DE1617332A1

DE1617332A1 - Verfahren zur Isolierung eines Proteins

Info

Publication number: DE1617332A1
Application number: DE1966B0089232
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Huber; Schulte Thomas Lacoste
Original assignee: Diagnostic Data Inc
Current assignee: Diagnostic Data Inc
Priority date: 1965-10-08
Filing date: 1966-10-06
Publication date: 1972-01-27
Also published as: FR6237M; DE1617332B2; DK122434B; JPS494929B1; DE1617332C3; GB1160151A; SE362012B; NL6614177A; CH575433A5; BE687828A; IL26551A; ES331853A1; NL152756B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung eines Proteins bzw. eines eiweißartigen Stoffes in Form eines Metallchelates.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung des Proteins bzw. des eiweißhaltigen Stoffes besteht im wesentlichen in der Abtrennung dieses Proteins aus einem Gemisch mit anderen Proteinen und ist dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der unerwünschten Proteine aus dem in einer Pufferlösung mit zumindest 0,01 molarer Konzentration, in welcher ein Salz eines zweiwertigen Metalls mit einem Ionenradius von 0,60 bis 0,79 Ä gelöst ist, befindlichen Proteingemisch abgetrennt wird.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Form eines Metallchelats isolierbare Protein besitzt schraubenförmige Molelcülstruktur, stellt ein Protein vom Globulintyp dar und ist zur Behandlung von Entzündungen} Überanstrenungszuständen und Virusinfektionen brauchbar. Zu diesem Zweck kann das Metallchelat des Proteins dem Organismus von Säugetieren >auf dem Injektionswege zugeführt werden.

109*8^71756

Es sind bereits Arbeitsweisen bekannt, nach welchen Proteine bei niedrigen Temperaturen isoliert werden können und nach welchen durch Modifizierung konzentrierte Fraktionen des gewünschten Proteins erhalten werden können. Diese Arbeitsweisen sind jedoch nicht dazu geeignet, das •nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare Protein zu gewinnen, da bei niedriger Temperatur aus frisch abgetöteten Eiweißquellen 'isolierte Proteinfraktionen stets noch 30 % oder mehr durch Gelscheiben-Elektrophorese auf Acrylamid abtrennbare Proteine enthalten (siehe Ornstein, Annais. N.Y. Academy Sei., 121, 321-49 (1964) und Davis, ebenda, S. 404-27). Die natürlichen Formen des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbaren Proteins sind höchstens von zweien dieser gebildet.

Das nach der USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 erhältliche Produkt besteht aus einer Vielzahl von Proteinen, darunter einer großen Menge von Albumin, und kann das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare Protein enthalten oder auch nicht. Von diesem Produkt wird zwar behauptet, daß es in Tiere injizierbar ist, jedoch enthält dieses Produkt, wenn überhaupt, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare Protein nicht in einer solchen Menge, daß sich die Nützlichkeit desselben irgendwie äußern würde. Das nach der USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 erhältliche Produkt enthält höchstens etwa 0,1 % des iii einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkt erhaltenen Proteins. Diese Konzentration ist viel zu gering, um bei Injektion eines solchen Proteingemisches irgendwelche Wirkungen gegen Anstrengungszustände, Entzündungen oder Virusinfektionen feststellen zu können. Darüber hinaus enthält das nach diesem bekannten Verfahren erhältliche Produkt mehr als 30 % allergenetisch.es Albumin, welches dieses Produkt ungeeignet macht zur Verabreichung an Menschen und darüber hinaus jede allenfalls vorhandene antiinflammatorische oder andere Wirksamkeit überdeckt. Darüber hinaus ist bei einem Produkt gemäß USA-Patentschrift

109885/1766

Nr. 2 663 668 ein wesentliches Merkmal des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbaren Proteins nicht erfüllt u. zw. liegt dieses Protein nicht in der hochaktiven Chelatform vor. Soferne das Verfahren gemäß der USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 nicht in erfindungsgemäßer Weise modifiziert wird, können danach nicht Proteingemische hergestellt werden, in welchen das nach dem erfindungsgemäßen' Verfahren isolierbare Protein angereichert vorliegt. Beispielsweise darf zwecks Herstellung eisies Gewebeextraktes nach dem bekannten Verfahren ein "Uktivator" nur in einer 0,004 molaren Konzentration nicht übersteigenden Konzentration verwendet werden_e Bei dieser Konzentration ist jedoch das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare Protein relativ unlöslich,so daß, soferne überhaupt, nur sehr wenig des im Ausgangsmaterial in natü-rlieher Form vorliegenden Proteins extrahiert wird. Darüber hinaus wird bei einer solchen geringen Ionenkonzentration das erwünschte Protein sehr leicht denaturiert und das dennoch extrahierte Protein würde bei anschließenden Schritten zur Isolierung desselben zerstört werden. Auch die erforderliche Behandlung mittels Aceton über Nacht würde den größten Teil eines allenfalls verbliebenen Restes des erwünschten Proteins zerstören. Auch die gemäß der USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 empfohlene Wärmebehandlung bei 75° C würde den Großteil des in dem für diesen Verfahrensschritt verwendeten Ausgangsgemisehes enthaltenen Proteins zerstören. Schließlich wird durch die Bleibehandlung in das Proteinmolekül ein toxisches zweiwertiges Metallion eingeführt, dessen Ionenradius größer ist als 0,80 Jt, u. zw. 1,20 Ä, und das im Endprodukt hartnäckig zurückgehalten wird und als äußerst kräftiges Zellgift in Erscheinung tritt. Schließlich enthält das Endprodukt auch hohe Mengen an Albumin.

Der für das erfindungsgemäße Verfahren wesentliche Verfahrenssehritt zur Herstellung des Metallchelats des

109885/1756

151733?

Proteins besteht demgegenüber im wesentlichen in der zumindest teilweisen Reinigung, vorzugsweise in der Isolierung, des Proteins in Form eines Metallchelates, in welchem das vorwiegend vorliegende Metall ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von'0,60 bis 0,79 Ä, vorzugsweise Magnesium, ist. Diese Maßnahme ist aus zweierlei Gründen für die Erzielung des angestrebten Effektes unbedingte Voraussetzung, u. zw. wird das als Verunreinigung vorhandene ^-Globulin und/oder Albumin leichter von den natürlichen Vorstufen des neuen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbaren Proteins getrennt, wenn das Chelat diese Form besitzt und das erhaltene Protein besitzt in dieser Form die größte Wirkung bei der Behandlung von Überanstrengungszuständen, Virusinfektionen und Entzündungen.

Im folgenden wird jene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, die als am besten brauchbar angesehen wird.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen eiweißartigen Stoffe sind im wesentlichen frei von anderen, die in den Rohstoffen enthaltenen Vorstufen des erwünschten Proteins begleitenden Proteinen und stellen weiße in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung und Pufferlösungen lösliche Pulver dar, die ohne Auftreten von für körperfremde Eiweißstoffe typische antigenetische Reaktionen injiziert werden können. Die Elementaranalyse, die Spektralanalyse (infrarot und Ultraviolett), die optische Drehung u. dgl. stimmt überein mit der Struktur eines Metallchelats eines Proteins. Die erfindungsgemäß erhältlichen Produkte lindern bzw. beseitigen in Säugetieren und anderen Tieren die schädlichen Wirkungen von Überanstrengungen (Stress), Entzündungen und Virusinfektionen, wie durch pharmakologische und klinische Untersuchungen erhärtet werden konnte.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare Protein ist ein schraubenförmig aufgebautes Protein u. zw. scheinen zumindest 80 % desselben schraubenförmige

109885/1756

161733?

Konfiguration zu besitzen. Bei Bestimmung der optischen Drehung zeigt das Protein eiiiBn deutlichen Cot&on-Sffekt, was darauf hindeutet, daß vorwiegend eine ßi-Sehraiiije vor«* liegt (siehe Blout, "Polypeptides and Proteins", Kapitel i?, Djerassi Editor, McGraw-Hill Publishers i960). Diese* schraubenförmige Struktur, welche Voraussetzung ist für die pharmakologisehen Eigenschaften des erfindungsgemäß erhältlichen Proteins scheint auf den niedrigen Anteil, u. zw. weniger als 15 % und wahrscheinlich 13 % "kettenabbrechenden" Amino säure res ten, wie Serin, Threonin-, Prolin, Isoleucin und Cystein der insgesamt vorliegenden Aminosäurereste zurückzuführen zu sein.

Die durchschnittliche Elementaranalyse des Proteinchelats lautet: 50,02 fo C, 7,92 % H, 25,55 fo 0, 15,26 fo N, 0,43 % S, 0,00 fo P, <1 fo Asche. Der Stickstoffgehalt gemäß dieser Elementaranalyse liegt etwas niedriger als der typischer Proteine, was darauf hindeutet, daß im erfindungsgemäß isolierbaren Protein auch Nicht-Proteine enthalten sind. Diese Tatsache wird durch unter Verwendung eines Jod-Schiff Indikators (lodo-Schiff stain) durchgeführter Gelscheiben-Elektrophorese bestätigt. Nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgeführte Prüfungen mit Zuckerreagentien weisen auf die Anwesenheit von etwa 5 fo Kohlehydrat, berechnet als Glukose, hin, welches wahrscheinlich covalent an das Protein gebunden ist.

Bei der Gaschromatographie und der Elektrophorese zeigt sich, daß das erfindungsgemäß isoliert© Protein kein Lipo-Protein ist, d. h. daß es weniger als 0,01 % Lipoid-Phosphor, weniger als 0,1 fo Cholesterin und weniger als 0,05 fo Galaktolipoid enthält und daß wasserlösliche Glyko-Lipoide nicht nachweisbar sind.

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäß isolierbaren Proteinchelats beträgt etwa 28500 £ 10 %. Auf dieses Molekulargewicht bezogen und unter Berücksichtigung des Aechegehaites von 0,3 % enthält dieses Proteinchelat

109885/1766

insgesamt 205 Aminosäurereste und etwa 2g-Atom Metalle pro Mol.

Dieses Molekulargewicht ergibt sich auf osmotischem Wege, aus dem Aminosäurenprofil und durch Gelfiltration auf einer mit Sephadex G-200 (Pharmacia, Inc.) gefüllten Kolonne mit 90 cm Höhe und 2,5 cm Durchmesser und Eluieren mit physiologischer Kochsalzlösung und einem Phosphatpuffer (pH 7>^)» wobei unter Verwendung von Ribonuclease, Chymotrypsin, Albumin uiid. ^-Globulin als Vergleichs standard gearbeitet wird. In diesem Molekulargewicht sind die 5 % Kohlehydrate mitberücksichtigt.

Die Analyse der Aminosäuren ergibt, daß das erfindungsgemäß isolierbare Protein von allen wesentlichen Aminosäuren aufgebaut ist. Es ist im wesentlichen frei von Cystein und anderen schwefelhaltigen Gruppen, d. h. daß es nur einen Cysteinrest/2 und drei Methioninreste pro Mol und keine weiteren schwefelhaltigen Gruppen enthält. Das erfindungsgemäß isolierbare Protein ist beispielsweise hinsichtlich des Aminosäurenprofils deutlich verschieden von Katalase, Arginase und anderen aktiven Proteinen. Es besitzt einen außergewöhnlich niedrigen Gehalt an Serin und Threonin u. zw. liegen hievon pro Mol etwa zwei bzw. vier Reste vor. Dieses Protein enthält reichlich basische Aminosäuren u. zw. 9 Arginin-, 15 Histidin- und 22 Lysinreste. Das erfindungsgemäß isolierbare Metallchelat eines Proteins zeichnet sich somit durch ein ungewöhnlich niedriges Verhältnis von Resten saurer Aminosäuren zu Resten basischer Aminosäuren aus und dieses Verhältnis beträgt 0,565. Bei Proteinen, Rinder-C0₂- -Anhydrase-B, Lacto-Globulin und Rinder-Albumin, welche im Rahmen des Ungar-Testes keine nennenswerte antiinflammatorische Wirkung zeigen ist dieses Verhältnis größer als 0,75.

In den Tabellen Ia und Ib ist nun das Aminosäurenprofil des erfindungsgemäß isolierbaren neuen Metallchelats den Aminosäurenprofilen anderer, aus ähnlichen Quellen isolierten biologisch aktiven Proteinen vergleichend

109885/1756

1917332

gegenübergestellt. Der theoretische Aminosäuregehalt der Probe (86,1 %), unter Zugrundelegung eines aus dem Aminosäurenprofil und dem elementaranalytisch bestimmten Stickstoffgehalt berechneten Paktors (5,64), liegt nahe Tbexmf tatsächlichen Wert (84,41 %), welcher sich aus der Aminosäurenanalyse ergibt. Es wird auch bestätigt, daß das Proteinchelat .eine beträchtliche Menge an organischen Nicht-Proteinen, beispielsweise, Kohlehydrate, enthält.

10988S/175 6

■' ο co

■ »α ■m

Tabelle la

Aninosäuren-Profil (g/lOO g Protein)

Aminosäure	■	Alanin.	Neues	\rginase .	Catalase	CO₂-	saures	Catalase	Appo-	Srythro	Glutamin-
	Arginin.	Protein	Grassraann	Rinder	.\ Vt r\ Y Ψ ^f ^* ^ Π 0K*	Glyco-	aus Rat-„	Ferri-	cuprein	Cyclo-
•	Asparaginsäure	Chelat		leber²	Annyurase aus Blut²	protein	tenleber	tin⁴ -	3 S 1	trans
Cystine/2		■			PlasEia			2,5 \	ierase⁶
Glutaminsäure	4,83	7,14	3,41	3,03	3,20	5_S88		4,75 ;	2,02
Glycin	4,98	5,64	7,09	5,12 ⁿ	3,59	8,54	9^1	4,27	6,26
Histidin	8,41	10,78	9,86	11,58	8,45	14,89	6,8	7,86	10,19
Isoleucin	O,35⁷	Nil	0,95	0,29	Nil	0,96	1,7	3,51	N.D.
Leucin	8,59	11,42	8,54	8,80	11,41	13,27	17,2	10,97-	8,39 "
Lysin	4,15	9",85	2,48	3,73	1,52	4,36	3,4	7,85	4,16
Methionin	7,21	ί,26	6,81	4,14	2,43	4,90	4,8	5,97	2,99
Phenylalanin	3,85	3,53	3^31	1,45	4,10	4,26	1,4	3,74	6,47
Prolin	5,86	10,38	7,42	3,53	9,92	6,93	19,1	6,07	8,76
Serin	9,78	10,87	8,66	6,50	4,60	7,45	7,8	7,86	6,65 .
Threonin	1,30	Nil	2,49 '	1,05	0,88	3,01	1,9	Nil	6,25
Tryptophan	3,62	6,84	6,81	. 4,55	6,01	8,27	6,1	4,37	4,24
Tyrosin	3,05	Nil	3,83	4,54	2,95	7,95	1,5	3,25	2,27
Valin	0,55	6,82	2,57	4,21	3,93	4,29	9	5,18	2,96
	6,57 '	2,81	4,61	4,67	5,00	4_r3	5,54	4,16
1,348	Nil	3,26	•	Nil	2,64	1,2 '	0,34	N.D.
2,98	2,94	6,12	3,16	2,25	5,67	5,0	0,95	5,50
7,18	5,88	5,20	4,01	3,60	6,76	4,3	6,87	4,57

Grassmann et al.,J.Physiol.Chem.,312, 273-S5 (l958) Tristran et al., Adv.Protein Chen.,18, 227-318 (1963] 7 '^ °Higashi T. J. ,BioChera (To!cyo)5G(4)36l-3(Eng. ) * .

entfernen von Fe Nach Entfernen von Cu

Mr_et_al. ,.C.R.Lab.Carlsberg, .35. (l)i-24.(l965

Mikrobiologisch bestimmt· "■ , ^Green et al.,J.Biol.Chem.;155.S.1 (1944) 'modifiziert durch zweistündige Hydrolyse mit lOnNTaOn

*Durch"sehnitt der mit HJ flGhj, HCl (18*0 und HCl (72h') erhaltenen V,'erte

Tabelle Ib

Aiainosliurcn-Profil, Anzahl der Asninosllurcrcste pro Mol auf- bzw. abgerundet

Aminosäure	■	Alanin	S'eues J	Lyso-	12	[tibo-	Car- .	Tyro-'	ß-Lac-	bcstinnii!	37700	Colla- lllinder-	i'@ ·	Pyro- ·	Carl) ox¹	I	3-1000
	Arginin	Protein-!	zyra	1	Nu-	boxy-	sinase	to-	33000	!cc inia	genase I-Albuniri	35"	sinase	Peptid	Zn**
•	Asparagin- . säure	Chclat I	aus	6	clcase	Pepti-	aus	globu-	1-Cu++		•	39 .	aus.cß-	dase B
	Cystinq-l/2	I	Ei	8	A	ase A	Neuro—	lin AB				jaren .
Glutanin- sKure			6			spora .	*-. . ■		69000	Pilzen	*
Glycin	19 I	12	2	12	20	' 24	29	97 48. .	keines	56	22
Histidin	9 I	10-31	3	4	11 .	14	-6.	30 I 23		37	.13
Isoleucin	21 I	21-23	2 -	15	28	31	*31..	85 I 57	114	26 -
Leucin	¹ I	8	12	8	2	o	Ii I	0 30	".0	I ". 7
Lysin	19 I	5	7-8	12	26	2*2	⁴⁹ .	68 1-77 -	102	24
Methionin	21 I	5-6	3	23	19.	7 ■	167 I 17	i 74	Γ ²J
Phenylalanin	15 I		4	8	6	•4	36 Λ 18	. 26	•J
Prolin ■	10	3 ·	3	20 .	Q	19	47 I 14	48	16
Serin	15	6 ·	2	24 .	24	43	61 65.	68	I ²⁰
Threonin	22	18 ·	10	15	12	30	100- 61	40	I ¹⁷ ■
Tryptophan	3		4	3	2	8	Spur; 4	17	*I ^**
	?	lö.QOO	3	•16	17	8	j 35 I 28 ·	48	8 ¹¹S 9 *I j Λ**
Tyrosin	9 .	'ccincs	5.	10 ■	23	17	1 30. J 29	58	12
Valin	2 ·		15	33	32	12	.94 I, 28	41	J -26 ·
AaM-MI ' Ct		Un- I -	10.	27	16	16	75 1 34	I ⁵⁹	I J, Λ.
	2	ler	nicht	8	8	4-5	Nil -2	I nicht	j 10
Molekülar ge v/ich t		DO₂- I	bcsJiijun		•		*1.' - . I**	ι Ibestinniit
Metall	5	\n— ' I	6 .	19s	' 12	8	j 89	33	22
	21	iiydra-J se B I	9	16	17	19	66 '	52	■ 14
13	17 I	17	19	nicht	30	nicht	nicht	23
	7 I			j bestir.nut	bestimmt
2 8Ö00	32 I	13700	31100	109000	1X0000
	1	!ccincs	JL-Zn⁺*	Ca⁺⁴"	-1-Cu⁺*
	23 I
20 I
11
5 *·
26
19.
3
11 ■
20
16"
15.
7

8
20
26

boooo

Der isoelektrische Punkt des neuen erfindungsgemäß isolierbaren Metallchelats eines Proteins liegt etwa bei ' einem pH-Wert von 5,5 - 0,2 und der isoionische Punkt bei 7,92 ί 0,2. Der isoelektrische Punkt wurde durch ■ Elektrophorese auf Zelluloseacetat bei verschiedenen pH-Werten und unter Verwendung eines Zitrat-Phosphat-Puffers ermittelt. Die Transportwege betrugen -5,77 mm bei pH = 4,45, -4,67 mm bei pH = 4,85, - 1,70 mm bei pH = 5,30, -0,50 mm bei pH =5,45, 0 mm bei pH = 5,50, +2,90 mm bei pH = 6,05 und + 4,90 mm bei pH = 6,55. Aus diesen Transportwegen ergibt sich der isoelektrische Punkt bei etwa pH = 5,5. Der isoionische Punkt wurde entsprechend Riddiford, j.Biochem. 239, 1079 (1964) bestimmt. Hiebei wurde das Protein zwecks vollständiger Entfernung von Elektrolyten gründlich dialysiert und anschließend lyophilisiert, worauf 25,8 mg des lyophilisierten Produktes in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und die erhaltene Lösung in eine auf 25° C gehaltene Zelle eingebracht wurden, in welcher sie unter Stickstoffatmosphäre so lange (etwa 40 bis 60 Minuten) belassen wurde, bis sich ein stabiler pH-Wert einstellte. Es ergab sich so ein isoionischer Punkt von etwa 7,92 i 0,02.

Der isoelektrische Punkt und der isoionische Punkt des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins liegen beträchtlich weit auseinander. Offenbar lagert sich das Protein vorzugsweise an jene Anionen an, welche in den Pufferlösungen enthalten sind, in welchen es selbst gelöst ist, so daß letzten Endes das isoelektrische Molekül nicht vom reinen Protein sondern von einem Salz mit den gebundenen Anionen gebildet ist.

Dieser Unterschied zwischen dem isoelektrischen Punkt und dem isoionischen Punkt ist bei den meisten Proteinen nicht die Regel, jedoch wurde bereits für Gelatine ein Unterschied zwischen isoionischem Punkt und isoelektrischem Punkt (D.S. Jackson, et al. Bioch. Biophys.Acta 26, 638, 1957)

- 10 -

109885/1756

und für Enolase (B.G.Malmstrom et al, J.Biοehem., 234, 1108, 1959) berichtet.

Im erfindungsgemäß isolierbaren Metallchelat eines

r Proteins überwiegen die freien basischen Gruppen (46 vom Arginin, Lysin und Histidin stammende basische Gruppen) . über die freien Säuregruppen (27 von der Asparaginsäure und der Glutaminsäure stammende saure Gruppen, 13 der sauren Gruppen der Asparaginsäurereste und Glutaminsäurereste sind in Amid-Bindungen blockiert). Das Überwiegen der freien basischen Gruppen über die freien sauren Gruppen (das Verhältnis beträgt etwa 1,7 J l) ist der Grraid. für die Verschiebung des isoionischen Punktes gegenüber dem isoelektrischen Punkt und stützt, die Annahme, daß das isoelektrische Molekül ein Salz fies Proteins und der daran gebundenen Anionen darstellt irad es wird auch angenommen, daß dieser Umstand zumindest zum Teil zur einzigartigen physiologischen Wirksamkeit des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins beiträgt.

Das Infrarotspektrum des erfindungsgemäß isolierbaren Metallchelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestimmt, typisch für Proteine. In der untenstehenden Tabelle und in Fig. 1 sind die Ultraviolettabsorptionsspektren dieses Proteins bei pH = 1,5 in 0,05 η HCl (Kurve A₂), bei pH =1,5 in 0,05 η HCl +0,10 m KCl (Kurve A₁), bei pH = 7 in Wasser, bei pH = 7 in 0,05 m Phosphatpuffer (Kurve B) und bei pH = 13 in 0,15 m KCl, wobei der pH-Wert mit 1 η KOH auf 13 eingestellt wurde (Kurve C), dargestellt.

- 11 109885/1758

Ultraviolett-AbsorptIonsspektren des neuen Proteinchelats

	•	pH 1,5	0	Optische Dichte	V= 0,15	pH 7,0	ο,	pH 7,0	-	pH 13,Q"
	V= 0,05			,434 mg/ml	H₂O		Puffer	KCl - KOH
	0,560 mg/m]		0,005	1,00 mg/ml		492 mg/ml	0,492 mg/ml
mu	0,066		0,030	0,035		0,00	0,126
310	0,102		0,066	0,090		0,03	0,280
300	0,145		0,129	0,184		0,13	0,353
295	0,236		0,190	0,372		0,18	0,430
290	0,320		0,204	0,510		0,25	0,429
285	0,3^2		—	0,540		0,22	0,430
284	0,355		0,219	0,560		—	_
283	0,369		-	0,570		0,29	0,438
282	—		0,244	0,580		-	_
281	0,377		0,226	0,585		0,30	0,430
280	—		0,227	0,590		-	—
279	0,384		0,228	0,592		0,30	0,420
278	-		0,226	0,590		-	_
277	0,385		0,225	0,588		0,30	0,411
276	0,385		0,206	0,580			0,410 ·
275	0,364		0,179	0,538		0,27	0,422
270	0,330		0,144	0,475		0,23	0,471
265	0,284		0,117	0,400		0,19	0,592
260	0,247		0,104	0,337		0,15	0,845
255	0,226		0,134	0,315		0,13	1.150
250	0,263		0,272	0,402		0,18	1,45
245	0,432	.—	0,190		0,37	1,70
240	—	-	1,80	—
230

Wie der Fig. 1 entnommen werden kann, sind die im sauren Milieu und im alkalischen Milieu ermittelten Absorptionsspektren des Proteinchelats beträchtlich verschieden von dem bei pH = 7 erhaltenen Absorptionsspektrum. In Anbetracht dieser Unterschiede können Ultraviolett-Differenzspektren dadurch bestimmt werden, daß die UV-Absorption des in einem Test-Lösungsmittel gelösten Proteins gegen die IW-Absorption

- 12 -

101888/1750

des mit gleicher Konzentration in einem Bezugslösungsmittel gelösten Proteins photometrisch bestimmt wird. Solelae Differenzspäctren sind hei der Beurteilung der Art fies Efnhaus aromatischer ,Aminosäuren und des Cysteins in Proteine wertvoll £siehe Wetlaufer, Adv. Protein Chemistry^ 17, 346 (1962), Riddiford et al«, J.Biol. Chem. 259, 1029 (1964); 240, 168 (i965)J· Tryptophan und Tyrosin tragen hauptsächlich zur Absorption im Bereiche zwischen 270 his 300 mu hei. Auf Phenylalanin ist die Feinstruktur im Bereich um 250 mji zurückzuführen; Phenylalanin adsorbiert jedoch nicht oberhalb 270 mil. Sowohl Tryptophan als auch Tyrosin und Cystein können zu einer Absorption im Bereiche von 235 bis 245 mn beitragen. Die in Fig. 2 gezeigten Kurven wurden bei 25° C im Spektrophotometer nach Hitachi-Perkin-Elmer Model No. 139 und unter Verwendung geschlossener (matched) Küvetten erhalten. Das Instrument wurde so kompensiert, daß sich bei allen pH-Werten eine flache Grundlinie ergab. Bei im alkalischen Bereich liegenden pH-Werten stellten sich die Endwerte rasch ein und blieben zwei Stunden konstant, während bei im sauren Bereich liegenden pH-Werten zwei Stunden erforderlich waren, um einen):Gleichgewichtszustand zu erreichen. Die Kurven ergeben sich aus unter den folgenden Bedingungen erhaltenen Meßwerten:
(Konzentration des Proteins: 0,502 mg/ml)

Kurve A. Vergleich: 0,05.m KgHPO^+0,1 m KClj pH 7»0 Probe: 0,1 m KCl + 0,05 m KCl; pH 1,5

Kurve A₂ Vergleich: 0,05 m K₃HPO^j pH 7»04

Probe: 0,05 η HCl; pH 1,5 (Konzentration des Proteins: 0,492 mg/ml)

Kurve B, Vergleich: 0,05 m KgHPQ^+ 0,1 m KOl; pH 7,06 Probe: 0,15 m MKCl + η KOH; pH 13

Bei pH s 13 scheinen alle Tyrpsinreste des Proteine dem Lösungsmittel frei zugängig zu selb und damit augenblicklich zu ionisieren, während hei einem pH-Wert von 1,5 sogar bei'

- 13 -

109885/17S6

einer Ionenkonzentration von 0,05 m die Tyrosinreste teilweise dem Zugriff des Lösungsmittels entzogen sind. Das Proteinmolekül zeigt sich somit im alkalischen Milieu stärker aufgefaltet.

Im sauren Milieu ist das Protein bei einem pH-Wert von 5>5 zum. Teil unlöslich, jedoch beginnt es sich bei einem pH-Wert ,von 2 wieder aufzulösen. Bei einem pH-Wert von i,5 wird das Protein wieder zur Kränze gelöst. Bei Bestimmung des Differenzspektrums im sauren Milieu sind die Absorptionsmaxima im Bereich von 292 bis 294 mü auf Tryptophan und jene im Bereich von 285 bis 287 mp auf Tyrosin und zum geringen Teil auf Tryptophan zurückzuführen, während Phenylalanin Änderungen in der Feinstruktur von 250 bis 265 mu bewirkt. Es ergibt sich ein· auffälliger Unterschied zwischen den im sauren Milieu bei Ionenkonzentrationen von 0,05 m und 0,15 m ermittelten Differenzspektren. Bei einer Ionenkonzentration von 0,05 m finden sich von 280 bis 296 mu keine ausgeprägten Absorptionsmaxima, jedoch zeigt sich bei 29^ bis 296 mu ein Plateau und eine breite Schulter von 285 bis 290 mu vor welcher bei 280 bis 282 χψ ein niedrigeres Plateau liegt. Bei einer Ionenkonzentration von 0,15 m zeigt sich bei 294 bis 296 mix weder ein Absorptionsmaximum noch ein Plateau, sondern ein breites welliges Plateau im Bereiche von 278 bis 285 mn mit einer Schulter bei 286 bis 290 ταμ.

Es besteht Grund zur Annahme, daß bei einem pH-Wert von 1,5 das Plateau bei 292 bis 296 mp auf Umlagerungen der zwei Tryptophanreste im Molekül des Proteins zurückzuführen ist. Die Schulter bei 287 bis 290 mu wird wahrscheinlich zum Teil durch die Tyrosinreste im Molekül erzeugt. Bei einer Ionenkonzentration von 0,15 m scheinen die Tryptophanreste nahezu vollkommen abgeschirmt zu sein, was bei einer Ionenkonzentration, von 0,05 m nicht der Fall ist. Die bei beiden Ionenkonzentrationen erhaltenen Spektren sind hinsichtlich der auf Tyrosin zurückzuführenden Absorptionsmaxima

- lh 109885/1756

ziemlich abnormal. Das bei. anderen Proteinen übliche Absorptionsmaximum bei etxra 285 m& fehlt bei einer lonenkonzentration von 0,15 m völlig und ist bei einer lonenkonzentration von 0,05 m zu einer schwachen Schulter degeneriert. Aus der Absorptionskurve von 284 bis 288 ma ergibt sich, daß die Tyrosinreste im Molekül des Proteins gut eingehüllt sind und damit dem Angriff des Lösungsmittels entzogen sind.

Bei der Gelscheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid gibt das erfindungsgemäß isolierbare Metallchelat des Proteins ein typisches Bild mit drei nahe beieinander liegenden Bändern sowohl bei einem pH-Wert von 9 9 4 als auch bei einem pH-Wert von 3>8 (fließendes GeI)₀

Diese Arbeitsweise beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis, Ann. N.Y. Acad.Sci. 121, 321 und "404 (1964) und von Williams und Reisfeld, Nature 195, 281 (1962), wobei zwecks besserer Auflösung, zwecks Erzielung schärferer Banden und zwecks Erzielung verläßlicher Fließbedingungen verschiedene Abänderungen getroffen wurden.

Es wurden unter anderem folgende Versuchsbedingungen eingehalten:

pH 9,4

1) Vorbehandlung: 2 mA pro Rohr während 1,5 Stunden bei

konstantem Strom, nur fließendes Gel.

2) Elektrophorese: $ mA pro Rohr während 50 Minuten bei

konstantem Strom, für 12 Rohre daher 60 mA, 140 V zu Beginn bis 320 V am Ende.

3) Anfärben: 16 Stunden in einem Gemisch aus 10 %

Eisessig, 20 % Methanol und 70 $ Wasser, wobei das Gemisch pro 100 ml 15 mg Amido-Black gelöst enthielt.

4) Entfärben: 12,5 mA pro Rohr und Stunde bei

konstantem Strom.

— 1" —

109885/1756

pH 3,8 .

1) Vorbehandlung: keine

2) Elektrophorese: 6 mA pro Rohr und Stunde bei konstan

tem Strom, für 12 Rohre daher 72 mA, " 100 V zu Beginn bis I60 V am Ende. 16 Stunden in der oben angegebenen Lösung. -■ .„

5,5 mA pro Rohr und Stunde bei ■ konstantem Strom.

. Typische Elektrophorogramme des Metallchelats des Proteins enthält die untenstehende Tabelle, in welcher sämtliche Werte Näherungswerte darstellen.

3) Anfärben:

4) Entfärben

	Breite in mm	I VJi O O I	pH	9,4	5 0 0	Relative Inensi- tät in %	Breite in mm	2 4 2	pH	3,8
	1, 1, 0,	Abstand vom Ur sprung in mm-·-		100 89-93 48-52	1, 0, 1,	Abstand vom Ur sprung in mm¹	Relative Intensi tät in %
oberes Band mittleres Band unteres Band	11, 14, 18,		16,5 20,0 22,0	100 53-56 94-96

oberer Rand, Gesamtlänge des fließenden Geles: 56 mm

Im Hinblick auf die offensichtliche Einheitlichkeit ■ des erfindungsgemäß isolierbaren Metallchelats eines Proteins, wie sie sich beim Ültrazentrifugieren, bei der Gelfiltration, beim Chromatographieren über Ionenaustauschharz en, wie DEAE-Sephadex, aus dem Aminosäurenprofil usw. ergibt, wird angenommen, daß die sich bei der Gelscheibenelektrophorese zeigenden typischen drei Banden auf eine' Aufspaltung einer Bande zurückzuführen ist, welche Aufspaltung Pufferwirkungen im elektrischen Feld zugeschrieben werden kann und nicht auf die Anwesenheit dreier

- 16 108885/1756

verschiedener Proteine im Metallchelat des Proteins hinweist. Bei der Gelelektrophorese bewegt sich das erfindungsgemäß isolierbare Protein langsamer als Albumine und schneller als ^-Globuline.

Beim Ultrazentrifugieren bewegt sich das erfindungsgemäß isolierbare Protein in Form eines einheitlichen, scharfen Bandes weiter, wobei der Sedimentationskoeffizient etwa 3,72 £ 0,05 Svedberg-Einheiten beträgt.

Die Verschiedenheit eines erfindungsgemäß isolier-, baren Metallchelats eines Proteins von Proteingemischen, welche in durch Extraktion von Rinderleber mittels 0,1 m Magnesium-(Tris-maleat) erhaltenen Extrakten gelöst enthalten sind (0,l M tris-maleate Mg⁺⁺ soluble components of bovine liver proteins) bzw. von aus solchen Extrakten erhaltenen weitgehend gereinigten handelsüblichen Fraktionen, welche Arginase und andere Enzyme enthalten, zeigt sich augenfällig bei der Prüfung der für die Elektrophorese der erwähnten drei Stoffe nach der GelScheibenelektrophorese verwendeten Proberohre, wenn als Trägerpolymer Polyacrylamid verwendet wurde und während 50 Minuten bei 5° G mit konstantem Strom von 5 mA bei von ilO auf 300 V ansteigender Spannung gearbeitet wurde. Die Zusammensetzung des Rinderleberextraktes ist so kompliziert, daß nur eine äußerst geringe Auflösung erzielt werden kann und große Mengen des Ausgangsmaterials im Probengel verbleiben. Der handelsübliche Enzymextrakt ist zwar weniger kompliziert zusammengesetzt, liefert jedoch noch immer eine Vielzahl von voneinander nur unvollständig getrennten Banden und auch in diesem Falle verbleiben beträchtliche Mengen des Ausgangsmaterials im Probengel· Das erfindungsgemäß Isolierbare neue Protein scheint im Gel im wesentlichen höchstens in Form dreier nahe beieinander liegender, jedoch deutlich voneinander getrennter Bänder.auf,. welche vom Ursprung 10,5 mm» 14,5 nm bzw. 18,0 mm entfernt slnd_r Im Probengel verbleibt nichts. ί '

- 17 109885/1756

Das erfindungsgemäß isolierbare Protein liegt zumindest zum Teil in Form eines Metallchelates vor, u. zw. enthält es etwa zwei Metallatome pro Porteinmolekül (two gram atoms of metal per protein molecule). Der Metallgehalt des Proteins . schwankt zwischen etwa 0,1 bis i,0 %. Bei den sich als am wirksamsten erweisenden Proben liegt der Metallgehalt zwischen 0,25,und 0,75 %» Das Ausmaß der pharmakologischen Wirkung des Metallchelates scheint zumindest zum Teil von der Anwesenheit eines oder mehrerer physiologisch wesentlicher zweiwertiger Metallionen im Chelat abzuhängen. Aus diesem Grunde werden in das Metallchelat vorzugsweise zumindest 65 %, besser mindestens 75 %, und insbesondere 85 % Metall eingebracht u. zw. in Form mindestens eines der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn und Cu. Zwecks Herstellung von Metallchelaten höchster Wirksamkeit wird dafür gesorgt, daß zumindest hO % des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65 bis 0,79 Ä, beispielsweise Magnesium, gebildet sind. Solche Metalle können beispielsweise dem Buch von Hall. "Chemistry and Physics", 44. Auflage, Seiten 3507 bis 3508 (1962) entnommen werden. In den meisten solchen Chelaten ist eines dieser Metalle auch das vorwiegende Metall. Unter dem "vorwiegenden Metall" ist hiebe! jenes chelatierende Metall zu verstehen, welches im Proteinchelat mit dem höchsten Anteil enthalten ist. Obzwar in den die stärkste Wirkung zeigenden Metallchelaten des Proteins der größte Teil des Metallgehaltes auf physiologisch wesentliche zweiwertige Metalle zurückzuführen ist, enthalten typische Metallchelate auch andere Metalle, wie in Tabelle II gezeigt ist. Diese weiteren Metalle werden häufig während der Isolierung des Proteins von diesem aufgenommen z. zw. insbesondere dann, wenn der Gesamtmetallgehalt des Proteins relativ niedrig ist. Dies kann dann vermieden werden, wenn das Protein in einer Pufferlösung verwahrt wird, die ein physiologisch wesentliches zweiwertiges Metall in einer die Aufnahme von Fremdmetallen durch das Protein

- 18 -

109885/1756

ausreichend hohen Konzentration als Kation enthält und/oder wenn das Protein nur mit Anlagenteilen in Berührung kommt, die keine solchen Metalle enthalten.

Die wirksamsten Chelate enthalten weniger als 10 % * physiologisch unwesentlicher Metalle, beispielsweise Al, Si und B. Der hohe Siliziumgehalt der in der Tabelle II angeführten Proben "6501 B" und ¹¹EXP-FE" ist mutmaßlich darauf zurückzuführen, daß während der Elektrophorese schwer entfernbare Verunreinigungen aufgenommen wurden. Anderseits ergibt sich aus der niedrigen anti-inflammatorisehen Wirkung der Probe ¹¹EXP-FE", daß ein zu niederer Gehalt des Proteins an physiologisch wirksamen zweiwertigen Metallen die Wirksamkeit des Chelats abträglich beeinflußt. (Die geringe Wirkung der Probe "31 B" ist auf die An~ Wesenheit einer größeren Menge eines anderen Proteins zurückzuführen). Der Calziumgehalt der Proben "ESP-FE⁵¹J "6501 B" und "6502 B" ist gering, jedoch ergibt sich aus einem Vergleich der Wirksamkeit dieser Proben, daß die geringe Wirksamkeit der Probe "EXP-FE" nicht auf den geringen Calziumgehalt zurückzuführen ist. Die miteinander Vergleichbaren Kupfergehalte der Proben "EXP-FE" und "642 B" weisen darauf hin, daß dieses Metall nicht kritisch ist. Da die Probe "642 B" kein Zink enthält, scheint dieses Metall keinen wesentlichen Einfluß zu haben. Mutmaßlich enthält die Probe "EXP-FE" zu wenig Magnesium, jedoch ist die niedrige Wirksamkeit dieser Probe mit größerer Wahrscheinlichkeit auf den kumulativen Einfluß der unzureichenden Mengen aller erwünschter zweiwertiger Metalle zurückzuführen. Das Protein aus "Stufe B", ein im Rahmen der Isolierung erhaltenes Zwischenprodukt, weist bestenfalls nur die Spur einer anti-inflammatorischen Wirkung auf, obzwar es weitgehend gereinigt wurde und dies weist deutlich darauf hin, daß die Wirksamkeit des Proteins nicht nur von der Anwesenheit erwünschter zweiwertiger Metalle, sondern auch weitgehend von der Abwesenheit fremdartiger Proteine abhängt, welche die Wirkung blockieren.

- 19 1098 8 5/175 6

Einwertige Metalle wie Na und K und Zellgifte darstellende Metalle, wie Pb, Cr, Se usw., sind in Metallehelat selbst vorzugsweise nur in Spuren vorhanden.

Gemäß der Erfindung wird das erwünschte Protein zumindest teilweise gereinigt, vorzugsxieise isoliert, während es in Form eines Metallehelats vorliegt, dessen vorwiegend vorhandenes Metall einen Ionenradius von 0,65 bis 0,79 Ä besitzt. Wenn ein Chelat isoliert vorliegt, dessen vorwiegend vorhandenes Metall einen kleineren oder größeren Ionenradius besitzt (beispielsweise Mangan mit dem Ionenradius 0,80 Ä oder Calcium mit dem Ionenradius von 0,99 $), so kann dieses durch Transchelatierung in ein Chelat übergeführt werden, dessen vorwiegend vorhandenes Metall einen Ionenradius von 0,65 "bis 0,79 $ besitzt. Bei einer solchen Transchelatierung wird das umzuwandelnde Chelat mit einem Überschuß einer ein wasserlösliches Salz des erwünschten Metalles enthaltenden Pufferlösung behandelt, wobei das Verhältnis von Metallion zu Protein so eingestellt wird, daß das Protein in der gewählten Pufferlösung als Metallchelat eines solchen Metalles verbleibt.

- 20 -

109885/1756

Tabelle II Spektographische Metallanalyse des Protein-Metallchelats

2lernent	EXP-FE	Asche	%	,81	3IB	gereinigtes	%	Proteinchelat	Asche	642B	Asche	4	%	650Σ	Asche	*	%	%	02R(	17	A. )	•	8	%	Proben aus	JJ
	% der	in	96		% der		23	6501B	in %	% der	in		04	% der	in		48		der	027	\sche		60"		Asche
	Probe	2,	88		Probe		89	% der	51,51	Probe	41,		50	Probe	10,		18	Probe	0043	Ln	V.	47	% der	in % '
	0,009	7,	94		0,470	Asche	90	Probe	2,09	0,290	45,		55	0,032	25,	62	o,	,039	59,		52	Probe	0,56
Magnesium	0,024	3,	21		0,120	in	,45	0,320	9,34	0,320	2,		0,077	2,	25	o,	,013	9,		,68	0,013	3,08
Calcium	0,012	8,	81		0,037	62,	,65	0,013	8,85	0,018		,40	0,008	38,	,69		,008;	1,		,56	0,110	1,88
ld X S GE.	0,025	1,	87		0,041	15,	,97	0,058	3,54	0,0	0	,69	0,117	15	,21	0	,0	13		,'84"	0,067	—
Zink	0,006	8,	27		0,020	4,	,58	0,055	2,58	0,003	1	,08	0,048	6		0	,024	4			0,0	0,29
Kupfer	0,027	4,	49,32	0,030	5	,86	0,022	6,92	0,012	4	,28	0,019		,63	0	,0	2	,42	0,009	86,90
Mangan	0,013	12	0,027	2	,46	0,016	13,25	0,030	4	,40	0,0	1	_	0	,0		3,100	3,64
Aluminium	0,150		0,006	3		0,043	0,97	0,031	Ö		0,005		_	0	,0		0,130	2,42
Silizium	0,039		0,004	3		0,083	_	0,003			Spur		_	0	,0		0,072	_
Bor	0,0		0,0	0		0,006	0,64	0,0		MP	0,0			0	,0 „		0,0	0,96
Blei	0,0		0,0	0		0,0	—			0,0		_	0	Spur		0,027	0,15 l>
Nickel	0,0		0,0			0,004	0,32	0,0		0,0	-	0	0,2854		0,006	0,08 "*
Chrom	0,0		0,0			0,0	■ . —	0,0		0,0		0			0,003	0,02
Silber	0,0	0,0		0,002		0,0		0,0			0,001	Na Cl
Natrium	0,304	0,755		0,0	0,707	0,306			28,30$
rPotal		0,622			3.5S8³

Glühverlust 99,36%

98,1

98,4%

Relative I Ani;iinflaBi~ matorische Wirkung

2,5

97,3% 99,5%

60 265

99,51%

310

¹MG⁺⁺-Puffer

²Mn⁺⁺-Puffer

unter Ausschluß von NaCl

109885/1756

67,3

GO CO N)

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbare. Protein zeichnet sich im wesentlichen durch die Abwesenheit anderer Proteine aus, welche die in den Rohstoffen enthaltene Vorstufe des erwünschten Proteins begleiten, u. zw. enthält es weniger als 10 Gew.-% solcher Proteine, Solche andere Proteine, insbesondere Albumin, verdecken oder zerstören die physiologische Wirksamkeit des im erfindungsgemäß isolierbaren Produkt enthaltenen Proteins. Bereits 10 % Albumin können die pharmakologische Wirkung beträchtlich verringern, und wegen der Erzeugung von Allergie (allergenicity) durch Albumin ergibt sich ein· Unsicherheitsfaktor bei der Verabreichung an Menschen. Das erfindungsgemäß isolierbare Produkt ist im wesentlichen frei von Albumin und enthält hievon weniger als 6 fo_f vorzugsweise weniger als 1,5 ^. Der Albumingehalt kann fluorometrisch bestimmt werden, wie von Rees et al., J.Clin.path., 7, 336-3^0 (1954) angegeben wurde, welche 8-Anilino-l-naphthalin-sulfonsäure verwenden und von Betheil, Anal» Chem., 32, 56O-563 (i960) angegeben wird, welcher Vasoflavin verwendet.

Wie oben erwähnt, ist die physiologische Wirkung des Metallchelats des Proteins auf dessen Gehalt an bestimmten Chelatierungsmetallen und auf seine weitgehende Reinigung zurückzuführen. Die physiologische Wirkung ist aber auch darauf zurückzuführen, daß das Chelat hauptsächlich schraubenförmig aufgebaut ist, d. h. daß es zumindest über SO ^c'i seiner Moleküllänge, wahrscheinlich über eine wesentlich größere Länge, solche Schraubenstruktur besitzt und dies ist auf den geringen Anteil an "kettenabbrechenden" AninosUureresten in den insgesamt vorliegenden Aminosäureresten zur Lic U ·■ zuführen (weniger als 15 % Reste von Serin, Threonin, Prolin, Cystein und Isoleucin), was den Transport von der Injection;. stelle zum Ort der Wirkung ermöglicht, ohne daß der Molekülaufbau durch Körperenzyme oder andere ICörpereinfHisse verändert würde. Die pharmakologische Wirksamkeit ist weitet β auch darauf zurückzuführen, daß freie basische Gruppen

BADORIGfNAL

- 22 -

103385/1756 fif

aufweisende Aminosäurereste die freie Säuregruppen aufweisenden Aminosäurereste um einen Paktor von etwa 1,7 - 05 % überwiegen, welche zahlreiche spezifische Tfirlsungs- Zentren bilden, die an jenen intrazellularenLokationen (Lysosome, Ribosome, Mitochondria) zur Wirkung gelangen, wo die spezifische pharraakodynamische Wirkung des Proteinclielats erforderlich ist.

In zahlreichen Quellen natürlicher Eiweißstoffe sind Spuren der natürlichen Vorstufe des im erfindungsgemäß isolierbaren Produkt enthaltenen Proteins enthalten. Solche Quellen können tierische Organe bzw. Gewebe, beispielsT\^reise Leber, Niere, Hoden, Pankreas, Placenta, Darmschleimhaut, Tlijnnus, Lunge, Milz von Kaninchen, Schafen, Rindern, SeliTv^reinen und Menschen, Meerestieren, Plunder, Heilbutt, Schwertfisch, Muscheln, Hummer, Auster, sein. Auch pflanzliche n, wie" Samen,. Weizerikeiirilinge,■"■■ ungeschälter Reis, Lima und Jackbeans sind brauchbar. Auch eßbare Pilze und Mikroorganismen, wie Fungi und Bakterien sind brauchbar. Beispiele hiefür sind Hefe, E.CoIi, Cl. Hystolyticuni, Ci.Klujaceri, CandeMycoderma, Cl*¥elehii and Achrom.Fisheri, Da die natürliche Vorstufe des erfiiidungsgemäß isolierbaren Produkts labil ist, soll mit der Isolierung sobald als möglich nach Gewinnung, der Eiweißquelle begonnen werden.

Nach geeigneter Vorreinigung und nach Bildung des geeigneten Chelats kann die Anwesenheit des erwünschten Proteins in einem Proteingemisch durch Trennung der Proteine mittels Gelscheiberi-Elektrophorese, beispielsweise in der oben beschriebenen Weise, nachgewiesen werden. Die Anwesenheit des erwünschten Proteins ist an den typischen zwei bis drei Bändern zwischen den schnell wandernden Albuminen und den langsam wandernden ^»»Globulinen zu erkennen.

Unter Vex~wendung von Argarose durchgeführte Elektrophorogramme können zur angenäherten Bestimmung der Konzentra-. tion des erwünschten Proteins im Proteingemisch herangezogen werden. Zu diesem Zwecke kann bei einer Konzentration der

Probe von 10 bis 100 mg/ml in 0,05 m (Tris-glycin)-Puffer bei pH 8,45 mit 5 mA und 188 V J>0 Minuten gearbeitet werden. Analytisch besitzt diese Methode gegenüber der Gelscheiben- . Elektrophorese den Vorteil, daß wegen der nahe dem Zentrum der Platte liegenden Probe die wandernden Proteine sowohl kathodisch als auch anodisch sichtbar gemacht werden können.

Häufig, wenn auch nicht stets, ist in der natürlichen Eiweißquelle die Vorstufe des erwünschten Proteins von enzymatische Wirkung besitzenden Proteinen, wie Arginase, COg-Änhydrase, Phosphokinase., Aminosäureoxydase, Collagenase, Diaminoxydase, Diaphorase, Lipase, Uricase, Peptidase, Hyaluronidase us\v., begleitet. Um eine an der natürlichen Vorstufe des erwünschten Proteins angereicherte Fraktion aus natürlichen Eiweißquellen zu gewinnen, können übliche Methoden zur Isolierung von solche Enzjnne enthaltenden Fraktionen angewendet werden-., soferne frische Eiweiß quell en verwendet werden und durch diese Methoden das erwünschte Protein nicht zerstört wird, (siehe R.M. Morton in "Methods in Enzymology", Colowick und Kaplan Editors, Bd. 1, S. 25-51, Academic Press, New York (1955)).

Die natürliche Vorstufe des im erfindungsgemäß erhaltenen Produkt enthaltenen Proteins ist in den Fraktionen natürlicher Proteine nur in äußerst geringen Mengen enthalten. Diese Vorstufe konnte bisher noch nicht festgestellt werden, da zu wenig Sorgfalt für den Schutz der höchst labilen Vorstufe des erwünschten Proteins vor Zerstörung verwendet wurde. Darüber ,hinaus waren übliche Aufarbeitungsmethoden nicht dafür brauchbar ohne Zerstörung oder gleichzeitige Abtrennung des erwünschten Proteins aus den Ausgangsmischungen die unerwünschten Proteine zu entfernen.

Im Rahmen einer bevorzugten Methode zur Isolierung des. Proteins der beschriebenen Art aus Proteingemischen wird eine Gel- oder eine "Zonen'^Elektrophorese durchgeführt, womit vom erwünschten Protein die auf andere Weise praktisch nicht abtrennbare Albumine und ^-Globuline abgetrennt werden, ;

- 2Λ -

109885/175 6

Die Entfernung des Albumins ist nun aber aus den oben angegebenen Gründen wesentlich. Wenn übliche Methoden zur Aufarbeitung von Pröteingemisehen verwendet würden, würde, wie aus Tabelle III hervorgeht, der Gehalt des erwünschten Proteins an Albumin eher erhöht als verringert werden.

Tabelle III -

- Albumingehalt des

Proteins in$

Lösliche Froteinfraktionen

Rinderleber 7,5

Rinderniere 8,0

Schweinsniere 9,6

Rindermilz 2,5

Auster 2,5

Muscheln 2,0

Konzentrierte Fraktionen

31 22,0

6501 ' 26Ϊ5

6502 31,0

Gereinigte Fraktionen

3,1B (Elektrophorese in frei-'

fallender Schicht) ?,Q

65OiB (Elektrophorese in freifallender Schicht) 5,5

6502B (GelelektrOphorese)

6502B (Chromatographieren
auf Sephadex)

Entspricht dem gemäß dem "Präparat" erhaltenen Proteingemisch. -

Wie der Tabelle III entnommen werden kann, wird das Albumin angereichert, soferne keine Elektrophorese oder Gelfiltration durchgeftifert wird, womit ein Produkt erhalten wird, das nicht mehr mit der erforderlichen Sicherheit zu

Injektionszwecken verwendet werden kann und auch nicht mehr eine brauchbare pharmakologische Wirksamkeit besitzt. Bei
Elektrophorese in freifallender Schicht wird zwar ein Groß-, teil des Albumins abgetrennt, jedoch erfolgt die Abtrennung des Albumins bei Gelelektrophorese und Gelfiltration in
einem höheren,Ausmaße.

Eine im Handel erhältliehe· Einrichtung zur Durchführung von Elektrophoresen, welche für die Elektrophorese in freifallerider Schicht verwendet werden kann, ist das Modell FF von Brinkmann. Die Trennkammer in diesem Brinkmann-Gerät ist quadratisch mit 50 cm Seitenlänge und 0,5 his 1,0 mm tief. Die Temperatur wird so nahe als möglich bei 5° C gehalten. Das Gerät ermöglicht das Auffangen von h8 Fraktionen. Bei Verwendung in geeigneter Weise vorgereinigter Proteingemische findet sich das gewünschte Proteinchelat in den Fraktionen 10 bis 26, welche miteinander vereinigt und sodann dialysiert und lyophilisiert v/erden. Im Betrieb wird das Protein in einem (Tris-Maleat)-Mg⁺*-Puffer mit einem pH von 7,6 gelöst, kontinuierlich aufgegeben. Bei einer Spannung von etwa 1000 V wird mit einem Strom von etwa 10 bis 20 mA gearbeitet. Der Aufbau dieses Gerätes und die einzuhaltenden Arbeitsbedingungen beschränken die Kapazität dieses Gerätes auf die Verarbeitung von Chargen zu je 500 mg. Das isolierte Protein wii-d in Chargen von etwa 100 -mg erhalten, die anschließend miteinander vereinigt werden. Unter Einhaltung dieser Arbeitsweise kann der Albumingehalt auf etwa 5 Ms 10 % verringert werden. In der Regel kann der Albumingehalt nicht unter 5 f» verringert werden.

Eine bessere Reinigung läßt sieh durch Gel- oder "Zonen^-Elektrophorese erzielen, im Rahmen der selben ein Gel, beispielsweise aus Polyacrylamid, Zellulose, Stärke usw., als Trägermedium verwendet wird. Auf diese Weise können Albumine und^-Globuline im wesentlichen vollständig entfernt werden.

- 26 .-1098 8 5717

Vorzugsweise wird für die Gel-Elektrophorese ein Trägermeditim aus Polyacrylamid (5 bis 10 %) verwendet. Zellulose, quervernetztes Dextran (Sephadex, Pharmacia, Uppsala, Schweden) und modifizierte Stärke (äthanolisiert, DEAE), Agar-Agar, Sucrose-Agar-Agar und andere Agar-Agar-Präparate können ebenfalls in zufriedenstellender Welse verwendet "werden, besitzen jedoch den Nachteil, unbeständiger zu sein. Die Prinzipien der Gel- bzw. Zonen-Elektropliorese sind beispielsweise in "Gel-Electropliorese" von J.P. Fredrick Editor, Annals N^Y, Academy Sei., 121, 305-650 (1964) beschrieben.

■Ein für Produktionszwecke geeignetes Gerät für die Gelscheibenelektrophorese besitzt einen 32 cm langen, 10 cm breiten und 1 cm starken Block aus 5 bis 7. $-igem Polyacrylamid, welcher zwischen an seiner Oberseite und Unterseite liegenden Platten aus durchsichtigem Kunststoff eingespannt ist. Die Abmessungen des Blockes sind also solche, daß eine wirksame Kühlung gegeben ist, wobei die geringe Dicke die rasche Einstellung eines Temperaturgreichgewichtes zwischen der Mitte und den Seitenflächen ermöglicht. Die Kühlung erfolgt mittels eines Gemisches aus Äthylenglykol und Wasser, das laufend umgewälzt und gekühlt wird. Gearbeitet wird bei einer Spannung von 6OO bis 1000 V und mit einer Stromstärke von 200 bis 500 mA. Diese hohe Stromstärke ermöglicht zusammen mit der wirksamen Kühlung die Verarbeitung von Chargen an Proteingemischen zu je 1 bis 5g innerhalb einer Entwicklungszeit von 2 bis h Stunden, Das Material wird einem Starttrog in Form einer hochkonzentrierten Lösung in einem (Tris-maleat)-Mg⁺⁺-Puffer von einem pH-Wert von 7,^;± zugeführt. Mittels eines in rechtem Winkel zur Wanderungsrichtung der elektrophoretisch geförderten Stoffe durch das Gel hindurchgeleiteten Puffers wird das Protein eluiert. Die Lage der Proteinbanden, die Vollständigkeit der Eluierung und die Konzentration des Proteins in den « eluierten. Fraktionen wird spektroskopisch bei 280 mti bestimmt.

5 6

Bei der Gelelektrophorese findet sich das gewünschte Protein zwischen dem langsam wandernden ^"-Globulin und dem' schnell wandernden Albumin,

Eine weitere vorzugsweise anzuwendende Methode zur Abtrennung des Albumins und anderer unerwünschter Proteine besteht im Chromatographieren, wobei beispielsweise als stationäre Phase poröse Harze verwende't werden, welche Proteine nach ihren Molekulargewichten geordnet herausfiltern und so als Molekularsiebe wirken. Ein solches Harz ist beispielsweise Sephadex G-IOO (Pharmacia Upsala, Schweden), welches in quervernetztes Dextranharz (dextran resin) definierter Porengröße darstellt. Das in einem,zweiwertige Metalle enthaltenden Puffer gelöste, teilweise gereinigte Protein wird in hochkonzentrierter Form auf eine mit dem Harz gefüllte Kolonne aufgegeben und dann in der für das Chromatographieren üblichen Weise eluiert, wobei für das Eluieren eine Pufferlösung verwendet wird, welche ein zweiwertiges Metall mit einem lonenradius von 0,65 bis 1,00 Ä, vorzugsweise 0,65 bis 0,79 Ä, insbesondere Magnesium, enthält. Eine Erhöhung der lonenkonzentration erleichtert hiebei häufig die Trennung und das anschließende Eluieren.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das im zu isolierenden Produkt enthaltene gewünschte Protein von allen oder im wesentlichen von allen Proteinen getrennt, welche in den natürlichen Rohstoffquellen ebenfalls enthalten sind. In zumindest einer Reinigungsstufe, vorzugsweise zumindest in der letzten Reinigungsstufe, liegt das Protein in Form eines Metallchelates vor, in welchem das vorwiegende Metall ein zweiwertiges Metall mit einem lonenradius von 0,65 bis 0,79 Ä ist. Wenn das in irgend eine Reinigungsstufe eingeführte Protein bereits in Form eines solchen Metallchelates vorliegt, kann diese Reinigungsstufe in Gegenwart einer solchen Menge eines zweiwertigen Metallions mit einem lonenradius von 0,65 bis 0,79 $ durchgeführt werden, welche sicherstellt, daß das Protein die erwähnte Form

- PR -

ti% f% ft f'M f¹ i <■- '&t ^-r* "'

beibehält» Wenn jedoch das Protein in einer anderen Form, beispielsweise in Form eines Metallehelates vorliegt, dessen vorwiegendes Metall, wie z. B. Mangan, einen Ionenradius von 0,80 Α oder mehr aufweist, wird vor oder im Zuge einer solchen Reinigungsstufe eine Transehe1atierung vorgenommen.

Es können hiebei an sich bekannte Methoden zur Transchelatierung verwendet werden, soferne sie in geeigneter Weise modifiziert werden. Die Wahl der Arbeitsbedingungen unterliegen in Anbetracht des Umständes einigen Einschränkurigen, daß das Protein in Abwesenheit von chelatierenden Metallen und bei Temperaturen oberhalb 5° C und bei pH-Werten unterhalb 1,0 bzw» oberhalb 11,0 labil ist und die Löslichkeit bei pH-Werten von etwa 4 bis 6 gering ist.

Bei der Transehe1atierung des Proteins ist es nicht jederzeit erforderlich, das zunächst vorhandene Chelatierungsmetall zu entfernen. Die Transehelatierung kann unter Verwendung einer Pufferlösung erreicht werden, welche mehr als die äquivalente Menge an erwünschtem Metallion enthält* Das Metallion liegt vorzugsweise in 0,01 bis 0,20 molarer oder größerer Konzentration, vorzugsweise in 0,10 molarer Konzentration, vor, so daß die Metallionen des Proteinchelats zumindest teilweise, vorzugsweise jedoch vorwiegend, gegen die MetalIionen der Pufferlösung ausgetauscht werden. Die tatsächlich verwendete Konzentration hängt hiebei vom bei der Transchelatierung verwendeten Metall ab. Magnesium, Mangan, CaIζium und Cobalt halten das Protein bei einer über 0,2 m liegenden Konzentration und bei einer Konzentration unterhalb etwa 0,02 m in Lösung; 55:j.nk';unä Kupfer.erzeugen bei einer Konzentration von .Ö_r2:-m eine Fällung, weshalb sie mit geringerer Konzentration als andere Metalle verwendet werden sollen. Die für Kupfer geltende Konzentration beträgt etwa 5,10"V und die für Zink 5,10""^m.

Im Halmen des erfindungsgemäßeii Verfahrens zur Isolierung des Metallchelats eines Proteins werden vorzugsweise Stoffe niedrigen Molekulargewichts, beispielsweise solche mit einem

■ 1 -.-29.-

Molekulargewicht von 5000 oder weniger, gesondert abgetrennt, indem in einer oder mehreren Stufen durch Lösungsmittel- und/oder Salzzugabe Fällungen erzeugt werden, die außer den erwünschten Protein noch andere Proteine enthalten,wobei die Stoffe niedrigen Molekulargewichts in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Unlösliche Stoffe, beispielsweise Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als 200000, werden unter Verwendung von Pufferlösungen abgetrennt, welche selektive Lösungsmittel für lösliche Proteine, darunter das erwünschte Protein, darstellen. Jene unerwünschten, in Pufferlösungen löslichen Proteine, welche durch schwache elektrostatische Kräfte oder durch schwache S-S-Brücken (Disulfidbrüeken) zusammengehalten werden, werden durch ein kurzzeitiges Erhitzen, welches solche Proteine selektiv zerstört, in unlösliche Körper übergeführt. Durch Elektrophorese, vorzugsweise durch Gelelektrophorese, können restliche lösliche Albumine und ^Globuline abgetrennt werden, wobei ein injizierbares Protein erhalten wird, das keine durch Verunreinigungen hervorgerufene Nebeneffekte zeigt.

Bei der Abtrennung der das erwünschte Protein enthaltenden Proteine aus natürlichen Rohstoffen können aus diesen grobe Teilchen von Nichteiweißstoffen und fasrige unlösliche eiweißähnliche Stoffe in an sich bekannter Weise abgetrennt werden. Unmittelbar nach der Gewinnung des Rohmaterials soll dieses gekühlt werden und nur in den in der Beschreibung angegebenen Ausnahmetfällen nicht gekühlt gehalten werden. Die Lagertemperatur soll unter 10° C, vorzugsweise unter 5 C, liegen und nahe an den Gefrierpunkt der bei der Isolierung verwendeten Pufferlösung herankommen.

Das erwünschte Protein ist nicht nur wärmeempfindlich, sondern auch empflindlich bei gewissen pH-Werten. Eine Denaturierung ist bei pH-Werten unterhalb 1,0 und oberhalb 11,0 zu beobachten. Je nachdem, von welcher Seite her man sich an den ispelektrischen Punkt heranbewegt, wird bei pH-Werten von 4,0 bis 6,0 das Protein teilweise oder

/ - 30 -

109885/1756

vollständig unlöslich. Lösungen des Proteins sollen daher pH-Werte von 1,0 bis 4,0 oder 6,0 Ms 11,0., vorzugsweise 7J0 bis 8,0, besitzen, um durch Fällungserscheinung eine Verringerung, der Ausbeute zu vermeiden. Die Löslichkeit bzw. Schwei-löslichkelt des Proteins unter gegebenen Bedingungen hängt darüber hinaus auch vom Reinheitsgrad des erwünschten Proteins und von dessen Konzentration ab.

Wie bereits erwähnt, ist das erwünschte Protein in Form , eines Metallehelats, dessen vondegöndes Metall ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von 0,60 bis I₅O A ist, beträchtlich stabiler, insbesondere wärmebeständiger. Dieses Protein verliert bei Abwesenheit angemessener Mengen solcher Chelatierungsmetalle rasch die für seine Wirksamkeit wesentliche schraubenförmige Konfiguration. Aus diesem Grunde werden zumindest die Wärmebehandlung und vorzugsweise mehrere oder alle übrigen Aufarbeitungsschritte unter Bedingungen vorgenommen, unter welchen das Protein in Form eines Chelate vorliegt, dessen vorwiegendes Metall vorzugsweise ein solches mit einem lonenradius von 0,65 bis 0,79 & ist.

Wenn von einem im wesentlichen nur aus Proteinen bestehenden Ausgangsstoff ausgegangen wird, welcher nach einer an sich bekannten, jedoch zwecks Schonung der Vorstufen des erwünschten Proteins in geeigneter Weise abgeänderten Methode erhalten wurde, besteht der erste Schritt zur Isolierung des erwünschten Proteins vorzugsweise in der Abtrennung der in Pufferlösungen unlöslichen Proteine aus dem Ausgangsstoff. Dies kann durch innige Vermischung des Proteingenisches mit eir^r™wässri-g^n,^neutralen oder schwach alkalischen Pufferlösung ausreichender Ionenkonzentration erreicht werden» Hiebel können übliche wässrige Pufferlösungen verwendet werden, welche Proteine lösen und den erfordelF-lichen pH-Wert besitzen. Beispiele hiefür sind NII^HgPO^ (UIIz₁)O¹^⁰I₁ » (JTris-(hydroxymethyl)-aminomethar^-Maleinsäure-NaOII, ZitroncnRäure-Natriuincitrat, Essigsäure-Natriumacetat,

~ ³¹ " 1".0"9-S 8.5./Λ TS 6'

1817332

Zitronensäure-(NIL )₂HPO., Bernsteinsäure-NaOH, Mononatriummaleat-NaOH, Natriumcacodylat-HCl, Borsäure-Borax usw. (siehe beispielsweise Cormoni "Methods In Enzymology" Bd. Ij S. 138-146 )1955, insbesondere Puffer No. 5-8 und 10-18. Schwach alkalisch gestelltes Wasser, welches eine ausreichende Menge an Ionen zweiwertiger Metalle enthält, kann ebenfalls verwendet werden.

Da das erwünschte Protein mit zweiwertigen Metallen stabilere Chelate bildet, soll die Pufferlösung oder die wässrige Lösung in diesem und allen anderen Verfahrensschritten vorzugsweise ein. Salz eines zweiwertigen Metalles mit einem lonenradius von 0,60 bis 1,0 Ä, vorzugsweise 0,65 bis 0,80 Ä, insbesondere 0,65 bis 0,79 &, beispielsweise Mg(CH-COO)₂, MgSO^, MgCl₂, CaCl₂, MnSO^ usw., in einer Konzentration von mindestens 1,10" m, vorzugsweise 0,005 bis 0,20 m, beispielsweise etwa 0,02 m enthalten, wenn das Metall Mg oder Mn ist.

Nach Abtrennung der unlöslichen Proteine kann die Abtrennung unerwünschter löslicher Proteine und restlicher Nichtproteine durch selektive Fällung erfolgen. Ein großer Teil der unerwünschten leicht löslichen und'weniger löslichen Proteine kann, aus dem Proteingemisch durch stufenweise selektive Fällung aus einer Lösung des Proteingemisches in einer Pufferlösung abgetrennt werden. Beispielsweise kann die Lösung des Proteingemisches in einer Pufferlösung mit Ammonsulfat zu hO bis 55 fo gesättigt werden oder mit einer solchen Menge, eines organischen Lösungsmittels versetzt werden, daß die Löslichkeit der unerwünschten weniger löslichen Proteine in der Pufferlösung so weit absinkt, daß sie gefällt werden. Die ausgefällten, weniger löslichen Proteine können sodann verworfen werden. Zur selektiven Fällung der unerwünschten Proteine geeignete organische Materialien sind beispielsweise mit Wasser mischbare polare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole, z. B. Äthanol und Isopropanol, Aceton, Dioxan und Tetrahydrofuran. ,

-32- ·

109885/1756

In der Lösung des Proteingemisches in der Pufferlösung | allenfalls enthaltene Pigmentstoffe sollten ebenfalls entfernt werden. Dies kann durch Zugabe eines wasserlöslichen, vorzugsweise heterozyklischen Amins, wie Pyridln oder Piperidin, oder eines anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels oder Lösüngsmittelgemisches/ in welchem die Pigmentstoffe unlöslich sind, zur Lösung der Proteine in einer Pufferlösung erfolgen. Die Fällung der Pigmentstoffe kann beispielsweise vor der Fällung der weniger löslichen Proteine vorgenommen werden. G-ewühschtenfalls kann die Entfernung der Pigmentstoffe auch im Anschluß an die Entfernung der weniger lösliehen Proteine vorgenommen werden, wobei eine zur selektiven Fällung einiger proteinähnlicher Stoffe ausreichende größere Menge organischen Lösungsmittels verwendet wird, so daß das erwünschte Protein, die leichter löslichen unerwünschten/Proteine und andere Fremdstoffe in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Beispielsweise können die Pigmentstoffe mittels einer Mischung aus Chloroform und Äthanol gefällt werden, worauf, vorzugsweise nach Abtrennung der Fällung, weiteres Äthanol bis zur beginnenden Fällung von Proteinen zugesetzt wird. Gewünschtenfalls kann zunächst das Chloroform im Vakuum abgedampft werden. In dieser Verfahrensstufe können auch andere organische Lösungsmittel, bei spielsweise niedere aliphatlsehe Alkohole, Aceton, Dioxan oder Tetrahydrofuran! verwendet werden.

Vor oder nach der Fällung der wärmelabilen Proteine, vorzugsweise jedoch nach einer solchen Fällung, kann das erwünschte Protein aus der Pufferlösung durch Zugabe weiteren Salzes oder Lösungsmittels zur überstehenden Flüssigkeit in der für die Abtrennung der weniger löslichen Proteine beschriebenen Weise selektiv gefällt werden, wobei die leichter löslichen Stoffe in der Lösung verbleiben.

Die Selektivität und der Wirkungsgrad der fraktionierten Fällungen ijiittels Salzen und/oder Lösungsmitteln wird vom pH-Wert der Pufferlösung beeinflußt. Bei Fällung-der.

- 33 ~

weniger löslichen Proteine, beispielsweise mittels Ammonsulfat oder mittels eines Lösungsmittels, soll der pH-Wert■ der Pufferlösung vorzugsweise 1,0 bis 1,4 oder 6,0 bis 12,0, beispielsweise 7,5» betragen. Bei der Fällung des erwünschten Proteins liegt der pH-Wert der Pufferlösung vorzugsweise bei etwa 5,5. Bei Verwendung von Lösungsmitteln zur Fällung des erwünschten Proteins soll dieses nur so kurze Zeit als

möglich mit dem Lösungsmittel in- Berührung stehen, da dieses die Neigung besitzt, das erwünschte Protein zu denaturieren.

Die stark wärmeempfindlichen Proteine werden vorzugsweise nach Abtrennung der weniger löslichen Proteine und der Pigmentstoffe aus dem Gemisch durch selektiven Abbau in der Wärme entfernt. In dieser Verfahrensstufe ist es äußerst wichtig, daß das erwünschte Protein in Form eines Metallchelats vorliegt. Aus diesem Grunde soll der Wärmebehandlung eine Lösung des Proteingemisches in einer Pufferlösung unterworfen werden, die an Ionen zweiwertiger Metalle mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,0 Ä, vorzugsweise 0,65 bis 0,79 Ä, i.IQ "bis 2.10"¹ molar ist.

Temperatur und Zeit der Wärmebehandlung sind einander umgekehrt proportional. Das erwünschte Protein ist bei Temperaturen oberhalb 75 C nur kurze Zelt beständig. Soferne es nicht möglich ist, wie beispielsweise beim flash-Pasteurisieren, das Erhitzen und das Abkühlen in kürzester Zeit vorzunehmen, soll das Gemisch nicht über 75° C erhitzt werden. Bloßes Erwärmen auf Temperaturen unterhalb 50° C zeitigt wenig zufriedenstellende Ergebnisse, da einige der unerwünschten wärmelabilen Proteine bei solchen niedrigen Temperaturen noch ziemlich beständig sind. Das erwünschte Protein ist bei 55° C 15 bis 30 Minuten und bei 65° C etwa 3 bis 8 Minuten beständig, womit es möglich ist, bei Zerstörung der wärmelabilen Proteine übliche Heiz- und Kühleinrichtungen zu verwenden. Aus diesem Grunde wird vorzugsweise auf 50 bis 65° C erhitzt, wobei innerhalb dieses Temperaturbereiches die Dauer der Erwärmung optimal etwa 10 bis 5 Minuten beträgt.

109885/1756

Bei eier Feinreinigung werden allenfalls vorhandene Reste an Albuminen oder ^-Globulinen abgetrennt. Da !^Globuline bei Injektion in geringerem Ausmaß unerwünschte Reaktionen zeigen als Albumine, ist die praktisch vollständige Abtrennung zwar weniger kritisch, doch nichts destoweniger zu empfehlen. Beide Arten von Proteinen können auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Gegenstromextraktion, Gelfiltration, Papi'erehromatographiej Dünnschicht Chromatographie oder selektives Eluieren aus Silikagel oder Iönenaustauschharzen, abgetrennt werden. Vorzugsweise wird die Gel-Elektrophorese oder das Chromatographieren verwendet, wobei beim Chromatographieren ein als Molekularsieb wirkendes poröses Harz, beispielsweise quervernetztes Dextran, verwendet wird. Quervernetztes Dextran ist aus Wirtschaftliehkeitsgründen und auch deshalb vorzuziehen, weil es die Verarbeitung auch ■größerer Mengen auf einmal ermöglicht.

Das nach dera erfindurigsgemäßen Verfahren erhältliche isolierte Protein besitzt in pharmakologischer Hinsicht ein breites Wirkungsspektrum und ist in der Lage, durch Vireninfektionen und chronische Bakterieninfektionen bewirkte Schädigungen-zu lindern und kann in Säugetieren die Foigen von Überanstrengungen beseitigen bzw. das Immunitätsgleichgewicht wieder herstellen. Dieses Protein besitzt auch ausgezeichnete anti-lnflammatorische Wirkung. Es ist für die Behandlung aller Krankheiten geeignet_s an welchen ein inaktiviertes oder aus dem Gleichgewicht geratenes mito-iinmunes System beteiligt ist und kann allein und zu-.sanmen mit für die Behandlung solcher Krankheiten dienenden Medikamenten verwendet werden.

Auch das erfindungsgemäß isolierbare Proteinchelat besitzt gegenüber Viren ein breites Wirkungsspektrum. Beispielsweise kann es in Säugetieren zur Behandlung folgender durch Viren induzierter Krankheiten verwendet werden: Influenza der Atmung siiege und des Gedarmtraktes (Myxo-r, Adeno-¹ und Rlilnp.r-Viren).,. atypische Pneumonie (llykoplasiiia-Virus),

Masern, Röteln (Rubella-Virus), Herpes-Zoster, Herpes-rSimplex (Varicella-Viren)_r Mumps und Kontaktdermatitis und Warzen (Verucca-Viren). Es wird angenommen, daß dieses breite. WirkungsSpektrum des Prqteinehelats auf eine Abschwächung der Immunitätsreflexe zurückzuführen ist, welche beim Eintritt des Virus in die Zellen in Erscheinung treten. Der ■ genaue Wirkungsmechanismus und die genaue Lage des Wirkungs-Zentrums ist derzeit unbekannt. Eine Linderung kann während einer beliebigen Phase zwischen dem Eintritt des Virus in die Zelle und der Freigabe desselben durch die Zelle erreicht werden, also auch während .des Zerfalls des Virus und der Vervielfachung neuer Teile und während der Rekombination des Virus.

Einige Uniersuchungsergebnisse deuten darauf hin, daß das Proteinchelat die Bildung von Interferon stimuliert, welches vom Wirt erzeugt wird und gegen eine große Anzahl von RNA- und DNA-Viren wirksam ist. Die Bildung von Interferon im Organismus von Säugetrieren stellt die Hauptwaffe des Organismus gegenüber Virusinfektionen dar, mit welcher unter Umständen der Organismus obsiegt. Die Bildung des Interferons scheint geschwindigkeitsabhängig,zu sein und dies mag auch der Grund dafür sein, daß die Stärke des Krankheitsbildes häufig verschieden ist und die Genesung mit einiger Verzögerung eintritt. Interferon tritt also stets als Folge einer Virusinfektion mit einiger Zeitverzögerung auf und verschwindet nach Beseitigung der Infektion rasch aus dem Organismus, Interferon kann somit nicht- prophylaktisch wirken. Von Nucleinsäuren, gewissen Bakterien und CoIi-Lipopolysacchariden wurde bereits berichtet, daß sie in Tieren die Bildung von Interferon stimulieren, jedoch sind sie therapeutisch nicht verwendbar, während des erfindungsgemäß isolierbare Proteinohelat sehr wohl therapeutisch verwendbar ist.

Das erfindlangsgemäß isolierbare Proteinchelat ist somit zium großen Teil frei von den Naohteilen synthetischer Drogen

-36 109885/1-756

zur Virenfaekämpfung, welche häufig nur sehr spezifisch, stark verzögert und unzureiehenä wirken, Das erfindungsgemäß isolierbare Proteinehelat wirkt nach Verabreichung stark und rasch* Dies mag darauf zurückzuführen sein, daß es in Anbetracht seiner schraubenartigen Chelatstruktur rasch auf die Zellen verteilt wird« Diese Schraubenstruktur macht dieses Proteinchelat hervorragend geeignet zur selektiven Absorption an und Speicherung in gewissen Zellen (Lysosomen, Ribosomen und Mitochonäria) und dies ist unter Umständen ein weiterer Grund für dessen überraschend hohe Wirkung gegen Viren.

Das erfindungsgemäß isolierbare Proteinchelat erv/eist sich auch bei der Behandlung einer großen Anzahl von Entzündungen geeignet, bei welchen entzündungshemmende Steroide nur beschränkt brauchbar sind. Solche Entzündungen sind beispielsweise Entzündungen des Genitaltraktes und der Harnwege und Harnblasenentzündungen wie interstitielle Cystitis, gutartige Prostatahypertropie, Epididymitis und chronische Hephritis und eine chronische Infektion der Harnwege begleitende Entzündungen, wie Harnröhrenverengung, ürethritis und Prostatitis, und rheumatische Krankheiten, wie Bursitis, Tendonitis, Osteo-Arthritis, traumatische Arthritis, Scheibensyndromen und Myositis. In Meeschweinchen ergibt hochgereinigtes erfindungsgemäß isolierbares Protein nach Erzeugung einer durch Antigene induzierten Entzündung nach der Methode von Ungar et al., Arch, Int. Pharmacodynam. 123? 71 (1959) eine etwa 50 $-ige Inhibierüng der Entzündung bei Dosen von 0,4 mg/kg. Die gleiche Inhibierung kann erst durch \ Verabreichung von 25 mg Butazolidin und etwa 15 mg «

Hydrocortison erreicht werden» Daraus ergibt sich, daß das { gereinigte Proteinehelat eine wesentlich größere Wirksam- j keit besitzt als übliche entzündungshemmend Steroide, und ^: } Nieht-Sterbide. Tabelle IV erläutert die ajati-lnilaramatorische ! Wirkung des erfinduiEgsgamäß isolierten Proteins, verschiedenen I

ί ' ί ·

Reintieitsgrades, . '.''■■

Vie der Tabelle IV entnommen werden kann, ist die antiinflammatorische Wirksamkeit des erfindungsgemäß isolierbaren Produktes nicht mit der Arginaseaktivität der meisten aus Leber erhaltenen Produkte verknüpft. Dies ergibt sich bei Isolierung des erwünschten Metallchelats des Proteins aus Proteingemischen, deren Proteine keinerlei Arginaseaktivität zeigen, und durch Herstellung hochgereinigter, keine Arginasewirkung zeigenden Proben des erwünschten Proteins aus Proteiniraktionen mit 25 bis 50 oder mehr Arginaseeinheiten pro mg_r Die Brauchbarkeit des erwünschten Proteins zur Behandlung von Entzündungen und Virenerkrankungen wird jedoch durch eine allenfalls vorhandene Arginasewirkung oder eine andere enzymatische Wirkung nicht beeinträchtigt, soferne das erwünschte Protein nicht zur Behandlung solcher Krankheiten verwendet wird, bei welchen durch eine solche enzymatische Wirkung das Krankheitsbild selbst verschlechtert wird. Anderseits wird die pharmakologische Wirkung des erfindungsgemäß isolierbaren Produktes bei Anwesenheit gewisser anderer Proteine, insbesondere Albuminen, schwerstens beeinträchtigt. So besitzt beispielsweise die Probe 6501 B, welche nur 5? 5 5* Albumin enthält, nur etwa l/lO der Wirksamkeit der Probe 6502 B₅ welche weniger als 1 % Albumin enthält und etwa die 125-fache anti-inflammatorische Wirkung des Hydroeortisons besitzt«

1098£5/1756 COPY

T ab el 1 e

IV

Protein	EXP-FE	Anti-inf1animator isehe Wirkung	1,0	0,4	bestimmten	0,04	0,01	2 Arginase -	Albumin
fraktion	31B	bei Meers ehwelnchenl	neg.					wirkung	gehalt 3
	6O₂B	% Inhibierung bei	20	. n.b.	0,2	8	neg.	Einheiten	in %
■	5O₂B	Dosen (mg/kg)	22	n.b.		9	8	mg
	90B	2,5	n.b.	neg.	n.b.
9 IB	12	38	n.b.	n.b.	neg.
92B	n.b.	20	n.b.	neg.	neg.		35,5	7,0
6h 2B	n.b.	25	n.b.	n.b.	neg.		173,0 .	5,5
65OiB	39	37	n.b.	18	10	neg.	65,0	5,8
6.5 O2B-	56	33	10	23	neg.	neg.	134,0	3,7
n,b.	54	n.b.	21	20.5	12	108,0	2,5
n.b.		neg.	Nil	1,7
n.b.	49^	40,0	18,0
53		33,5	5,5
50	0,0	<L,0

n.b. = nicht bestimmt

Methode von Ungar et. al., Pharmacoaynamics, 123, 71 (l959).

2
Methode von D.M. Greenberg, The Enzymes, 4, 257 (i960).

3 "■- "'"■'"■

Methode von Eees et al. ,J.din.Path., 7, 336 (1954; modifiziert).

mg/kg Butazolidin erforderlich für eine 35-50 ^-ige Inhibierunj

mg/kg Hydrocortison erforderlich für eine 20-25 %-ige Inhibierui

¥enn die erzielte Inhibierung in% gegen die Dosis funktionell dargestellt wird, wird eine typische asymptotische Kurve erhalten, welche bei Dosen zwischen 0,01 und 0,2 mg/kg rasch ansteigt. Wenn die verabreichten Dosen im logarithmischen Maßstab aufgetragen werden, ergibt sich eine verschiedene Meßpunkte verbindende gerade Linie.

Das erfindungsgemäß isolierbare proteinhaltige Produkt kann bei der Behandlung von Entzündungen gleichzeitig oder alternierenä mit Steroiden wie Cortison, Hydrocortism,

- 39 1Ö9885/1756

Copy

Prednison, Prednisolon, Dexamethason, Fluorcortison, Fluormethalon, Methylprednisolon, Triamoinolon und dessen Acetonid, ß-Methason und deren bekannte Ester und Derivate verabreicht werden. Wenn in dieser Weise vorgegangen wird, können die Steroide schwächer als üblich dosiert werden, womit unerwünschte Störungen der Hormontätigkeit und andere Nebeneffekte abgeschwächt werden. Das erfindungsgemäß isorlierbare Produkt kann auch gleichzeitig oder alternierend mit bekannten Stoffen zur Behandlung von Bakterien- und Vireninfektionen verwendet werden, womit letztere in geringeren Dosen verabreicht'"werden können und normalerweise vorkommende toxische Wirkungen und sonstige Nebeneffekte verringert werden.

Das erfindungsgemäß isolierbare Protein erwies sich auch bei der Behandlung von durch Viren oder Entzündungen verursachten Leiden.von Säugetieren und anderen Tieren brauchbar. Solche Leiden sind beispielsweise Virus-Pneumorhinitis, Azoturia, akute Traumacontusion mit begleitender Entzündung und chronische Arthritis. In Anbetracht seiner krampflösenden Wirkung können auch auf das Zentralnervensystem zurückzuführende Depressionszustände, beispielsweise durch curareähnliehe Drogen, akute Sepsis, Arzneimittelvergiftungen, chirurgische und traumatische Schocks usw. bewirkte, durch dieses Protein gelindert werden, obzwar das Protein selbst keine nennenswerte stimulierende Wirkung auf das Zentralnervensystem ausübt.

Sowohl bei der Prüfung als auch bei der Verwendung des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins kann weder eine chronische noch eine akute Toxizität festgestellt werden. Bei intraperitoneal und/oder intramuskulär verabreichten Einzeldosen des Proteins von 6ö mg/kg, welche weit über der therapeutisch erforderlichen Dosierung liegt, kann in ^ Mäusen, Ratten, Meerschweinchen oder Eseln weder vor der Tötung noch nach augenscheinlicher und mikroskopischer Prüfung der Milz, der Nieren, des Rückenmarks, des Hirns und

der Injektionsstellen eine toxische Wirkung festgestellt werden. Die bei Injektion körperfremder Proteine auftretende typische Eosinophilie bzw. Monocytosis bleiben aus. Bei der Verabreichung'von dem Hundertfachen der wirksamen Dosis entsprechenden Dosen an Esel und Meerschweinchen konnten keine chronischen Vergiftungen festgestellt werden.

Bei intradermaler VerabreichungvOder bei Verabreichung auf anderem Wege an vorsensibilisierte Meerschweinchen erzeugt das erfindungsgemäß isolierbare Protein keine Antigene. Entsprechende Versuche bei Verwendung von Freund¹s-Adjuvans in Kaninchen konnte die Bildung von Antikörpern nicht festgestellt werden, womit erwiesen erscheint, daß die antigenetische Wirkung des Proteins höchstens extrem niedriger Größenordnung ist, sodaß dieses Protein über lange Zeiträume an Säugetiere verabreicht werden kann ohne Störungen erwarten zu müssen. An Kaninchen wurden innerhalb 29 Tagen auf 6 Einzeldosen verteilt insgesamt50 mg/kg des Proteins zusammen mit Freund¹s-Adjuvans und Alaunfällung (Alumnpreeipitate) verabreicht. Nach Ablauf der Immunisierungsperiode wurde das Serum-( j*-Clpbulin) der Tiere durch Aus-, salzen konzentriert und anschließend lyophilisiert, Ouchterlony-Platten und Immun-Elektrophorese unter Verwendung dieser konzentrierten ^"-Globulin-Fraktion gegen das erfindungsgemäß isolierbare Protein lieferten keinerlei Fällungslinien.

Obzwar gesunde Tiere immunologisch nicht ansprechen, sprechen Schwerkranke, deren autoimmunes System praktisch inaktiv ist oder aus dem"Gleichgewicht geraten ist, gelegentlich immunologisch an, wodurch sich allerdings die Verwendung des Proteins nicht verbietet. Gans im Gegenteil ist darin eine begrüßenswerte Erscheinung zu sehen, welche darauf hindeutet, daß sich das autoimmune System des Patienten reaktiviert hat, was eine lebenswichtige Vorstufe Tor der völligen Genesung des Patienten darstellt.

zn ig

Das ,erfindungsgemäß isolierbare Protein wird in der Regel auf dem Injektionswege, beispielsweise intravenös oder subkutan, vorzugsweise jedoch intramuskulär verabreicht. Die an Menschen zu verabreichenden Einzeldosen liegen in der Regel zwischen etwa 0,05 bis 1,0 mg. An Pferde werden in der Regel etwa 0,4 bis 5>0 mg intramuskulär verabreicht. Die Dosis ist nicht kritisch. Die Anfangsdosen sind in der Regel größer zu wählen als die für die anschließende ,_? Therapie. Bei der Bekämpfung von V/irus erkrankungen wird das Proteinchelat in der Regel in Einzeldosen von 0,2 bis 0,4 mg intramuskulär verabreicht. Im Gegensatz zur Behandlung chronischer Krankheiten empfiehlt sich bei der Bekämpfung von Viruserkrankungen die Verabreichung in schneller aufeinanderfolgenden Dosen, beispielsweise in Form von zwei Injektionen pro Tag während mehrerer Tage. Die Behandlungsdauer und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von der Reaktion ab, welche häufig einer dramatischen Besserung entspricht. In der Regel beträgt die Behandlungsdauer drei bis acht Tage. Im Falle eines Rückfalles sind erneute Injektionen von gleichem Erfolg.

Orale Verabreichung des Proteins ist möglich,soferne es vor einer Zerstörung im sauren Milieu des Verdauungssystems und dessen Enzymen, beispielsweise in Form beschichteter Tabletten, geschützt ist. Bei diesem Verabreichungsweg sirid^ allerdings wesentlich größere Dosen erforderlich, überraschenderweise ist das Protein auch lokajl verabreicht wirksam und dieses Protein kann beispielsweise/ in Form einer Lösung in physiologischer Kochsalzlösung oder, einer Pufferlösung und in Form von Cremen, Salben usw. verabreicht werden, womit das Protein zur Behandlung von Erkrankungen der Cornea und von Conjuctiva, der Atmungswege, der Genitalien, des Harnweges und der Haut verwendet werden kann. Durch lokale Verabreichung ist es beispielsweise möglich, Akne, Irritationen, Abschürfungen, Brandwunden, Abszesse, Psoriasis usw. zu behandeln. In diesem

~ ⁴² "

617332

Falle wird das Protein zweckmäßig gemeinsam mit einem Netzmittel und/oder einem Penetrationsmittel verabreicht. Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung des wirksamen Proteins "bzw. dessen Chelats beispielsweise erläutert.

Albuminbestimmung.

Die AlhuminbeStimmung kann nach der oben erwähnten Methode von Rees et al in einem Turner-Pluorometer erfolgen. Hiebei werden 6 mg 8-Anilino-l-naphthalinsulfonsaures Ammonium in einer äquivalenten Menge an Q,In NaOH gelöst, worauf die Lösung mit entsalztem Wasser auf 500 ml verdünnt wird. Das gereinigte Protein wird in isotonischer physiologischer Kochsalzlösung £0,9 g pro 100 ml Lösung (0,9 fo w/v in waterjf in solcher Menge gelöst, daß eine Lösung von 4g Protein pro 100 ml Lösung (4 percent w/v solution) erhalten wird. Für die Ermittlung der Standardkurve wird diese Lösung 1 : 10 verdünnt, wobei der von Rees et al angegebene Phosphatpuffer verwendet wird £es sind jedoch 12 mg/l der Stammlösung A ztt vereenden).

In 7 ml der Lösung A werden 20 A der zu analysierenden Probe einpipettiert. Im Turner Fluorometer wird die Intensität der Fluoreszenz gegen eine Vergleichslösung (7 ml der Lösung A) gemessen. An Stelle eines 1 $-igen neutralen Filters wird ein 10 ^-iges neutrales Filter mit dem Ililfsfilter Nr. 110-816 gekuppelt und die Schlitzbreite auf Nr. 10 eingestellt.

Herstellung des Ausgangsstoffes

■Im folgenden wird die Isolierung von Protein aus natürlichen Rohstoffen in allgemeiner Weise besehr.ieben.

Zwecks Gewinnung des für das erfindungsgemäße Verfahren nötigen Ausgangsmaterials sind aus der frisch geernteten, gewaschenen und gereinigten pflanzlichen oder tierischen Proteinquelle die Nicht-Proteine so weitgehend»als möglich

- 43

zu entfernen» Alle folgenden Arbeitsschritte sind bei einer Temperatur unter 5° C durchzuführen.

a)-Aufarbeitung der"Rohstoffe mittels Toluol Die Proteinquelle wird homogenisiert und unmittelbar -i"-darauf mit dem Breifachen ihres Volumens entionisierten Wassers oder eines geeigneten Puffers verdünnt. Dieser Puffer ist an Gelöstem 0,05 bis 0,30 molar und enthält beispielsweise ein Maleatj ein Phosphat, ein Tris-Maleat, ein Cacodylat oder ein Borat oder Barbital oder Tris-hydroxymethyl aminomethan oder Glyein-Natriumhydroxyd. Das Wasser· oder der Puffer enthält-weiters Ί.10 .bis 2.10"¹ Mol eines wasserlöslichen Salzes eines physiologisch wesentlichen ' zweiwertigen Metalles_s beispielsweise Magnesium, Calzium, Mangan, ZiZiIc₉ Kupfer, Cobalt oder Eisen, beispielsweise in Form eines Chlorids, Sulfats, Phosphats, Acetats, Citrats, Maleats oder Borats. Der pH-Wert wird mit Natriumhydröxyd auf 7p0 bis 7p8 eingestellt. Anschließend wird etwa zwei * Stunden gerührt_o Sodann wird dem Gemisch langsam l/lÖÖ . seines Volumens an Toluol (add slowly 0.01 vol.-equivalent of toluene) zugegeben, worauf mehrere Stunden weiteige"-""" rührt wird"» Hierauf wird absitzen gelassen bis die"'über-" "- "" stellende Flüssigkeit ausreichend klar ist. Sodann wird' " ■ " ■^:- ' beispielsweise über ein Tuch, über Baumwolle, über Glas- ^: liolle oder über Filterhilfe filtriert oder auch zentrifugiert. Bei allen diesen Arbeitsschritten ist der Zutritt von " direktem Licht auszuschließen. Das Filtrat wird gefroren und lyophilisiert. Wenn das direkte Lyophilisieren schwierig sein SOlItBa ist zuerst gegen einen 0,001 molaren Puffer zu dialysieren,.welcher an einem zweiwertigen Metallsalz, beispielsweise einem Salz von Mg, Mn, Zn, Cu, Co, Fe, 0,1 bis 5.10" molar ist. Das erhaltene Pulver wird kalt, vorzugsweise unterhalt 0° C, gelagert. ; _;

BAD ORIGINAL - kk -

103035/1756

-Tj)- Aufarbeitung der Rohstoff e mittels -Ac et oft

Fein zerkleinerte Gewebsteile oder cytoplasmisehe Teil- ~ chen werden in irgendeinem der unter a Jenmhnten Pufier-Me⁺ Gemische suspendiert, worauf der pH-Wert auf 7,0 bis 7,8 ein-• . gestellt wird und auf 0° C gekühlt wird. Unter starkem mechanischem Rühren werden der erhaltenen Dispersion bei -Id⁰ C äußerst langsam iö Volumsteile trockenen Acetons pro Volumsteil Dispersion zugeführt. Es wird sodann Id Minuten absitzen gelassen und das überstehende wässrige Aceton dekantiert. Der Niederschlag wird entweder durch Zentrifugieren oder durch Abnutsehen über ein Filterpapier (Whatman Nr. l) auf einem weiten Buchner-Trichter in einem kalten Raum: bei 0° C gesammelt. Der Niederschlag wird zweimal gewaschen, indem er jedesmal in etwa 3 Volumina Aceton, bezogenauf das ursprüngliche Volumen der Dispersion, von -10° C suspendiert wird. Aus dem Niederschlag wird sodann das Aceton mittels eines Stickstoffstromes entfernt, worauf das erhaltene Pulver im Vakuum über H₂SO^ getrocknet wird. An die letzte Acetonbehandlung kann ein Wascbeiumit trockenem, peroxydfreiem Diäthyläther (bei -i5° C) angeschlossen werden, womit die Trocknung besonders rasch erfolgt. Das getrocknete Material wird in der Kälte, vorzugsweise im Vakuum mit einem Trocknungsmittel gelagert.

Alternativ kann die gesamte Menge an Gewebssubstanz bei -.15° C innerhalb 3 Minuten in einem Waring Blendor direkt in 10 Volumsteilen Aceton, bezogen auf das Volumen der Gewebssubstanz, zerkleinert werden, worauf der Niederschlag in der oben angegebenen Weise mit Aceton weiterbehandelt wird. ·

Wenn der zuerst aus Aceton anfällende Niederschlag viel Lipoide enthält, kann durch Waschen desselben mit n-Butanol bei -15° C das anschließende Extrahieren wesentlich er« ; ieichtert werden* I

Jm Spezialfalle kann 1kg frischer, vom Bindegewebe : befreiter dchsenleber in fünf oder sechs Stücke zerteilt

werden, welche anschließend mit Leitungswasser gespült und zerkleinert werden. Kleinere Mengen der zerkleinerten Ochsenleber (200 g) werden in einem Waring jBlendor mit 200 ml •kalter isoosmotischer KCl-Lb'sung innerhalb 20 Sekunden homogenisiert, worauf unmittelbar anschließend im Waring Blendor das Homogen!sat innerhalb 20 Sekunden bei -10° C mit 200 ml Aceton vermischt wird. Das mit Aceton behandelte Homogenisat wird sodann unter Rühren in ein, 2,5 1 auf -10° C gekühlten Acetons enthaltenes 10 1-Becherglas gegossen. Sobald der letzte Anteil der zerkleinerten Ochsenleber in der angegebenen Weise behandelt worden ist, wird der Inhalt des Becherglases mit kaltem Aceton auf 10 1 aufgefüllt und durchgemischt. Die Temperatur wird anschließend einige Minuten auf k° C gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wird nun abdekantiert, worauf der Inhalt des Becherglases mit Aceton auf 10 1 aufgefüllt wird. Nach dem Abgießen der klaren überstehenden Flüssigkeit wird die Suspension rasch auf einem Büchner-Trichter filtriert, welcher oben abgedeckt ist, um den Zutritt von Luft so weitgehend als möglich auszuschalten. Noch bevor der am Trichter befindliche Filterkuchen völlig trocken ist, wird mit 2 1 kaltem Aceton gewaschen.

Das Filtrieren wird solange fortgesetzt, bis die Teilchen vollständig trocken sind. Der Filterrückstand wird zerkleinert, auf einem Filterpapier ausgebreitet und, vorzugsweise unter Stickstoff, getrocknet. Das erhaltene Pulver wird noch kalt fein gemahlen und bei k° C im Vakuum gelagert. Die Ausbeute an pulverförmigem Material beträgt etwa 52 g. Beispiel i: Im folgenden wird allgemein die Herstellung und Isolierung des Protein-Metallchelats aus Ausgangsmaterialien beschrieben, welche in der oben angegebenen Weise hergestellt worden sind. ·

Soferne nichts.anderes angegeben ist, werden alle Arbeitsgänge in einem 0,1 molaren Tris-Maleat-Me⁺⁺-Puffer bei einem ph-2-Wert von 7.,4 durchgeführt. Mit: 0,05 bis Q,2 molarem tris-Phosphat-Me⁺⁺-Puffer und 0,05 bis 0,2 molarem

lift «

.106-885/1766

Tr'i s»Succinat-Me⁺⁺- Puff er- kann- glei cli gut gearbeitet werden« Bei allen, in Anwesenheit organischer. Lösungsmittel ■ durchgeführten Arbeitsgängen wird bei O bis 2° G.gearbeitet ₉ wobei

.- j 'tiv.w : . Q ■ '-.-■■·-■-■

die organischen Lösungsmittel auf -10 C gekühlt verwendet

■ ■- i^s-ii'^;: :--.■.■ ^: ''-■-■■

werden.. Alle übrigen Arbeitsgänge werden bei Temperaturen

unterhalb 5° C vorgenommen,, . .

A₀ Entfernung des, in Pufferlösungen unlöslichen Materials, . In Abwesenheit Ton direktem' Licht un:d in der'Kälte;'werden 100 gdes wie oben erhaltenen, trockenen Pulvers in.i Liter Trisinaleat-Puffer eingerührt₉ Nach Ablauf, einiger Minuten werden 6_S5 g MgSO-. _o 7 H_nOiU Anteilen zugegeben und der pll-Vert mit la NaOH auf 7_?4 eingestellte Anschließend werden weitere,600 ml Tris-maleat-Puff-er-und weitere 6,5 g'MgSO^,^DLO zugegeben und der pH=<Wert erneut auf 7 ₉*t eingestellt« Nun werden weitere 400 ml l/asser zugesetzt.und es wird in einem kalten Raum weitergerührt bis gerechnet vom Arbeitsbeginn 6 Stunden verstrichen.. sind_B Die Mischung wird sodann ab» sitzen .gelassen, worauf filtiriert und zentrifugiert wird₀' Der pll-¥ert des Filtrates wird au-f 7_S8 eingestellt),--worauf das FiItrat in der Kälte stehengelassen wirdj bis die Abscheidung vollständig ist„ Die überstehende"Flüssigkeit wird naeh dem Abzentrifugiereii filtriert«, Zwecks Lagerung wird das Filträty wie oben beschrieben (Herstellung der Ausgangsmaterialien), .ly-o-philisiertff

Bei einigen Rohstoffenj beispielsweise■Leber, wird bei obigem Verfehrens.schritt und auch bei der Herstellung des Ausgangsmaterials vorzugsweise mit 0|.l m Mangansulfat gearbeitet, welches das zweiwertige Metall.liefert„ Die Transchelatierung, also dio Entfernung des größten Teils des Mangans und dessen Austausch gegen Magnesium, wird erreicht, indem in einem anschließenden Verfahrensschritt ein Trismaleat-Magnesiumsalz-Pufferverwendet wird. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, den Maiigan-Trisinaleat-Puffer bei der Entfernung der Pigmente und auch bei der ■

- hl - "■ .

1 09886/ 17 StS

_Hi :17332

Wärmebehandlung zu verwenden. In weiteren anderen Fällen *. ;. ;■ kann es von Vorteil sein, in Anfangsstufen und/oder Zwischen- μ :\ stufen andere zweiwertige Ionen, beispielsweise Ca-, Öo-, Zn-, Cu- oder Fe-Ionen, enthaltende Puffer zu verwenden. Der pulvjerförmige Rückstand beträgt etwa 50 # oder weniger, bezogen auf das Trockengewicht der Proteine im Ausgangsmaterial· ·'

B. Entfernung der Pigmente.

Dieser Arbeltegang ist erforderlich, wenn als Ausgangsmaterial eine Proteinfraktipn verwendet wird, die aus dunkelgefärbte» Rohstoffen, beispielsweise Leber, Niere, Herz, Milz, Pankreas, schwarze Bohnen (jack beans), gewissen Bakterien usw., erhalten wurde. Aus Pflanzengeweben, Hoden, von Blutresten befreiter Placenta, Thymus, Meerestieren und anderen Mikroorganismen erhaltene Ausgangsmaterialien machen in der Regel keine Abtrennung von Pigment erforderlich.

100 g des gemäß Punkt A, erhaltenen Pulvers werden unter Rühren in 400 ml kaltem, 0,1 m Trismaleat-Mg^-Puffer bei pH 7t2 suspendiert, worauf in einem kalten Raum bis zum Absetzen des Niederschlages stehengelassen wird, bei 1 bis 2° C zentrifugiert wird und schließlich abdekantiert wird«

Bei Verwendung von Pyridln zur Abtrennung der Pigmente wird die abdekantierte Flüssigkeit in fünf gleiche Teile geteilt, worauf jedes Teil unter Rühren langsam 8 ml gekühltes Pyrldin {c»p*-Qualität) zugegeben wird. Anschließend werden jedem Teil 40 ml 0,1 ^Pris»aleiit-Mg⁺⁴'-Puffer zugesetzt. Es wird sodann bei i bis 2° € zentrifugiert, beispielsweise 15 Minuten bei 13000 U/Min. Die überstehenden Flüssigkeiten werden abdekantiert und miteinander vereinigt. Der Niederschlag wird verworfen.

Wenn ssur Abtrennung der Pigmente ein Gemisch aus Chloroform und Äthanol verwendet wird, werden der abdekantierten' Flüssigkeit langsam unter Rühren 15 Vol.-$ eines vorgekühlten Gemisches aus einem Teil Chloroform und zwei Teilen Äthanol zugesetzt, wobei während der Zugabe die Temperatur *·

109886/m6

unter h⁰ C bleiben soll. Nach dem Abzentrifugieren, beispielsweise bei 12000 bis 14000 U/Min, während etwa 10 Minuten, wird der dunkelgefärbte Niederschlag verworfen. Die leicht gefärbte und opalesalerende überstehende Flüssigkeit wird kühl gehalten.

Zu diesem Zeitpunkt kann aus der Lösung bereits teilweise gereinigtes Protein mittels eines Lösungsmittels ausgefällt werden. Dieses teilweise gereinigte Protein kann im Vakuum von anhaftendem Lösungsmittel befreit werden und'¹ durch nochmaliges Auflösen in einem etwa 0_f15 molaren Trismaleat-Mg⁺⁺-Puffer mit einem pH-Wert von 7_fk unä'anschließende Abtrennung von unlöslichen Peststoffen durch Zentrifugieren und Verwerfen derselben weiter gereinigt werden.

Die so erhaltene Lösung kann, gegebenenfalls nach vorhergehender Dialyse, lyophilisiert werden. Das erhaltene weißliche Pulver ist bei Aufbewahrung in einem Eisschrank über mehrere Monate beständig«

C, Abtrennung der weniger löslichen Stoffe«

Die gemäß Punkt A oder B erhaltene kalte Lösung in Trismaleat-Mg⁺⁺-Puffer, oder eine frisch aus lyophilisiertem Pulver hergestellte äquivalente Lösung, wird bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,5 mit Ammonsulfat zu hO bis k% % gesättigt, indem das Ammonsulfat unter Rühren in Anteilen entweder in fester Form oder in Form einer gesättigten wässrigen Lösung zugegeben wird. Die Temperatur wird auf 0 bis 5 C gehalten« Die Mischung wird in der Kälte 10 bis 30 Minuten stehengelassen, bis die Fällung vollständig ist. Zentrifugiert wird bei 800Ö bis 12000 U/Min, und der Niederschlag wird Verworfen, Die überstehende Flüssigkeit wird sodann mehrere Stunden stehengelassen und anschließend zentrifugiert, worauf ein. allenfalls gebildeter Niederschlag vearwairfen wird.

Alternativ können zu 250 ml de? gemäß Punkt B erhaltenen tillerstehenden Flüssigkeit oder zu einer Lösung des gemäß Punkt A erhaltenen ptgmentfreien Proteins in

tO98ftS/175-6

250 ml 0,1 m Trismaleat-Mg⁺⁺-Puffer bei pH 7,5 langsam und unter Rühren etwa 2,2 Volumina auf -10° C gekühltem Acetons oder Äthanols gegeben werden, welche Menge gerade ausreicht, nur einen Teil der Proteine zu fällen. Die Temperatur des Gemisches soll 2° C nicht tiberschreiten. Sobald die Fällung vollständig ist, wird in der Kälte, belspielsweise bei 8000 bis 12000 U/Min, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen,

D. Entfernung der wärmelabilen Proteine

Die gemäß Punkt C erhaltene überstehende Flüssigkeit
wird in einem il-Rundkolben in einem auf 65 bis 70° G gehaltenen Wasserbad erwärmt, wobei die Lösung bis zum Erreichen einer Temperatur von 59° C kräftig gerührt und
5 Minuten auf dieser Temperatur gehalten wird. Unmittelbar anschließend wird der Kolben in ein Gemisch aus Trockeneis und Lösungsmittel oder in ein Eis-Salz-Gemisch eingetaucht und kräftig weitergeführt bis die Temperatur auf 2 bis 3 C gesunken ist. Der flockige Niederschlag wird in der Kälte
abzentrifugiert und sodann verworfen.

E, Entfernung der leichter löslichen Stoffe

1) Ausfällung mittels Salzen.

Die gemäß Punkt D erhaltene Pufferlösung wird in der oben angegebenen Weise, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0, zu 58 bis 76 % mit Ammonsulfat getrocknet und bis zur vollständigen Ausfällung 1/2 bis 2 Stunden kaltgestellt.

Der mittels Ammonsulfat ausgefällte, nahezu weiße Niederschlag wird im 10 bis 15-fachen seines Gewichts an 0,10 m Trismaleat-Mg⁺⁺-Puffer aufgenommen uiid i/2 Stunde kalt stehengelassen. Ein allenfalls entstandener Niederschlag wird abzentrifiigiert und verworfen.

2) Fällung mittels Lösungsmitteln.

Zu der unter l) verwendeten Ausgangslösung wird, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 3»5 oder etwa 7,5» in Anteilen und unter Itühren auf -10° C gekühltes Acetan oder Äthanol in einer zur Ausfällung zumindest eines Teiles der

~ ⁵° ~ 1Ö988S/17S6

gelösten Proteine ausreichenden Henge gegeben^ wobei die •Temperatur um 0° C gehalten wird» Falls etwa O₉5 Volumina an Lösungsmittel erforderlich wairea, um die weniger lös* ■ liehen Proteine aiiszufälleiig so aiftä jetzt etwa 0,5 »is i,5 weitere Volumina zuzusetzen, Me Mischung wird hei etwa 0⁰C einige Minuten stehen gelassen, Isis die Fällung vollständig ist. Der Niederschlag wird"frei X® € und iÖQOO bis 13000 U/Min, abzentrifagiert» B©y erhaltene Niederschlag wird vom anhaftenden Iipsusgsmittela befreit und in der Kälte im Vakuum getrocknet» Bureis. Eugafee weiterer O₉2 Volumina auf <-iO° 0 .gekühlten Aceton® ©der JLthMipls zur !überstehenden Flüssigkeit wir# der Erfolg üer Fällung 'überprüfte Isopropylalkohol (Oj5 bis 2 Volumina pro Volumen) kann ebenfalls venfenäet werden.

Zur Ausfällung der weniger l'dsliehen Proteine wird vorzugsweise Ammonsulfat verwendet, wälireaö zur Ausfällung des enfünschten Proteins .vorzugsweise Lösuagsiaittel verwendet werden.

F. Elektrophorese

Eine Lösung des gemäß Punkt E ausgefällten Proteins im iO- bis 15-fachen seines Gewichts an 0,1 m. Trismaleat-Mg⁺⁺- -Puffer (allenfalls auftretendes Unlösliches wird verworfen) wird durch Gelelektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamid fraktioniert, wobei das fließende Gel auf einen pH-Wert von 8,0 bis 9»5 oder auf einen pH-Wert von 3,0 bis 4,3 eingestellt wird,

. Bei der Gelelektrophorese wird, folgendes Gerät verwendet:

Elektrophoresekammer; Buchler-Stromversorgung (Modell 3-1014 A); Beschickungsstange (Loading Eack); Injektions-

IT <S »T

spritzen (Kunststoff, 20 cm , 5 cm , 1 cm , vertierfbar); Injektionsnadeln 22Gxl-l/2^M und 256x5/8"; Teflonspitzen zur Überschichtung; photopolymerisierendes Licht (fluoreszente Lichtquelle).

- 51 -

1QS88S/1756

Die Elektrophdresekamaer soll gründlich gewaschen und mit destilliertem Wasser durchspült werden. Anschließend wird die Elektrophoresefcammer einige Minuten in eine Lösung' von Siliclad (Clay Adasgs, New York) eingetaucht, welche 1 Teil Siliclad und 50 Teile Wasser enthält. Die Elektro-· phoresekammer wird sodann gespült und. ofengetrocknet.

Die verwendete Elektrophoresekammer entspricht der oben angegebenen Eiektropfaoresekammer für Präfluktionszwecke.

Die verwendeten Reagentien waren folgende: Monomeres Acrylamid (Eastman No. 5521)'; N,N^fMethylenbisacrylamid D 15 (Eastman No. 8383); Riboflavin (Eastman No. 5i8i); NjNjN^N'-Tetramethyläthylendiainin TEMED (Eastman No. 8178)? Clycln (Eastman No. 445)i TRIS(TrIs(Hydroxymethyl)aminomethan) (fisher T-395); Sucrose (Baker No. 4072); Ammoniumpersulfat, chemisch rein; 1 η ECl; i m H-PO. ; Essigsäure und Methanol (chemisch rein)«

Es wurde ein kleinporiges Gel, 7 $-ig» verwendet.

Es wurden folgende Stammlösungen verwendet:

InHCl	ml	480	•	256	ml
TRIS		363	57	g
TEMED		4,6		ml
H₂0 mf 1000	ml . 6,9)	280
ImH-PO^		7,36	ml
TRIS			g
H₀O auf 1000 ¹ (pH	ml	100
Acrylamid		25	g
BIS			g
H₂O auf 1000	ml	40
Acrylamid			g
BIS	jnl	g
H₂O auf 1000
Riboflavin	mg
H_nO auf 1000

1OS&&S/1760

ί ϊ ' I C t C

	Teil (*}	• " -
2	Teil* fts)	Mo ι
i	Teil (H₀O)	iOOO al
Ammoniumpersulfat

_SO 1. : ■ .. - ' ■ "

Die Arbeitslösungen waren folgende: . Mischung Ai

Mischung B:

Es wurde folgende Pufferlösung verwendet*

TRIS - 60 g

Glycin 288 g

H₂O auf 20 1

^r ti- pH 8,45. ; ■"■■-■' -. ' '- ..■■:■ ■--.-. ';.';.^: ".. .

Ais Markierungsfarbe wurde O₁OOi $-igeg Bromphenölblatt verwendet. Es wurde festgestellt, daß zwecks Erzielung bester Trenneffekte für jede Trennung eiää frische Puffer-Ibsungverwendet werden soll· Sine Pufferlösung kann maxiipal fiir drei Chargen verwendet werden, wobei allerdings bei der zweiten und dritten Charge die erzielte Auflösung geringer ist. Alle Lösungen sollen im Eissehrank gelagert werden, in. welchem Falle sid mit Ausnahme des Gemisches B, welches wöchentlich frisch bereitet werden soll, mehrere Monate brauchbar sind.

Gleiche Teile des Gemisches A und des Gemisches B werden direkt dem Eisschrank entnommen und miteinander in einer Saugflasche vermischt, wobei die Saugflasche an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen wird und der Inhalt der Saugflasche unter Unterdruck etwa 1 Minute leicht vermischt wird. Bie Elektroplioresekammer wird sodann unter Verwendung eines langen dünnen Rohres bei 16 min unterhalb ihrer Oberseite befindlichem" Verschluß gefüllt, wobei -zunächst das Rohr bis zum Boden der Kammer eingeführt und, in eiern Maße als äas Gel eingeführt wirä_s langsam surtickg-e"zogen und. hiebet die Spitze des Rohres unterhalb 'des &elspiege1,g. gehalten .wird» Das Gel wird sodann mit Wasser beschichtet und auf einen. Trockenachrank, gestellt» Die. Ge lie rung "ist inner« imfh etwa ±5 Ms 30 Miauten

BADORI©fNAL

Bin G«rät aur Beschichtung mit Wasser kann aus einer injektioniäfritze aus Kunststoff und einer Injektionsnadel 25G * 5/β Zoll, welche Mit einer Tefloiispitze (Analytical Ckiüists Ine*) versehen ist, hergestellt werden. Die Spritze wird zu etwa einem Drittel »1t Wasser gefüllt, welches mit der Lösung der Märkierungsfarbe Dian gefärbt wurde« Die Teflonspitae wird eben unter die. Oberfläche des Gels eingeführt und In dem Maße nach oben bewegt, als das Wasser über dft« Gel geschichtet wird, wobei die Spitze nie über den Flüssigkeitsspiegel angehoben werden soll.

Nach der Polymerisation wird das Wasser sorgfältig entlernt. Die Oberfläche wlrä einmal mit entgastem Sucrosegel

Die Profc® (0,5 bis 5>0 g) wird, in 0,9 %-iger

physiologischer Kochsalzlösung oder in TRIS-Puffer suspendiert, alt dem Gel vermiedst und in d®n vorgeformten Trog des Geistreifens eingefüllt. BId Oberfläche wird mit Sucrose beschichtet und mit Gel abgedee&t, welches solange aufgegeben wird, bis ein konvexer Miniskus vorliegt. Anschließend wird ein Kunststoffdeckel über daa Gänse geschoben, so daß keine Luftblasen eingeschlossen, werden. Der beschickte Trog wird sodann zwischen zwei Fluoreszenzlampen gebracht und den Lichtquellen so nahe als möglich angeordnet. Die Polymerisation ist innerhalb 0,5 bis 1 Stunde abgeschlossen, je nachdem wie groß die verwendete Probe ist und je nachdem weicher Art sie ist.

Sobald die Polymerisation abgeschlossen ist, was durch Trübung der Probe und der Geldecken angezeigt wird, wird der Deckel entfernt und die Kammer in die Pufferbehälter eingebracht. Vor Arbeitsbeginn wird das Gerät und der Puffer gekühlt. Gearbeitet wird bei etwa 5° C* Die Stromquelle wird so eingestellt, daß sie je nach Menge der Probe und je nach den Abmessungen des Gelstreifens einen Strom von 100 bis 200 mA liefert, Die Arbeitsdauer beträgt etwa 2 bis 3 Stunden, und nach Ablauf dieser Zeit hat die Markierungsfarbe den Gelstreifen nahezu zur Gänze durchquert/ .

ΐ·³ί

Im Anschluß daran findet sieh daß erwünschte Proteinchelat in jenem Bereich, welcher um 20 fete" 30- % des von der Markierungsfarbe zurückgelegten WanderungswegeB vom Ur-. sprungspunkt entfernt liegt. Dieser Bereich ist gut getrennt von den beträchtlich rascher wandernden Albuminfraktionen und; ebenfalls gut getrennt von den geringen Mengen an den viel langsamer Wandernden ^Globulinfraktionen.

Das erwünschte Proteinchelat wird aus dem Gel durch einen Querstrom an 0,1 molarem Trismäleat-Puffer eluiert, welcher an Mg⁺* 0,001 molar ist. Das Portschreiten des Eluierens kann an der UV-Absorption bei 280 mji" erkannt werden. Die Einheitlichkeit des Produktes wird durch analytisch durchgeführte Gelscheibenelektrophorese überprüft, an welche ein Anfärben mit "Amido Black" anschließt, GewUnschtenfalls können die Albumine und auch die langsamer wandernden Fraktionen in ähnlicher Weise unter Verwendung von Trismaleat-Puffern gewonnen werden.

Bei fließendem Gel werden im kationischen System bei einem pH-Wert von 3,8 Kaiittmionen als voreilende Ionen verwendet, während die nacheilenden tonen von ß-AiBiiin geliefert werden. Als Puffersubstanz wird Essigsäure verwendet,π Nach diesem System wurde in der gleichen Weise vorgegangen, wie beim anionischen System (pH-Wert des fließenden Gels 9,4).

Zwecks Isolierung des erwünschten Proteinchelatsaus dem Eluat wird dieses erschöpfend gegen 0,001 molaren Trismaleat-Mg ⁺-Puffer und dann gegen entionisiertes Wasser dialysiert, worauf lyophilisiert lilrd. Auf diese Weise wird ein weißes flaumiges Pulver in einer Menge erhalten, die etwa 6 bis ±6 % des durch Ammonsulfat oder durch ein Lösungsmittel ausgefällten Produktes ausmacht.

Die Ausbeute an isoliertem Proteinchelat beträgt in der Regel 0,005 bis 0,02 5», bezogen auf Trockengewicht der verwendeten Itolistoffc.

Beispiel 2: Soferne nichts anderes angegeben ist, werden alle Arbeitsgänge in einem kalten Raum (2 bis 5 C) vorgenommen.

Herstellung der Ausgangsmaterialien

Frische Rinderleb'er wird vermählen und in einen Kunststoffbehälter eingefüllt, worauf kaltes destilliertes Wasser in einer Menge von 2 1 pro kg Leber unter Rühren zugegeben wird und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit 0,In NaOH auf 7,5 bis 7,6 eingestellt wird. Dem Gemisch wird so viel 2 molarer Mangansulfatlösung zugegeben, daß das Gemisch an Mangan 0,05 molar wird." Der pH-Wert wird sodann auf 7»6 eingestellt, worauf so viel frisches kaltes Wasser zugegeben wird, daß auf 1 kg Leber insgesamt 3 1 Wasser kommen. Nun werden pro kg Leber 50 ml Toluol zugesetzt, worauf die Mischung über Nacht im kühl gehaltenen Raum gerührt wird.

Entfernung der leichter löslichen Stoffe

Am darauffolgenden Morgen wird die Suspension durch Gaze aus Kunststoffäden filtriert, worauf das Filtrat mit dem gleichen Volumen an kaltem Aceton (-10° C) unter gelindes Rühren versetzt wird. Die Zugabe des Acetons erfolgt über ein Glasrohr, welches weit genug unter die Oberfläche des Gemisches ragt. Der entstandene Niederschlag wird unmittelbar darauf durch Abzentrifugieren isoliert und sogleich mit etwa 25 % (V/V) an 0,05 m Maleat-Mn⁺⁺-Puffer, bezogen auf das Volumen des Filtrats vor Zugabe des Acetons, suspendiert. Die Mischung wird in der Kälte mehrere Stunden gerührt, über Gaze aus Kunststoffäden filtriert und durch Zentrifugleren geklärt.

Abtrennung der wärmelabilen Proteine

Die überstehende Flüssigkeit wird in einem Kessel aus rostfreiem Stahl unter Rühren rasch auf 60° C erhitzt und , bis 20 Minuten nach Beginn des Erhitzens auf dieser. Temperatur gehalten. Die Mischung wird sodann so rasch als möglich auf 5° G gekühlt, worauf der entstandene voluminöse Niederschlag im* kalten Raum durch langsames Absaugen über

- 56 -

109885/1756

eine große Filterfläehe abfiltriert wird. Die Temperatur des klaren Flltrats wird auf 2 bis 5° C gebracht, worauf 0,9 Volumina denaturiertes Äthanol (-10° JG) mittels eines Tropftrichters über ein sich bis weit unter die Oberfläche'des Gemisches erstreckendes Glasrohr zugegeben werden. 'Hiebe! ist es wesentlich stark zu rühren und die Temperatur bei. 5° C oder bei einer niedrigeren Temperatur zulhalten. .

Nach vollständiger Zugabe des Alkohols wird das Gemisch gerade so lange in einem kalten Raum verwahrt, bis sieh der Niederschlag zusammengeballt und abgesetzt hat. Der Niederschlag wird durch Absaugen mit niedrigem Unterdruck isoliert und unmittelbar anschließend in kaltem 0,001m Maleat-Mh⁺⁺- -Puffer von pH 7»0 gelöst. Die Menge an verwendetem Puffer beträgt etwa 4 Volumteile pro Gewicfetsteil Niederschlag. Die Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit abgetrennt wird und der Niederschlag mit kleinen Mengen kalter Pufferlösung mehrmals extrahiert wird. Die überstehenden Flüssigkelten werden miteinander vereinigt und lyophilisiert«. An dieser Stelle der Aufarbeitung ist es nicht erforderlieh, die Ionen der Pufferlösung vorher durch Dialyse zu entfernen. Das erhaltene Pulver ist bei Raumtemperatür zwar mehrere Monate beständig, wird jedoch vorzugsweise in einem kalten Raum aufbewahrt. Das erhaltene Pulver stellt ein Gemisch aus erwünschtem Protein, Arginase und* anderen Enzymen, Albumin und anderen, unwesentlichen Proteinen dar.

Abtrennung der weniger löslichen Stoffe und Transchelatierung

Zwecks weiterer Aufarbeitung wird das so erhaltene Pulver im 12-faehen Volumen kaltem 0,S m Tris-Mg*⁺-Puffer ^; gelöst, welcher an Mg⁺* 0,001 molar ist und einen pH-Wert von 7,β besitzt. Die so erhaltene Lösung wird mit kalter gesättigter Ammonsulfat!ösung behandelt, welche ebenfalls an Mg⁺⁺ 0,001 molar ist. Pro 1000 ml Pufferlösung werden hievon Anteile zu je 375 ml gegeben, wobei äi$ Pufferlösung Jeweils zu 15> 50» %5, f0 und 75 % an Ammonsulfat gesättigt

ff -

wurde. In jedem Falle erfolgt die Zugabe der Ammonsulfat- . lösung tropfenweise bei 0 bis 5 C und unter Rühren. Es wird weitere iO Minuten gerührt, worauf der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren bei 4500 ü/Min. während 30 Minuten bei 0° C abgetrennt wird.

Von«den 5, erhaltenen Fällungen wird die erste (A), welche die unerwünschten Proteine hohen Molekulargewichts enthält, verworfen. Die zweite und die dritte Füllung (B und C) werden vereinigt und enthalten Arginase und andere Enzyme, welche erwünschtenfalls isoliert werden können. Auch die vierte und die fünfte Fällung·(D und E) werden miteinander vereinigt. Diese letztgenannten Fällungen enthalten das mit Albumin und verschiedenen anderen Proteinen niedrigeren und höheren Molekulargewichts verunreinigte erwünschte Protein. Die zuletzt vorliegende überstehende Flüssigkeit, welche Proteine niedrigen Molekulargewichts und weitere unerwünschte Verunreinigungen enthält, wird verworfen.

Chromato^raphieren

Die Füllungen D.und E werden in 0,03 molarem Tris-Mg⁺⁺-Puffer, welcher an Mg⁺ 0,001 molar ist und einen pH-Wert von 7,8 besitzt, in einer Menge gelöst, daß die Konzentration der Lösung so nahe als möglich 10 fo (w/v) beträgt. Die so erhaltene Lösung wird gegen kalten Puffer dialysiert bis die Reaktion auf Sulfationen negativ ist. Die dialysierte Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit durch ein "Millipore"-Filter filtriert wird. Das erhaltene Filtrat wird direkt auf den Kopf einer Chromatographiersäule (76 χ 456 mm) aufgegeben, welche mit Sephadex G-IOO (Dextran resin, Pharmacia, Schweden) gefüllt ist. Das Sephadex wurde nach den Vorschriften des Herstellers gequollen, auf einen definierten Zustand gebracht und gewaschen. Die so vorbereitete Kolonne wurde mit 0,03 m Tris-0,001-Mg -Puffer von pH 7,8 ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Durchflußgesehwindigkeit von etwa 20 ml pro Stunde eingestellt.

- 58 -

109885/1756

Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden ist, wird sie innerhalb 30 bis 45 Minuten mit den ersten 3 cm des Kunstharzbettes ins Gleichgewicht gebracht, worauf mit dem Fraktionieren begonnen wird. Es werden Einzelfraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das Auftreten der Scheitel wird durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels der Absorption bei 280 mji erkannt.

Vor dem Auftreten des erwünschten Proteins ergeben sich zwei Scheitelwerte, die auf Albumin und andere unerwünschte Proteine ähnlichen oder höheren Molekulargewichts zurückzuführen sind. Diese Scheitelwerte zeigenden Fraktionen werden verworfen. Das erwünschte Protein findet sich in der Regel in jenen Fraktionen des gesamten Eluats, welche die crar von 130 bis 170 umfassen. Diese Fraktionen werden zwecks weiterer Aufarbeitung vereinigt. Beim weiteren Eluieren der Kolonne, insbesondere beim Erhöhen der Ionenkonzentration des Puffers, fließen aus der Kolonne restliche Proteine niedrigen Molekulargewichts enthaltende Eluate ab. Die Proteine niedrigen Molekulargewichts werden aus der Kolonne entfernt um diese für die nächste Charge zu reinigen»

Abtrennung von Puffersubstanz und überschüssigem Mg⁺*

Die das erwünschte Protein enthaltenden, miteinander vereinigten Fraktionen werden gegen entionisiertes Wasser 0,001 a Mg⁺⁺ dialysiert bis sie weniger als iO" m Tris-Puffer enthalten.Anschließend wird gegen entionisiertes Wasser, welches 1 bis 5.10 m o-Phenanthrolin oder Äthylendiamintetra-

essigsäuresalze enthält, weiter dialysiert bis die

++ —7

Konzentration an Mg auf weniger als 10 'm verringert worden ist» Falls ein Pro~teinchelat erwünscht ist, dessen vorwiegend vorliegendes Metall von einem anderen Metall als Magnesium, beispielsweise von Zink, Calzium, Kupfer oder Eisen, gebildet ist, wird bei k° C mehrere Tage weiter dialysiert, worauf das Protein etwa einen Tag einer Lösung eines Metallsalzes solcher Molarität ausgesetzt wird, daß das Protein in Lösung verbleibt, worauf überschüssiges

- 59 -

109085/1756

Metall in der oben beschriebenen Weise entfernt wird. Die erhaltene Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit in zweierlei Weise weiterbehandelt werden kann, u. zw. wird zwecks Herstellung pulverigen Proteins die Lösung lyopliilisiert bzw. wird für die Herstellung einer für Injektionszwecke geeigneten sterilen Lösung des Proteins der erhaltenen Lösung 5 ?° (w/v) Dextrose zugesetzt. Die erhaltene Dextroselösung wird durch Filtration über ein Millipore-Filter sterilisiert und unter sterilen Bedingungen in sterilisierte Ampullen oder Phiolen hineinfiltriert.

75 kg frische Rinderleber, welche 70 % Wasser enthält und 22,5 kg Trockensubstanz liefert, ergibt eine Ausbeute von etwa 200 g (l %) des das Mn⁺⁺-Chelat enthaltenden Zwischenproduktes.

200 g dieses Zwischenproduktes liefern 12,5 bis 17,5 g (0,06 bis 0,08 fo) Feststoffe in Form der Fraktionen D und E. Beim Chromatographieren über Sephadex werden aus den Fraktionen D uiid E 2,4 bis 2,9 g des erwünschten Proteins erhalten, was, bezogen auf Trockengewicht der Leber, einer Ausbeute von 0,011 bis 0,014 fo entspricht.

Bei pharmakologisehen und klinischen Untersuchungen wurde die Brauchbarkeit des erfindungsgemäß isolierbaren Protein-Metallchelats zur Behandlung verschiedener Krankheiten von Säugetieren erwiesen. Es handelt sich, hiebei insbesondere um solche Krankheiten, welche sich im erkrankten Säugetier durch Spannungszustände äußern, die durch das erfindungsgemäß isolierbare Proteinchelat gemildert werden, so daß das Abklingen der Krankheit erleichtert wird oder die Krankheitssymptome teilweise oder vollständig verschwinden. Die Wirkung ist für keine Art der Säugetiere irgendwie spezifisch.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte neue Protein-Metallchelat zeigt sich bei tier Behandlung von Entzündungen wirksam und schwächt die Folgen derselben

- 60 -

10988B/1756

ab. Insbesondere können Entzündungen des Harnweges und der Gelenke bei intramuskulärer Verabreichung von Dosen zu etwa 0,1 mg an ßäugetiere mit Erfolg behandelt werden. Dieses Proteinchelat besitzt auch ein breites WirkungsSpektrum ge.gen Viren, Überraschenderweise besitzt bereits eine sehr geringe Dosis, beispielsweise eine Dosis von 0,004 mg/kg, bei chronischen Erkrankungen eine Wirkungsdauer von mehreren , Wochen nachdem der Patient zunächst einigermaßen wiederhergestellt worden ist. Das Proteinchelat ist auch zur Behandlung allergischer Zustände, beispielsweise von Penicillinreaktionen, Pusteln (multiple wheals), Verhärtungen, Erythema, endemische Krankheiten und Krätze, geeignet. Dieses Protein erweist sich auch als höchst wirksam bei der Behandlung chronischer und hartnäckiger Bakterieninfektionen, beispielsweise von Infektionen der Genitalien, des Harnweges und der Atmungswege durch Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken und Colibazillen,

Im folgenden werden Anwendungsbeispiele des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins bzw. dessen Chelats gebracht.

An 16 Pferde mit traumatischer Arthritis würden 0,50 mg des vermischten Metallchelats des Proteins in Form einer Lösung in isotonischer Kochsalzlösung intramuskulär verabreicht. Innerhalb von h Tagen zeigte sich eine deutliche Besserung.

An 20 von 25 Polizeipferden aus San Francisco, welche an durch Viren verursachter Pneumorhinitis litten, wurden 0,5 mg des vermischten Metallchelats des Proteins in Form von 3 ml steriler Lösung in isotoner Kochsalzlösung verabreicht. Das Krankheitsbild er nichtbehandelten Pferde blieb unverändert, hingegen erholten sich von den behandelten Pferden bis auf ein einziges alle übrigen rasch und vollständig. Diesem Pferd wurden weitere 2,5 mg injiziert. Die Besserung war dramatisch. Innerhalb von 24 Stunden fiel die Temperatur von 40° C auf den normalen Wert ab. Der Zustand v/eiterer 10 Pferde konnte nach Injektion von

nt

0,l6 bis 1,0 mg des Proteins in ähnlicher Weise verbessert werden. Der Husten verschwand bereits nach i i/2 Stunden, Die verabreichte Menge war hiebei nicht kritisch.

An 10 Pferde mit Quetschwunden und starken Entzündungserscheinungen wurden 0,16 bis 1,0 mg des vermischten Metallchelats des Proteins intramuskulär verabreicht. Innerhalb einer Zeit von weniger als 24 Stunden klang die Entzündung und die Empfindlichkeit ab. Die Pferde konnten nach 1 bis Tagen wieder eingesetzt werden,

6 an Azoturia leidenden Pferden wurden intramuskulär 1,0 mg des vermischten Metallchelats des Proteins injiziert. Innerhalb 20 Minuten waren an den Pferden Zeichen der Besserung festzustellen und nach 1 bis 1,5 Stunden ergaben sich bereits Überlebenschancen, Im Falle eines Rückfalles oder im Falle häufigerer Rückfälle erwies sich die gleiche Behandlung als gleich wirksam.

Von 14 an einer schweren Virusinfektion der Atmungswege leidenden Rennpferden, welche an dieser Krankheit bereits zwei Wochen bis drei Monate litten und als Symptome verstopfte Blutgefäße (engorged sinuses), Atemschwierigkeiten, häufige Hustenanfälle, geschwollene Lymphdrüsen und stark blutige Schleimabsonderung aus der Nase zeigten, wurden 11 durch intramuskuläre Injektion des erfindungsgemäß isolierbaren Proteinchelats in Dosen von 0,4 bis 1,4 mg pro Injektion behandelt, wobei als Vehikel 1 ml 5 $-ige Dextrose pro 0,2 mg Protein verwendet wurde. Die Behandlung bestand in 4 bis 9 über 10 bis 15 Tage verteilten Injektionen. Zu Vergleichszwecken wurde den anderen drei Pferden Placebo injiziert, welches lediglich aus 5 $-iger Dextrose bestand.

Nach dieser Behandlung zeigte keines der drei, Kontrollzwecken dienenden Pferde irgendwelche Anzeichen einer Besserung. Die anderen elf Pferde erholten sich rasch und vollständig und wurden wieder bei Rennen eingesetzt.

Einem zweijährigen Rennpferd, welches an schwerer Pleuritis litt und vom Tierarzt bereits aufgegeben worden

BAD ORIGINAL

■war, wurde das erfindungsgemäß isolierbare Proteinchelat 'in Forn von fünf Injektionen zu 0,4 mg Proteinchelat in je 2 ml 5 tf-iger Dextrose, verteilt über 8 Tage, verabreicht. Die Erholung war vollständig.

Patentansprüche;

109885/1756

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Isolierung eines löslichen, nicht-· anti-genetischen Proteins vom Globulin-Typ, dessen Molekülaufbau im wesentlichen ΰ( -helical ist und welches entsprechend seinem Aminosäurenprofil unter den insgesamt vorhandenen Aminosäureresten weniger als 15 % Serin-, Threonin-, Prolin^·, Cystein- und Isoleucinreste aufweist und in welchem freie basische Aminogruppen aufweisende Aminosäurereste die freie Säuregruppen aufweisenden Aminosäurereste überwiegen, in Form eines Metallchelates, welches im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, die neben der Vorstufe des zu isolierenden Proteins in den zu verwendenden Rohstoffquellen vorliegen, aus diesem Proteingemisch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der im Proteingemisch enthaltenen unerwünschten Proteine abgetrennt werden,, während sich das Proteingemisch in. einer Pufferlösung zumindest 0,01 molarer Konzentration befindet, welche ein wasserlösliches Salz eines zweiwertigen Metalles mit einem Ionenradius von 0,60 bis 0,79 Ä* enthält.

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Metallsalz ein Magnesiumsalz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Metallchelat, in welchem das vorwiegend vorliegende Metall von Mangan gebildet ist, mit einer Pufferlösung zumindest 0,005 molarer Konzentration transchelatiert wird, wobei diese Pufferlösung, in welcher das Protein löslich ist, ein wasserlösliches Magnesiumsalz enthält, so daß ein¹ Metallchelat gebildet wird, dessen Metallgehalt zu weniger als etwa iO % von Mangan gebildet ist.

- 6h -

109885/1756

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Pufferlösung befindliche Proteingemisch zwecks Trennung einer Gelelektrophorese unterworfen wird oder daß die Trennung unter Verwendung eines porös eil, als Molekularsiel) wirkenden Harzes vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallehelat der Gelelektrophorese in einer Pufferlösung unterworfen wird, welche ein Salz eines zweiwertigen Metalles mit einem Ionenradius von 0,60 bis 0,79 Ä enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallehelat unter Verwendung quervernetzten Dextrans als Molekularsieb aufgearbeitet wird.

7. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß

a) von einem die Vorstufe des Proteinchelats enthaltendem Proteingemisch die in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 8, welche zweiwertige

.Metallionen mit einem Ionenradius von 0,6 bis' 0,8 % enthält, unlöslichen Bestandteile abgetrennt werden, daß

b) vom pufferlöslichen Anteil des Ausgangsgemisches (X) die in dieser Pufferlösung am wenigsten löslichen Eiweißstoffe höheren Molekulargewichts

A) die löslicheren Komponenten niedrigeren Molekulargewichts,

die wärmelabilen, leicht abbaubaren Proteine und

im wesentlichen die gesamten Proteine vom Albumintyp und ^-Globulintyp

abgetrennt werden, wobei mit Ausnahme des Verfahrensechrittes 4T)'alle Verfahrensschritte in der Kälte durchgeführt wurden und zumindest der Verfahrensschritt f*) in einer zumindest O₁OOl molaren Pufferlösung durchgeführt wird, welche ein lösliches Salz eines zweiwertigen Metalles

- 65 -

109885/1756

mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 Ä enthält, und wobei alle Verfahrensschritte bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 oder bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8,5 durchgeführt werden, und wobei ferner zumindest der Verfahrensschritt a ) in einer zumindest 0,Oi molaren Pufferlösung durchgeführt wird, welche pin wasserlösliches Salz eines zweiwertigen Metalles mit einem Ionenradius von 0,65 his 0,79 Ä enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwecks Entfernung der wärmelabilen Proteine während des Verfahrensschrittes ff ) die in einer Pufferlösung gelösten Proteine kurzzeitig auf eine Temperatur unter 65° C erhitzt werden, worauf die erhitzte Lösung sofort gekühlt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7_f dadurch gekennzeichnet, daß zumindest während der letzten beiden Stufen das Protein in Form eines Metallchelates vorliegt, dessen vorwiegend vorliegendes Metall ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von 0,65 his 0,79 Ä ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das vorwiegend vorliegende Metall Magnesium ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Proteinfraktion mit einer Pufferlösung vermischt wird und die darin unlösliche Fraktion abgetrennt wird, daß

b) die am wenigsten löslichen Komponenten durch Ausfällung lediglich eines Teiles der in der Pufferlösung löslichen Komponenten ausgefällt werden und hiebei das erwünschte Protein gelöst gehalten wird und daß die löslicheren Komponenten durch Ausfällung eines das erwünschte Protein enthaltenden Teiles der in der Pufferlösung löslichen Proteine abgetrennt werden, wobei die

¹ unerwünschten leichter löslichen Komponenten in der Lösung verbleiben, daß

- 66 -

109885/1756

c) die am stärksten wärmeempfindlichen eiweißartigen Komponenten durch kurzes Erhitzen der Pufferlösung auf eine Temperatur unter 65° C und anschließendes rasches Abkühlen auf eine Temperatur unter 5° C abgetrennt werden und daß

d) die rasch wandernden Komponenten vom Albumintyp und die langsam wandernden Komponenten vom ^f-Globulintyp von den restlichen Proteinen entweder durch Gelelektrophorese oder durch Chromatographieren über eine Kolonne aus einem als Molekularsieb wirkenden porösen Harz abgetrennt werden, wobei alle Verfahrensschritte in einer Pufferlösung durchgeführt werden, die ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 Ä enthält und wobei zumindest im letzten Verfahrensschritt ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von 0,60 bis 0,79 -& verwendet wird und wobei ferner mit Ausnahme des Verfahrensschrittes c) alle Verfahrensschritte unterhalb 5° C durchgeführt werden,

12, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aufeinanderfolgend folgende Verfahrensschritte vorgenommen werden:

a) Vermischen der Proteinfraktion mit einer Pufferlösung und Abtrennung der darin unlöslichen Fraktion,

b) Ausfällung einer das erwünschte Protein enthaltenden Fraktion aus der erhaltenen Pufferlösung mittels eines damit mischbaren organischen Lösungsmittels,

c) Abtrennung des wärmelabilsten Anteiles der restlichen, pufferlöslichen'Proteine durch kurzzeitiges Erhitzen auf 65° C einer Lösung derselben in eiiier Pufferlösung, wobei der wärme-

• labilste Anteil der Proteine ausfällt,

- 67 -

109885/1756

d) Abtrennen der am wenigsten löslichen Komponenten· von den restlichen pufferlöslichen Proteinen durch Zugabe einer zur fraktionierten Fällung der in einer Pufferlösung gelösten restlichen pufferlöslichen Proteine ausreichenden Menge an Ammonsulfat und

e) Abtrennung der restlichen rasch wandernden Komponenten vom Albumintyp und der langsam wandernden Komponenten vom ^-Globulintyp von der am leichtesten löslichen Fraktion der ausgefällten Proteine durch selektive Molekularfiltration unter Verwendung eines als Molekularsieb wirkenden porösen Harzes,

wobei zumindest die Verfahrensschritte c), d) und e) in einer ein zweiwertiges Metallion mit einem Ionenradius von 0,65 bis 0,79 A* enthaltenden Pufferlösung durchgeführt werden und mit Ausnahme des Verfahrensschrittes c) alle Verfahrensschritte unter 5° C vorgenommen werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verfahrensschrittes e) das zweiwertige Metallion von Magnesium geliefert wird.

- 68 -

k, Nov» 71

109885/1756

€3

Leerseite