzymen und anderen Proteinen eingesetzt, jedoch bedurfte es bei der Vielzahl an möglichen Reinigungsmethoden intensiver Suche, um diejenige zu finden, die im Gegensatz zu den bisher bekannten Methoden die optimalen Bedingungen für die Human-Interleukin- 2-Reinigung liefert.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß bei allen Schritten nur ein geringer Proteinverlust auftritt, die Ausbeute also recht hoch ist. Andere Verfahren wie z. B. die DEAE-Chromatographie oder ide Iso-elektro-Fokussierung dagegen sind sehr ineffektive Reinigungsverfahren für Interleukin- 2. Die Farb-Liganden-Chromatographie kann auch als erster oder zweiter Reinigungsschritt durchgeführt werden, ohne daß eine Stabilisierung von Interleukin-2 nötig wäre, weil gleichzeitig sich an die Säule bindendes Humanalbumin den Faktor stabilisiert. Setzt man die Säule als drittes Reinigungsverfahren ein, sind allerdings Stabilisierungsbedingungen nötig.
Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kann als ein an beliebiger Stelle einsetzbarer Reinigungsschritt im Laufe einer Interleukin-2-Reinigungskette angewandt werden, beispielsweise im Anschluß an eine Ammoniumsulfatfällung als erste und eine Gelfiltration als zweite Reinigungsstufe.
Es kann jedoch auch als einziger bzw. zusätzlicher Reinigungsschritt angewandt werden, um Phytohaemagglutinin abzutrennen. Wie bereits vorstehend ausgeführt ist Phytohaemagglutinin außerordenlich schwierig abzutrennen. Alle bisher beschriebenen Verfahren trennen nur einen Teil ab. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt jedoch eine 98 bis 100%ige Entfernung der für viele immunologischen Experimente so störenden Phytohaemagglutine in einer einzigen Stufe.
Bei Anwendung als zusätzlicher Reinigungsschritt kann beispielsweise die Ammoniumsulfat-Fällung als weiterer Schritt angewandt werden.
Weiterhin ist für die Stabilisierung des bei der Reinigung sehr labil werdenden Interleukin-2 entscheidend, daß, wie bereits vorstehend erwähnt, an die Farbligand-Säule gleichzeitig auch Humanalbumin gebunden werden kann, was zu einer Stabilisierung während der Bindung an die Matrix und während der Elution führt. Dies ist von entscheidender Bedeutung bei der Herstellung eines Phytohaemagglutin-freien Interleukin-2 Präparates.
Der blaue Farbligand Blue A besitzt folgende Formel
Er ist über eine Ether-Bindung an den Triazin-Ring an ein Matrix-Gel wie folgt gebunden.
Eine ausführliche Beschreibung des Blue A-Liganden, seiner Varianten, des Green A-Liganden und der Matrix-Gele wird in 7. "Dy Ligand-Chromatography" by Amicon Corp. Publication 512 A (1980) gegeben.
Als Matrix-Gel eignen sich beispielsweise Agarose oder Sepharose, vorzugsweise vernetzte Agarose.
Die Konzentration des Farbliganden beträgt etwa 1,5 bis 3,0 mg/ml gequollene Matrix, vorzugsweise 1,58 mg/ml.
Die Stärke der Bindung von Interleukin-2 an den Liganden kann durch Variation folgender Parameter innerhalb der beanspruchten oder als zweckmäßig erachteten Bereiche verstärkt oder abgeschwächt werden:
pH-Wert
Ionenstärke
Temperatur
Proben-Volumen
Säulen-Dimension und
Durchflußgeschwindigkeit.
Der pH-Wert beträgt 6,8 bis 8,5 (im leicht sauren Milieu ist die Bindung von IL-2 an die Matrix stärker).
Als Elutionsmittel kann praktisch jedes für diesen Zweck geeignete Salz verwendet werden. Beispiele hierfür sind NaCl, KCl und andere Salze.
Man arbeitet bei einer Ionenstärke von 0,01 bis 2 M.
Die Arbeitstemperatur beträgt etwa 4 bis 40°C.
In Abhängigkeit von der Säulendimension und der verfügbaren Menge an Rohprodukt kann das Probenvolumen etwa 0,1 ml bis mehrere Liter betragen. Die Methode kann auch im Batch-Verfahren durchgeführt werden.
Die Säulendimension kann von 1 ml (0,5 × 2 cm) bis 500 ml oder darüber betragen bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 bis 100 ml/h.
Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 (Gewinnung von rohem Human-Interleukin-2)
Human Vollblut wurde in Gegenwart von OPG-Citrat 1 Stunde lang bei 37°C bei 1 × g sedimentiert. Plasma und Buffy coat wurden gesammelt und zentrifugiert. Das Sediment wurde resuspendiert, auf Ficoll-Hypane überschichtet und 20 Minuten lang bei 1500 × g 20 Min. zentrifugiert. Die in der Zwischenschicht sich befindlichen mononuklearen Zellen wurden 2 mal im Medium durch Zentrifugieren bei 250 × g gewaschen. Gepoolte Zellen von 3 Spendern erhielten bei einer Zellkonzentration von 10⁶/ml eine allogene und eine mitogene (1% PHA-M) Stimulation und wurden 48 Stunden in RPMI-1640, das zusätzlich 25 mmol Hepes-Puffer, L-Gutamin, Antibiotika und 1% inaktiviertes gepooltes Humanserum enthielt, kultiviert. Die das Interleukin-2 enthaltenden Überstände wurden durch Zentrifugieren geerntet, sterilfiltriert und bei -20°C gelagert.
Beispiel 2 (1stufiges Reinigungsverfahren)
Eine DyematrexTM-Blue A®-Säule (Konzentration 1,58 mg Blue A-Farbligand/ml gequollene Agarose) mit einem Säulenvolumen von 2 ml wurde mit dem 5fachen Säulenvolumen 8 M Harnstoff in 0,5 M NaCl regeneriert.
Danach wurde sie mit dem 10fachen Säulenvolumen 20 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,5 und durch anschließendes Waschen mit dem 10fachen Säulenvolumen RPMI 1640 (synthetisches Medium mit Salzen, Puffersubstanzen, Aminosäuren, Vitaminen und Wachsstoffen + L- Glutamin für die Zellkultur äquilibriert. Anschließend wurde eine 2 ml Probe des gemäß Beispiel 1 gewonnenen Interleukin-2 mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 10 ml/h aufgetragen. Nach Eindringen der Probe und 30minütigem Warten wurde die Säule mit dem 5fachen Säulenvolumen 20 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,5 gewaschen. Anschließend erfolgte die Elution mit 10 ml 1,5 M NaCl. Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.
Das dabei erhaltene Produkt bestand zu einem hohen Prozentsatz aus Interleukin-2 mit geringen Verunreinigungen + Albumin + γ-Interferon, und es war kein PHA mehr nachweisbar im Eluat.
Der Verlauf der vorstehend beschriebenen Chromatographie wird in Fig. 2 gezeigt.
Nach erfolgter Chromatographie wurde die Säule bei 4°C in Gegenwart von 0,2% NaN₃ gelagert.
Beispiel 3 (2stufiges Reinigungsverfahren)
1. Stufe Ammoniumsulfat-Fällung
2. Stufe Blue A
Zu 100 ml Rohextrakt wurden bei 4°C 32,6 g (55% Sättigung) festes (NH₄)₂SO₄ langsam unter Rühren zugegeben. Dann wurde 2 h lang auf dem Magnetrührer weiter gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat durch eine 20minütige Zentrifugation bei 4°C bei 50 000 × g entfernt und verworfen. Es enthielt vorwiegend hochmolekulare Proteine und PHA.
Dann wurde erneut festes (NH₄)₂SO₄ bis zu einer Sättigung von 90% zugegeben, 2 h bei 4°C gefällt und der Niederschlag 20 Min. bei 50 000 × g abgeschleudert in 10 ml Puffer folgender Zusammensetzung aufgenommen:
0,01 M Na/K Phosphat pH 7,4
0,15 M NaCl
Die hohe (NH₄)₂SO₄-Konzentration wurde durch eine 2-3stündige Diafiltration entfernt unter Verwendung einer PM10-Membrane. Dann wurde die in Beispiel 2 beschriebene Blue A- Chromatographie durchgeführt. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Anstelle einer 2 bis 3stündigen Diafiltration kann mit gleichem Erfolg eine Dialyse über Nacht angewandt werden.
Beispiel 4 (3stufiges Reinigungsverfahren)
1. Stufe Ammoniumsulfat-Fällung (wie in Beispiel 3)
2. Stufe Gelfiltration
3. Stufe Blue A (wie in Beispiel 2)
Die 1. Stufe erfolgte gemäß Stufe 1 in Beispiel 3, jedoch ohne Diafiltration.
2. Stufe Gelfiltration
Eine Säule (2,5 × 100 cm) wurde mit Sephadex G75 gefüllt und mit folgendem Puffer äquilibriert:
0,01 M Na/K-Phosphat pH 7,4
0,15 M NaCl
0,01% PEG 6000 (Stabilisator)
Nach der Eichung der Säule mit Standardproteinen wurden 10 ml der in Stufe 1 hergestellten Lösung auf die Säule aufgetragen. Große Serumproteine wie z. B. Albumin wurden dabei abgetrennt. Das Elutionsprofil ist aus Fig. 3 ersichtlich.
Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 25 m/h. Die Fraktionsgröße 3 ml.
3. Stufe Blue A-Chromatographie
Als Abweichung gegenüber Beispiel 3 wurde jetzt zu dem Puffer noch Stabilisator zugesetzt:
0,01% PEG 6000
Bei diesem Schritt wurden Proteine mit gleichem Molekulargewicht wie Interleukin-2, die aber nicht an die Blue A- Säule binden, abgetrennt.
Vergleichsbeispiel 5 (Inaktivität geltend machend)
Alle in der folgenden Tabelle aufgeführten und publizierten Verfahren wurden, ausgehend von Rohextrakt, auf ihre Verwendung zur Reinigung von human-Interleukin-2 getestet. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Methode
Ausbeuteverlust an IL-2
Blue A|5-10%
(NH₄)₂SO₄ 5-10%
Gelfiltration 10-20%
hydrophobe Chromatographie 40-50%
Präparative Gel-Elektrophorese (mit oder ohne Detergens) 50-60%
DEAE-Anionenaustausch-Chromatographie 90-95%
CM-Kationenaustausch-Chromatographie 90-95%
Präparative Isoelektrofokussierung 90-95%
Hydroxyl-Apatit Chromatographie 80-90%
Die vorstehend genannte Literaturstelle 6. wurde nachgearbeitet und die Ergebnisse sind in Tabellenform zusammengefaßt:
Ausbeute an IL-2
Rohextrakt|100%
(NH₄)₂SO₄ 90-95%
DEAE 1-5%
Gelfiltration <0,1%
Gel-Elektrophorese <0,01%

Claims (5)

1. Verfahren zur Reinigung und/oder Phytohaemagglutinin- Abtrennung von Interleukin-2, dadurch gekennzeichnet, daß man Interleukin-2-Rohextrakt in einer einzigen oder einer zusätzlichen von mehreren Reinigungsstufen einer gruppenselektiven Farbligand-Adsorptionschromatographie unter Verwendung eines Matrix Gel-Mediums, bestehend aus einem an ein Matrix-Gel gebundenen blauen Farbliganden Blue A oder einer Variante desselben oder grünen Farbliganden Green A in einer Konzentration von 1,5 bis 3,0 mg/ml gequollene Matrix, unterwirft, bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,5, einer Temperatur von 4 bis 40°C, einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 bis 100 ml/Std. und unter Verwendung eines Elutionsmittels.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Matrix 5%ige Agarose verwendet.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel NaCl oder KCl verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigungsstufe nach vorangegangener fraktionierter Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration anwendet.
5. Verwendung des nach den Ansprüchen 1 bis 4 erhaltenen Produktes zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern.
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