DE1792196A1 - Verfahren zur Stabilisierung eines Proteins - Google Patents

Description

lh 280

Diagnostic Data, Inc in San Francisco (USA)

Verfahren zur Stabilisierung* eines Proteins

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stabilisierung eines gemÜO Stanapatent Nr. ...·.·...··....·· (Patentanmeldung B 89.232 IV a/30h) erhältlichen Proteln-tfetftll·- -Chelfttes, dessen Protein ein Protein vom Globulintyp 1st, la seiner Struktur o6-helioal ist und keine antigenetisch· Virkumg zeigt. Die Stabilisierung kann ait Sucrose oder ein·« anderes Saccbarid vorgenoraen werden.

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Ib Stsjospatent Vr. .· definiert· Protein

bzw. das in eine« Protein-Metal1-Chelat enthaltene Protein 1st tin ecbraubenföreig aufgebautes Protein u.*w. ioheinen ra-■indoet 80 % desselben eohraubenfttralge Konfiguration sn beeltsen. Bei Bestisarang der optischen Drehung zeigt das Protein einen deutlichen Cotton-Effekt, «as darauf hindeutet, daß vorwiegend eine oO-Schraube vorliegt (siehe Blout, "Polypeptides and

t Proteine", Kapitel 17, Djeraesi Edltor,MoGraw~Hlll PubIi»here I960). Diese schraubenfurvige Struktur, welche Voraussetzung 1st für die pharaakologlsohcn Eigenschaften des erflndungsgealB erhältlichen Proteine sobeint auf den niedrigen Anteil, u.zw. weniger als 15 % und wahrsoheinlloh 13 % •'kettenabbrechenden" Aainos&ureresten, wie Serin, Threonin, Prolin, Isolenoin und Cystein.der lnsgesaat rorllegenden Aslnostturereete zurückzuführen zu sein.

Die durchschnittliche Eleaentaranalyse des Protelnohelats lautet: 50,02 % C, 7,92 % H, 25,55 * 0, 15,26 % N, 0,43 % S,

' 0,00 % P, <i % Asche. Der Stickstoffgehalt geaäß dieser

Kleaentaranalyse liegt etwas niedriger als der typischer Proteine, was darauf hindeutet, daß !■ erfindungsgeejäO isolierbaren Pretein auch Nicht-Proteine enthalten sind. Diese Tatsaohe wird dureJi unter Verwendung eines Jod-Schiff Indikators (Iodo-Sohlff stain) durchgeführter Gelsohelben-Elektrophoreee bestätigt· Haoh saurer Hydrolyse des Proteins durchgeführte Prüfungen alt Zuokerreagentien weisen auf die Anwesenheit ron etwa k bis 5 % Kohlehydrat» bereohnet als Glukose, hin, welohee wahrscheinlich covalent em das Protein gebunden 1st.

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BAD ORiQfNAL

Bei der Gasohroaatographle end der Elektrophorese seift ■ich, daß das erfindungsgeaäß isolierte Protein kein Llpo- -Protein ist, d.h. daß ee weniger ale O₁Oi % Lipoii-Phosphor, weniger ale 0,i % Chloesterin und weniger ale 0,05 % Galakte— lipoid enthält und daß wasserlösliche Glyko-Llpolde nioht nachwelebar sind.

Das Molekulargewicht des erfindungsgeaäß isolierbaren Proteinohelats beträgt etwa 34000^(32600) * 10 % bis 28500 - 10 %. Auf diesel Molekulargewioht bezogen and unter Berüoksichtlgungjdes Asehegehaltes τοη 0,3 % enthält dieses Proteinohelat insgesamt 205 bis 243 Aainosaurereste und etwa 2 bis 4 g-Atoa Metalle pro Mol. Dieses Molekulargewicht ergibt ■loh auf osaotlsohea Wege, aus dea Asilnosäurenprofll und durch Gelfiltration auf einer alt Sephadex G-200 (Phamaela, Inc.) gefüllten Kolonne alt 90 ca Hbhe und 2,5 ca Durohaesser und Eluieren alt physiologischer Kochsalzlösung und eine* Phos~ phatpuffer (pH 7,4), wobei unter Verwendung von Ribonuolease, Chymotrypsin, Albumin und V^Globulin als Verglelohsstandard gearbeitet wird. In diesem Molekulargewicht sind die 4 bis 5 % Kohlehydrat sitberüoksichtigt.

D£e Analyse der Aminosäuren ergibt, daß das erflndungsgeaftfl isolierbare Protein von allen wesentlichen Aminosäuren aufgebaut ist. Es ist im wesentlichen frei von Cystein und anderen schwefelhaltigen Gruppen, d.h. daß as nur 0,5 bis 1, »eist 0,5 Cysteinreste und 3 bis 4, meist 3 Methioninreste pro Mol und keine weiteren schwefelhaltigen Gruppen enthält. Das erfindungsgemäß isolierbare Protein ist beispielsweise hinsichtlich des Aminosäurenprofils deutlich verschieden τοη Katalase, Arginase und

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anderen aktiven Proteinen* Ee beeitst einen außergewöhnlich, niedrigen Gehalt an Serin und Threonin und strar liegen hievoB pro Mol etwa 2 «sw· 5, in der Segel 2 bis %, Beste tot. Diesee Frotein enthält reieblioh basisch· Aminosäuren «ad tvar 9 1)1· Il Arginin-, 15 toi· 18 Histidin- and 22 bi· 26 Lysinreet· Da« erflndungegeatta Isolierbare Metallebelat eine· Protein· zeichnet eloh eoait durch «in ungewöhnlich niedrige· Verhältnis Ton Hosten saurer A»lnosäuren zu Resten baslsoher Aminosäuren au· und dieses Verhältnis beträgt 0,565» Bei Proteinen

-Anbydraee-B , Laoto~Globulin and Rlnderleber-Albnmin^ ««lohe

in Benson des Ungar-Testes keine nennenswerte antllnflanaatorisoht

Wirkung zeigen ist dieses Verhältnis grtfOer als 0,75«

In den Tabellen Ia und Xb ist nun da· Aalno·Kurenprofil des erflndungegeeäß isolierbaren neuen Metallobelat· den Aelnosäurenprofilen anderer, aus ähnllohen Quellen isolierten biologisoh aktiven Proteinen vergleiche»* gegenübergestellt· Der theoretische A^tnosäuregefaalt der Probe (86_fi %), unter Zugrunde» legung eines aas den Ajainos&urenprofll und de« elenentar- ) analytieoh bestiomton StiokeftdOfgehnlt berechneten Faktors (5»64), liegt nahe bei« tatsächlichen Wert (84,41 Jt), weleber sioh aus der AHinoeäurenanalyee ergibt. Es wird auch bestätigt» daß das Proteinohelat eine beträchtliche Menge an organischen Iflcht-Proteinen» beispielsweise Kohlehydrate, enthält«

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0960/138602

Tabelle la

Ami no "^:"ren-Prof il (g/lOO g Protein)

	Aminosäure	Neues	\rginase	Catalase	CO-	saures	Catalase	Appo-	Erythro-	Glutamin—
		Protein	Grassmann	Rinder-	Anhydiase aus Blut2	GlNu 0 -	aus Rat- tenieber	Ferri-	cuprein '	Cyclo- 6
		Chelat*		leber"	3,08	protein Plasma"	5,88	tin4		transferase
	Alanin	4,83	7,14	3,41	5,12	3,20	8,54	1,9	4,75	2,02
	Arginin	4,98	5*64	7,09	11,58	3, 59	14,89	9,1	4,27	6,26
	Asparaginsäure	8,41	10,78	9,86	0,29	8,45	0,96	6,8	7,80	10,19
	Cystine/2	0,357	Nil	0,95	8,80	Nil	13,27		3,51	N.D.
	Glutaminsäure	8,59	11,42	8,54	3,73	11,41	4,36	17 ^ 2	10,97	8,39
CD	Glycin	4,15	9,85	2,48	4,14	1,52	4,90	3,4	7,85	4,16
g	Histidin	7,21	1,26	6,81	1,45	2,43	4,26	4,8	5,97	2,99
O	Isoleucin	3,85	3,53	3,31	8,53	4,10	6,93	1,4	3,74	6,47 —\
AF CD	Leucin	5,86	10,38	7,42	6,50	9,92	7,4 5	19,1	6,07	8>76 S
	Lysin	9,7S	JO,87	8,66	1,05	4,60	3,01	7,8	7,86	6,65 J3
r-	Methionin	1,30	Nil	2,49	4,55	0,88	8,27	1,9	Nil	6,25 *■? _,
	Phenylalanin	3,62	6,84	6,81	4,54	6,01	7,95	6,1	4,37	4,24 cß
	Prolin	3,05	Nil	3,83	4,21	2,95	4,29	1,5	3,25	2,27 cn
	Serin	0,55	6,82	2,57 '	4,61	3,93	5,00		5,18	2,96
	Threonin	1,48	6,57	2,81		4,67	2,64	4,3	5,54	4,16
	Tryptophan	1,348	Nil	3,26	3,16	Nil	5,67	1,2	0,34	N.D.
	Tyrosin	2,98	2,94	6,12	4,01	2,25	6,76	5,0	0,95	5,50
	Valin	7,18	5,88	5,20		3,60		4,3	6,S7	4,57

■Grassmann et al.,J.Physiol.Chem.,312, 273-85 (l958) ⁶Messer.et al. ,C.R.Lab.Carlsberg, 35 (l)l-24 (l965 ^!Tristram et al., Adv.Protein Chem.,18, 227-318 (1963)⁷Mikrobiologisch bestimmt .

'Higashi T.J.,BioChem (Tokyo)56(4)36l-3(Eng.)

Nach entfernen von Fe ⁵Nach Entfernen von Cu

®Green et al. , J.Biol.Chem.,155,S.1 (1944)

. modifiziert durch zweistündige Hydrolyse mit 1OnKaOII

*DurchsphnitL der nit Ml (lChj, HCl (l8ⁿ) und ECl (72h) erhaltenen Werte

Tabelle Ib

Aminosäuren-Profil, Anzahl der Ai:ii nosäurereste pro Mol auf- bzw. abgerundet

	Neues	Lyso-	12	bin	■·■ - ■■ ■ \ Ribo-	Car-	Tyro-	ß-Lac-	Colla	lindcr-	yro-	Carboxy-
	Protein-	zym	1	der	Nu-	b OX)'-	sinase	to-	genase	-Alburain	inase	Peptidäse
	Chelat	aus	6	CO-	clease	Pepti-	aus	globu-			us eß-
		Ei	8	\ns	A	ase A	Neuro-	.in AB			aren	D
			6	hydra-			spora				ilzen
			2	se B
	19	12	3	17	12	20	24	29	97	48	56	22
	9	10-11	2	7	4	11	14	6	30	23	37	13
	21	21-23	12	32	15	28	31	31	85	57	114	26
	1	8	7-8	1	8	2	0	11	0	30	0	7
	19	5	5-6	23	12	26	22	49	68	77	102	24 <fN
	21		20	3	23	19	7	167	17	74	21
	15		11	4	8	. 6	4	36	18	26	7
	10	3	5	3	20	' 9	19	47	14	48	16
	15	6	26	2	24	24	43	61	65	68	20
	22	18	19	10	15	12	30	100	61	40	17
	3		3	4	3	2	8	Spur	4	17	6
	7		11	3	16	17	8	35	28	48	12
	9	15000	20	5	10	23	17	30	29	58	12 _jj
	2	keines	16	15	33	32	12	94	28	41	26 ^j
	4	15	10	27	16	16	75	34	59	26 <d
	2	7	nicht	8	8	4-5	Nil	2	nicht	10 (Q
			be-						be	—1
			stimmt						stimmt
	5	8	6	19	12	8	39	19	33	22 cn
	21	20	9	16	17	19	66	35	52	14
	33	26	17	19	nicht	30	nicht	39	ni cht	23
					be-		be-		be-
					stiniüt		£ ;::-:.it		s'xr.rrt
	2S500	30000	13700	34400	3 3000	37700	101JOOO	C 9000	119000	34000
	2-Me++	1-Zn++	keines	1-Zn++	1-Cu++	keines	Ca++	[keines	4-Cu++	Zn+ +
Aminosäure
Alanin
Arginin
Asparagin säure
Cystine-l/2
Glutamin säure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptoj»':
Tyr·: :.jn
Valin
Anid-M?o
d
Molekular
gewicht (Metall

V/ fm

Xe seift «in typtlsehes

eineo Protein-Metall-Chelats dar la Staaapateat Kr.

definierten Art, welohes ela Molekalargevloat von 31*00 teiltst.

Der theoretisch· Aalaesftaregehalt dieser Prose (89»9 % )#

unter Zugrundelegung eines aas des) Aalnostareaprofll nl de* eleaentsjrsiMlytisoh bestlasiten 8tlokstetrgebalt sereehaeten

Faktors (5,39), Hegt nahe bela tatsKohllehen Wert (88,1 %)₉ veloher

slob ans der AalnosKaraaaaalyse ergibt» Aaeh bier bestätigt sieh, daO das Proteinohelat eine betrMohtliohe Menge an|>rganleohen ä

Niobt-Proteinen, beisplelsveise Kohlehydrate, entbJtlt·

Tabelle Io AalnosKorenproflle

AninosKiire Eeste pro Mol lest·

(auf ganz· fahlen gerundet) f/lOO g Protein*

4.99 5,07 8,89 0,36 9,12 4,£9 7,** 3,98 6,05 10,10 i.5« 3,75 3.15

Alanin	23
Arginin	11
Aspa agineKurs	25
Cyatin-Va	1
aiutsjiinsXare	83
Glyoln	25
Histidin	18
Isoleaoin	11
Levoln	17
Lysin	26
Methionin	k
Phenylalanin	8
Prolin	11

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BADORIGINAi Portsetzung Tabelle I ο Aainoaäure Reste pro Mol Reste

(auf ganze Zahlen gerundet) g/lOO g Protein

Serin 2 0,57

Threonin 5 it52 Tryptophan 3 1,68

Tyrosin 6 5»O9

Valin 24 7,41

Aaidgruppen (i7) (0,70)

Asche 2-4 (Me⁺*) 0,2 - 0,5

Durchschnittswert erhalten duroh Hydrolyse «it EJ (l6 h), HCl (18 h) und HCl (72 h).

Der lsoelektrisohe Punkt des neuen erflndungegeaäfi laollortaren Metallohelats eines Proteins liegt etwa hei eines pH-Wert ▼on 5,5 - 0,2 und der isolonisohe Punkt bei 7,92 - 0,2· Der lsoaLektrieobe Punkt wurde duroh Elektrophorese auf Zellaleaeaoetat bei verschiedenen pH-Werten und unter Verwendung eine· Zitrat-Phosphat-Puffers emittelt. Die Transportwege betrugen -5,77 β» bei pH ■ 4,45, -4,67 ra bei pH = 4,85, -1,70 sä bei pH ■ 5,30, -0,50 m bei pH = 5>45, 0 μ bei pH » 5,50, 4-2,90 ■■ bei pH s 6,05 und -t-4,90 m bei pH * 6,55· Aus diesen Transportwegen ergibt sich der-lseiLektrieche Punkt bei etwa pH * 5 t 5· Der leolonieohe Punkt wurde entsprechend Rlddiford, J.Bloohea· 239t 1079 (1964) bestirnt· Hlebel wurde das Protein sveek* Yollsttadiger Entfernung τοη Elektrolyten grUndlloh dialyslert und ansohlieOend lyophilislert, worauf 25,8 ag des lyophllcsierten

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BAD

Produktes in 5 al entionisiertea Wasser gelöst und die erhalten« g in eine auf 25°C gehaltene Zelle eingebracht wurde} in

welcher sie unter Stickst off atmosphäre so lange (etwa 40 bis 60 Minuten) belassen wurde, bis sich ein stabiler pH-Wert einstellte. Es ergab sioh so ein isoionischer Punkt von etwa 7,92 ί 0,02.

Der Isoelektrische Punkt und der isolonisohe Punkt dee erfindungsgemäß isolierbaren Proteins liegen beträchtlich weit auseinander. Offenbar lagert sieb das Protein τοrzugsweise an jene Anionen an, welehe in den Pufferlösungen enthalten sind, in welchen es selbst gelöst ist, so daß letzten Endes da* isoelektrische Molekül nicht tob reinen Protein sondern tob eines Salz mit den gebundenen Anionen gebildet ist.

Dieser Unterschied swiscben dea isodLektrisohen Punkt und dea iaoioniechen Punkt ist bei den meisten Proteinen nioht die Regel, jedoch wurde bereits für Gelatine ein Unterschied zwischen ieoionisoheo Punkt und isoelektrischem Punkt (D.S. Jackson, et al. Biooh. Biophys.Acta 26, 638, 1957) und für Enolase (B.G.MalBtstroo et ai, J.Bioohea., 234, 1108, 1959) berichtet.

Im erfindungsgemäß Isolierbaren Metallehelat eines Proteine überwiegen die freien basischen Gruppen (46 bis 55 tob Arginin, Lysin und Histidin stammende basische Gruppen) über die freien Säuregruppon (27 bis 31 von der Asparaginsäure und der Glutaminsäure stammende saure Gruppen, 13 bis 17 der 40 bis 48 sauren Gruppen dor Asparaginsäurereste und Glutaainsäurereste sind in Amid-Blndungon blockiert). Das Überwiegen der freien basischen Gruppen über die freien sauren Gruppen (das Verhältnis beträgt etwa 1,7 t 1 bis 1,8 1 l) ist der Grund für die Ver-

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BAO ORIGINAL

8chielnmg dee isoionischen Punktes gegenüber dem isoelektrieohen Punkt und stützt die Annahme, daß das isoelektrieche Molekül ein Salz des Proteins und der daran gebundenen Anionen darstellt und es wird auch anganoaaen, daß dieser umstand zumindest zum Teil zur einzigartigen physiologischen Wirksamkeit des erfindungsgemäß isolierbaren Proteins beiträgt.

Das Infrarotspsktrua äee erfindungsgamäß isolierbaren Metallchelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestirnt, typisoh fttr Proteine. In der unionsteheaden Tabelle sind die ültraviolettabsorpticn3spektren dieses Proteins bei pH = 1,5 in 0,05 η HCl₉ bei pH = 1,5 in 0,05 η HCl + O₉IO m KCl , bei pH * 7

in Wasser_s bei pH = 7 in 0,05 m Phosphatpuffer und bei pH - 13 in 0,15 a KCl, wobei der pH-Wert Bit 1 η KOH auf eingestellt wurde, dargestellt.

iO -

209821/0960 BAD ORiGiNAL

	Ultraviolett* Abtun	•Y"«s 0,05	j "V β 0,15	Mbalato	1?H 7,0	1792196	• ■	PE 13,0	ι - ,	0,430
	* nct;.oi.i Protoli	0,560 ng/io]	0,434 ug/nri	tiaoho Dichte	Pnffor			KGX - KOjE
		0,068 .	OnOOS	pH 7,0	0,402 sg/ni	•	0,492 og/sl	0,420 \
		0,102	0c030		0,00	o.iae	•
	pH 1,5	ΟΓ1Ί5	0,0G6	1,OC icg/sl	0,03	0(280 I	0,411
	0,23ο	0,129	0f 035	0,i3	0P3£3 ■ Ί	' 0,410
	0,320 ■'■-	0,ii>0	o,üöo	0B18	0,480	0,422
"Ζ"	0,342	0,,304	0,184	0.28 '	0,4£2	0,471
310	0,355		0,373	0,22	0,4SO '	' 0,502
300	0,369	0,2id	0,OiO	«.		0,645
29ΰ			0,640	.0,20	0,4SS	1.150 '■
290	0t377	• 0,344	0,560		1,45 I
285		0,223	0,S70	0,30	1,70
284	0,364 '	O1.327	0,530
283		0,223	0,583	0,30 ,
283	0f3S5 ' '	C1.226	0,590
281	0,385	0-225	0,892	O0SO
280	0,364	0,306	0,500
37ß	0t330	0,170	0,638	0,27
278	0,264	0,144	0t530	0,23
277	0,247	0,117	0,538	0,19
2 ΊΓβ	0.226	0( 104	0,475	Ο,ί.5
27ΰ	O1263	0,134	0,400	0,13
a ve	0,433	0,372	0,337	O913
365	-	-	0,315	0,37
2Ö0		0,402	ΙρθΟ
255		0,190
2S0		··
243
240
230

Die im sauren Milieu und i» alkalischen Milieu eraittelttn Absorptionsspektren des Proteinchelats sind beträohtlich yersohieden ron de* bei pH - 7 erhaltenen Absorptionsspektru«. In Anbetracht dieser unterschiede kennen Ultrarldett-Differen*- apektren daduroh beetlent werden, daß die UV-Absorption des In

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BAD ORIGINAL -

einen Test-Lösungsmittel gelösten Proteine gegen die UV-Absorption des isit gleicher Konzentration in einen BezugsliSsungsmittel gelösten Proteins photoiaetriech bestimmt wird· Solche Differenzspektren Bind bei der Beurteilung der Art des Einbaus aromatischer Aminosäuren und des Cysteine in Proteine wertvoll ^fliehe Vetlaufei Adv. Protein Chemistry, 17» 346 (1962), Biddiford et al., J.Biol. Chea. 239, 1029 (1964); 240, l68 (1965)_7. Tryptophan und Tyrosin tragen hauptsächlich zur Absorption in Bereiche zwischen 270 bis 300 mu bei* Auf Phenylalanin ist die Feinstruktur im Bereich um 250 eu zurückzuführen; Phenylalanin absorbiert jedoch nicht oberhalb 270 mu · Sowohl Tryptophan ale auch Tyrosin und Cystein können zu einer Absorption im Bereiche von 235 bis 245 9a beitragen. Bei 25°C wird in Spektrophotometer nach Hitaohi-Ferlrin-Elraer Model No. 139 und unter Verwendung geschlossener (matched) XUvetten das UV-Spektrum bestimmt· Das Instrument wurde so kompensiert, daß eioh bei allen pH-Werten eine flache Grundlinie ergab. Bei im alkalischen Bereich liegenden pH-Werten stellten sich die Endwerte rasch ein und blieben zwei Stunden konstant, während bei im sauren Bereich liegenden pH-Werten zwei Stunden erforderlloh waren, um einen Gleichgewichtszustand zu erreichen. Die Kurven ergeben sich aus unter den folgenden Bedingungen erhaltenen Meßwerten:

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BAD ORIGINAL¹^ '' ^QAB

(Konzentration des Protein·! 0,502 mg/ml)

Kurve A₁ Vergleioh; 0,05 η KgHPO^+O,! β KCl; pH 7,0 Probe: 0,1 η KCl + 0,05 st KCl) pH 1,5

Kurve A« Vergleioh: 0,05 m K₃HPO₄J pH 7,04 Probes 0,05 η HCl; pH 1,5

(Konsentration des Proteinst 0,492 mg/ml)

Kurve B, Vergleich: 0,05 η K₂HPO₄+ 0,lm KGl; pH 7,06 Probe: 0,15 m MKCl + η KOH; pH 13

Bel pH ■ 13 scheinen alle Tyroeinreste des Proteine dem

Lösungsmittel frei zugängig zu sein und damit augenblicklich iu ionisieren, nährend bei einen pH-Wert von l„5 sogar bei einer Xonenkonzentration von 0,05 m die Tyroeinreste teilweise des Zu» griff des Lösungsmittelβ entzogen sind· Das Proteinmolekül zeigt sioh somit im alkalischen Milieu stärker aufgefaltet·

Im eueren Milieu ist das Protein bei einem pH-Wert von 5,5 zum Teil unlöslich, jedoch beginnt es sich bei einem pH-Wert von 2 wieder aufzulösen. Bei einem pH-Wert von I₉S wird das Protein wieder zur Gänze gelöst« Bei Bestimmung des Difforenzspektrums

im sauren Milieu sind die Absorptionsmaxlma im Bereich von 292 ν

bis 394άα auf Tryptophan und jene im Bereich von 285 bis 287au auf Tyrosin und zum geringen Teil auf Tryptophan zurUokzufUhren, während Phenylalanin Änderungen in der Feinstruktur von 250 bis 265ma bewirkt· Es ergibt sioh ein auffälliger Unterschied zwischen den im sauren Milieu bei Ionenkonzentrationen von 0,05 ■ und 0,15 m ermittelten Oifferenzspektren. Bei einer lonenkonaentratloa von 0,05 m finden sich von 280 bis 296mu keine ausgeprägten Absorptionemaxlraa, jedoch zeigt sioh bei 294 bis 296*u ein Plateau und eine breite Schulter von 285 bis 29ObU vor, welcher

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bei 280 bis 282au ein niedrigere« Plateau liegt· Bei einer lonenkonzentration τοη 0,i5 m zeigt eioh bei 294 bis 296mu weder ein Absorptionsmaximum noob ein Plateau, sondern ein breites welliges Plateau im Bereiohe τοπ 278 bis 285mu mit einer Schulter bei 286 bis 290*u.

Ee besteht Grund zur Annahme, daß bei einem pH-Wert τοη Ι,δ das Plateau bei 292 bis 296bu auf Umlagerungen der zwei fryptophanreete im Molekül des Proteins zurtiokzufuhren let. Die Schulter bei 287 bis 290au w3rd wahrscheinlich sum Teil durch fc die Tyrosinreste im Molekül erzeugt. Bei einer lonenkonzentration τοη 0,15 m scheinen Ale Tryptophanreste nahezu vollkommen abgeschirmt zu sein, was bei einer lonenkonzentration τοη 0,05 ■ nicht der Fall ist* Die bei beiden lonenkonzenvrationen erhaltenen Spektren sind hinsiohtl/.ch der auf Tyrosin zurttokzuftthrenden Absorptionsmaxiaa ziemlich abnormal. Das bei anderen Proteinen übliche Absorptionsmaximua bei etwa 285m« fehlt bei einer lonenkonzentration ron 0,15 m röllig und ist bei einer lonenkonsentratlon τοη 0,06 m zu einer schwachen Schulter degeneriert· Au« der Absorptionskurre τοη 284 bis 288smi ergibt sich, daß die Tyrosinrette la Molakttl des Proteins gut eingehüllt sind und damit den Angriff lies Lösungsmittels entzogen sind.

Bei der Gelsoheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid und der ' DUnnsohloht-Elektrophoreee auf Agaröse gibti das Protein-Metall- -Chelat ein typisobes Bild mit drei nahe beieinander liegenden Bändern· Die DUnnsohloht-Elektrophorese 1st τοη R.E.Phillips und F.R.EleTitch, progress in Clinical Pathology, 1966, Selten 62 bis 153ι beschrieben worden. .

DIe Gelsoheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid

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BAD ORfGfNKL ·'

toeruht auf den Arbeiten von Ornatein .

und Davis, Ann. N.Y. Aoad.Soi» 121, 321 und 404 (1Θ64) und von Williams und Reisfeld; Nature 105, 281 (1962), wobei sweoks besserer Auflo*sung_f zwecks Erzielung sehärferer Banden and sweoks Ersielung verläßlicher Fließbedingungen verschiedene Abänderungen getroffen wurden·

Es wurden unter anderem folgende Vereuohsbedinguagen eingehalten:

pH 9,4

1) Vorbehandlung! 2 mA pro Rohr während 1,5 Stunden bei

konstantem Strom, nur fließendes Gel.

2) Elektrophorese: 5 mA pro Rohr während 50 Minuten bei

konstanten Strom, fUr 12 Rohre daher 50 *A, 140 Y su Beginn bis 320 V am Ende.

3) Anfärben: 16 Stunden in einem Gemisch aus 10 %

Eisessig, 20 % Methanol und 70 % Wasser, wobei das Gemlsoh pro 100 al 15 ag Amido- -Black gelttst enthielt.

4) Entfärben: 12»5 oA pro Rohr und Stunde bei konstan

te« Strom. pH 8,8

1) Vorbehandlung: keine

2) Elektrophorese: 6 mA pro Rohr und Stunde bei konstant·»

Strom_t für 12 Rohre daher 72 mA, 100 V zu Beginn bis 160 V am Ende.

3) Anfärben: 16 Stunden in der oben angegebenen Lttsvnf_r

4) Entfärben: 5,5 mA pro Rohr und Stunde bei konstantem

8trom.

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BAO ORIGINAL

Typ}, echo Eloktropborograome dos Metellohelate des Proteiae οuthält die unfcottsichoiiäQ Tabelle, In «reicher aaatliobe Werte

Niihorungaworbo

	I 1 I·	pH 9,4	Enenal- tät in %	Breite in σα	2 - 4,	pH	3,0	0	Eeleiire Intonsi- tiit in %
' \	Brot-fco In cm ι	Abstand voia Ur sprung in bei*	100 68-52	i. °*	von Ur- üprung iu oml		1°° 53-53 -
oberes D a ml üittlox-GD D a rid' iint.oroo Band	i.o Ο,δ	11,5 i4,0 18,0		16, 2O1 22,

'oborcr rißH'J_t Croecrjolünge des flfefionäon Οβίοβί 56 mn ;

Die DUnnschicht-Elektrophorese auf Agarose wurde in 0,05 a Tris-glycin-Puffer bei eine» pH-Wert von 8,^5 während 30 Minuten und bei einen konstanten Strom von 5 "A durchgeführt, wobei zu Beginn die Spannung etwa 185 bis 195 V betrug und gegen Ende die Spannung um etwa 20 V höher war. Die Platten wurden entsprechend den Angaben in*der erwähnten Literatur behandelt und gefärbt.

Im Hinbliok auf die offensichtliche Einheitlichkeit des erfindungsgemäO isolierbaren Metallchelats eines Proteins,& wie sie sich beim Ultrazentrifugieren, bei der Gelfiltration, beim Chromatographieren über Ionenaustauschharzen, wie DEAE- -Sephadex, aus dem Aminosäurenprofil usw. ergibt, wird angenommen, daß die sich bei der Gelscheibenelektrop^orese zeigenden typischen drei Banden auf eine Aufspaltung einer Bande zurückzuführen ist, welche Aufspaltung Pufferwirkungen im elektrischen Feld zugeschrieben werden kann und nicht auf die Anwesenheit dreier verschiedener Proteine im Metallchelat des Proteins hln-

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weist. Bei der Gelelektrophoreee bewegt sich das erfindungsgeaäß isolierbare Protein langsamer als Albumine und söhne11er al· ^-Globuline.

Bein Ultrazentrifugieren bewegt sich das erfindungsgeaäß isolierbare Protein in For« eines einheitlichen, scharfen Bande· weiter, wobei der Sediaientationskoeffizient etwa 3*72 - 0,05 Svedberg-Einheiten beträgt·

In folgenden sind einige weitere Kennzahlen des !■ Staimpatent Nr. definierten Protein-Metall-Chelats

bzw. des erfindungsgeaäß erhältlichen Protein-Metall-Chelat· angegeben·

Molekulargewicht

aus Gelfiltration

" Sucrose-Dichtegradient " AasliLOßäureprofil

ⁿ 0au3tisohem Druck

Sedimentationskoeffizient (physiologische Kochsalzlösung) Isoelektrischer Punkt, Zitrat- -Phosphat-Puffer

Ieoionischer Punkt
Absorbtion, aJ₈*
Intrinsische Viskosität el/f Partielles spezifisch«· Volumen el/g friktionsYerhältnis
8oh«raga-Mandelkern-Koefflzient_f 0 Lunge das äquir&lenten Ellipaoids in % sohwer austauschbarer Aaid-Vasserstoff Elektronenspinresonanz
H»utpr«eoaanx (Cu⁺+), Gauß

32200 - 1000 32500 32600 i 33500 i 1000 32900

3,72 χ 10""¹³

5,5 i 0,2 7,92 i 0,02 6,2 i 0,2 3,55 0,7*2

2,22 χ iO° 110 bi· >80 %

3250

_v O»« trfindemege^O ieollerbtr· frotein liegt >wit«ifit

SWi Teil in rom «In·· Mttalloaelat·« vor» «·■*· «itMUt ·■

Protein«

2 bis k Mgtallatone pro Proteinmolekül. Der Metallgehalt /

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BAD ORIGINAL

•aasten erweisenden Proben liegt der Metallgehalt swlsohen 0,28 ond 0,75 5». Da* Ausmaß der pharmakologlsohen Wirkung de« Metall·· Ohelates soheiat zumindest zum Teil von der Anwesenheit eine· oder mehrerer physiologisch wesentlicher zweiwertiger Metallleneη la Chelat abzuhängen« Au« dieses Grunde werden in da· Metall·, ohelat vorzugsweise zumindest 66 %_t besser mindesten· 75 %, und insbesondere 85 % Metall eingebracht u. zw. in Fora mindesten* einasj der Metalle Mg, Ca, Pe, Sn und Cu. Zwecks Herstellung von Metallehelateη höchster Wirksamkeit wird dafür gesorgt, da8 zumindest 40 % des Metallgehaltes von einem swelwertlgen Metall mit einem Ionenradius von 0,65 bis 0,79 A, beispielsweise Magnesium, gebildet sind, Solehe Metalle können beispielsweise dem Buoh von HaIl₁ «Chemistry and Physios,¹¹ 44 - Auflage, Selten 3507 bis 3508 (1982) entnommen werden. In den meisten solehen Chelaten 1st eines dieser Metalle auch das vorwiegende Metall· Unter dem "vorwiegenden Metall" ist hiebet jenes obelatlereade Meteil zu verstehen, welches im Proteinohelat mit dem httohstea Anteil enthalten ist. Obswar in den die stärkste Wirkung seifen·» den Metallohelate* des Proteins der größte Teil des Metallgehaltes auf physiologisch wesentliche zweiwertige Metalle aurüoksufUhren 1st, enthalten typische Metallohelate auch andere Metalle. Diese weiteren Metalle

werden häufig während der Isolierung des Proteins voa diesen aufgenommen u. sw. insbesondere dann, wenn der Oesamtmetallgehalt des Proteins relativ niedrig ist« Dies kann dann vermiete» werden, wenn das Protein in einer Pulisriesuag verweaxtwird, «ie ela päyslelegis«* vea*a«Uet»· sveiverUj·· Metall la eimer e*#

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BAD ORIGINAL

aufaunae von Freadeetallen durch das Protein auerelohend hoben

Konzentration ale Kation enthält und/oder wem? das Protein nur

halten. mit Anlagenteilen in Berührungkönnt,die keine «olohen Metall ent-·/

In den wirksamsten Chelaten sind weniger als 10 % der insgesamt vorhandenen Metalle physiologisch unwesentliche Metalle» beispielsweise Al, Si und B.Ein zu geringer Gehalt des Protein* -Metall-Chelats an physiologisch wesentlichen 2-wertigen Metallen ist nachteilig für die Wirksamkeit dieses Chelate. Einwertige Metalle, beispielsweise Natrium und Kaliua, und Zellgifte darstellende Metalle, beispielsweise Blei, Chroe, Selen usw.,sind ie Metall- ' ohelat selbst vorzugsweise höchstens in Spuren anwesend,

Auf Grund der bisher gemachten Feststellungen auß gesohlossen werden, daß Ca⁺*, Cu⁺*, Mg⁺⁺ und Zn⁺⁺ eine entsoheidenfe Rolle dabei spielen die Struktur des nativen Proteine zu bewahren, diese Metallionen können als "Sperrstifte" angesehen werden, die intramolekulare Quervernetzungsbrlioken bilden und danlt das Molekül zusannenhalten; diese Metallionen tragen eoait zur Stabilität des Proteins bei, nach en das Protein itausun gegen die meisten proteolytisohen Enzyae und sind dor Grund fUr zahlreiche der pharnakodynaiaisoben Funktionen dee Proteins.

Doim Vorfahren geaäß Stcjampatent wird das erwünschte Protein zunindest teilweise gereinigt, vorzugsweise isoliert, während ee in Fora eines MetaUchelats vorliegt, dessen vorwiegend vorhandenes Metall einen Ionenradius von 0,65 bis O₉79 λ besitzt. Venn ein Cholat isoliert vorliegt, dessen vorwiegend vorhandenes Metall einen kleineren oder größeren Ionenradiu« besitzt (beispielsweise Mangan Bit des lone»-adius 0,80 % oder Calzlum «it den Ionenradius 0,99 X), so kann dieses duroh

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Transohelatierung In ein Chelat Übergeführt «erden« dessen Torwiegend vorhandenes Metall einen Ionenradina von O_f65 hl« O₉79 Ä besitzt. Bei einer solohen Transohelatierung wird das umzuwandelnde Chelat mit einen Überschuß einer ein wasserlösliche» Salz des erwünschten Metalles enthaltenden Pufferlösung behandelt» wobei das Verhältnis von Metallion zu Protein so eingestellt wird» daß das Protein in der gewählten Pufferlösung als Metallohelat eines solohen Metalles verbleibt.

ί In zahlreichen Quellen natürlicher Eiweißstoffe sind Spuren

der natürlich en Vorstufe des in erfindungsgemäO Isolierbaren Produkt enthaltenen Proteins enthalten. Solehe Quellen keimen tierische Organe bzw. Gewebe« beispielsweise Leber, Viere« Hoden» Pankreas, Plaoenta, Darasohleishaut, Thyaus, Lunge, Mils von Kaninchen, Schafen, Rindern, Schweinen und Menschen« Meerestieren, Flunder, Heilbutt, Schwertfisch, Muscheln, Hunser, Auster,fceln. Auch pflanzliche Eiweißquellen, wie Samen, Veisenkeimlinge ungeschälter Reis, Sojabohnen, Lina and Jaokbeans sind brauchbar. Auoh eßbare Pilze und Mikroorganismen, wie Fungi und Bakterien sind brauchbar. Beispiele hiefür sind Hefe, E.Coil, Cl. Hystolyticun, Cl.Kluyweri, Cand.Mycoderma, Cl,Velchii und Achron.Fisheri. Da die natürliche Vorstufe des erflndungsgenäß isolierbaren Produkts labil ist, soll alt der Isolierung sobald als auglich nach Gewinnung der Eiweißquelle begonnen werden.

Ein Protein-Metall-Chelat der in Stannpatent definierten Art kann gemäß der Erfindung dadurch stabilisiert werden, daß aus diesem Chelat und (a) Sucrose, oder (b) einer Pentose» einer Bexose oder einer Heptose mit einer Hydroxygruppe an elnea

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BAD ORIGl

jp'OSRO am

einer freien Carbonylgruppe einer Ketogruppe an oder einer Aldehydgruppe benachbarten Kohlenstoffatom» und in einer ränalloh den zwei Hydroxygruppen an den nächst folgenden Kohlenstoffatomen gegenüberlieglenden Stellung, oder (o) Alkylacetalen von Pensosen, Hoxosen oder Heptosen, oder (d) Gluooae, oder (e) Mannose ein Gemisch hergestellt wird* Unter anderen betrifft die Erfindung die Herstellung von bei Raumtemperatur Lagerfähigen wässerigen Lösungen und gefriergetrockneten Präparaten eines solchen Metallohelats, beispielsweise die Herstellung steriler injizierbarer Lesungen und die Herstellung gefriergetrockneter und in eines Behälter dicht eingeschlossener steriler Misohungen, die nach längerer Lagerung in eine injizierbare Fora gebracht werden können. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung des Proteins, welche ein Saooharid der angegebenen Art enthält, getrocknet. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgeaäßen Verfahrens wird ein Proteln-Metall-Chelat in Gegenwart eines Saccharide der anggegebenen Art gereinigt.

Es ist Gegenstand der Erfindung ein gefriergetrocknetes Protein der angegebenen Art in Form eines Gem is oh es mit Sucrose oder einem anderen stabilisierend wirkenden Saooharid herzustellen. Es ist weitere Gegenstand der Erfindung ein solches Gemisch in fester Form, inabesondere in steriler Form herzustellen. Einweiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung einer solchen Misohung in Form einer sterilen injizierbaren Lösung. Es ist weiters Gegenstand der Erfindung solche fest«, sterile Mischurgeiu hermetisch in einem Behälter

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eingeschlossen zu sohaffen ua aus einer solohen Misolnmg ·1β injizierbare· Präparat herstellen xu kennen. Bin weiterer Gegenstand der Erfindung let dl· Schaffung einer In eines Behälter elnceeobloseenen sterilen» injizierbar« tarnung de« Metallohelates, welche vor Verwendung gelagert werden kann· Ein weiterer Gegenstand der Erfindung let ein Verfahren zu» Beinigen und Gefriertrocknen eine· solchen Proteins in Gegenwart eines Saooharlds der angegebenen Art ua eine ZeretSrang dee Proteins zu vermeiden.

Das Protein-Metall-Chelat der ie Stsaapatent Vr. ··.··... angegebenen Art 1st in reiner Fern instabil. Beispielsweise let ein teilwelser Abbau des gereinigten Proteins während des Gefriertrocknen« su beobachten, u.zw. unabhängig davon wie hiebe! ie einzelnen vorgegangen wird. Ein sdtebes Verhalten ist fttr reine Proteine durchaus nicht ungewähnllch und es wurde bereits von verschiedenen andersartigen Proteinen berichtet« da8 sie nach Erreiohen eines bestimmten Beinheitsgrades Zersetzungen ) erleiden· Dies gilt insbesondere für unstarre Proteine, das sind solche Proteine, die nicht durch intramolekulare kovalente Bindungen, beispielsweise S-S-Brücken, zneaanengehalten werden·

Es ist bereits bekannt, daß Broteine hohen Beinheitegrades am besten durch geringe Mengen anderer Proteine, beispielsweise .slbunin, stabilisiert werden kttnnen. Andere hoohaoleknlare« lOsllche Verbindungen biologischer Herkunft, wie aarltlae Kolloide (Carrageenln), Stärke, Dextrin und andere Poljrsaoeharlde und Phospholipoide wirken gleiob gut« Da nun aber das gseiifl dar vorliegenden Erfindung bzw. das geatto des Stwystent Mr· ····.·»·.

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BADORiGiNAL ^fVh

erh&tllehe Protein mwt de· Injektion·«·!· verakreioht wird, eind alle diese Stoffe für Stabllleierttngssweoks deshalb angeeignet weil ele Allergie enengen, nicht leoton sind and in einigen Fällen stark toxisch wirken· Darüber binans wird doroh Freadproteine und/oder Lipoproteine die biologlaohe Wirksamkeit de· in Staaapatent Hr. «·«·... definierten Proteine verringert, was häufig der wichtigste Grund für die Unbrauohbarkeit solcher Stoffe 1st.

Ähnliche Einsohrädcungen gelten auch für ander· bereits für die Stabilisierung τοη Proteinen nlt Erfolg angewendet· Stoffe, wie Nuoleotlde, Glutathion and andere Thiole und Sulfite· Zur Stabilisierung von Proteinen worden auch Übliche Pufferlösungen, Terpene, Polykationen and PoIy*- anionen verwendet. Beispiele für Polykationen sind Protaein- -SuIfat, Polylysin, Polyvinylanid und 1,10-Dlanlnodeean. Beispiele für Polyanlonen sind sulfuriertes Polystyrol, PoIyvinylsulfat, latrloa-Dodeoyleulfat, Deztran-Sulfat u.dgl. P.Burnfeld etal.» Areh.Bloehen.Bioph·, 111, 31 (1965) bringt typische Beispiele für die Verwendung von Polykationen und Polyanionen für die Stabilisierung von verschiedenen Proteinen, hohen Reinheitsgrades. Obzwar verschiedene der erwähnten Verbindungen zur Stabilisierung des neuen Proteins an sich verwendet

sie
werden könnten, slnd/d«nnoch wegen ihrer Toxlzität, wegen der Erzeugung von Allergie und wegen mangelnder Isotoni· unbrauchbar für den vorliegenden Zweck. Ton Vakld und Hansur 1st in J.Hol. Pharaaoology, l, 53 (1965) über die Sohutswirktmg von Hezose-Phosphaten , Nucleotiden, Glutathion und

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Sulfat- oder Phosphationen, entweder allein oder vorzugsweise in Kombination angewendet, au# Phosphofructoklnase berichtet worden. Die überprüfung der Methode von Wakid and Mansur auf ihre Eignung für den vorliegenden Zweck liefert· jedoch negative Ergebnisse. Die Nucleotide, welche sich zwar zum Teil als wirksam erweisen, müssen zur Erzielung einer Stabilisierungswirkung in mindestens der fünffachen Gewiohts-Benge, bezogen auf das neue Protein, verwendet werden, weshalb,

" abgesehen von den Kosten, diese Stoffe wegen fehlender Isotonie und wegen der Erzeugung von Allergie als Stabilisatoren nicht in Frage kommen. Glutathion kann nicht verwendet werden, da es mit dem neuen Protein unter Verringerung der Löslichkeit und der Wirksamkeit desselben reagiert. Von den verschiedenen Hexose-Fbosphaten wirkt das Fructose-l,6~diphosphat au besten, weshalb das Fruotose-i. ,ö-diphoophat zwar im Prinzip verwendet werden könnte, jodocb wegen seines hoben Preises wieder nicht in Frage kommt. Die durch Fruotose-l.6-diphosphat erzübare

. StabiliBierun&tfirkung für das neue Protein ist nun

gebunden an die gleichzeitige Anwesenheit von Glutathion, Meroaptoüthanol und anorganischen Ionen, welche Stoffe dies· Kombination für die Stabilisierung des neuen Proteine wertlos

machen. Die Feststellung der genannten Autoren, daß frei·

bei

Monosaccharide selbst/einer Konzentration von 10 -molar bzw. bei einem 250-fachen Überschuß an Stabilisator gegenüber dem Protein keine Stabiliseruiigswirkung ergeben, spricht überhaupt gegen die Verwendung von Zuckern als Stabilisatoren für das neue Protein,

- 2k -209821/096Q

bad

Iff

Es sind bereits verschiedene Saccharide in Kombination alt eiweißhaltigen Stoffen verwendet worden. Beispielsweise wurde Glycerin mit Tri-Krasol als Bakteriostatikum für Sareom-Antlgen verwendet· Vitamin A und anöüro leicht oxydicrbara Verbindungen niedrigen Molekulargewichts sind bereits dadurch gegen Oxydation geschützt worden, daß aus diesen Verbindungen und Polysacchariden hohen Molekulargewichts, z.B. Dextrin und Stärke, Einschlußverbindungen hergestellt worden sind. Ein für intravenöse Verabreichung bestimmtes Proteinhydrolysat ist bereits durch ein Gslatinehydrolyaat stabilisiert worden. Trypsin wurde bereits in lösliche Fora gebracht und stabilisiert mittels Mischungen von Polyüthylenglykol, pflanzlichem Gummi, Zuckeralkohole^ löslichen Stärken, lösliohnn Zellulcsederivaton, Dextrose, Lävnlose, Inosit, Arabinose und ß-Lactose. Injizierbare Pha-Tnazeetika niedrigen Molekulargewichts wurden bereits dadurch mit eiaer Depotwirkung ausgestattet, dcß sie mit Fibrinogen ^v biniert wurden, welches nach Injektion koaguliert und damit di Depotwirkung erzeugt, wobei Glycerin verwendet wurde um ein· Koagulation vor Injektion zu verneiden. Masernvaooine urden bereifen iiit groBa Mengen ^c.n Lactone eataalte* . .sohungen von Lactone und Olxitamat stabilisiert. Eaociili Calmette-Gueria- -Veoci;ic3 wurde bereits mit Dextran stabilisiert. Polio-laooin· wird Ublichurweise zvsoks oraler Verabreichung in einem Stttok Würfelzucker absorbiert. Vaccinia Virtus (Pox)-Vaooine ist -bereits durch Trieatz einer Mischung von Lactose und Caloiualaoto-» bionat stabilisiert worden. Zur Stabilisierung eines Masern-Vacoinec wurde bereits Sorbit verwendet. Für parenteralβ

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BAD ORIGINAL

Injektion bestimmte Präparate von Chlorilazepoxyd eind In einem Maleinsäure» Polyoxyäthylen bzw. OH-Gruppen aufweisenden Verbindungen mit 2 bis 6 C-Atome, vie Glycerin, Propylen-

glykol, Sorbit oderGluoose, enthaltendem Medium dlspergiert worden.

Es wurden somit bereite viele Verbindungen stark verschiedener Struktur alt wechselndem Erfolg als Stabilisatoren für verschiedene Proteine verwendet. Es existiert jedooh keine

allgemeine Regel, welche auf die Brauchbarkeit Irgend eine· Stoffes schließen läßt. FUr jedes Protein ist eine andere Art eines Stabilisators erforderlich. Ein sich für ein Protein als Stabilisator als äußerst wirksam erweisender Stoff 1st häufig fUr ein anderes Protein als Stabilisator völlig ungeeignet. Im Stammpatent Hr. ....... ist ein neues

injiaerbares Protein-Metal1-Cbelat beschrieben, das tiberragende pharmakologlsöhe Wirksamkeit besitzt. Dieses Metallohe|.at wird im Rahmen eines Verfahrens erhalten, bei welchem das Chelat gegebenenfalls gefriergetrocknet wird. Das Protein ist nun während des Gefriertrocknenes in hohem Maße der Gefahr einem Abbaues ausgesetzt. Darüber hinaus sind auch wässerige LOsnnges des Proteins, aber auch das gefriergetrocknete Protein selbst bei Raumtemperatur nicht ausreichend lange lagerbeständlg (die Lagerbentändlgkelt beträgt nur kurze Zeit). Dies «teilt nun vom wirtschaftlichen Standpunkt aus einen ernsten tfaohteil dar. Der Preis des isolierten Proteins 1st äußerst hooh, da bezogen auf das Trockengewicht der natürlichen EiweiBqaelle, nur Ausbeuten von O₉Ol % erzeilt werden. Der beim Gefriertrocknen des gereinigten Proteins eintretende Verlast von 25 % oder mehr ist somit äußerst schwerwiegend. Darüber

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BAD ORIGINAL ⁿ'^{;0 f} ■ ^H

hinaas ist das während des Gefriertrocknen oder ' während Lagerung bei Raumtemperatur denautierte Protein unlöslich, weshalb die aus den Protein zu Injektionszweoken bereitete Lösung vor Verwendung filtriert werden nuß, so daß die Verwendung des Proteins schwierig wird.

In erfindungsgeaäßer Weise hergestellte gefriergetrocknet« Mischungen des Protein-Metall-Chelats der angegebenen Art und Sucroso oder einem anderen Sacoharid der angegebenen Art sind in der Segel völlig frei von unlöslichen Protein und können ohne weiteres zur Herstellung klarer Lösungen verwendet werden. Es let welters von Wichtigkeit, daß sowohl trocken· Mischungen als auch Lösungen des neuen Proteine und des zu Stabilisierung·- zwecken verwendeten Saooharids bei Raumtemperatur bis zu Temperaturen bei 37°C über wesentlich längere Zeiträume lagerfähig sind als dieses Protein allein oder Mischungen dieses Proteins mit Sachariden anderer Art als der angegebenen Art. Erfindungsgemäß herstellbare Mischungen bedingen somit einen beachtlichen technischen Fortschritt gegenüber den gemäß

Staaapatent Hr ...erhätliehen gefriergetrockneten reinen

Protein.

Es wurde gefunden, daß lediglich gewisse wasserlösliche Polyhydroxyverbindungen Überraschend wirksame Stabilisatoren für ein im Starapatent Nr. ....... definiertes Protein-Metall-Chelat darstellen. Diese Polyhydroxyverbindungen schützen das Protein gegen Abbau nicht nur während des Abtrennens desselben von weiteren in den natürlichen Rohstoffen enthaltenen Proteinen sondern erhöhen auch die Beständigkeit des reinen Proteins gegen eine Voränderung während des Lagerna bei Temperaturen

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oberhalb 4⁰C₉ gleichgültig, ob das Protein in For« tftier Lösung oder in Fora eine« trookenen Festkörper· vorliegt. Insbesondere der letztere Dastand ist von Wichtigkeit, da es da«it ab*glich wird, das isolierte Protein, insbesondere la gefriergetrockneten Zustand bei Rauateaperatur zn lagern und zu verwenden, vas bei« reinen Protein nicht attglioh 1st.

Die zur Stabilisierung des Protein-Metall-Chelats verwendeten Saccharide liefern alt wenigen Ausnahaen bei» Gefriertrocknen einer Lösung des verwendeten Saccharide und des w Protein-Metal1-Chelate ein körniges gefriergetrocknetes Produkt. Verwendbare Saccharide sind (a) Sucrose, (b) Aldo- und Keto-

pentoeen, -hexoeen und -heptosen, welohe durch Alkylgruppen, beispielsweise Methyl-, Äthyl- oder andere niedere jUkylgruppen acetallsiert sind, wie dies beispielsweise für das Methylglucoeid und das Methylgalaktosld gilt, (c) Aldo- oder Keto-

pentosen, -bexosen und -heptosen, in welchen die der freien Carbonylgruppe benaohbarte Hydroxylgruppe rau«lieh entgegengesetzt orientiert ist zu den Hydroxygruppen an den beiden unmittelbar folgenden Kohlenstoffatomen, wie dies für Galactose, Fructose, Fuooose, Arabinose, AjLdose Galactoheptulose, Sedobeptulose usw. gilt,(d) Gluoose, und (e) Mannose« Sine Aufzählung von Sacchariden, darunter den oben angegebenen Polyhydroxyverbindungen, ist von K<rk und Otbaer *t '!nc.Cliea.Teoh., Intersoienee Pub., (1954) Bd. 13, Selten 228-236 angegeben. Bs wurde zunächst angenoaaen, daß nicht-reduzierende Zucker wegen der bekannten

Malllard("Browning")-Reaktion reduzierenden Zuckern überlegen sein mliOten. Die Maillard-Reaktiön wurde hüuflg bei« Gefrier- /

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trocknen kuiioliir Protein« Ib Gegenwart redusiereader xoeker beobaobtet, wobei le Hlnb11ok «at die Veobselwlrkung xvlsebes ^-Aminogruppen (Lysin) sit Ketogruppe der reduxlerenden

Zucker braune, unltfsllebe Produkt· entstehen. Da da· erflsdung·-

J
gesKß isoliertür· neu« Protein releh an Lysin let» eise«

isoion-iseben Pnnkt bei pH » 7*9 eeeltst umd zwecks Beibebaltang •einer Struktur eisen alkali«oben pft-Vert besBtlgt, wurde sunäobBt angenoaa«n_t daß die Melllartf-Reaktien anrer««ldlieh wSre und ee dealt unartglica wäre reduzierende Zuoker ale Stabilisatoren xa verwenden.

■ Hon wirken ttberraaebeBderweiee svei reduxierende Zueker, u.sw· Galaotoee and Fruotoee, al· anegexelebsete Stabilieaterea» wogegen zwei niobt~reduxierende Zuekeralkobole, u.xw. Serbit und Mannit, und anob der niobt-reduxierende Inoelt al· Stabilisatoren geringere Yirksaaksit be«ltx«n· Di···· Pbllnos]«n sebeiBt auf die steriscb· Konfiguration der Stablliaaterem xurMok-ZUfuhren zu sein. Sewobl Pmeteee al« auob Oalaotese feesltst an einer Seite de· Molekül· swei »enaebbarte nydroxygnppesi, wobei die·· beide« HydroxygruppeB der fmaktienellen firuppe, d.i. die Aldebyd- oder die Ketegmppe, siebt besaeabart •Ind. Diese eterleobe Anordnung sag es des Zvekeraolekttl eratg» Hoben β lob relatlr xas Proteiaaelektll derart ass«erdses_v daJ die C-Aslnegrvppes der Lyainreste »terieoh as einer leelcttem alt der Aldebydgrappe eder der Ketogruppe de· rednsieremdea Zuokers gebindert »Ind.

Is eise« Dieaeebarid ist die «terlsobe Anordnung der !»ober· Belekttle eise selebe, defl eis derartige· Ansrlobtea «er beides ftexosea weniger vabrsobelBliob ist» wa· dl· gerlsgere Wir

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BADORfGjNAl

keit τββ Hal to·· mid Lactose verständlich a··**, welea· reduzierende Zucker sind. Suorose iet «in aioat~redBzl Sacoharld, weshalb bier wegen de· Fehlens einer frelea gruppe die sterieeh· Konfiguration nicht weeeatlieb let· la einstiaaang ait die·er Hypothese erweisen aioh Faseeee bino·· al· e«hr wirksaa; ihre sterisobe Anordmoag let —i1»g •«br wirksam! Salaetoae.

Zur Beruteilung Abt Stabilisiemngswirlmng elnas

ist die Absorption ( Λ A₂₈₀) bei 280 ym ram later····· J·

ά·τ Vert fir A A₂₈₀ ist «mo stärker· Yertfader»g«ft da« **·*·!■· •ind *· «rwarten. Die· soll besagen_v daB d«r flrad der im wart «in·· beatlnten 2eok*r« sn «rwartend··] VrnxSmiurmmg Protein· dvreh Absolutwerte τοη Aa₂₈₀ angokaadlgt wird; die Veränderungen la natiren Proteinnolekttl sind araealehst g*riagfiigig. In einigen der Disaecharid« and in zwei Zaekeralk»k«l··) ist die Tendenx dieselbe, obzwar die Absolutwerte deshalb nicht gaax TSrIOlIeIi sind, well durch die Trvtasmg der TI·—! •in· TerlMJliche Bestinenang Tea ^ A₂₉₀PiOBt a#gliek let. Ia ) keinen Stasilisator enthaltenden rreeea dee Preteia-Iletall-Caelst«

kann Agao ¹¹⁹I'¹¹ *^#r *■ ^der ^^tt^^B LOsung Torllegeadea Flecken nicht bestlnt werden.

Da« A«««eben des ait Galactose, Freotess edler ese (dl··· werden Bevorzugt verwendet) atabillaiertea gefrlerce-troekneten Proteine ist «her ktfrnig el· flookig· Xa diester Vel·· etablIieiorte· Protein !Set eich la Yasser «ad tthliebea PallerlOsungen «agew«hnliefa leicht, wobei eine veliksaaia klar· li»»aag erhalten wird. Me Lttsungsgeechwiadlgkeit de· ee stabllislartea Fret ei«· let beträchtlich größer el· die de· aleaft eteUllelerteB Protein·.

Bai Verwendung «er angegebenen 8aocharIda, insbesondere Sucrose, Galactoaa oder Pructoee, ala Stabilisatoren wird auoh die Standzeit τοη Lösungen des Proteins erhöbt. Bei einer Tea· peratur τοη k°C wurde eine LOsung τοη 2 Teilen Sucrose pro Teil Protein in isotoner Kochaalzlösung eit einer Lösung des Proteins in isotoner Kochsalzlösung vergleichen. Beide Lösungen wurden periodisch überprüft, wobei sowohl ^Ao80 ^*·*^¹¹·* ^a1· Anob auf Trübung geprüft wurde. Mach Ablauf einer Voohe war die keine Suorose enthaltende LÖaung bereits etwas trüb und sowohl duroh Bestiaaung τοη ^gO ^{ale aucn} *^uren Bestlaaung des Trookengewiohtes war auf einen Yerluat τοη 15 bis 20 % Protein zu sohl lessen. Die Suorose enthaltende Lösung war selbst naoh drei Wachen noch völlig klar und sowohl für das Trookangewioht als aueh für

A₂₈₀ waren die zu Versuobsbeginn festgestellten Werte alt innerhalb der Fehlergrenzen liegender Genauigkeit unverltndert· Lösungen die zwei Teile Haitose bzw. Duelit pro Teil Protein enthielten, zeigten während einer Woche oder aehr die gleiche Stabilität.

Ein Gewlehtsteil oder weniger Zucker pro Oewlohtstell Protein soheint zur Erzielung einer optiaalen Stabilisierungswirkung unvermeidlich zu sein. Zwei Gewichtsteile Sucrose pro Gewlohtsteil Protein ergeben einen sehr guten Stabilisierung»- effekt. Bei weniger wirksaaen Stabilisatoren sind sweoks Erzielung optiaaler Stabllialerungwirkung gesgentlich größere Mengen erforderlich. Praktisoh brauchbare obere Grenzen für die zu verwendende Menge an Stabilisator sind duroh die Forderung nach Isotonie und die Wirksamkeit elnea bestiaaten Saooharids als Stabilisator gegeben und diea wird duroh die folgende Ta-

belle I erläutert. Die Zahlenwerte sind in ag Zuoker pro ag Lösung

209821/0960 »

- 31 -

BAD ORtöfNAL

η.

angegeben. Die Zuokergewiohte sind ihrerseits auf eine durchschnittliche Menge von 1 ag Protein pro al bezogen.

Tabelle I

Isotonie Zunahme der Isotonie wegen bei mg/ml «g Stahllisator/mg

Protein

2,0 4,92 5,05 9»25

—— 10 % —r—

NaCl	9,0	3	—
Fructose	50,5	4	,96 *
Galactose	49,2	2	,07 %
Sucrose	92,5	,16 %

10 JC

Zwei Gewichtsteile Zucker pro Gewichteteil Protein-Metal1~ -Chelat erhöhen den osaotischen Druck um 3,96 % für Fructose, usi 4,07 % für Galactose und um 2,16 % für Sucrose, In pharsmkologiecber Hinsioht kann der zulässige Werte um 10 % Überschritten werden, wenn intramuskulär injiziert wird, insbesondere wenn leicht verdünnbare und leicht absorb!erbur· Stoffe, wie Natriumchlorid und Zucker, intraeuskular injiziert werden. Sieht «an eine 10 K-lge Hypertonie als suläesig an, dann beträgt der obere Grenzwert für Fructose 5,05 Teile, fttr Galactose %,92 Teile und für Sucrose 9,25 Teile pro Teil Protein.

In Bezug auf die durch den Stabilisator erzeugte Hypertonie 1st von den drei der oben erwähnten Stabilisatoren der Sucrose der Vorzug zu geben, da sie bei eineai bestimmten Gewichtsverhältnis von Zucker zu Protein die kleinste %pertenie ergibtr

" ³²" 209821/0960

BAD ORIGiN/ffv ''W^O OAS

Größere Mengen an Zucker enthaltende Lösungen können ohne weiteres dadurch isoton gemacht werden« daß Koohsalz alt einer Konzentration von weniger als 0,9 % eingesetzt wird» Dl·· ist jedoch in der Praxis schwierig durchzuführen» da es daait erforderlich wird sterile isotone physiologische Kochsalzlösungen mit sterilem Wasser im geeigneten Mengenverhältnis zu verdünnen und dieses Verhältnis vorher zu berechnen.

Wenn zwecks Erzielung ausreichender Stabilität oder ans anderen Gründen noch größere Mengen an Saooharld wünschenswert sind, dann kann die physiologische Kochsalzlösung überhaupt durch unter Verwendung eines Zuckers oder Genisehen von Zuckern hergestellte isotone Lösung ersetzt werden. In dieses Falle beträgt die maximal zulässige Menge an Fructose 50,5 ag/al, für Galactose 49» 2 mg/ml und für Sunrose 92,5 mg/ml.

Zn eriindungsgeiiäß herstellbaren Mischungen liegt das Protein in Form des Metall-Chelates vor, welches la wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, die in den verwendeten Ausgangsstoffen mit deis erwünschten Protein vergesellschaftet sind. Dl··· Metallohel&te stellen weiße Pulver dar, welche in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung und Pufferlösungen löslich sind; die se erhaltenen Lösungen können injiziert werdet) ohne daß antigenetische Reaktionen auftreten, wie sie bei Injektion von körperfremden Proteinen die Regel sind. Die Ergebnisse einer Elementeranalyse, das InfrarotSpektrum, das Ultraviolettspektma, die optische Drehung und sonstige analytische Daten βtimaen iibereiii r.«it der Annahme, daß es sich um ein Protein-Metall-Chelat handalt_o Diese Protein-Metall-Chelate mildern in Säugetieren dl· Folgen von Überanstrengung, wirken antiinflaamatorisoh und fegen

Viren, wie durch pharmakolglscha und klinisohe Untersuchungen

209821/0960

BAD ORIGINAL

erhärtet werden konnte.

Pcaraakologisoh und klinisch zeigt· SIoIi₁ daß erfindangsgeoÄa herstellbare Mischungen zur Behandlung verschiedenster Krankheiten von Säugetieren verwendet werden kennen. Bei Verwendung dieser Mischungen können die Krankbeltssyaptoae teilweise oder vollständig beseitigt werden. Die Anwendbarkeit dieser Mischungen ist keinesfalls auf irgendeine Art von Saugetieren beschränkt.

Boi intramuskulärer Verabreichung von O₉S ag der erfindungsgenäß herstellbaren Mischungen können bei verschiedensten Säugetieren akute Entzündungen, insbesondere der Harnwege and Gelenke, unterdrückt werden. Solche Mischungen besitzen auch ein breites Virkungespektrua gegen Viren, überraschenderweise wirken solche Mischungen bereits in Dosen von 0,004 mg/kg bei ohronischen Erkrankungen Über aehrsre Wochen naohden das Allgemeinbefinden des Patienten zunächst normalisiert wards. Erfindungegemäß herstellbare Mischungen können auch bei Behandlung von Allergien, beispielsweise von Reaktionen nach Verab-) reichung von Penicillin, von Multiple wheals, von Verhärtungen, Eryth einen, Endeaen und Juckreiz, verwendet werden. Erfindung*- gemäß herstellbare Mischlingen erwsiaen sich sei der Behandlung von ohroiiisehen und hartnäckigen Bakterieninfektionen, beispielsweise bei der Behandlung von Infektionen der Genitalien, der Eai'nwege und der Atsungsorgane durch Stapbylooo«cen, Streptococcen, Enterococcen und Colibazillen, als besonders wlrksaat.

ErfindungsgenäQ herstellbare Mischungen, welohe Aaren an sich bekanntes Gefriertrocknen einer LOsung dos Proteins ssv· des Protoin-Metall-Chelata und eines stabilisierend wirkenden

- Jk -

209821/0d60

BAD

Saccharide hergestellt worden sind, können zur Herstellung von Injektionepräparaten verwendet werden. Hiebel können Lösungen des Proteine und des Saccharide allein aber auch BaTcterioatatika, Bakterizide, spezifisch wirkende Steroide» wie progoatntionale, östrogene, androgene und antiinflania&torisohe Steroide, Verdiok-ungemittel, Konservierungsmittel und pharnazentisch verträgliche Farbstoffe zusätzlich enthaltende Lösungen verwendet werden. In 3olchen Lösungen können auch Salze, beispielsweise Natriuaohlorid, in einer Menge vorliegen, die die erhaltene Lösung leoton macht,

Bas Protein-Sftccharid-Geaieoh kann auch zu sterilen Lösungen, Suspensionen usw. verarbeitet werden, die ohne weitere Manipulationen direkt injiziert werden können.

Die erfindungsgenäß herstellbaren trockenen Gemische sind Im Gegensatz sub reinen Protein, welches bei Rauateoper tür bereite innerhalb einiger Tage stark zerstört wird, Über viele Woohen bei Raumtemperatur ohne irgendwelchen nachweisbaren Abbau stabil. Auch die Stabilität wässeriger Lesungen erfindungsgeciöü herstellbarer Mischungen bei Rauatemperalur beträgt mehrere Tage oder Wochen_v wogegen Lösungen des Proteine allein innerhalb weniger Stunden unbrauchbar werden. Beispielsweise ist «las LOsung des Proteins und Suerose bei Raumtemperami r und bei 37⁰C mehr als «lasn Monat ohne msSsars Veränderung lagerfähig. Selbst DuIölt und Maltose, weloh· das Protein während des Gefriertrocknens in geringerem Maß gegen Abbau schützen als Sucres·, machen Lösungen des Proteins zumindest für eine Woche bei Banatemveratur stabil; ein feststellbarer Abbau beginnt hiebe! erst nach einer Woche.

20*9821/0960

BAD ORIGINÄR

in
Das/Goalsch alt Sucrose oder eines anderen Saccharin

der angegebenen Art vorliegende Protein let bei Ranntemperetut soweit stabil, daO das Protein auch topieoh and oral verabreicht werden kann. Diese Verabreichungswege sind sonst für

bei Rauateaperatur nicht lagerfähige Pharnazeutika niobt gangbar. Das in erfindungsgeaäQer Weise stabilieierte Protein ist gegen·» über einein Abbau durch proteolytieche Ensyae beaerkenswert reoiotent, wodurch die orale Verabreichung desselben erauglioht wird.

Ee let sonit aöglloh aus eine« in erflndungs^gesHOer Velse hergestellten Geaieob von Protein und Sacoharid für oral« oder topische Verabreichung geeignete Präparate in Ublioher Velse unter Zuhilfenahme von Trägern und/oder Exzipientia herzustellen» Beispiele für topieoh anwendbare Präparate β lud Salben, Lotionen, Crestes, Spraye, Puder, Tropfen (beispielsweise für Ohren und Augen), Suppositorien (beispielsweise für die Behandlung ron rectalen Entzündungen) und Aerosole· Salben und Crenes können auf Grundlage von Wasser oder ölen hergestellt werden, wobei geeignete Verdickungsmittel und/oder Gelieraittel verwendet werden können. Brauchbare Salbengrundlagon können Wasser und/oder ein öl, beispielsweise Paraffinöl oder ein pflanzliches Ul enthalten. Je nach Salbongrundlage können als Verdickungsmittel Weichparaffin, Aluainiunstäaret, Ketostearylalkohol, Polyäthylenglykole, Wollfett, hydriertes Wollfett, Bienenwachs uοdgl. verwendet werden.

Lotionen können auf Grundlage von Wasser oder ölen hergestellt werden und enthalten in der Regel zumindest ein Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel,. D.ispergieraittel,

- 36 -

. 209821/0960

BAD ORIGINAL

Suspsnsionshilfsaittel, Verdlokungsaittel und/oder Farbstoffe» Duftstoffe u.dgl.

Puder können unter Verwendung geeigneter Pudergrundlagen_v beispielsweise Talkum, Laotose, Stärke ud.dgl. hergestellt werden. Tropfen kunen unter Verwendung einer wässerigen oder nioht-wässerigen Grundlage hergestellt werden, die ebenfalls zualndest ein Dispergiermittel, Suepensionshilfsalttel, und/oder Lösungsvereittler u.dgl.< enthalt.

Solche pharaazeitische Präparate können auch ein oder ■ebrere Konservlerungsalttel oder Bakterlostatika, beispielsweise Methylhydroxyben&oat, Propylhydroybensoat, Chlorkreaol, Bensalkoniuaohioride u.dgl. enthalten. Znsätslieh ktfnnen weiter· Wirkstoffe, beispielsweise antimikrobiell wirkende Stoffe, insbesondere Antibiotika und/oder antlinflaaaatorlseh wirkende Steroide, eingearbeitet werden.

Die Menge des in erfindungsgeaäO herstellbaren Mischungen enthaltenen Proteins hängt von der Art der herzustellenden Präparate ab, beträgt jedoch in der Regel 0,001 bis 5 Ctew.-£· Vorteilhafter ist es jedoch solche Mischungen alt elnea Gehalt von 0,001 bis 0,5 #, insbesondere O₉Ol bis 0,25 %t an Protein herzustellen«

Beispiele für solche oral verabreiehbare Präparate sind übliche flüssige Präparate, beispielsweise Lösungen und Suspensionen, und feste Präparate, beispielsweise Tabletten, Pillen, .Kapseln und uabttllte Mikrokugela. Vorsugswelse werden besohiohtete Tabletten hergestellt, welche erst la Terdauungstrakt, insbesondere erst la Dünndara, serfalen. Bei der Herstellung solcher Tablitten können Übliche Stoffe,für «ie Be-

- 37 - 209821/0960

BAD ORIGINAL

schichtung («ret lBsliob Ib Yerdauungstrakt) und Füllstoffe, beispielsweise Veizenstftrke, Lactose, Talkua, Pflanzeaguaal u.dgl·, rerwendet werden.

Ia folgenden vlrd zunächst die Herstellung de* Protein- -Metall-Chelats beschrieben. Ia Bahnen dieser Herstellung wird,«oferne keine anderen Teaperaturengaben geaaobt sind, in einen kalten Raue (2 bis 5°C) gearbeitet.

Frisohe Rinderleber wurde naob dea Mahlen in eisen Kunststoffbehälter eingebracht and dort unter Rühiea alt 2 1 kaitea destilliertes Wasser pro kg Leber Tersetzt. Der pH-Wert der Mischung wurde anschließend alt O,In ITaOE auf 7,5 bis 7,6 eingestellt, worauf so Tiel 2n MnSO.-Lösung sugesetzt wurde, daß die Molarität der Creaisehes 0,05 betrug. Sodann wurde der pH-Wert des Ceaisches erneut auf 7»6 eingestellt und der Ltfsuag soviel kaltes Frischwasser zugesetzt, dafi pro kg Leber 31 Wasser Torlagen. Schließlich wurden pro kg Leber 50 al Toluol zugegeben, worauf das Geaisoh in einea kalten Raua über Macht gerührt wurde·

Aa folgenden Morgen wurde die erhaltene Suspension durch ein Kunststoffsieb gegossen, worauf das FIltrat unter gelinden Rühren alteine« dea Toluaen des Filtrats glelohen VoIusen an kalten Aceton (-10⁰C) versetzt wurde, wobei das Aceton der Mischung über ein sieb bis unter die Oberflftehe der Mischung erstreckendes filasrohr zugeführt wurde. Der sieh hiebe! bildende Niederschlag wurde sofort abzentrlfugiert und uaaittel-

- 38 - .

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BAD ^; '

bar anschließend alt etwa 25 Vo1-% 0,05b Mal«at-Mn⁺*-Puff*r

versetzt, wobei die verwendete Menge ^n Puffer, hexogen auf das Volumen dee Filtrate vor der Zugabe des Acetone errechnet wurde. Die Mischung wurde nun in einem kalten Raum mehrere Stunden gerührt, dann über ein Kunststoffsieb filtriert und durch Zentrifugieren geklärt.

Die erhaltene klare Flüssigkeit wurde unter Rühren in ο in em Kessel aus rostfreies Stahl auf 6O⁰C erhitzt und, gerechnet von Beginn des Erhitzens, 20 Minuten auf 60°C gehalten, Anschließend wurde die Mischung so rasch als möglich auf 5 C gekühlt, worauf der entstandene voluminöse Niederschlag entweder abzentrifugiert oder durch langsames Filtrieren Über eine große Filterflöche abfiltriert wurde, worauf die so erhaltene ^lare Lösung auf eine Temperatur von 2 bis 5°C gebracht und mit 0,9 Vol.-tin. denaturierten Äthanols (auf -iO°C gekühlt) rasch versetzt wurde, das aus einem Trichter über ein sich bis unter die Oberfläche des Gemisches erstreckendes Glasrohr zugeführt wurde.

Nachdem die gesamte Menge des Alkohole zugesetzt worden war, wurde die Mischung in einen kalten Raum stehen gelassen bis oi.cn der entstandene Niederschlag eben zusammengeballt und abgesetzt hatte, worauf der Niederschlag abzentrifugiert oder unter geringem Unterdruck abfiltriert und im unmittelbaren Anschluß daran in kaltem 0,001 α Ilaleat-Mn⁺⁺-Puf fer von pH 7,0 aufgelöst wurde. Der Puffer wurde hiebei in einer Menge von k Vol.-tin. pro Gew.-ti. Niederschlag verwendet. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugleren geklärt, worauf nach dem Abtrennen der klaren Flüssigkeit der Niederschlag erneut mit

209821/0960 - 39 -

BAD ORIGINAL

geringen Mengen an kalter Pufferlösung extrahiert wurde und die erhaltenen Lösungen erneut zentrifugiert wurden. Die erhaltenen klaren Lösungen wurden alteinander vereinigt und unaittel· bar gefriergetrocknet, da es nicht erforderlich war Tor dee Gefriertrocknen die Puffersubstanz durch Dialyse zu entfernen. Die so erhaltene pulverige Substanz ist bei Raumtemperatur über mehrere Monate stabil, wird aber dennoch vorzugsweise in eine« kalten Raun verwahrt. Die erhaltene Substanz stellt ein Gemisch des erwünschten Proteine, von Arginase und anderen

" Enzynen und Albumin und anderen bedeutungslosen Proteinen dar.

Die so erhaltene Substanz wurde in etwa der ζwolffachen Volumenenge kaltem 0,2 m Tris-0,001 m-Mg⁺⁺-Puffer von pH 7*8 gelüst, worauf die Lösung mit einer kalten gesättigten Amrnonsulfatlösung, welche an Mg⁺* 0,001 molar war, behandelt wurde. Die Aminonsu If at lösung wurde mit Anteilen zu je 375 nl pro 1000 ml Pufferlösung verwendet, so daß die Konzentration der erhaltenen Lösung an Ammonsulfat 15, 30, 45, 60 bzw. 75 %. betrug. Die Ammonsulfatlösung wurde stets unter Rühren und

k tropfenweise bei 0 bis 5⁰C zugesetzt, wobei naoh jeder Zugabe von Ammonsulfat 30 Minuten gerührt und der entstandene Niederschlag bdurch Zentrifugieren mit 4500 U/min während 30 Minuten bei O⁰C abgetrennt wurde.

Der zuerst erhaltene Niederschlag A, welcher hochmolekulare unerwünschte Proteine enthielt, wurdhe verworfen. Die im Zug· der zweiten und dritten Fällung erhaltenen Niederschlag· B und C wurden miteinander vereinigt; diese Niederschläge enthalten Arginase und andere Enzyme und können zwecke Isolierung dieser Enzyme.aufgearbeitet werden. Die im Zuge der vierten und fünften

_ _k0 _ 209821/0960 BAD ORIGINÄR¹ '^^{Aü ÖAy}

Fällung erhaltenen Niederschläge O und E wurden ebenfalls Miteinander vereinigt; diese Niederschlag· enthalten das gewünscht· Protein und als Verunreinigungen Albuain und verschiedene ander· Proteine büberen oder auch niedrigeren Molekulargewichts. Die nach der letzten Fällung als Rückstand anfallende klare Flüssigkeit enthält niedrigaolekulare Proteine und sonstige Verunreinigungen

und wurde verworfen»

■lt Die Niederschläge D und E wurden möglichst genau/einer

Konzentration von 10g/i00 al in 0,03 B-Tris-0,00i »-Mg⁺⁺-Puffer von PpH 7,8 gelöst , worauf die Lösung gegen kalte Pufferlösung dialysiert wurde bis die Reaktion auf Sulfation negativ war. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt und die erhaltene klare Lösung wurde über ein feinporiges Filter (Millipore-Filter) filtriert, worauf das erhaltene Filtrat direkt auf den Kopf einer mit Sephadex G-iOO («it Eplchlorhydrin quer-νernetatee Dextran-Harz, Pbaraacia, Schweden) gefüllten Chroaatographiersäule (76 am χ 458 am) aufgegeben wurde. Das verwendete Dexiranharz wurde nach den Angaben des Herstellers angequollen und gewaschen. Die gefüllte Kolonne wurde alt 0,05 B-Tris-0,001 n-Mg⁺⁺-Puffer von pH 7,8 im Gleichgewicht gebracht, und die DurchfluQgeschwindigkeit durch die Kolonne wurde auf etwa 20 al/h eingestellt.

Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgebracht worden war* wurde sie innerhalb der ersten drei Zentriaeter der Kunstharz*· füllung der Kolonne während 30 bis 45 Minuten ins Gleichgewicht gebracht, worauf ait den Fraktionieren begonnen wurde· BeIa Fraktionieren wurden Einzelfraktionen zu je 10 al aufgefangen. Die Ein2elfraktionen wurden absorptlonsspektrophotoaetrlsoh alt

Licht der Wellenlänge 280 au (nm) untersucht*

7 209821/0960

- .41 -

BAD ORIGINAL

Noob bevor das erwünschte Protein enthaltende Fraktionen aufgefangen wurde, wurden zwei Absorptloneaaxiaa zeigende Fraktionen erhalten, die Albuain und sonstige unerwünschte Proteiue nit dea Molekulargewicht des Albualna vergleichbares) oder höherem Molekulargewicht enthielten. SoIoAe AbsorptionsaaxIna zeigende Fraktionen wurden verworfen. Das erwünschte Protein ist in der Regel in den Fraktionen 13 »is 17 des Eluate enthalten, und diese Fraktionen wurden zweeks Weiterverarbetung alteinander vereinigt. Bei* weiteren Eluieren der Kolonne, insbesondere bei« Blaieren alt Puffer höherer Konzentration, wurden niedrigaolekttlaro Proteine enthaltende Fraktionen aufgefangen· Diese nledrigaolekularen Proteine wurden aus der Kolonne entfernt na diese swecks Aufarbeitung einer weiteren Charge zu reinigen.

Die das gewiineohte Protein enthaltenden Fraktionen wurden gegen 0,001 ag Mg⁺⁺-Lösung, welche unter Verwendung von entionisiertem Wasser hergestellt worden war, dlalyslert als öle an

—6 Tris-Puffer weniger als 10 aolar slnd.Anaehliellend wurde gegen an o-Phenanthrolln oder Atbylendiaalntetraesslgsäuresalzen ixiO"' bis 5x10*"' aolar en entioniserten Wassers

dialyeiert bis die Konzentrration des Dialysato an Mg geringer war als 10*" a. Falls ein Protein-Metall-Chelat hergestellt werden sollte, dessen vorwiegend vorhandenes Metall ein anderes, beispielsweise Zn₉ Ca, Cu oder Fo₉ war al« Magneslua, wurde aehrere Tage bei 4⁰C weiter dlalysiert «ad sodann da· Protein etwa einen Tag alt einer Lösung eines ltalioaea Salzes (deren Molaritat eine solche war, dall das Protein in Ufsung verblieb) in Berührung gebraoht, worauf ttbera^Mssiges Metal11on

209821/0980

■ - W.BAD ORIGINAL

in der oben angegebenen Weise entfernt wurde. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt.

Auf diese Weise konnten aus75 kg frischer Rinderleber (22,5 kg Trockengewicht) etwa 200 g (l %) eines das Protein-Mn⁺⁺-Chelat enthaltenden Zwischenproduktes erhalten werden, wobei aus den. aus dem Protein-Mn⁺⁺-Chelat erhaltenen

das

Fraktionen D und E 12,5 bis 17,5 g (0,06 bis 0,08 %) eines/erwünschten Protein in Form des Mg-Chelate enthaltenden Produktes erhalten wurden. Beia Chromatograpbieren dieser Fraktionen 0 und E auf einer mit Sepbadex-G 100 gefüllten Kolonne wurden 2,4 bis 2,9 g des erwünschten Proteins (Mg-Chelat) erhalten, was, bezogen auf das Trookengewicht der eingesetzten Leber einer Atisbeute τφπ 0,011 bis 0,014 % entspricht. A₀ Stabilisieren während des Gefriertrocknen«

\5 Gew.-tie des in der obigen Welse isolierten Proteine und 30 Gew.-tie eines Zuckers der bereits angegebenen Art wurden alteinander rermisoht, worauf die Mischung in 30 Gew.-TIn. entmineralislertem Wasser gelöst wurde, dessen pH-Wert mittels gasförmigen Ammoniaks auf 9,4 gebracht worden war. Die erhaltene < Lösung wurde sodann mit geringem Saugdruck über ein angefeuchtetes feinproriges Filter filtriert, dessen Poren eine Größe von 0,45um besaßen. Das Volumen des HiIträte wurde bestimmt und die Gewichtsmenge des im Filtrat enthaltenen Proteine wurde wie folgt errechnet;

2 ml de« Filtrats wurden mit 3ml Biuret-Reagens Termischt, worauf die Mischung 15 Minuten auf 37°C gehalten wurde und anschließend die Absorption des Gemisches bei 555/um gegen Wasser oder eine Pufferlösung als Vergleichslösung bestimmt wurde. Die

- 43 - 209821/0960 BAD ORIGINAL

Konzentration in mg/ml wurde durch Multiplikation des für dl ο Absorption 555 /Uta erhaltenen Wdrtee Bit dem Faktor 9,1 erhalten. Dieser Uarechnungsfaktor wurde graphisch ermittelt usw. aus einer Kurve, welche sich aus den unten angegebenen Werten ergab, WcJdIe Proteinkonzentration bekannt war»

Protein tag/al	Absorbtion
	A555
5,7	0,407
1,8	0,197
0,9	0,100
0,45	0,050
0,22	0,024
0	0

Trockengewicht (ca 10 % weniger ale la feuchten Zustand)

Die Probe wurde sodann eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde sodann in entaineralisiertöra Wasser, dessen pH-Wert alt Aftconiak auf 9,4 gebracht worden war, aufgenoamen, wobei eine Lösung etwa der ursprünglichen Konsentration hergestellt wurde. Die erhaltene Lösung wurde auf eine allenfalls vorhandene Trübung geprüft und dann über ein angefeuchtetes feinporiges Filter Bit einer Porengröße von 0 ,45 /Uta filtriert«, Anschließend wurde die Absorption bei 280 na beetisat und der Wert A_g80/eg emittelt· Der Proteinverlust wurde aus der Differenz zwischen der aus dem Proteingewiolit und dea Volumen der Lösung vor dea Gefriertrocknen errechneten Proteinkonzentration und der aus

" ^lik * 209821/0960 BAD ORIQfNAi

dem Proteingewicht und des Volumen der Lösung naob dea Gefriertrocknen errechneten Proteinkonzentration emittelt. Der prozentuelle Verlust wurde auf die vor den Gefriertrocknen vorhandene Menge an Protein bezogen. Auch bei späteren Chargen wurde in der gleichen Welse vorgegangen·

In den Tabellen II und Iljist nun die Wirksamkeit verschiedener Polyhydroxyverbindungen als'Stabilisatoren in der oben angegebenen Weise errechnet worden. Hiebe! ist der Proteinverlust nach einmaligem und auch nach viermaligem Gefriertrocknen angegeben. Die in der Tabelle II angegebenen Saooharide erweisen sich als ausgezeichnete Stabilisatoren, welche den Proteinverlust auch nach viermaligem Gefriertrocknen auf etwa 15 % oder weniger beschränken, wogegen nicht-stabilisiertes Protein einen Proteinverlust von 6l bis 80 % ergibt. Die aus so stabilisiertes) Protein erhaltenen Losungen sind kristallklar} wobei lediglioh c(,—Methyl- -n-Gluoosid eine Ausnahme bildet. Die in der Tabelle III angegebenen Saoobaride erhöhen die Stabilität des Proteins in geringerem Maße, wobei aus den Protein-Saocharid-Gemisob hergestellt« Lösungen in Wasser oder aus diesem Gemisch hergestellt· leotone Lösungen in der Regel trüb sind. Aus diesem Grunde sind die Ib der Tabelle III angegebenen Saooharide von wirtschaftlichen Standpunkt trotz des ümstandes weniger interessant, daß si· ·1η·η Proteinverlust im wesentlichen in geringen Grenzen halten.

1, .V'Ul O ί

Taljelle II

Wirkung des Gefriertrocknens

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) kein Stabilise

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44

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119

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Trübung

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lraal

b)

Zuckeralkohol«

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Trübung

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Trübung

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9

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schwach

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0

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Dulcit

Tt

46

0

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wolkig

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0,628

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115

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48

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217

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VI

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0,604

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Trübung*

b)

D-Galacturonsi

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B. Lagerbeständigkeit ia festen Zustand. .. ■

25 ag frisch hergestelltes Protein-Metall-Ohelat und 50 ag Sucrose, Fructose oder Galactose wurden In 50 al entaineralisierten Wasser gelöst, dessen pH-Wert mit AnuBoniakwasser auf etwa 9 eingestellt worden war, worauf die erhaltenen Lösungen filtriert und gefriergetrocknet wurden. Die gefriergetrockneten Produkt· wurden ebenso wie eine Probe des als Ausgangsstoff rerwendeten Protein-Metall-Chelats bei Raumtemperatur unter Luftzutritt rerwahrt. Die Lagerfähigkeit der Mischungen bei Rauateaperatur ist in Tabelle IV angegeben, in Welcher verschiedenen Lagerungs*· zeiträuaen verschiedene Absorptionswerte A₂₆₀ von Lösungen zugeordnet sind, die an Lösungen von eine bestimmte Zeit gelagerten festen Proben ernittelt wurden.

Tabelle IV
Stabilität fester Mischungen bei Rauatenperatur

Stabilisatoren

1. Sucrose

zu Beginn 0,637 0,052

i Woche 0,595* 0,041

1 Monat 0,633 0,04i

2 Monate 0,637 0,040 4 Monate 0,602 0,047

2. Fructose

zu Beginn 0,631 0,050

1 Woohe 0,589* 0,048

1 Monat 0,768 0,037

2 Monate 0,666 . 0,046 4 Monate 0,758 0,055

- 48 -

209821/0960

	A555(korr.)
0,630	0,051
0,615	0,044
0,649	0,041
0,689	0,042'
0,673	0,055

Fortsetzung der Tabelle IV Stabilisatoren j

3. Gals.ato.se s?,u Beginn 1 ¥ocbe

1 Monat

2 Monate 4 Monate

Zeitweilig wurden naoh etwa ein- bis zweiwöchiger Lagerung^ geringfügig niedrigere Verte beobachtet. Alle Proben lösten sich nach der Lagerung zu klaren Lösungen, die keinen Viedersohlag enthielten.

Die angegebenen Zahlenwerte legen dar, daß auoh naoh Tier-■onatigor Lagerung eines gefriergetrockneten Gemisches aus Protein und Sncoiiarld kein nennenswerter Abbau des Proteins eintritt. Unter den gleichen Bedingungen tritt bei Lagerung des reinen Proteine innerhalb eines Monats ein 50 jCiger Verlust auf.

Zwecke Beetlmung der Stabilität des Protein-Metall-Chelats bei 37⁰C wurden 50 ng dieses Chelate in 100 al einer wässerigen Lösung gelöst, die 1 ng Sucrose/ml enthielt. Der pH-Wert des rerwendeton Wassers wurde alt Ammoniakwasser auf 9,4 eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde über ein feinporiges Filter τοη 0,45 /UB Porenweite filtriert. Aus einer Probe der erhaltenen Lösung vurde ^₂BO "⁰^ ^d*^{e p}™teinkonzentration bestimmt. Der Rest der erhaltenen Lösung wurde innerhalb eines Zeitraumes τοη Tier Tagen gefriergetrocknet, worauf das gefriergetrocknete Produkt bei 37°C gelagert wurde. In der folgenden Tabelle V sind naoh verschiedenen Lagerungszelten erhaltene Analysenwerte angegeben.

" ^h9 209821/0960 BAD ORIGINAL

	W-.	A555(IWr	r.)	Aussehen der hergestellten Lesung
fabeile V
Lagorbestiindlgkeit bei 37°C	0,519%	0,038		klar
Stabilisatoren	0,%846	0,0*1		»
Sucrose	0,5816	0,039		• :
su Beginn	0,5081	0,039		N
1 Woche	0,532%	0,039
2 Wochen
1 Monat
2 Monate

Au· den In der Tabelle angegebenen Verten ergibt sich, daß das Protein auch bei zweimonatiger Lagerung bei 37⁰C keinen nennenswerten Abbau erleidet. Das reine Protein erleidet bei Lagerung unter den gleichen Bedingungen einen 50 £igen .

Abbau innerhalb von 11 Tagen. C.LagerfMbigkeit von Losungen

25 ng Protein-Metall-Chelat und 50 ag Sucrose, Maltose

oder DuIOit wurden in der oben angegebenen VeIse in 50 el entBineralisiertesj Wasser gelBst, worauf die Lesungen bei Rau»» temperatur verschieden lange gelagert und nach Ablauf der Legerselt der Protelnverlvst bestiaat wurde. Sie erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle ¥1 xusaraengefaSt.

- 50 -

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BAD ORiGlNAi

Tabelle VI

frei Raueteeperatur

Stabilisatoren A₂₈₀/ag A_-e(korr.)

Aussehen der Lösung

1. Sucroae
zu Beginn
Woche

Wochen
Wochen

2. Dulcit

zu Beginn
Woche
Wochen
*^HGchen
3« Maltose
zu Beginn
Woche
Wochen

0,562 0,640 0,626 0,702

0,616

0,637 0,696 0,660

0,603 0,725 0,759

0,055 0,052

0,045 0,051

0,052 0,054 Op 049 0,055

0,065 0,061

0,063

klar

sehr schwaoh getrübt

klar

n η η

klar

1» n

wahrscheinlich wegen bakterieller Verunreinigung

Die in der Tabelle angegebenen Werte zeigen_t daß bei Lagerung wässeriger Lösungen von Protein und Sucrose einerseits bzw. Protein und Dulcit andererseits bei Rauatemperatur das Protein innerhalb drei Wochen oder mehr kaum abgebaut wird· Lösungen von Mischungen aus Protein und Maltose lassen einen gewiesen Abbau des Proteins erkennen. Eine LBsung des Proteine allein gibt einen mehr als 70 ^igen Verlust innerhalb 36 Stunden.

Patentansprüche t - 51 - 209821/0960

BAD ORIGINAL

Claims (1)

1. Patentansprüche :

   1. Isoliertes wasserlösliches nicht-antigenetisches Protein vom Globullntyp gemäß Staaapatent Nr. .,(.Anmeldung B 89232 IVa/3Qh! im stabilisierten Zustand, dadurch gekennzeichnet, daß diese· Protein als Gemieoh mit einer stabilisierend wirkenden Menge eines Saccharide, u.zw. (a) von Sucrose, (b) einer Pentose» Hexose oder Heptose mit einer Hydroxygruppe aa einer freien Carbonylgruppe einer Keto- odor Aldobydgruppe benachbarten Kohlenstoffatom, wobei die räumliche Stellung der Eydroxygruppe entgegengesetzt ist zu jener von zwei an den beiden benachbarten Kohlenstoffatomen befindlichen Hydroxygruppen, (o) eines Nioder-Alkyl- -Aoelala einer Pentoαβ, Eexaee oder Heptoee, (d) von Glucose,

   und (θ) von Mannose, vorliegt,

   2. Stabilisiertes Protein nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, daß das Gewichteverbaltniβ von Saccharid zu Protein zunindest 2 t 1 beträgt.

   3* Stabilisiertes Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es einen trockenen Feststoff darstellt, welcher im wesentlichen frei ist voa denaturiertem Protein.

   h. Stabilisiertes Protein nach Anspruch 1, 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß es in Fcrm eines, beispielsweise in einer Phiole oder in einer Ampulle, steril eingeschlossenen biologischen Präparates vorliegt, welches im wesentlichen frei ist von denaturiertem Protein und für Injcktlonszwecke geeignot

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   BAD ORIGINAL.

   5. Stabilisierte« Protein naob Anepruoh k_f daduroh gekennzeichnet, daß es in Präparat in For» eines trockenen Festkörpers vorliegt,

   5, Verfahren zur Herstellung eine« Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch des Proteine mit einer stabilisierend wirkenden Menge eines Saccharide, u.zw. (a) von Siiorose, (b) einer Pentose,. Hexose oder Heptose alt einer Hydroxygruppe am einer freien Carbonylgruppe einer Keto- oder Aldehydgruppe benachbarten Sohlen«toffatob, wobei die räumliche Stellung der Hydroxygruppe entgegengesetzt ist zu jenor von zwei an don beiden benachbarten kohlenstoffatomen befindlichen Hydroxygruppen, (c) eines Nieder-Alkyl- -Acetals ainer Pentose, Hexose oder Heptose, (d) von Glucose und

   von
   (e)/Mennose_y hergestellt wird.

   7ο Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Lösung des Gemisches gefriergetrocknet wird.

   8, Verfahren nach Anspruch 7» daduroh gekennzeichnet, daß eine im wesentlichen von denaturiertem Protein freie wässerig· ⁽ Lösung gefriergetrocknet wird.

   - 53 -

   Γ.9.7.68/ /n

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