DE1617332C3 - Verfahren zum Isolieren eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiphlogistischer Wirkung - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Isolieren eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiphlogistischer Wirkung aus natürlichen Proteinrohstoffen. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß

a) das Ausgangsmaterial bei einem pH-Wert von 1,0—11,0 mit einer wäßrigen Lösung, die ein zweiwertiges Metallion mit einem Ionenradius von 0,6—1,0 A, vorzugsweise 0,65—0,80 Ä insbesondere Mn und gegebenenfalls einen Puffer enthält, versetzt wird,

b) das erhaltene Protein-Metall-Chelat durch eine Anzahl beliebig aneinandergereihter, für die Proteinfraktionierung bekannter Schritte gereinigt wird, wobei

c) eine Abtrennung der thermolabilen Proteine durch kurzfristiges Erhitzen bis auf 75° C erfolgt und

d) die Fraktionen gesammelt werden, die bei der Gelscheibenelektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wandern und das für das gewünschte Protein-Metall-Chelat charakteristische Multibandmuster zeigen, worauf

e) aus diesen gesammelten Fraktionen ein Chelat erhalten wird, das 0,1 bis 1,0% Metall aufweist und in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co ίο oder Cu, insbesondere Mg, gebildet ist. Gemäß

einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so vorgegangen, daß in den Verfahrensstufen a), b), d) und e) bei Temperaturen unterhalb 5⁰C gearbeitet wird und die Verfahrensstufe c) ein Erhitzen auf 65° C für die Dauer von 5 min bzw. ein Erhitzen auf 5O⁰C für die Dauer von 10 min umfaßt.

Die meisten eiweißhaltigen Naturstoffe enthalten ein Protein-Metall-Chelat, welches das unter den Bedingungen des Verfahrensschrittes d) charakteristische Multibandmuster zeigen. Die Mengen dieses Proteins sind üblicherweise sehr gering und von der Jahreszeit und bei Tieren der Ernährung abhängig. Dieses Protein hat mit Ionen der unter e) genannten zweiwertigen Metalle chelatisiert hervorragende antiinflammatorische und antiphlogistische Wirkung, ohne die Nebenwirkungen bekannter antiinflammatorisch und antiphlogistisch wirkender Substanzen aufzuweisen. Dieses Protein, welches den Globulinen zuzuzählen ist, läßt sich mit einer Reihe von beliebig aneinandergereihten für die Proteinfraktionierung bekannten Schritten reinigen, wobei vor allem eine Abtrennung der thermolabilen Proteine durch kurzfristiges Erhitzen bis auf höchstens 75⁰C den Effekt hat, daß die die antiphlogistische Wirkung beeinträchtigenden Begleitstoffe weitgehend zerstört werden. Die für die Fraktionierung und Reinigung in Frage kommenden bekannten Schritte, wie beispielsweise Gel-Elektrophorese, Chromatographie etc., können in sinnvoller Weise dadurch effektiver gestaltet werden, daß diesen Verfahren über ein Molekularsieb bereits eine Proteinfraktion zugeführt wird, welche in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch fraktioniertes Fällen mittels Salzen und/oder Lösungsmitteln, von der Hauptmenge der das erfindungsgemäß zu isolierende Protein begleitenden Proteine befreit worden ist, um die bei der Gel-Elektrophorese bzw. beim Chromatographieren aufzuarbeitende Substanzmenge möglichst gering zu halten und damit eine schärfere Auflösung der Banden (Fraktionen) so erzielen zu können. Zwecks Isolierens des bei der Gelscheiben-Elektrophorese mit typischer Geschwindigkeit relativ zu anderen Proteinen wandernden Protein-Metall-Chelats ist es jedoch nicht unbedingt erforderlich, eine Gel-Elektrophorese vorzunehmen oder zu chromatographieren, sondern es können auch, wenn auch in weniger vorteilhafter Weise, andere für das Fraktionieren von Proteinen an sich bekannte Fraktionierschritte aneinandergereiht werden, wobei es lediglich erforderlich ist, beim Aufsuchen neuer bo Kombinationen an sich bekannter Methoden bzw. beim Aufsuchen neuer Wege den Gehalt der erhaltenen Fraktionen an dem bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander t>5 liegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wandernden Protein-Metall-Chelat mittels Gelscheiben-Elektrophorese zu überprüfen; sobald mittels des Orientierungshilfsmittels »Gel-

scheiben-Elektrophorese« irgendeine Kombination von Fraktionierschritten als brauchbar erkannt worden ist, kann diese Kombination von Fraktionierschritten ohne weitere Kontrolle durch Gelscheiben-Elektrophorese, stets die gleiche Proteinquelle vorausgesetzt, routinemäßig wiederholt werden.

Die Struktur des erfindungsgemäß in Form eines Metallchelats isolierbaren Proteins ist, ebenso wie für die weitaus meisten Proteine, nicht geklärt. Die bisherigen Untersuchungen ermöglichen es, das Molekulargewicht und das Aminosäureprofil des Proteins innerhalb ziemlich weiter Toleranzen (±10%) anzugeben, jedoch ist die für die Kennzeichnung der Struktur eines Proteins zumindest erforderliche Aminosäurensequenz unbekannt. Im folgenden werden die bisher vorliegenden Ergebnisse der Strukturuntersuchung des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins angegeben.

Die durchschnittliche Elementaranalyse des Protein-Metall-Chelats lautet: 50,02% C, 7,92% H, 25,55% O, 15,26% N, 0,43% S, 0,00% P, < 1% Asche. Der Stickstoffgehalt gemäß dieser Elementaranalyse liegt etwas niedriger als der typischer Proteine, was darauf hindeutet, daß im erfindungsgemäß isolierbaren Protein auch Nicht-Proteine enthalten sind. Diese Tatsache wird durch unter Verwendung eines Jod-Schiff-lndikators durchgeführte Gelscheiben-Elektrophorese bestätigt. Nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgeführte Prüfungen mit Zuckerreagentien weisen auf die Anwesenheit einer geringen Menge an Kohlenhydrat hin, welches wahrscheinlich covalent an das Protein gebunden ist.

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäß isolierbaren Protein-Metall-Chelats beträgt etwa 28 500 ±10%.

Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäß herstellbaren Protein-Metall-Chelats liegt etwa bei einem pH-Wert von 5,5 ±0,2. Je nachdem, von welcher

ίο Seite her man sich an den isoelektrischen Punkt heranbewegt, wird das Protein-Metall-Chelat bei pH-Werten von 4,0 bis 6,0 teilweise oder vollständig unlöslich, weshalb Lösungen dieses Chelats pH-Werte von 1,0 bis 4,0 oder 6,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,0 bis 8,0,

i") besitzen sollen, um durch Fällungserscheinungen eine Verringerung der Ausbeute zu vermeiden; ein pH-Wert unterhalb 1,0 bzw. ein pH-Wert oberhalb 11,0 soll vermieden werden, da dann die Gefahr einer Denaturierung des Protein-Metall-Chelats besteht.

2(i Das Infrarotspektrum des erfindungsgemäß isolierbaren Metall-Chelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestimmt, typisch für Proteine. In der unten stehenden Tabelle sind die Ultraviolettabsorptionssspektren dieses Proteins bei pH = 1,5 in 0,05 n-HCl, bei pH - 1,5 in

>■■> 0,05n-HCl + 0,10-m KCl bei pH = 7 in Wasser,; bei pH = 7 in 0,05-m Phosphatpuffer und bei pH = 13 in 0,15-m KCl, wobei der pH-Wert mit 1 n-KOH auf 13 eingestellt wurde, dargestellt. u ^

Ultraviolett-Absorptionsspektrum des neuen Protein-Metall Chelats

Optische	Dichte	V = 0,15	pH 7,0	pH 7,0	pH 13,0
nm	pH 1,5	0,434 mg/ml	H2O	Puller	KCl-KOII
	y='0,05 .	0,005	1,00 mg/ml [:	0,492 mg/ml	0,492 mg/ml
	0,560 mg/ml	::: 0,030 ;! ; "	0,035	0,00	0,126
310	0,066	0,066	0,090 ":lÄ:		0,280 ' '
300 '	0,102 i''y	0,129	0,184	0,13	0,353
295	0,145	0,190	0,372	0,18	0,430
290	0,236	0,204	0,510	0,25	0,429
285	0,320	-	0,540	0,22	0,430
284	0,342	0,219	0,560	-	- ■
283	0,355	-	0,570	0,29	0,438
282	0,369	0,244	0,580	-	-
281	-	0,226	0,585	0,30	0,430
280	0,377	0,227	0,590	-	-
279	-	0,228	0,592	0,30	0,420
278	0,384	0,226	0,590	-	-
277	-	0,225	0,588	0,30	0,411
276	0,385	0,206	0,580	-	0,410
275	0,385	0,179	0,538	0,27	0,422
270	0,364	0,144	0,475	0,23	0,471
265	0,330	0,117	0,400	0,19	0,592
260	0,284	0,104	0,337	0,15	0,845
255	0,247	0,134	0,315	0,13	1,150
250	0,226	0,272	0,402	0,18	1,45
245	0,263	-	0,190	0,37	1,70
240	0,432		-	1,80	—
230	-

Wie der Tabelle entnommen werden kann, sind die im sauren Milieu und im alkalischen Milieu ermittelten Absorptionsspektren des Protein-Metall-Chelats beträchtlich verschieden von dem bei pH = 7 erhaltenen Absorptionsspektrum.

Bei der Gelscheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid gibt das erfindungsgemäß isolierbare Metall-Chleat des Proteins ein typisches Bild mit drei nahe beieinander liegenden Banden sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 (fließendes Gel). [Diese Arbeitsweise beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis, Ann. N. Y. Acad., S. 121, 321 und 404 (1964) und von W i 11 i a m s und Reisfeld, Nature 195, 281 (1962).] Typische Elektrophorogramme des Protein-Metall-Chelats enthält die unten stehende Tabelle, in welcher sämtliche Werte Näherungswerte darstellen.

	pH 9,4	Abstand	Ralative	pH 3,8	Abstand	Relative
	Breite	vom Ursprung	Intensität	Breite	vom Ursprung	Intensität
		in mm1)	in%		in mm1)	in%
	in mm	11,5	100	in mm	16,5	100
Oberes Band	1,0	14,0	89-93	1,2	20,0	53-56
Mittleres Band	1,0	18,0	48-52	0,4	22,0	94-96
Unteres Band	0,5		1,2

') Oberer Rand, Gesamtlänge des fließenden Geles: 56 mm.

Es wird angenommen, daß die sich bei der. Gelscheiben-Elektrophorese zeigenden typischen drei Banden auf eine Aufspaltung einer Bande zurückzuführen ist, welche Aufspaltung Pufferwirkungen im elektrischen Feld zugeschrieben werden kann und nicht auf die Anwesenheit dreier verschiedener Proteine im. Metall-Chelat hinweist. Unter Verwendung von Argarose durchgeführte Elektrophorogramme können zur angenäherten Bestimmung der Konzentration des erwünschten Proteins in einem Proteingemisch heran- r> gezogen werden. Zu diesem Zwecke kann bei einer Konzentration der Probe von 10 bis 100 mg/ml in 0,05-m [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan]-Glycin-Puffer bei pH 8,45 mit 5 mA und 188 V 30 Minuten gearbeitet werden. Analytisch besitzt diese Methode gegenüber der Gelscheiben-Elektrophorese den Vorteil, daß wegen der nahe dem Zentrum der Platte liegenden Probe die wandernden Proteine sowohl kathodisch als auch anodisch sichtbar gemacht werden können.

Das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat stellt im Hinblick auf das Verhalten bei der Gelscheiben-Elektrophorese offensichtlich eine chemisch einheitliche Substanz dar, was auch durch das Verhalten dieses Chelats beim Chromatographieren über Ionenaustauschharzen aber auch durch das Verhalten beim Ultrazentrifugieren bestätigt wird, wo das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat in Form eines einheitlichen, scharfen Bandes weiterwandert und der Sedimentationskoeffizient zu etwa 3,32 ±0,05 Svedberg-Einheiten bestimmt wird.

Das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat besitzt in pharmakologischer Hinsicht ein breites Wirkungsspektrum und ist in der Lage, durch Vireninfektionen bewirkte Schädigungen zu lindern und kann in Säugetieren die Folgen von Überanstrengungen beseiti- faß gen bzw. das Immunitätsgleichgewicht wieder herstellen. Dieses Protein-Metall-Chelat besitzt auch ausgezeichnete antiinflammatorische Wirkung. Es ist für die Behandlung aller Krankheiten geeignet, an welchen ein inaktiviertes oder aus dem Gleichgewicht geratenes auto-immunes System beteiligt ist und kann allein und zusammen (gleichzeitig oder alternierend) mit für die Behandlung solcher Krankheiten dienenden Medikamenten, beispielsweise Steroiden, wie Cortison, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, Dexamethason, Fluorcortison, Fluormethalon, Methylprednisolon, Triamoinolon und dessen Acetonid, /?-Methason und deren bekannte Ester und Derivate oder anderen bekannten Stoffen zur Behandlung von Bakterien- und Viren-Infektionen, verwendet werden, wobei diese Medikamente in geringeren Dosen verabreicht werden können und normalerweise vorkommende toxische Wirkungen und sonstige Nebeneffekte verringert werden. Das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat erweist sich auch bei der Behandlung einer großen Anzahl von Entzündungen geeignet, bei welchen entzündungshemmende Steroide nur beschränkt brauchbar sind, was daraus . ersichtlich wird, daß diese Chelat nach Erzeugung einer durch Antigene indizierten Entzündung nach der Methode von Ungar et al. [Arch: Int. Pharmacodynam. 123, 71(1959)] eine etwa 50%ige Inhibierung der Entzündung bei Dosen von 0,4 mg/kg bewirkt, wogegen die gleiche Inhibierung erst durch Verabreichung von 25 mg Butazolidin und etwa 15 mg Hydrocortison erreicht werden kann. Sowohl bei der Prüfung als auch bei der Verwendung des erfindungsgemäß herstellbaren Protein-Metall-Chelats kann weder eine chronische noch eine akute Toxizität festgestellt werden. Bei intraperitoneal und/oder intramuskulär verabreichten Einzeldosen des Chelats von 60 mg/kg, welche weit über der therapeutisch erforderlichen Dosierung liegt, kann in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen oder Eseln weder vor der Tötung noch nach augenscheinlicher und mikroskopischer Prüfung der Milz, der Nieren, des Rückenmarks, des Hirns und der Injektionsstellen eine toxische Wirkung festgestellt werden. Die bei Injektion körperfremder Proteine auftretende typische Eosinophilie bzw. Monocytosis bleiben aus. Bei der Verabreichung von dem Hundertfachen der wirksamen Dosis entsprechenden Dosen an Esel und Meerschweinchen konnten keine chronischen Vergiftungen festgestellt werden. Das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat ist somit zum großen Teil frei von den Nachteilen synthetischer Drogen, welche häufig nur sehr spezifisch, stark verzögert und unzureichend wirken. Das erfindungsgemäß isolierbare

Protein-Metall-Chelat wirkt nach Verabreichung stark und rasch. Dies mag darauf zurückzuführen sein, daß es in Anbetracht seiner Chelatstruktur rasch auf die Zellen verteilt wird. Diese Struktur macht dieses Protein-Metall-Chelat hervorragend geeignet zur selektiven Adsorption an und Speicherung in gewissen Zellen, und dies ist unter Umständen ein weiterer Grund für dessen überraschend hohe Wirkung gegen Viren.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wesentlich, das Protein-Metall-Chelat mit einem Metallgehalt von 0,1 bis 1,0% herzustellen und hierbei dafür Sorge zu tragen, daß zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, da nur dann dieses Chelat die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften besitzt. Darüber hinaus ist ein ausreichender Metallgehalt des Chelats auch im Hinblick auf dessen Stabilität unbedingt erforderlich. Die pharmakologisch wirksamsten erfindungsgemäß herstellbaren Protein-Metall-Chelate besitzen einen Metallgehalt von etwa 0,25 bis 0,75%. Das Ausmaß der pharmakologischen Wirkung des Protein-Metall-Chelats scheint zumindest zum Teil von der Anwesenheit eines oder mehrerer physiologisch wesentlicher zweiwertiger Metallionen im Chelat abzuhängen, weshalb in das Chelat vorzugsweise mindestens 75%, insbesondere 85%, der Metalle in Form mindestens eines der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu eingebracht werden.. Bei Herstellung von Protein-Metall-Chelaten höchster Wirksamkeit ist dafür zu sorgen, daß zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65 bis 0,79 Ä, beispielsweise Magnesium, gebildet sind. Solche Metalle können beispielsweise dem Buch von Hall, »Chemistry and Physics«, 44. Auflage, Seiten 3507 bis 3508 (1962) entnommen werden. In den meisten solchen Chelaten ist eines dieser Metalle auch das vorwiegende Metall, also jenes chelatierende Metall, welches im Protein-Metall-Chelat mit dem höchsten Anteil enthalten ist. Obzwar in den die stärkste Wirkung zeigenden Chelaten_ii;derν größte .Teil. des.,,Metallgehaltes apf physiologisch ,wesentliche zweiwertige. Metalle zurückzuführen ist, enthalten typische Metallchelate auch andere Metalle, welche häufig während der Fraktionierschritte vom Protein, insbesondere dann aus Anlagenteilen aufgenommen werden, wenn in den aufzuarbeitenden' Lösungen die Konzentration der erwünschten physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen gering ist. Falls zumindest im letzten Fraktionierschritt in den aufzuarbeitenden Lösungen eine ausreichend hohe Konzentration an physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen aufrechterhalten wird, gelingt es Protein-Metall-Chelate herzustellen, in welchen von den insgesamt vorliegenden chelatisierenden Elementen nur 10% physiologisch unwesentliche Elemente, beispielsweise Al, Si oder B, sind.

Da das erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ziemlich wärmeempfindlich ist, ist es zweckmäßig, mit Ausnahme des kurzzeitigen Erhitzens alle Verfahrensschritte bei einer Temperatur unterhalb 5° C durchzuführen. Das zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine vorzunehmende kurzzeitige Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung erfolgt zweckmäßig auf eine Temperatur von mindestens 50⁰C, vorzugsweise auf eine Temperatur von 50 bis 65° C bei einer Erhitzungsdauer von 10 bis 5 min. Hierbei ist zu beachten, daß die Temperatur und die Dauer der Wärmebehandlung einander umgekehrt proportional sind. Das in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ist bei Temperaturen oberhalb 75°C nur kurze Zeit beständig. Sofern es nicht möglich ist, wie beispielsweise beim flash-Pasteurisieren, das Erhitzen und das Abkühlen in kürzester Zeit vorzunehmen, soll das Gemisch nicht über 75° C erhitzt werden. Bloßes Erwärmen auf Temperaturen unterhalb 50° C zeitigt wenig zufriedenstellende Ergebnisse, da einige der unerwünschten wärmelabilen Proteine bei solchen niedrigen Temperaturen noch ziemlich beständig sind.

ίο Das erwünschte Protein ist bei 55°C 15 bis 30 min und bei 65° C etwa 3 bis 8 min beständig, womit es möglich ist, bei Zerstörung der wärmelabilen Proteine übliche Heiz- und Kühleinrichtungen zu verwenden.

Da, wie erwähnt, das erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein bei einem pH-Wert unter 1,0 bzw. bei einem pH-Wert oberhalb 11,0 instabil ist und in Nähe des isoelektrischen Punktes (pH-Wert = 5,5) nicht so löslich ist, ist es zweckmäßig, bei allen Fraktionierschritten bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 oder zwischen 6 und 11, vorzugsweise 7 bis 8, zu arbeiten, sofern es nicht bezweckt ist, aus einer Lösung dieses Proteins dieses Protein auszufällen, in welchem Falle der pH-Wert einer dieses Protein enthaltenden Lösung auf einen Wert zwischen 4 und 6, insbesondere auf etwa 5,5, zu bringen ist. .-■_■-: : j - v-:

Da das erfindungsgemäß in Form eines Metall-Che-? lats zu isolierende Protein in Form eines Chelats wesentlich stabiler ist, ist es zweckmäßig, sämtliche Fraktionierschritte in Anwesenheit eines Ions ,eines.

zweiwertigen Metalls mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,0 Ä durchzuführen. Es ist hierbei zweckmäßig, die Konzentration der Lösungen an Ionen zweiwertiger Metalle auf mindestens 1,10-⁴-m, vorzugsweise 0,005 bis 0,20-m, insbesondere etwa 0,02-m, einzustellen. Die Ionen zweiwertiger Metalle können hierbei in Form der Sulfate, Chloride oder Acetate der oben angegebenen Metalle, z.B. in Form von Mg(CH₃COO)₂, MgSO₄, MgCl₂, CaCb oder MnSO₄, beigestellt werden. Die Anwesenheit: von Ionen -zweiwertiger Metalle in Lösungen des erfindungsgemäß in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins ist _;ypr aljemTbeim Abtrennen der wärmelabilsten Proteine durch kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Lösung zweckmäßig, da, wie erwähnt, dieses Protein in Form eines Chelats am stabilsten ist und damit während des Erhitzens nur eine geringe Menge des erwünschten Proteins zerstört wird.

Da der in den einzelnen Fraktionierschritten, beispielsweise selektive Fällungen mittels Salzen oder

so Lösungsmitteln, erzielbare Trenneffekt stark abhängig ist vom pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen, ist es zweckmäßig, den pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen durch Zusatz von Puffersubstanzen gegen äußere Einflüsse zu stabilisieren. Zu diesem Zwecke wird am. besten in an Puffersubstanz 0,01- bis 0,20molaren, vorzugsweise mindestens 0,05molaren, insbesondere 0,1 molaren Lösungen gearbeitet. Als Puffer können hierbei partiell neutralisierte organische oder anorganische Säuren, z. B. Gemische aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (im folgenden kurz als Tris bezeichnet) einerseits und einer Dicarbonsäure, wie Maleinsäure oder Bernsteinsäure, Phosphorsäure oder einer Aminosäure, z. B. Glycin, andererseits, verwendet werden.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zweckmäßig die natürliche Eiweißquelle, beispielsweise tierische Organe bzw. Gewebe, wie Leber, Niere, Hoden, Pankreas, Placenta, Darmschleimhaut, Thymus,

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Lunge oder Milz von Kaninchen, Schafen, Rindern, Schweinen oder Menschen bzw. ein daraus in an sich bekannter Weise durch Behandeln mit organischen Lösungsmitteln, wie Toluol oder Aceton, erhaltenes Trockenpulver mit einer einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweisenden und zweiwertige Metallionen mit einem Ionenradius von 0,6 bis 1,0 Ä, vorzugsweise 0,6 bis 0,8 Ä, enthaltenden Pufferlösung extrahiert, womit eine Lösung erhalten wird, aus welcher, wie bereits erwähnt, bereits durch Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben das erwünschte Protein-Metall-Chelat auf Grund seines Wanderungsverhaltens bei der Gel-Elektrophorese abgetrennt werden kann, wobei jedoch zwecks Erzielung eines ausreichenden Trenneffektes die Gel-Elektrophorese oder das Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes mehrmals vorzunehmen ist, um schließlich die einzelnen Fraktionen weit genug auseinanderziehen zu können.

Um jedoch im Rahmen der Gel-Elektrophorese oder im Rahmen des Fraktionierens mittels Molekularsieben nicht zu große Substanzmengen aufarbeiten zu müssen, ist es zweckmäßig, vor dem Fraktionieren durch Gel-Elektrophorese oder dem Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes eine an erwünschtem Protein angereicherte Fraktion durch fraktioniertes Fällen mittels Salzen, insbesondere Ammonsulfat, und/oder mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Isopropanol und/oder Äthanol, herzustellen. Naturgemäß ist es im Zuge dieser Fällungen zweckmäßig, stets in eine Puffersubstanz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltenden wässerigen Lösungen zu arbeiten.

■Naturgemäß ist aus den hierbei erhaltenen Fraktionen das erwünschte Protein um so leichter mittels Gel-Elektrophorese oder Molekularsieben abzutrennen, je weitergehender unerwünschte Begleitstoffe entfernt worden sind, jedoch kann jede der in Frage kommenden Fraktionen im Prinzip durch die Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben aufgearbeitet werden! ^l'-"'°'· ·" '■ ;'■

Eine Möglichkeit zu einer an erwünschtem Protein angereicherten' Fraktion zu kommen besteht darin, daß die durch Extraktion der Eiweißquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wässerige Lösung zwecks Ausfällens von weniger als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffen zu 40 bis 45% mit Ammonsulfat gesättigt oder mit etwa 1,5 Vol.-Teilen Aceton oder Äthanol versetzt wird, wobei zwecks Ausfällens allenfalls vorhandener Pigmente vor oder nach dem Fällen der weniger löslichen Stoffe die jeweils vorliegende Lösung mit, vorzugsweise 10% ihres Volumens, eines heterocyclischen Amins, z. B. Pyridin oder Piperidin, oder mit etwa 15% ihres Volumens eines Gemisches aus Äthanol und Chloroform (etwa 2:1) versetzt wird. Hierbei kann zwecks Abtrennens der wärmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch, z.B. unter kräftigem Rühren, auf 59°C erhitzt, etwa 15 min auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch, z. B. mittels einer Kältemischung, auf etwa 3⁰C abgekühlt werden, wobei vor oder nach dem Abtrennen der wärmelabilen Proteine ein das erwünschte Protein enthaltender Niederschlag dadurch hergestellt werden kann, daß die erhaltene Lösung entweder zu 58 bis 76% mit Ammonsulfat gesättigt oder mit der zwei- bis vierfachen Menge der zum Fällen der weniger löslichen Proteine erforderlichen Menge an Lösungsmittel (vorzugsweise Aceton oder Äthanol) versetzt wird. Der das erwünschte Protein enthaltende

ίο

Ή)

Niederschlag wird zwecks Weiterverarbeitung zweckmäßig in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelöst.

Eine weitere Möglichkeit zu einer an erwünschtem Protein angereicherten Fraktion zu gelangen besteht darin, daß die durch Extraktion der Eiweißquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wässerige Lösung zwecks Abtrennens von leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffen mit dem gleichen Volumen an kaltem Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn + +, enthaltendem Puffer (Ph-Wert etwa 7,6) gelöst wird. Im Anschluß daran kann so vorgegangen werden, daß zwecks Abtrennens der wärmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch auf 60° C erhitzt, bis etwa 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch auf 5°C abgekühlt wird, worauf aus der erhaltenen Lösung eine das erwünschte Protein enthaltende Fraktion durch Zusetzen von etwa 0,9 Vol.-Teil Äthanol ausgefällt wird und sodann der erhaltene Niederschlag in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelöst wird. Schließlich f kann die erhaltene Lösung zwecks Abtrennens der leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffe einer fraktionierten Fällung mit Ammonsulfat unterworfen werden, wobei die bei einer 60 bis 75% der Sättigungskonzentration des Ammonsulfats betragenden Konzentration an Ammonsulfat anfallenden Niederschläge in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer suspendiert werden und aus der erhaltenen Suspension Unlösliches entfernt wird. -...■..-■ '.■.,. ■..:.'■ .,-:,-.■.■-.,

Die so erhaltenen Lösungen des erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins, insbesondere die von den wärmelabilen Proteinen, den leichter löslichen und den schwerer löslichen Stoffen befreiten Lösungen, können der Feinreinigung durch Gegenstromextraktion, Gel-Elektrophorese oder Chromatographieren, z. B. Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Chromatographieren: in mit' Ionenaustauschharz oder Gelen wie Silikagel oder vernetztes Detran (Molekülsieb) gefüllten Kolonnen, unterworfen werden. Bei der Feinreinigung genügt es im allgemeinen eine Absorptionsbande bei 280 nm zeigende Fraktionen aufzufangen, da nur solche Fraktionen das erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein enthalten. Bei dieser Feinreinigung wird das erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein von allenfalls vorhandenen Resten an Albuminen oder y-Globulinen abgetrennt; insbesondere das weitgehende Abtrennen der Albumine vom erfindungsgemäß zu isolierenden Protein ist wesentlich, da die Albumine die pharmakologische Wirksamkeit des erfindungsgemäß in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins wesentlich stärker beeinträchtigen als y-GIobuline.

Da voraussetzungsgemäß ein 0,1 bis 1,0% Metalle aufweisendes Chelat zu isolieren ist, in welchem zumindest 65% des Metallgehalts von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, ist es zweckmäßig zumindest im letzten Fraktionierschritt in Anwesenheit eines zweiwertigen Metallions mit einem lonenradius von 0,60 bis 0,79 Ä, insbesondere in Anwesenheit von Magnesiumionen zu arbeiten oder erhaltenes Protein-Metall-Chelat erforderlichenfalls zu einem Chelat zu transchelatieren, in welchem zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall

mit einem Ionenradius von 0,65 bis 0,79 A, insbesondere Magnesium, gebildet sind.

Da die im letzten Fraktionierschritt anfallenden Lösungen des erwünschten Protein-Metall-Chelats noch ziemliche Mengen an Puffersubstanz und Salzen -■> zweiwertiger Metalle gelöst enthalten, ist es zweckmäßig, aus diesen Lösungen die Puffersubstanz und die Salze zweiwertiger Metalle durch Dialyse zu entfernen, wobei zweckmäßig zuerst durch Dialyse gegen eine etwa 0,001 molare Lösung eines Salzes eines zweiwertigen Metalls, insbesondere Mg, in entsalztem Wasser die Konzentration der Lösung an Puffersubstanz auf weniger als 10~⁶-m gebracht wird und dann durch Dialyse gegen entsalztes Wasser die Konzentration der Lösung an dem Salz eines zweiwertigen Metalls auf r> weniger als lO-'-m gebracht wird.

Da das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat im trockenen Zustand und bei tiefer Temperatur gelagert am beständigsten ist, ist es das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösungen, insbesondere erhaltene Lösungen des reinen Chelats, gefrierzutrocknen.

Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert:

Beispiel 1 ,_r

i kg frischer, vom Bindegewebe befreiter Ochsenleber -wurde in fünf oder sechs Stücke zerteilt, anschließend mit Leitungswasser gespült und zerkleinert. Kleinere Mengen der zerkleinerten Ochsenleber (200 g) wurden in einem Schneidmischer mit 200 ml kalter isoosmotischer KCl-Lösung innerhalb 20 see homogenisiert, worauf unmittelbar anschließend im Mischer das Homogenisat innerhalb 20 see bei — 10⁰C mit 200 ml Aceton vermischt wurde. Das mit Aceton behandelte Homogenisat wurde sodann unter Rühren in si ein 2,5 I auf —10°C gekühlten Acetons enthaltendes 10-1-Becherglas gegossen. Sobald der letzte Anteil der zerkleinerten Ochsenleber in der angegebenen· Weise behandelt worden war, wurde der Inhalt des Becherglases -mit kaltem Aceton auf 101 aufgefüllt und durchgemischt. Die «Temperatur wurde anschließend eihige-Minüten auf 4°C gehalten. Die klare überstehen-' de Flüssigkeit wurde nun abdekantiert, worauf der Inhalt des Becherglases mit Aceton auf 101 aufgefüllt wurde. Nach dem Abgießen der klaren überstehenden 4^r> Flüssigkeit wurde die Suspension rasch auf einem Buchner-Trichter filtriert, welcher oben abgedeckt ist, um den Zutritt von Luft so weitgehend als möglich auszuschalten. Noch bevor der am Trichter befindliche Filterkuchen völlig trocken war, wurde mit 2 I kaltem w Aceton gewaschen. Das Waschen wurde so lange fortgesetzt, bis die Teilchen vollständig trocken waren. Der Filterrückstand wurde zerkleinert, auf einem Filterpapier ausgebreitet und unter Stickstoff getrocknet. Das erhaltene Pulver wird noch kalt fein gemahlen ^r>^r> und bei 4°C im Vakuum gelagert. Die Ausbeute an pulverförmigem Material betrug etwa 52 g.

100 g des in der oben angegebenen Weise hergestellten trockenen Pulvers wurden in 1 I 0,1-m Tris-Maleat-Puffer eingerührt, worauf dem erhaltenen Gemisch nach w> Ablauf einiger Minuten 6,5 g MgSO₄ · 7 H₂O in Anteilen zugegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt wurde. Anschließend wurden weitere 600 ml Tris-Maleat-Puffer und weitere 6,5 g MgSO₄ ■ 7 H₂O zugegeben, worauf der pH-Wert erneut auf 7,4 t» eingestellt wurde. Nun wurden weitere 400 ml Wasser zugesetzt, worauf in einem kalten Raum weitergerührt wurde bis, gerechnet vom Arbeitsbeginn, 6 Stunden verstrichen waren. Die Mischung wurde sodann absitzen gelassen, worauf filtriert und zentrifugiert wurde. Der pH-Wert des Filtrates wurde auf 7,8 eingestellt, worauf das Filtrat in der Kälte stehengelassen wurde, bis die Abscheidung vollständig war. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Abzentrifugieren filtriert. Zwecks Lagerung wurde das Filtrat gefriergetrocknet.

100 g des durch Extraktion des Trockenpulvers erhaltenen Pulvers wurden unter Rühren in 400 ml kaltem, 0,1-m Tris-Maleat-Mg++-Puffer bei pH 7,2 suspendiert, worauf in einem kalten Raum bis zum Absetzen des Niederschlages stehengelassen, bei 1 bis 2°C zentrifugiert und schließlich abdekantiert wurde. Zwecks Abtrennung der Pigmente wurde die abdekantierte Flüssigkeit in 5 gleiche Teile geteilt und jeder Teil unter Rühren langsam mit 8 ml gekühltem Pyridin (chemisch rein) versetzt, worauf noch jedem Teil 40 ml 0,1-m Tris-Maleat-Mg⁺+-Puffer zugesetzt wurden. Die erhaltenen Gemische wurden sodann bei einer Temperatur von 1 bis 2° C während 15 min bei 13 000 U/min zentrifugiert. Die überstehenden klaren Flüssigkeiten wurden abdekantiert und miteinander vereinigt, wogegen der Niederschlag verworfen wurde.

Die von Pigmenten befreite kalte Lösung von Proteinen in Tris-Maleat-Mg++-Puffer wurde,auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und sodann mit Ammonsulfat zu 40 bis 45% gesättigt, in dem das Ammonsulfat unter Rühren in Anteilen in Form einer gesättigten wässerigen Lösung zugegeben wurde und die Temperatur des Gemisches auf 0 bis 5° C gehalten wurde; Das erhaltene Gemisch wurde in der Kälte 30 min stehen gelassenem den entstandenen Niederschlagvöllstäridig absetzen zu lassen. Der entstandene Niederschlag, welcher die weniger als das erfindungsgemäß zu isolierende proteinlöslichen Stoffe enthält, wurde bei 12 000 U/min abzentrifugiert und verworfen.

Um aus ⁱ der erhaltenen-Lösung die wärmelabilen Proteine auszufällen, wurde die Lösung in einen 1-l-Rundkolben übergeführt und darin mittels eines auf 65 bis 70^C gehaltenen Wasserbades unter kräftigem Rühren auf 59^qC^; erhitzt/5 min auf dieser Temperatur gehalten und unmittelbar anschließend durch Eintauchen des Rundkolbens in ein Gemisch aus Trockeneis und Aceton rasch auf eine Temperatur von 2 bis 3°C gekühlt. Der hierbei entstandene flockige Niederschlag wurde in der Kälte abzentrifugiert und sodann verworfen. .. ■;.-.: ,1 :.,/;

Die von den wärmelabilen Proteinen befreite Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, dann zu 76% mit Ammonsulfat gesättigt und dann, bis zur vollständigen Ausfällung 2 Stunden kalt gestellt. Der hierbei entstandene, nahezu weiße Niederschlag wurde im 10- bis 15fachen seines Gewichts an 0,10-m Tris-Maleat-Mg+ +-Puffer aufgenommen und V2 Stunde kalt stehengelassen, worauf ein allenfalls verbliebener Rückstand abzentrifugiert und verworfen wurde.

Die nunmehr vorliegende Lösung des erfindungsgemäß in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins (befreit vom Hauptteil der leichter löslichen und der schwerer löslichen Stoffe) wurde nun einer Feinreinigung durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung von quervernetztem Polyacrylamid als Gel unterworfen. Hierbei wurde ein für Produktionszwecke entwickeltes Gerät verwendet, in welchem ein 32 cm langer, 10 cm breiter und 1 cm starker Block aus einem 5 bis 7 Gew.-% quervernetztes Polyacrylamid enthaltendem Gel in der Elektrophoresekammer untergebracht war, die ihrer-

seits mit den Seitenflächen größter Abmessungen vertikal angeordnet war und im Bereiche dieser Seitenflächen mittels eines laufend umgewälzten und gekühlten Gemisches aus Äthylenglycol und Wasser gekühlt werden konnte, so daß es möglich war, bei einer Spannung von 600 bis 1000 V und mit einer Stromstärke von 200 bis 500 mA zu arbeiten. Der Gel-Block wurde in der Elektrophorese-Kammer dieses Gerätes durch Polymerisieren eines im Vakuum entgasten und blasenfrei in die Elektrophorese-Kammer eingebrachten Gemisches aus wässerigen Lösungen von Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Hilfsstoffen hergestellt, wobei folgende Lösungen verwendet wurden:

a) 1 n-HCl 480 ml
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 363 g
Tetramethyläthylendiamin 4,6 ml
H₂Oaufl000ml

b) Acrylamid 280 g
Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid 7,36 g
H₂Oaufl000ml

c) Ammoniumpersulfat 1,00 g
H₂O 1000 ml

Das _ in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Gemisch bestand aus 1 Vol.-Teil eines Gemisches aus 1 Vol-Teil der Lösung a), 2 Vol.-Teile der Lösung b) und 1 Vol.-Teil Wasser einerseits und 1 Vol.-Teil der Lösung c) andererseits. Mit diesem Gemisch wurde die Elektrophorese-Kammer bis 16 mm unterhalb ihres oberen Randes gefüllt, worauf das Gel in der Elektrophorese-Kammermit einer 0,001 %igen wässerigen Lösung von als Markierungsfarbe dienendem Bromphenolbläu vorsichtig überschichtet wurde und nach abgeschlossener Polymerisation der Überschuß an wässeriger Lösung des Bromphenolblaues sorgfältig entfernt wurde. Nun wurde die in der oben angegebenen Weise hergestellte wässerige Lösung des erfindungsgemäß zu isolierenden Proteins in 0,10-m Tris-Maleat-Mg++-Puffer mit einem zu einem Gel polymerisierbaren Gemisch vermischt und das erhaltene Gemisch auf das in der Elektrophorese-Kammer befindliche Gel aufgebracht und dort unter Lichteinwirkung auspolymerisiert. Das zu einem Gel polymerisierbare Gemisch wurde unter Verwendung folgender Lösungen hergestellt:

d) 1-m H3PO4	256 ml
Tris-(hydroxymethyl)-
aminomethan	57 g
H2Oaufl000ml
(pH 6,9)
e) Acrylamid	100 g
Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid	25 g
H2Oaufl000ml
c) Ammoniumpersulfat	1,00 g
H2O	1000 ml

Hierbei wurde 1 Vol.-Teil eines aus 1 Vol.-Teil der Lösung d), 2 Vol.-Teile der Lösung e) und 1 Vol.-Teil Wasser hergestelltes Gemisch mit einem Vol.-Teil der Lösung c) vermischt. Nach dem das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Proben-Gel auspolymerisiert war, wurde die Elektrophorese-Kammer in den Pufferbehälter eingebracht, welcher mit einer aus 60 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 288 g Glycin und der für 20 1 erforderlichen Menge an Wasser hergestellten und auf einen pH-Wert von 8,45 eingestellten Pufferlösung gefüllt war, und unter Kühlen die Elektrophorese bei 5° C und einer Stromstärke von 200 mA durchgeführt, bis nach 3 Stunden die Markierungsfarbe das Gel nahezu zur Gänze durchquert hatte.

Zu diesem Zeitpunkt befand sich das erfindungsgemäß zu isolierende Protein-Metall-Chelat in einem Bereich, welcher etwa um 30% des von der Markierungsfarbe zurückgelegten Wanderungsweges vom Ursprungspunkt entfernt war. Das erfindungsgemäß zu isolierende

ίο Protein-Metall-Chelat war gut getrennt von den beträchtlich rascher wandernden Albuminen und ebenfalls gut getrennt von den wesentlich langsamer wandernden y-Globulinen. Nach abgeschlossener Elektrophorese wurde das erwünschte Protein-Metall-Chelat aus dem Gel mittels eines Querstromes an 0,1-m Tris-Maleat-Puffer, welcher an Mg⁺+ 0,001 molar war, ausgewaschen, wobei das Fortschreiten des Isolieren durch Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm verfolgt wurde. Die Einheitlichkeit des so erhaltenen Protein-Metall-Chelats wurde durch analytisch durchgeführte Gelscheiben-Elektrophorese noch überprüft.

Aus dem erhaltenen Eluat wurde das zu isolierende Protein-Metall-Chelat dadurch gewonnen, daß dieses Eluat zunächst erschöpfend gegen 0,001-m Tris-Maleat-Mg⁺ +-Puffer und dann gegen entsalztes Wasser dialysiert und dann das erhaltene Dialysat gefriergetrocknet wurde. Hierbei wurde ein weißes, flaumiges Pulver in einer Menge erhalten, die etwa 16% des durch Ammonsulfat ausgefällten Produktes ausmachte. Die Ausbeute an Protein-Metall-Chelat betrug, bezogen auf Trockengewicht der eingesetzten Ochsenleber, 0,02%.

Beispiel 2

Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Arbeitsgänge in einem kalten Raum (2 bis 5° C) vorgenommen. ■

Frische Rinderleber wurde vermählen und in einen Kunststoffbehälter eingefüllt, worauf kaltes destilliertes Wasser in einer Menge von 21 pro kg Leber unter Rühren zugegeben und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit 0,1 n-NaOH auf 7,5 bis 7,6 eingestellt wurde. Dem Gemisch wurde nun so viel an 2 m-MnSO,»- Lösung zugegeben, daß das Gemisch an Mangan 0,05molar wurde. Der pH-Wert wurde sodann auf 7,6 eingestellt, worauf so viel frisches kaltes Wasser zugegeben wurde, daß auf 1 kg Leber insgesamt 31 Wasser kamen. Nun wurden pro kg Leber 50 ml Toluol zugesetzt, worauf die Mischung über Nacht im kühlgehaltenen Raum gerührt wurde.

Am darauffolgenden Morgen wurde die Suspension durch Gaze aus Kunststoffäden filtriert, worauf das Filtrat mit dem l'/2fachen Volumen an kaltem Aceton (-10⁰C) unter gelindem Rühren versetzt wurde. Die Zugabe des Acetons erfolgte über ein Glasrohr, welches weit genug unter die Oberfläche des Gemisches ragte. Der entstandene Niederschlag wurde unmittelbar darauf durch Abzentrifugieren isoliert und sogleich in etwa 25 Vol.-% an 0,05-m Maleat-Mn ++-Puffer, bezogen auf das Volumen des Filtrats vor Zugabe des

bo Acetons, suspendiert. Die Mischung wurde in der Kälte mehrere Stunden gerührt, über Gaze aus Kunststoffäden filtriert und durch Zentrifugieren geklärt.

Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde in einem Kessel aus rostfreiem Stahl unter Rühren rasch auf 60⁰C erhitzt und bis 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde sodann so rasch als möglich auf 5° C gekühlt, worauf der entstandene voluminöse Nieder-

schlag im kalten Raum durch langsames Absaugen über eine große Filterfläche abfiltriert wurde. Die Temperatur des klaren Filtrats wurde auf 2 bis 5⁰C gebracht, worauf 0,9 Vol.-Teile denaturiertes Äthanol (-10⁰C) mittels eines Tropftrichters über ein sich bis weit unter die Oberfläche des Gemisches erstreckendes Glasrohr unter starkem Rühren und bei einer Temperatur von höchstens 5° C zugegeben wurden. Nach vollständiger Zugabe des Alkohols wurde das Gemisch gerade so lange in einem kalten Raum verwahrt, bis sich der Niederschlag zusammengeballt und abgesetzt hatte. Der Niederschlag wurde durch Absaugen mit niedrigem Unterdruck isoliert und unmittelbar anschließend in kaltem 0,001-m Maleat-Mn++-Puffer von pH 7,0 gelöst. Die Menge an verwendetem Puffer betrug etwa 4 ml/g Niederschlag. Die Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit abgetrennt und der Niederschlag mit kleinen Mengen kalter Pufferlösung mehrmals extrahiert wurde. Die überstehenden Flüssigkeiten werden miteinander vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver stellte ein Gemisch aus erwünschtem Protein, Arginase und anderen Enzymen, Albumin und anderen, unwesentlichen Proteinen dar.

Zwecks weiterer Aufarbeitung wurde das so erhaltene Pulver im 12fachen seines Schüttvolumens an kaltem 0,2-m Tris-Puffer gelöst, welcher an Mg++: O.OOlmolar war und einen pH-Wert von 7,8 besaß. Die so erhaltene Lösung wurde mit kalter gesättigter Ammonsulfatlösung behandelt, welche ebenfalls an; Mg+;+0,001molar war. Pro'1000 ml Pufferlösung wurden hiervon Anteile zu je 375 ml gegeben, wobei die Pufferlösung jeweils zu 15,30,45,60 und 75% an Ammonsulfat gesättigt wurde. In jedem Falle erfolgte die Zugabe der Ammonsulfatlösung.tropfenweise bei 0 bis 5⁰C und unter Rühren. Es würde;;; weitere= al0 Minuten gerührt,: worauf.-■ der entstandene-!Niederschlag durch Zentrifugieren:·.bei 4500 U/min .während.30 min bei 0⁰C abgetrennt wird. Von deii 5 erhaltenen: Fällungen wurde, die erste (A), welche;die unerwünschten Proteine hohen. Molekulargewichts; enthält,·',verworfen; Die zweite und die dritte Fällung-(B und C) wurden vereinigt und enthalten Arginase und andere Enzyme (welche erwünschtenfalls isoliert werden können). Auch die vierte und die fünfte Fällung (D und E), welche das mit Albumin und verschiedenen anderen Proteinen niedrigeren und höheren Molekulargewichts verunreinigte erwünschte Protein enthalten, wurden miteinander vereinigt. Die zuletzt vorliegende überstehende Flüssigkeit, welche Proteine niedrigen Molekulargewichts und weitere unerwünschte Verunreinigungen enthält, wurde verworfen. Die Fällungen D und E wurden in 0,03 m Tris-Mg++-Puffer, welcher an Mg++ 0,001 molar ist und einen pH-Wert von 7,8 besaß, in einer Menge gelöst, daß eine möglichst genau 10%ige Lösung erhalten wurde. Die so erhaltene Lösung wurde gegen kalten Puffer dialysiert, bis die Reaktion auf Sulfationen negativ war. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit durch ein »Millipore«-Filter filtriert wurde. Das erhaltene Filtrat wurde direkt auf den Kopf einer Chromatographiersäu-Ie (76 χ 456 mm) aufgegeben, welche mit SephadexG-100 (Pharmacia, Schweden) gefüllt war. Das Sephadex wurde nach den Vorschriften des Herstellers gequollen, auf einen definierten Zustand gebracht und gewaschen. Die so vorbereitete Kolonne wurde mit 0,03-m Tris-(0,001-m Mg++)-Puffer von pH 7,8 ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Durchflußgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Stunde eingestellt. Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden war, wurde sie innerhalb 30 bis 45 min mit den ersten 3 cm des Kunstharzbettes ins Gleichgewicht gebracht, worauf mit dem Fraktionieren begonnen wurde. Es wurden Einzelfraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das Auftreten der Scheitel wird durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels der Absorption bei 280 nm erkannt. Vor dem Auftreten des

ίο erwünschten Proteins ergaben sich zwei Scheitelwerte, die auf Albumin und andere unerwünschte Proteine ähnlichen öder höheren Molekulargewichts zurückzuführen sind. Diese Scheitelwerte zeigenden Fraktionen wurden verworfen. Das erwünschte Protein fand sich in jener Fraktion des gesamten Eluats, welche die cm³ von 130 bis 170 umfassen. Diese Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung vereinigt. Beim weiteren Eluieren der Kolonne/ insbesondere beim Erhöhen der Ionenkonzentration des Puffers, flössen aus der Kolonne restliche Proteine niedrigen Molekulargewichts enthaltende Eluate ab. Die Proteine niedrigen Molekulargewichts wurden aus der Kolonne entfernt, um diese für die nächste Charge zu reinigen.: :

Die das erwünschte Protein enthaltenden, miteinander vereinigten Fraktionen werden gegen eine 0,001 molare Lösung von Mg++in entsalztem Wasser dialysiert,-bis sie : weniger als 10-⁶-m Tris-Puffer -enthielten. Anschließend wurde gegen entsalztes Wasser, welches 1 bis 5,10-? o-Phenanthrolin oder Äthylendiaminteträessigsäuresalze enthielt, weiter dialysiert bis die Konzentration an Mg++ auf weniger als 10~⁷-m verringert worden, war. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet wurde. . ;; - ..■·..· :

75 kg frische Rinderleber, welche 70% Wasser enthält und 22,5 kg ^Trockensubstanz, .lieferte, ergab eine* Ausbeute, von etwa .200 g (1 %) des: das Mn++-Chelat; enthaltenden Zwischenproduktes.. 200 g. dieses Zwischenproduktes lieferten. 17,5 g (0,08%) Feststoffe in Form der Fraktionen D und.E. Beim^Chromatographier ren über Sephadexwurden aus den Fraktionen D und E, 2,9 g des erwünschten Protein-Metall-Chelats erhalten, was, bezogen auf Trockengewicht der Leber, _: einer. Ausbeute von 0,014% entsprach. :, ■·■ ,

Bei intradermaler Verabreichung oder bei Verabreichung auf anderem Wege an vorsensibilisierte Meerschweinchen erzeugt das erfindungsgemäß isolierbare Protein-Metall-Chelat keine Antigene. Entsprechende Versuche bei Verwendung von Freunds-Adjuvans in

so Kaninchen konnte die Bildung von Antikörpern nichtfestgestellt werden, womit erwiesen erscheint, daß die antigenetische Wirkung des Protein-Metall-Chelats höchstens extrem niedriger Größenordnung ist, so daß dieses Chelat lange Zeiträume an Säugetiere verabreicht werden kann, ohne Störungen erwarten zu müssen. An Kaninchen wurden innerhalb 29 Tagen auf 6 Einzeldosen verteilt insgesamt 30 mg/kg des Protein-Metall-Chelats zusammen mit Freunds-Adjuvans und Alaunfällung verabreicht. Nach Ablauf der Immunisierungsperiode wurde das Serum-(y-Globulin) der Tiere durch Aussalzen konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Ouchterlony-Platten und Immun-Elektrophorese unter Verwendung dieser konzentrierten y-Globulin-Fraktion gegen das erfindungsgemäß isolierbare Protein lieferten keinerlei Fällungslinien.

Obzwar gesunde Tiere immunologisch nicht ansprechen, sprechen Schwerkranke, deren autoimmunes System praktisch inaktiv ist oder aus dem Gleichge-

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wicht geraten ist, gelegentlich immunologisch an, wodurch sich allerdings die Verwendung des Protein-Metall-Chelats nicht verbietet. Ganz im Gegenteil ist darin eine begrüßenswerte Erscheinung zu sehen, welche darauf hindeutet, daß sich das autoimmune System des Patienten reaktiviert hat, was eine lebenswichtige Vorstufe vor der völligen Genesung des Patienten darstellt.

Das erfindungsgemäß herstellbare Protein-Metall-Chelat wird in der Regel auf dem Injektionswege, beispielsweise intravenös oder subkutan, vorzugsweise jedoch intramuskulär verabreicht. Die an Menschen zu verabreichenden Einzeldosen liegen in der Regel zwischen etwa 0,05 bis 1,0 mg. An Pferde werden in der Regel etwa 0,4 bis 5,0 mg intramuskulär verabreicht. Die Dosis ist nicht kritisch. Die Anfangsdosen sind in der Regel größer zu wählen als die für die anschließende Therapie. Bei der Bekämpfung von Viruserkrankungen wird das Protein-Metall-Chelat in der Regel in Einzeldosen von 0,2 bis 4,0 mg intramuskulär verabreicht. Im Gegensatz zur Behandlung chronischer Krankheiten empfiehlt sich bei der Bekämpfung von Viruserkrankungen die Verabreichung in schneller aufeinanderfolgenden Dosen, beispielsweise in Form von zwei Injektionen pro Tag während mehrerer Tage. Die Behandlungsdauer und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von der Reaktion ab, welche häufig einer dramatischen Besserung entspricht. In der Regel beträgt die Behandlungsdauer drei bis acht Tage. Im Falle eines Rückfalles sind erneute Injektionen von gleichem Erfolg. ■.;-,-■

Orale Verabreichung des Protein-Metall-Chelats ist möglich, sofern-es vor einer Zerstörung im sauren Milieu des Verdauungssystems und dessen Enzymen, beispielsweise in Form beschichteter Tabletten, geschützt, ist. Bei diesem Verabreichungsweg sind allerdings rwesentlich größere Dosen erforderlich. Überraschenderweise ist das Protein-Metall-Chelat auch lokal verabreicht wirksam, weshalb es beispielsweise in Form einer Lösung in physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung und in Form von Cremen, Salben bzw. verabreicht werden und zur Behandlung von Erkrankungen der Cornea und von Conjuctiva, der Atmungswege, der Genitalien, des Harnweges und der Haut verwendet werden kann. Durch lokale Verabreichung ist es beispielsweise möglich, Akne, Irritationen, Abschürfungen, Brandwunden, Abszesse, Psoriasis usw. zu behandeln. In diesem Falle wird das Protein-Metall-Chelat zweckmäßig gemeinsam mit einem Netzmittel und/oder einem Penetrationsmittel verabreicht.

Im folgenden werden Anwendungsbeispiele des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins bzw. dessen Chelats gebracht.

An 16 Pferde mit traumatischer Arthritis wurden 0,50 mg des vermischten Metallchelats des Proteins in Form einer Lösung in isotonischer Kochsalzlösung intramuskulär verabreicht. Innerhalb von 4 Tagen zeigte sich eine deutliche Besserung.

An 20 von 25 Polizeipferden aus San Francisco, welche an durch Viren verursachter Pneumorhinitis litten, wurden 0,5 mg des vermischten Metallchelats des Proteins in Form von 3 ml steriler Lösung in isotoner Kochsalzlösung verabreicht. Das Krankheitsbild der nicht behandelten Pferde blieb unverändert, hingegen erholten sich von den behandelten Pferden bis auf ein einziges alle übrigen rasch und vollständig. Diesem

ίο Pferd wurden weitere 2,5 mg injiziert. Die Besserung war dramatisch. Innerhalb von 24 Stunden fiel die Temperatur von 40⁰C auf den normalen Wert ab. Der Zustand weiterer 10 Pferde konnte nach Injektion von 0,16 bis 1,0 mg des Proteins in ähnlicher Weise verbessert werden. Der Husten verschwand bereits nach l'/2 Stunden. Die verabreichte Menge war hierbei nicht kritisch.

An 10 Pferde mit Quetschwunden und starken Entzündungserscheinungen wurden 0,16 bis 1,0 mg des vermischten Metallchelats des Proteins intramuskulär verabreicht. Innerhalb einer Zeit von weniger als 24 Stunden klang die Entzündung und die Empfindlichkeit ab. Die Pferde konnten nach 1 bis 3 Tagen wieder eingesetzt werden.

6 an Azoturia leidenden Pferden wurden intramuskulär 1,0 mg des vermischten Metallchelats des Proteins injiziert. Innerhalb 20 Minuten waren an den Pferden Zeichen der Besserung festzustellen und nach 1 bis 1,5 Stunden ergaben sich bereits Überlebenschancen. Im Falle eines Rückfalles oder im Falle häufigerer Rückfälle erwies sich die gleiche Behandlung als gleich wirksam.

Von 14 an einer schweren Virusinfektion der Atmungswege leidenden Rennpferden, welche an dieser Krankheit bereits zwei Wochen bis drei Monate litten und als Symptome verstopfte Blutgefäße (engorged sinuses), Atemschwierigkeiten, häufige Hustenanfälle; geschwollene Lymphdrüsen und stark blutige Schleimabsonderung aus der Nase zeigten, wurden 11 durch intramuskuläre Injektion des erfindungsgemäß isolierbaren Proteinchelats in Dosen von 0,4 bis 1,4 mg pro Injektion behandelt, wobei als Vehikel .1 ml 5%ige Dextrose pro 0,2 mg Protein verwendet wurde. Die Behandlung bestand in 4 bis 9 über 10 bis 15 Tage verteilten Injektionen. Zu Vergleichszwecken wurde den anderen drei Pferden Placebo injiziert, welches lediglich aus 5%iger Dextrose bestand.

Nach dieser Behandlung zeigte keines der drei Kontrollzwecken dienenden Pferde irgendwelche Anzeigen einer Besserung. Die anderen elf Pferde erholten sich rasch und vollständig und wurden wieder bei Rennen eingesetzt.

Einem zweijährigen Rennpferd, welches an schwerer Pleuritis litt und vom Tierarzt bereits aufgegeben worden war, wurde das erfindungsgemäß isolierbare Proteinchelat in Form von fünf Injektionen zu 0,4 mg Proteinchelat in je 2 ml 5°/oiger Dextrose, verteilt über 8 Tage, verabreicht. Die Erholung war vollständig.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Isolieren eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiphlogistischer Wirkung aus natürlichen Proteinrohstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das Ausgangsmaterial bei einem pH-Wert von 1,0—11,0 mit einer wäßrigen Lösung, die ein zweiwertiges Metallion mit einem Ionenradius von 0,6—1,0 Ä, vorzugsweise 0,65—0,80 Ä insbesondere Mn und gegebenenfalls einen Puffer enthält, versetzt wird,

b) das erhaltene Protein-Metall-Chelat durch eine Anzahl beliebig aneinander gereihter, für die Proteinfraktionierung bekannter Schritte gereinigt wird, wobei

c) eine Abtrennung der thermolabilen Proteine durch kurzfristiges Erhitzen bis auf 75° C erfolgt und

d) die Fraktionen gesammelt werden, die bei der Gelscheibenelektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wandern und das für das gewünschte Protein-Metall-Chelat charakteristische Multibandmuster zeigen, worauf

e) aus diesen gesammelten Fraktionen ein Chelat erhalten wird, das 0,1 bis 1,0% Metall aufweist und in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co oder Cu, insbesondere Mg, gebildet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verfahrensstufen a), b), d) und e) bei Temperaturen unterhalb 5° C gearbeitet wird und die Verfahrensstufe c) ein Erhitzen auf 65° C für die Dauer von 5 min bzw. ein Erhitzen auf 50⁰C für die Dauer von 10 min umfaßt.