DE3240174C2

DE3240174C2 -

Info

Publication number: DE3240174C2
Application number: DE3240174A
Authority: DE
Inventors: Kimihiro Shimizu; Tsuguji Nakahara; Taketoshi Kinoshita
Original assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Current assignee: Nippon Chemiphar Co Ltd
Priority date: 1981-10-30
Filing date: 1982-10-29
Publication date: 1990-08-23
Also published as: GB2110219A; US4495285A; FR2515684A1; SE8206173D0; FR2515684B1; DE3240174A1; SE457800B; CA1203764A; SE8206173L; CH658669A5; GB2110219B; JPS5896026A; BR8206347A; US4495285B1; JPH0525470B2

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebene Derivat eines vom Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen- Aktivators, das Verfahren zu seiner Herstellung nach den Ansprüchen 9 bis 11 sowie ein diese Derivate enthaltendes thrombolytisches Mittel nach Anspruch 12.

Es ist bekannt, daß menschliche Gewebe eine Vielzahl von Substanzen enthalten, die Plasminogen zu einem fibrinolytischen Enzym oder Plasmin aktivieren. Unter diesen bekannten Substanzen ist das repräsentativste ein Plasminogen- Aktivator, d. h. Urokinase, welche im Nierengewebe gebildet und in den Urin abgesondert wird. Urokinase kann erhalten werden durch Isolieren und Reinigen von menschlichem Urin, Gewebekulturen oder durch Gentechnik. Als fibrinolytische Enzym-Aktivatoren, die heutzutage weit verbreitet handelsübliche Anwendung gefunden haben, existieren aus hämolytischem Streptococcus stammende Proteine und Urokinase, das ein von menschlichem Urin stammendes Enzym ist. Angesichts seines immunisierenden Verhaltens wird Urokinase, das aus einer solchen Quelle stammt, vorteilhaft für klinische Anwendungen eingesetzt, da es gegenüber dem Menschen nicht immunisierend ist. Von aus menschlichem Urin abstammender Urokinase wird angenommen, daß sie sowohl hochmolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht =54 000) auch als niedermolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht=33 000) enthält. Urokinase ist in den letzten Jahren als ein thrombolytisches Mittel oder als ein Adjuvans für krebshemmende Substanzen verwendet worden, und sein Verbrauch für klinische Anwendungen steigt von Jahr zu Jahr.

Jedoch ist Urokinase unter bestimmten Bedingungen instabil, da sie ein Enzym ist und ihre enzymatische Aktivität verliert, z. B. im Verlauf einer Extraktion, Isolierung und Reinigung aus einem Urokinase tragenden Rohmaterial, wie Urin, während der Lyophilisationsverarbeitung zur Herstellung dosisgerechter Formulierungen, während der Wärmebehandlung zur Desaktivierung von Viren, oder wenn sie in verdünntem Zustand in eine Tropfflasche gegeben und über einen langen Zeitraum in solch verdünntem Zustand bei Raumtemperatur für klinische Anwendung gehalten wird. Die physikalisch instabile Natur von Urokinase hat ernste Probleme bei der Herstellung und Formulierung von Urokinase in industriellem Maßstab oder bei der eigentlichen Verwendung dieser für klinische Zwecke verursacht. Menschliches Albumin wurde als Additiv für Urokinase verwendet, um so deren Stabilität zu verbessern. Dies kann jedoch keineswegs als Durchbruch zur Lösung des eben diskutierten Problems angesehen werden, da reines Albumin, das heißt eine Globulinfraktion oder immunisierende Verunreinigung schwierig zu erhalten ist, reines Albumin teuer ist, Albumin und Urokinase unter virusdesaktivierenden Bedingungen, bei denen Urokinase einer Wärmebehandlung bei 60°C während 10 Stunden zusammen mit Albumin, welches zur Stabilisierung der Urokinase zugegeben wurde, unterzogen wird, einen Komplex mit hohem Molekulargewicht bilden, und solch ein Stabilisator, falls zugegeben, bis zu einem bestimmten Ausmaß Urokinase vom Verlust ihrer enzymatischen Aktivität nach der Lyophilisation schützen kann, jedoch nicht deren Aktivitätsverlust nach der eigentlichen klinischen Anwendung verhindern kann.

Die physiologische Aktivität von Urokinase bei intravenöser Verabreichung an lebende Körper wird sofort durch im Blut vorhandene Protease-Inhibitoren (α₂-Makroglobulin- und α₂-Plasmin-Inhibitoren und dgl.) verzögert, und der Stoffwechsel-Grundumsatz von Urokinase selbst ist sehr hoch, woraus eine extrem verkürzte Halbwertszeit resultiert, die selbst einige Minuten nicht überschreitet. Bisher wurden keine Vorschläge zur Lösung des Problems der kurzen Halbwertszeit von Urokinase im Blut gemacht.

Aus der US-PS 41 79 337 sind physiologisch aktive, im wesentlichen nicht-immunogene Polypeptid- Zusammensetzungen bekannt. Im einzelnen wird die Modifizierung eines immunogenen Polypeptids, wie Insulin, in seine nicht-immunogene Form beschrieben. Der dort beschriebene Typ der Modifizierung hat eine Verminderung der physiologischen Aktivität des Polypeptids zur Folge.

Im Rahmen dieser Erfindung wurden umfangreiche Forschungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Derivate von vom Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen- Aktivatoren, welche die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwinden, durchgeführt. Hieraus resultierten neue Plasminogen-Aktivator-Derivate, die stabil und durch im Blut vorhandene Inhibitoren kaum verzögerbar sind und somit eine verlängerte Halbwertszeit im Blut erreichen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, vom Menschen stammende, nicht-immunisierende Plasminogen-Aktivator-Derivate, deren Aktivität bei verschiedenen Behandlungen wie Stehen bei Raumtemperatur oder Einfrieren und Auftauen erhalten bleibt und die weiterhin vor dem Angriff von Protease-Inhibitoren in dem Blut geschützt sind, um deren in vivo Halbwertszeit zu verlängern sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und diese Derivate enthaltende thrombolytische Mittel zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Derivate eines vom Menschen stammenden, nicht-immunisierenden Plasminogen-Aktivators dadurch gelöst, daß sie mindestens ein Polyalkylenglykol, das mit mindestens einem Kupplungsmittel an Aminosäure-Seitenketten des Plasminogen-Aktivators gebunden ist, umfassen, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 2000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthält.

Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung und viele der damit verbundenen Vorteile werden leicht durch die folgende, detaillierte Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen erhalten. In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 die optimalen pH-Bereiche von modifizierter, hochmolekulargewichtiger Urokinase (PEG-DCT-UK) und von unmodifizierter, hochmolekulargewichtiger Urokinase (Molekulargewicht=54 000), gemessen als Amidase-Aktivität mit einem synthetischen Substrat (S-2444), wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK und die gefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 2 die optimalen pH-Bereiche von modifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase (PEG-DCT-L-UK) und von modifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase (Molekulargewicht=33 000), gemessen als Amidase- Aktivität mit S-2444, wobei die freien Kreise der PEG- DCT-L-UK und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 3 schematisch die Stabilität von PEG-DCT-UK und von unmodifizierter Urokinase bei Raumtemperatur in entweder physiologischer Kochsalzlösung oder einer Ringer- Lösung, wobei die durchgezogenen bzw. unterbrochenen Linien der physiologischen Kochsalzlösung bzw. der Ringer- Lösung entsprechen und wobei die freien Kreise der PEG- DCT-UK und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 4 die Stabilität von PEG-DCT-L-UK und von unmodifizierter Urokinase (Molekulargewicht=33 000) gegenüber Einfrieren sowie anschließender Auftaubehandlung bei 2-, 4- und 6maliger Wiederholung, wobei die freien Kreise der PEG-DCT-L-UK und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase entsprechen;

Fig. 5 die variierten Mengen, als Funktion der Zeit, eines Plasmin-Inhibitors in einer Plasmafraktion F₁ jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei einer Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht=54 000) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase-verabreichten Gruppe entsprechen;

Fig. 6 die variierten Mengen, als Funktion der Zeit, eines Plasminogens in einer Plasmafraktion F₃ jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei einer Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht=54 000) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase-verabreichten Gruppe entsprechen; und

Fig. 7 die variierten Mengen, als Funktion der Zeit, von Plasminogen in einer Plasmafraktion F₃ jeder von zwei Gruppen von gesunden Kaninchen, wobei das Plasma mit einer Säure und dann mit einer Base zur Inaktivierung des Plasmin-Inhibitors behandelt wurde, wobei einer Gruppe PEG-DCT-UK und der anderen Gruppe unmodifizierte Urokinase (Molekulargewicht=54 000) verabreicht wurde, und wobei die freien Kreise der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe und die ausgefüllten Kreise der unmodifizierten Urokinase- verabreichten Gruppe entsprechen.

Durch den hierin verwendeten Ausdruck "vom Menschen stammender, nicht-immunisierender Plasminogen-Aktivator" werden nicht nur Urokinase, sondern ebenfalls Gewebe-Plasminogen- Aktivatoren umfaßt, die aus menschlichen Geweben, wie Gebärmutter- und Tumorgewebe und dgl., erhalten werden. Diese Plasminogen-Aktivatoren aus menschlichem Gewebe enthalten auch solche, die durch Gewebekultur oder Gentechnik erhalten werden. Es sei darauf hingewiesen, daß hinsichtlich der Molekulargewichte dieser Aktivatoren keine Beschränkungen bestehen, solange sie in der oben beschriebenen Weise erhalten werden. Beispielsweise kann als Urokinase, die ein von menschlichem Urin stammender Plasminogen-Aktivator ist, hochmolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht=54 000) wie auch niedermolekulargewichtige Urokinase (Molekulargewicht=33 000) entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden.

Geeignete Polyalkylenglykole, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen ein Polyäthylenglykol und ein Polypropylenglykol. Im Falle des Polypropylenglykols sind sowohl geradkettige Polypropylenglykole, wie diejenigen der Formel HO[CH(CH₃)CH₂O]_nH, als auch verzweigtkettige Polypropylenglykole, wie diejenigen der Formel CH₃CH₂C [[CH₂O[CH₂CH(CH₃O]_nH]]₃ oder H[OCH(CH₃)CH₂]_nOCH[[CH₂ [OCH₂CH(CH₃)]_nOH]]₂, umfaßt.

Die Molekulargewichte der Polyalkylenglykole können im Bereich von 200 bis 20 000 liegen. Besonders bevorzugte Molekulargewichte liegen im Bereich von 500 bis 10 000.

Die Polyalkylenglykole können jeweils wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthalten. Typische Beispiele der Alkylgruppen sind Methyl, Äthyl, Propyl, Stearyl und dgl. Typische Beispiele der Alkanoylgruppen sind Acetyl, Propionyl, Stearoyl und dgl. Als ein bevorzugtes Polyalkylenglykol eignet sich ein unsubstituiertes oder methylsubstituiertes Polyalkylenglykol.

Geeignete Kupplungsmittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können und geeignet sind, ein Polyalkylenglykol an einen nicht-immunisierenden Plasminogen-Aktivator, z. B. Urokinase, zu binden, umfassen solche, die fähig sind, mit Aminosäure-Seitenketten des zu modifizierenden Proteins zu reagieren und zwischen diesen chemische Bindungen zu bilden, beispielsweise Acylazid, Cyanurhalogenide, p-Diazoniumbenzyläther, 3-(p-Diazoniumphenoxy)-2-hydroxypropyläther, Dihalogenbernsteinsäureanhydrid und dgl. Die folgenden Teilformeln können als Beispiele für die Kupplungsstrukturen zwischen einem Polyalkylenglykol und Urokinase durch diese Kupplungsmittel gegeben werden.

worin X ein Halogenatom bedeutet und UK für einen Restteil des Urokinasemoleküls steht.

Das erfindungsgemäße neue Urokinase-Derivat kann hergestellt werden durch Umsetzung eines gekuppelten Produkts aus mindestens einem korrespondierenden Polyalkylenglykol und mindestens einem Kupplungsmittel mit Urokinase, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituenten enthält.

Typische Beispiele des mit dem Polyalkylenglykol-Kupplungsmittel gekuppelten Produktes umfassen Polyalkylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin, Polyalkylenglykol-4,6- difluor-1,3,5-triazin, Polyalkylenglykol-4-chlor-6-hydroxy- 1,3,5-triazin, Polyalkylenglykol-β-(bromcarbonyl)-monopropionat, Polyalkylenglykol-azidocarbonyl-methyläther, Polyalkylenglykol-(p-diazoniumbenzyl)-äther, Polyalkylenglykol- 3-(p-diazoniumphenoxy)-2-hydroxypropyläther und dgl.

Bei der Umsetzung des mit Polyalkylenglykol-Kupplungsmittel gekuppelten Produktes mit Urokinase ist es notwendig, solche Reaktionsbedingungen zu wählen, daß die enzymatische Aktivität auf einem minimalen Verlust gehalten wird. Hierzu ist erstrebenswert, die Umsetzung bei niedrigen Temperaturen, z. B. bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, in einer wäßrigen Lösung, wie einem Puffer, auszuführen. Eine bevorzugte Reaktionszeit kann im Bereich von einigen Minuten bis zu 5 Stunden liegen. Der pH des Puffers liegt vorzugsweise innerhalb eines solchen Bereichs, daß die enzymatische Aktivität von Urokinase nicht herabgesetzt wird, nämlich bei 2 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9. Der bevorzugte pH-Bereich kann jedoch variieren in Abhängigkeit der Reaktivität des jeweils verwendeten Kupplungsmittels und/oder der Art des Aminosäurerestes. Das Modifizierungsausmaß von Aminosäure- Seitenketten des Plasminogen-Aktivators kann reguliert werden durch Änderung der Konzentration des Polyalkylenglykols, das mit dem Kupplungsmittel in einem Reaktionsmedium aktiviert wird. Beispielsweise wurde ein Monomethyläther- polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 bei pH 7,0 mit hochmolekulargewichtiger Urokinase umgesetzt, um neue Urokinase-Derivate zu erhalten, während die Konzentration des ersteren Reaktanten auf 0,4, 4,0 bzw. 6,0 mM geändert wurde. Unmodifizierte ε-Aminogruppen von Lysin des resultierenden Urokinase-Derivats wurden unter Verwendung von Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat quantitativ bestimmt. Deren Modifizierungsgrad wurde auf der Grundlage der durch quantitative Analysen erhaltenen Ergebnisse erforscht. Die Modifizierungs-Prozentgehalte der ε-Amino gruppen von Lysin, die gegenüber Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat aktiv waren, betrugen 6 bis 7% bei 0,4 mM, etwa 40% bei 4,0 mM und etwa 60% bei 6,0 mM. Zusätzlich wurden die Molekulargewichte dieser Reaktionsprodukte durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Die durchschnittlichen Molekulargewichte der Reaktionsprodukte betrugen etwa 60 000 bei 0,4 mM und etwa 120 000 bei 4,0 mM. Diese Werte stimmen im wesentlichen mit den Ergebnissen überein, die oben bei den quantitativen Analysen der ε-Aminogruppen von Lysin erhalten wurden. Demzufolge ist es erforderlich, die Reaktion zwischen dem mit dem Kupplungsmittel aktivierten Polyalkylenglykol und dem Plasminogen-Aktivator bei einem hohen pH-Wert und einer hohen Konzentration des ersteren Reaktanten durchzuführen, wenn gesteigerte Modifizierungsgrade des Plasminogen- Aktivators erwünscht sind. Andererseits sollte, wenn verringerte Modifizierungsgrade bevorzugt sind, die Umsetzung bei einem relativ niedrigen pH-Wert und bei einer niedrigen Konzentration des gekuppelten Produktes erfolgen. Die Modifizierungsgrade können natürlich durch Regulierung der Reaktionszeit geändert werden. Durch geeignete Kombination dieser Reaktionsbedingungen ist es möglich, die beabsichtigten, neuen Plasminogen-Aktivator- Derivate zu erhalten, die stabil sind und verlängerte fibrinolytische Aktivitäten besitzen.

Das mit dem Kupplungsmittel aktivierte Polyalkylenglykol kann auf folgende Weise erhalten werden. Ein endständig substituiertes Polyalkylenglykol-4,6-dihalogen-1,3,5-triazin wird erhalten durch Umsetzung seines korrespondierenden, monosubstituierten Polyalkylenglykols mit einem Cyanurhalogenid in einem wasserfreien Lösungsmittel und in Anwesenheit einer Base. Ein Polyalkylenglykol-4-halogen- 6-hydroxy-1,3,5-triazin wird gebildet, indem man zuerst sein entsprechenden Polyalkylenglykol mit Cyanurhalogenid umsetzt und dann das resultierende Reaktionsprodukt mit Wasser behandelt. Ein Polyalkylenglykolacetoazid wird gebildet durch Umsetzung eines Anions seines entsprechenden Polyalkylenglykols mit Äthylchloracetat, nachfolgende Behandlung des Reaktionsproduktes mit Hydrazin und schließlich Aktivierung des resultierenden Hydrazins mit salpetriger Säure. Ein Polyalkylenglykol- p-diazoniumbenzyläther oder ein Polyalkylenglykol-3-(p- diazoniumphenoxy)-2-hydroxypropyläther wird erhalten durch Umsetzung seines korrespondierenden Polyalkylenglykols mit p-Nitrobenzylchlorid oder p-Nitrophenylglyceryläther und anschließende Reduktion der Nitrogruppe in eine Aminogruppe sowie Diazotierung des resultierenden Produkts mit salpetriger Säure.

Nach Beendigung der Umsetzung des mit dem Kupplungsmittel aktivierten Polyalkylenglykols und des Plasminogen-Aktivators können die Isolierung und Reinigung des Reaktionsproduktes auf biochemische Weise, wie per se in der Technik bekannt, erfolgen, z. B. unter Verwendung (einzeln oder in Kombination) einer Gelfiltration, Dialyse, Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie und dgl. Vorzugsweise wird das Konjugat als Lösung mit einem Gehalt eines Puffers oder eines physiologischen Salzes aufbewahrt, indem man die Lösung unter -20°C einfriert oder die Lösung lyophilisiert.

Die optimalen pH-Werte für die neuen, wie oben beschrieben hergestellten Urokinase-Derivate variieren in Abhängigkeit der Molekulargewichte und der Arten der verwendeten Polyalkylenglykole, der Arten der verwendeten Kupplungsmittel, der Modifizierungsgrade der Urokinase, der Modifizierungsbedingungen und Meßbedingungen, wie etwa den verwendeten Substraten. Bei Messung als Amidase- Aktivität unter Verwendung eines synthetischen Substrates S-2444 liegt der optimale pH-Wert im Bereich von etwa 8 bis 9. Im Falle hochmolekulargewichtiger Urokinase, die durch Umsetzung mit Momomethyläther-polyäthylenglykol-4,6- dichlor-1,3,5-triazin mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 bei pH 7,0 und bei einer Temperatur von 0°C während 3 h unter Verwendung einer Konzentration des letzteren Reaktanten von 4,0 mM (nachfolgend abgekürzt als PEG-DCT-UK) modifiziert wurde, beträgt der optimale pH, gemessen als Amidase-Aktivität, 8,2, wie in Fig. 1 gezeigt. Der optimale pH von niedermolekulargewichtiger Urokinase, die unter den gleichen Bedingungen modifiziert wurde (nachfolgend als PEG-DCT-L-UK bezeichnet), beträgt, gemessen als Amidase-Aktivität, 8,2, wie in Fig. 2 gezeigt.

Die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate besitzen eine extrem gesteigerte Stabilität, verglichen mit unmodifizierter Urokinase. Beispielsweise zeigt Fig. 3 die Ergebnisse der Rest-Urokinase-Aktivität, wie sie erhalten wurden im Verlauf der Zeit, wenn Urokinase mit einer Ringer- Lösung oder einer physiologischen Lösung auf eine solche Konzentration verdünnt wurde, wie sie bei Verabreichung in Tropfenform für klinische Anwendung verwendet wird, und dann bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Als Ergebnis hat sich gezeigt, daß PEG-DCT-UK, gelöst in der Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 105,3 IE/ml, eine Aktivität von 73,4% selbst 6 h nach Beginn des Versuchs beibehält. Weiterhin behält PEG-DCT-UK eine anfängliche Aktiviät von 79,4% in der physiologischen Salzlösung bei. Andererseits behält unmodifizierte Urokinase, gelöst in einer Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 76,1 IE/ml, nur 33,3% ihrer anfänglichen Aktivität selbst nach 2 h bei. In einer physiologischen Salzlösung beträgt die Restaktivität nur 26,3%.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden durch Vergleichen der Stabilität von PEG-DCT-L-UK und unmodifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase im Verlauf des Einfrierens und der anschließenden Auftaubehandlung. Die Ergebnisse bestätigen, daß die vorzügliche Stabilität von PEG-DCT-L-UK selbst unter solchen Bedingungen erreicht wird.

Des weiteren besitzen die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase- Derivate verlängerte Urokinase-Aktivitäten im Blut, verglichen mit unmodifizierter Urokinase. Die Wirksamkeit von Urokinase wurde beispielsweise erforscht durch Verabreichung von 8000 IE/kg von sowohl PEG-DCT-UK als auch unmodifizierter Urokinase an gesunde Kaninchen durch intravenöse Einspritzung, periodische Blutprobenentnahme vor der Dosierung und nach Ablauf von 4 h sowie Messen der Mengen des in dem citratierten Plasma vorhandenen Plasmin-Inhibitors und Plasminogens. Die Ergebnisse sind in den Fig. 5, 6 und 7 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen, daß PEG-DCT-UK bis zu einem wesentlichen Ausmaß die biochemischen Parameter, wie Plasmin-Inhibitor und Plasminogen, ändert und diese Parameter bei erniedrigten Werten über eine ausgedehnte Zeitspanne beibehält, verglichen mit unmodifizierter Urokinase.

Die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate sind daher ausgezeichnete Plasminogen-Aktivatoren, die unter Beibehaltung der Plasminogen-aktivierenden Fähigkeit, wie bei unmodifizierter Urokinase der Fall, die Nachteile von Urokinase, wie geringe Stabilität und kurze Halbwertszeit im Blut, überwunden haben.

Die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate können als pharmazeutische Produkte für die Behandlung einer Reihe von Krankheiten verwendet werden, die sich herleiten aus der übermäßigen Koagulierbarkeit bzw. Gerinnungsfähigkeit des Bluts, wie arterielle und venöse Thrombosen, Kranzarteriengerinnung, Myocardinfarkt, Intracerebralinfarkt, Lungenembolie, Nephritis und dgl. Diese Urokinase- Derivate können geeigneterweise durch intravenöse Einspritzung oder Tropfen oder auf oralem Weg verabreicht werden. Die intravenöse Einspritzung ist besonders bevorzugt. Als dosisgerechte Form ist insbesondere eine lyophilisierte Form geeignet. Bei Bereitstellung entweder in reinem Zustand oder mit einem physiologischen Salz, wie einem Salz einer Ringer-Lösung, oder Natriumchlorid, können die lyophilisierten Produkte für klinische Anwendung durch Auflösen mit sterilem, destilliertem Wasser oder weiterer Verdünnung mit sterilem, destilliertem Wasser, um deren osmotischen Druck vor der eigentlichen Verwendung einzustellen, eingesetzt werden. Da die erfindungsgemäßen, neuen Urokinase-Derivate stabil sind, benötigen sie keinen Stabilisator, wie Albumin. Die Zugabe eines solchen Stabilisators verursacht jedoch keinerlei Probleme oder Unannehmlichkeiten. Beim Unterziehen der neuen Urokinase-Derivate einer Lyophilisierung kann ebenfalls ein Träger zugesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung wurde vorstehend im allgemeinen beschrieben. Die Erfindung wird im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Modifizierungsbehandlung kann in jeder der Herstellungsstufen des Plasminogen- Aktivators ausgeführt werden.

Beispiel 1 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin

Polyäthylenglykolmonomethyläther mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 (25,0 g; 0,05 Mol) wurde unter Erwärmen in 200 ml trockenem Benzol gelöst. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung auf Zimmertemperatur wurden 5,0 g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,75 g (0,015 Mol) Cyanursäurechlorid zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat mit 600 ml Petroläther versetzt. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Saugfiltration gesammelt und mit einer geringen Menge Petroläther gewaschen. Der Niederschlag wurde durch dreimaliges Ausfällen aus trockenem Benzol und Petroläther gereinigt, um überschüssiges Cyanursäurechlorid zu entfernen, wobei in stöchiometrischen Mengen Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin als weißes Pulver erhalten wurde. Das Produkt zeigte nach der Hydrolysierung die qualitativen Reaktionseigenschaften von Chlorionen (AgNO₃).

In ähnlicher Weise wurden Polyäthylenglykol-monomethyläther mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 550, 700, 2000 bzw. 20 000 jeweils mit Cyanursäurechlorid umgesetzt, um stöchiometrische Mengen an Monomethylätherpolyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazinen mit den entsprechenden durchschnittlichen Molekulargewichten zu erhalten.

Beispiel 2 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht ihrer Polyäthylenglykol- Anteile=10 000 und 15 000)

Polyäthylenglykol-monomethyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 10 000 (25,0 g; 0,025 Mol) wurde unter Erwärmen in 200 ml trockenem Benzol aufgenommen. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung wurden 2,5 g wasserfreies Natriumcarbonat und 1,38 g (0,0075 Mol) Cyanursäurechlorid zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei 33°C gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurden nichtgelöste Bestandteile abfiltriert. Das Filtrat wurde mit etwa 600 ml n-Hexan versetzt, um eine Ausfällung einzuleiten. 100 ml trockenes Benzol wurden dem Präzipitat zugesetzt, das dann erwärmt und gelöst wurde. Dann wurden 500 ml n-Hexan zur Einleitung der Ausfällung zugesetzt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Das so erhaltene Präzipitat wurde über Nacht bei 50°C im Vakuum getrocknet, wobei stöchiometrische Mengen an Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=10 000) als weißes Pulver erhalten wurden. Auf ähnliche Weise wurde Polyäthylenglykol-monomethyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 15 000 mit Cyanursäurechlorid umgesetzt, wobei stöchiometrische Mengen an Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor- 1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=15 000) erhalten wurden.

Beispiel 3 Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin

Polyäthylenglykol-monostearyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 3200 (16,0 g; 0,005 Mol) wurde in 200 ml trockenem Benzol aufgelöst. Anschließend wurden 5,0 g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,75 g (0,015 Mol) Cyanursäurechlorid unter Rühren zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurden ungelöste Bestandteile durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit etwa 600 ml n-Hexan zur Einleitung der erneuten Ausfällung versetzt. 100 ml trockenes Benzol wurde dem Präzipitat zugesetzt, um das letztere aufzulösen. 500 ml n-Hexan wurden zur Einleitung der erneuten Ausfällung zugegeben. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei stöchiometrische Mengen an Monostearyläther- polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils= 3200) als weißes Pulver erhalten wurden.

Beispiel 4 Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin

Polyäthylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 6000 (33,6 g) wurde unter Erwärmen in 150 ml trockenem Benzol aufgelöst. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung wurden 1,6 g wasserfreies Natriumcarbonat und 0,74 g Cyanursäurechlorid zugesetzt und das resultierende Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend gab man 1,0 ml Wasser zu, rührte das Gemisch 6 h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 40°C. Ungelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugieren (2000 U/min; 10 min) entfernt, und der überstehende Teil wurde der Kondensation unter vermindertem Druck unterzogen. Der Rückstand wurde unter Erwärmen in trockenem Benzol aufgenommen und das Lösungsmittel anschließend abgedampft. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5- triazin erhielt (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=6000).

Polyäthylenglykole mit unterschiedlichen Durchschnittsmolekulargewichten von 1000 und 4000 wurden jeweils auf gleiche Weise wie oben mit Cyanursäurechlorid und Wasser umgesetzt, was zur stöchiometrischen Bildung von Polyäthylenglykol- 4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazinen mit ihren korrespondierenden Durchschnittsmolekulargewichten führte.

Beispiel 5 Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin

Polyäthylenglykol-monostearat mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 2700 (6,765 g) wurde in 100 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst und anschließend mit 2,5 g wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt. Unter Rühren der resultierenden Mischung wurden weiterhin 1,38 g Cyanursäurechlorid zugegeben. Die entstehende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, wobei stöchiometrische Mengen an Stearoylpolyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=2700) erhalten wurden, und zwar in Form einer weißen, wachsartigen Substanz.

Beispiel 6 Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin

Polypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 1000 (4,0 g) wurde in 50 ml wasserfreiem Benzol aufgenommen und anschließend mit 1,27 g wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt. Unter Rühren wurden weiterhin 0,552 g Cyanursäurechlorid zugesetzt. Nach dem Rühren der resultierenden Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur setzte man 1 ml Wasser zu. Das Gemisch wurde weitere 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Benzol und wasserfreiem Natriumsulfat versetzt. Die Mischung wurde anschließend 10 min bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Filtration der Mischung wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat abgedampft. Der Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet, wobei man stöchiometrische Mengen an Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy- 1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol- Anteils=1000) in Form eines farblosen, viskosen Öls erhielt.

Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise erhielt man ein Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol- Anteils=4000) sowie ein weiteres Polypropylenglykol- 4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils=10 000).

Die in den obigen Beispielen verwendeten Polypropylenglykole waren vom geradkettigen Typ, nämlich solche der Formel HO[Ch(CH₃)CH₂O]_nH.

Beispiel 7 Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 wurde Polypropylenglykol- 4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils=4000) in stöchiometrischen Mengen als weiße Substanz aus Polypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 4000 (8,0 g), 80 ml wasserfreiem Benzol, 0,636 g wasserfreiem Natriumcarbonat und 0,368 g Cyanursäurechlorid erhalten.

Das in diesem Beispiel verwendete Polypropylenglykol war vom verzweigtkettigen Typ, nämlich ein solches der Formel

CH₃CH₂C[[CH₂O[CH₂CH(CH₃)O]_nH]]₃.

Ferner wurde unter Verwendung eines Polypropylenglykols der Formel

und mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 3000 ein Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils=3000) erhalten.

Beispiel 8 Monomethyläther-polyäthylenglykol-methoxycarbohydrazid

Polyäthylenglykol-monomethyläther mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 5000 (13,3 g; 0,0027 Mol) wurde unter Stickstoff in 400 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran aufgenommen. Eine kleine Menge Diphenylessigsäure wurde als Indikator zugegeben und n-Butyllithium unter Kühlen mit Eis zugetropft, bis die Reaktionslösung in schwaches Gelb umschlug. Danach wurden 5 ml (0,047 Mol) Äthylchloracetat bei Raumtemperatur zugetropft, die resultierende Lösung über Nacht gerührt und dann 1 h unter Rückfluß gehalten. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgetrieben und der Rückstand in 200 ml wäßrigem Aceton aufgenommen. Die resultierende Lösung wurde mit Holzkohle (Aktivkohle) behandelt. Nach Filtration und anschließender Konzentration des Filtrats wurde Benzol zugesetzt. Nach Entfernung des Wassers durch azeotrope Destillation wurde der Rückstand erneut aus Benzol und n- Hexan ausgefällt, um ein gelbliches Pulver zu erhalten. Das so erhaltene Pulver wurde in 150 ml Methanol gelöst und dann mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Die Mischung wurde über Nacht unter Rückflußbedingungen erhitzt. Nach Abtreiben des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 150 ml Wasser zugegeben und überschüssiges Hydrazin durch azeotrope Destillation entfernt. Im Rückstand verbleibendes Wasser wurde zusammen mit Benzol azeotropisch entfernt. Der Rückstand wurde erneut in Benzol gelöst und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Anschließend wurde das Lösungsmittel abgetrieben und der Rückstand in warmem Benzol gelöst. Die Benzollösung wurde mit Aktivkohle behandelt und dann konzentriert. Das Reaktionsprodukt wurde zweimal aus Benzol und n-Hexan ausgefällt, mit Aktivkohle erneut behandelt, mit Silikagel behandelt und dann erneut aus Benzol und n-Hexan ausgefällt, wobei Monomethyläther-polyäthylenglykol-methoxycarbohydrazid als weißes Pulver erhalten wurde. Auf gleiche Weise wurde eine Vielzahl von Hydraziden unter Verwendung von Polyäthylenglykol-monomethyläthern mit Durchschnittsmolekulargewichten von 550, 700, 2000, 10 000, 15 000 bzw. 20 000 als Ausgangsmaterialien erhalten.

Beispiel 9 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinase (PEG-DCT-UK)

Ein 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 7,0 (2,0 ml) wurde unter Kühlen mit Eis zu 0,61 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht =54 000; 66 300 IE/ml) gegeben. Danach wurde Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor- 1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=5000) in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Triazins auf 4 mM gebracht wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 3 h unter Eiskühlung gegebenüber 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und dann eine weitere Stunde gegenüber physiologischer Salzlösung ausgeführt. Der Inhalt der Röhre wurde dann auf 40 ml aufgefüllt und in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase- Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierten Urokinase (PEG-DCT-UK) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 4550 IE/ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 18 200 IE. Da die Aktivität der Ausgangs-Urokinase 40 443 IE betrug, war ein Aktivitätsverlust von 55% festzustellen.

Das obige Verfahren wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß das Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=5000) durch Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=550, 700 bzw. 2000) ersetzt wurde, wobei modifizierte Urokinasen mit Urokinase-Aktivitäten von 9800, 10 000 und 6500 IE/ml, wie durch das Fibrin-Platten-Verfahren bestimmt, erhalten wurden.

Beispiel 10 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin- modifizierte, niedermolekulargewichtige Urokinase (PEG-DCT-L-UK)

Ein 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,0 (4,7 ml) wurde unter Eiskühlung zu 0,2 ml einer niedermolekulargewichtigen Urokinaselösung (Molekulargewicht=33 000; 567 828 IE/ ml) gegeben. Anschließend wurde Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=5000) in solcher Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Triazinderivats auf 4 mM eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 3 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und dann eine weitere Stunde gegenüber physiologischer Salzlösung durchgeführt. Nach der Dialyse wurde der Inhalt auf 8 ml aufgefüllt und in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin-modifizierten, niedermolekulargewichtigen Urokinase (PEG-DCT-L-UK) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 10 300 IE/ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 82 400 IE. Da die Aktivität der Ausgangs- Urokinase 113 566 IE betrug, war ein Aktivitätsverlust von 27,4% festzustellen.

Beispiel 11 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin-modifizierte Urokinase

Das Verfahren des Beispiels 9 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Konzentration des jeweiligen Monomethyläther- polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazins zu 0,4 mM geändert wurde. Man erhielt (mit Modifizierungsgraden, die sich von den in Beispiel 9 erhaltenen unterschieden) Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6- dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils= 550, 700, 2000 bzw. 5000). Die Urokinase-Aktivitäten betrugen 8670, 8900, 6770 und 8670 IE/ml, bestimmt mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens.

Beispiel 12 Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbomethylazid-modifizierte Urokinase

(1) Zu 200 mg des in Beispiel 8 hergestellten Monomethyläther- polyäthylenglykol-methoxycarbohydrazids (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=5000) gab man unter Eiskühlung 2 ml 1 N Salzsäure und dann 1 ml einer 0,008 N wäßrigen Natriumnitritlösung. Das resultierende Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt, und dann gab man weiterhin 2 ml einer 1 N wäßrigen Natriumhydroxidlösung zur Neutralisation der Mischung zu. Die resultierende Lösung des Monomethyläther-polyäthylenglykol- carboxymethylazids wurde bei 0°C gelagert.

(2) Ein 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8,0 (3,656 ml) wurde zu 1 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht=33 000; 45 600 IE/ml) gegeben. Anschließend wurden 0,435 ml der gemäß dem obigen Verfahren (1) hergestellten Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbomethylazid-Lösung unter schwachem Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die resultierende Reaktionslösung wurde dann in eine Dialyseröhre überführt und 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert. Der Inhalt wurde auf 8 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in geforenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen Monomethyläther-polyäthylenglykol-carbomethylazid- modifizierten Urokinase wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 7300 IE/ml bestimmt. Verglichen mit nichtmodifizierter Urokinase wurde eine Aktivitätszunahme von 28% festgestellt.

Beispiel 13 Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinase

Zu 0,61 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht=54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,0 (2,0 ml) und dann unter schwachem Rühren Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor- 1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=10 000). Das Triazinderivat wurde in solcher Menge zugsetzt, daß die Konzentration auf 0,1 mM eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 3 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphorsäure-Puffer, versetzt mit 0,035% (Vol/Vol) Äthylamin (pH 8,0), und dann weitere 2 h gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit 3% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (0,1 ml) versetzt und dann mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 4,0 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Aktivität der so erhaltenen, Monomethyläther-Polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierten Urokinase wurde gemäß dem Fibrin-Platten-Verfahren mit 10 028 IE/ml bestimmt. Somit betrug die Gesamtaktivität 40 112 IE und der Aktivitätsverlust 35%. Ähnliche, modifizierte Urokinasen wurden durch Änderung der Konzentration an Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=10 000) auf 0,4 bzw. 1,0 mM erhalten. Deren Urokinase-Aktivitäten betrugen 8794 und 6634 IE/ml.

Außerdem wurden Monomethyläther-polyäthylenglykol-4,6- dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=15 000) und Urokinase auf ähnliche Weise umgesetzt, wobei Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=15 000) erhalten wurde. Die Aktivitäten der modifizierten, durch Änderung der Konzentrationen der Triazinderivate zu 0,1, 0,4 und 1,0 mM erhaltenen Urokinasen betrugen 11 388, 8580 bzw. 7176 IE/ml.

Beispiel 14 Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin-modifizierte Urokinase

Zu 0,2 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht=54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 0,66 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und danach Monostearyl- polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils=3200). Das Triazinderivat wurde in solcher Menge zugesetzt, daß die Konzentration auf 2 mM eingestellt wurde. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und der Dialyse zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit 0,1 ml einer 3,0%igen wäßrigen Lösung von Rinderserumalbumin versetzt und dann mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 4,0 ml eingestellt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so hergestellten, Monostearyläther-polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin-modifizierten Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=3200) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 2826 IE/ml bestimmt. Da die Gesamtaktivität 11 304 IE betrug, lag die Aktivität bei 55,9%, verglichen mit der der Ausgangs- Urokinase. Die Aktivitäten der modifizierten Urokinasen, die durch Änderung der Konzentration an Monostearyläther- polyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin zu 4, 6 bzw. 8 mM erhalten wurden, betrugen 2351, 1430 und 1059 IE/ml.

Beispiel 15 Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase

Zu 1 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht= 54 000; 45 600 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 4,0 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 9,2) und anschließend 2,34 mg Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin. Das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyäthylenglykol- Anteils des Triazinderivats lag bei 6000. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und überschüssiges Triazinderivat durch Dialyse entfernt. Die Dialyse wurde 1 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 9,2) und dann weitere 3 h gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) auf 8,0 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Die Urokinase-Aktivität der so erhaltenen, mit Polyäthylenglykol-4-chlor-6-hydroxy- 1,3,5-triazin modifizierten Urokinase (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=6000) wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens mit 460 IE/ ml bestimmt.

Auf ähnliche Weise wurden andere Polyäthylenglykol-4- chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinasen (Durchschnittsmolekulargewicht der Polyäthylenglykol- Anteile=4000 bzw. 1000) erhalten.

Beispiel 16 Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinase

Zu 0,5 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht= 54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 1,5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und dann 0,05 ml einer Dioxanlösung von Stearoylpolyäthylenglykol-4,6- dichlor-1,3,5-triazin (270 mg/ml) (Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils=2700). Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats der Dialyse unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit einem Phosphatpuffer auf 5 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert.

Als Ergebnis der Urokinase-Aktivitätsbestimmung mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens wurde festgestellt, daß die so erhaltene Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5- triazin-modifizierte Urokinase eine Aktivität von 106% im Vergleich zu der der Ausgangs-Urokinase hatte.

Andere Stearoylpolyäthylenglykol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden durch Umsetzung mit Urokinase unter Verwendung einer Dioxanlösung von Stearoylpolyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin (270 mg/ml) in Mengen von 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 2700. Die so hergestellten, modifizierten Urokinasen besaßen Aktivitäten von 106 und 101% im Vergleich zu derjenigen der Ausgangs-Urokinase.

Beispiel 17 Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinase

Zu 0,5 ml einer Urokinaselösung (Molekulargewicht= 54 000; 101 167 IE/ml) gab man unter Eiskühlung 1,5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und anschließend 0,05 ml einer Dioxanlösung des Polypropylenglykol-4- chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazins (100 mg/ml), erhalten in Beispiel 6. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol- Anteils des Triazinderivats betrug 1000. Die Mischung wurde 3 h unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung in eine Dialyseröhre überführt und zur Entfernung überschüssigen Triazinderivats der Dialyse unterzogen. Die Dialyse wurde 4 h unter Eiskühlung gegenüber einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durchgeführt. Der Inhalt wurde mit einem Phosphatpuffer auf 5 ml aufgefüllt und dann in gefrorenem Zustand bei -80°C gelagert. Es wurde festgestellt, daß die so erhaltene Polypropylenglykol-4-chlor- 6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase eine Aktivität von 96,4% gegenüber derjenigen der Ausgangs-Urokinase (bestimmt nach dem Fibrin-Platten-Verfahren) beibehalten hatte.

Andere Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung einer Dioxanlösung von Polypropylenglykol-4-chlor-6- hydroxy-1,3,5-triazin (100 mg/ml) in Mengen von 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polypropylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 1000. Die modifizierten Urokinasen zeigten Aktivitäten von 99,3 und 106,8% im Vergleich zu derjenigen der unmodifizierten Ausgangs-Urokinase.

Beispiel 18 Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin- modifizierte Urokinase

Polypropylenglykol-4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinasen mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden wurden in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 3 unter Verwendung einer Dioxanlösung, enthaltend 400 mg/ml des in Beispiel 7 erhaltenen Polypropylenglykol- 4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazins, in Mengen von 0,05, 0,1 bzw. 0,2 ml erhalten. Das Durchschnittsmolekulargewicht des Polyäthylenglykol-Anteils des Triazinderivats betrug 4000. Mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens wurde festgestellt, daß ihre Urokinase-Aktivitäten 89,7, 100,0 und 98,9% im Vergleich mit derjenigen der Ausgangs- Urokinase betrugen.

Beispiel 19 Optimaler pH für modifizierte Urokinase, gemessen als Amidase-Aktivität

Gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK und unmodifizierte Urokinase wurden jeweils mit physiologischer Salzlösung, enthaltend 0,1% menschliches Albumin, verdünnt, um zwei Lösungen von 167 IE/ml zu erhalten. Jede der Lösungen wurde in Portionen von 0,3 ml geteilt, welche dann mit 50 mM Tris-HCl-Puffern verschiedener pH-Werte (jeweils 1,0 ml) und dann mit einem synthetischen Substrat S-2444 (pyrGlu-Gly-Arg-p-nitroanilid) versetzt wurden. Die resultierenden Mischungen wurden 10 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden dann durch Zugabe von 30%iger Essigsäure gestoppt. Deren Extinktion wurde bei 405 nm gemessen. Daraus resultierte, daß die optimalen pH-Werte für PEG- CDT-UK und unmodifizierte Urokinase 8,2 bzw. 8,5 betrugen, gemessen als Amidase-Aktivität, bei Verwendung des synthetischen Substrats S-2444. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Die optimalen pH-Werte für PEG-DCT-L-UK, erhalten gemäß Beispiel 4, und für unmodifizierte, niedermolkulargewichtige Urokinase wurden in ähnlicher Weise als Amidase- Aktivität bestimmt und betrugen 8,2 bzw. 8,4. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 20 Stabilität von modifizierter Urokinase bei Raumtemperatur

Gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK wurde entweder mit einer Ringer-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung auf eine Konzentration von 105,3 IE/ml verdünnt. Zum Vergleich wurde ebenfalls unmodifizierte Urokinase entweder mit einer Ringer-Lösung oder einer physiologischen Salzlösung auf eine Konzentration von 76,1 IE/ml verdünnt. 3,5 ml jeder der so verdünnten Lösungen wurden 6 h bei Raumtemperatur (27°C) stehengelassen. Die Rest- Urokinaseaktivität wurde mittels des Fibrin-Platten-Verfahrens periodisch gemessen, bis eine Zeit von 6 h verstrichen war. Das Ausmaß des Aktivitätsverlustes der erfindungsgemäßen, modifizierten Urokinase war weitaus geringer als bei unmodifizierter Urokinase. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 21 Stabilität von modifizierter Urokinase gegenüber Einfrier- und Auftaubehandlung

Gemäß Beispiel 10 erhaltene PEG-DCT-L-UK wurde mit physiologischer Salzlösung auf eine Konzentration von 200 IE/ml verdünnt. Zum Vergleich wurde unmodifizierte, niedermolekulargewichtige Urokinase mit physiologischer Salzlösung auf eine Konzentration von 200 IE/ml verdünnt. Jede der so verdünnten Lösungen wurde bei -80°C eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Einfrier- und Auftaubehandlungen wurden 0-, 2-, 4- und 6mal wiederholt. Die Rest-Urokinaseaktivität wurde unter Verwendung eines synthetischen Substrats S-2444 gemessen. Das Ausmaß des Aktivitätsverlustes der erfindungsgemäßen, modifizierten Urokinase war extrem niedrig, verglichen mit unmodifizierter, niedermolekulargewichtiger Urokinase. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 22

Acht gesunde, männliche Kaninchen (weiße Japaner) mit einem jeweiligen Körpergewicht von 2,6 bis 3,1 kg wurden in zwei Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit 8000 IE/ kg PEG-DCT-UK und die andere mit 8000 IE/kg unmodifizierter Urokinase dosiert, jeweils über die Gehörvenen. Aus den Gehörvenen wurden vor der Dosierung und bei einer Zeit von 1, 2 und 4 h nach der Dosierung Blut gesammelt. Die Blutproben wurden mit einer Natriumcitratlösung versetzt, um Plasma abzutrennen. Nach Auswaschen der modifizierten und unmodifizierten Urokinasen über 18 Tage wurden die zwei Gruppen miteinander gekreuzt und ähnliche Versuche ausgeführt, um Plasmaproben zu entnehmen. Ein Teil der jeweiligen, so erhaltenen Plasmaproben wurde abgetrennt und der Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung von Lysin-Sepharose 4B unterzogen, wobei eine Plasmin-Inhibitorfraktion (Fraktion F₁) und eine Plasmin- und Plasminogen-Fraktion (Fraktion F₃) erhalten wurden. Änderungen in der Menge an Plasmin-Inhibitor in der Fraktion F₁ im Verlauf der Zeit wurden bestimmt durch Zugabe von Plasmin zur Fraktion F₁ und Messen der Menge an restlichem Plasmin, welches durch den Inhibitor nicht nachteilig beeinflußt wurde, mit einem synthetischen Substrat S-2251. Der Plasmin- Inhibitor aus der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe zeigte scheinbare Abnahme und langsamere Regenerierung. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe war die Abnahme des Plasmin-Inhibitors eher gering und seine Änderungen im Verlauf der Zeit kamen nicht deutlich heraus. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.

Andererseits wurde die Menge an Plasminogen in der Fraktion F₃ bestimmt durch Zugabe von Urokinase zur Fraktion F₃, um Plasmin zu erzeugen, und Messen der Menge des so erzeugten Plasmins mittels eines synthetisierten Substrats S-2251. In der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen nach 2 h auf etwa 50% und regenerierte sich danach stufenweise. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen jedoch bis zu etwa 65% nach 1 h, nahm jedoch nicht weiter ab. Es war eine Tendenz der Regenerierung von Plasminogen selbst 2 h nach der Dosierung zu beoachten. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.

Weiterhin wurde ein Teil jedes Plasmas als Probe genommen und mit einer Säure auf pH 5,2 behandelt, um so den darin enthaltenen Inhibitor zu desaktivieren. Dann wurde neutralisiert und die in dem säurebehandelten Plasma vorhandene Menge an Plasminogen gemessen durch Zugabe von Urokinase zu dem säurebehandelten Plasma, um Plasmin zu erzeugen, und durch Messen der Menge des so erzeugten Plasmins unter Verwendung eines synthetisierten Substrats S-2251. In der PEG-DCT-UK-verabreichten Gruppe verringerte sich das Plasminogen auf etwa 70% nach 2 h, zeigte jedoch seine stufenweise Regenerierung danach. In der unmodifizierte Urokinase-verabreichten Gruppe verringerte sich jedoch die Menge an Plasminogen auf etwa 84% nach 1 h, nahm jedoch nicht weiter ab. Danach nahm die Menge an Plasminogen stufenweise zu. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 7 gezeigt. Nebenbei sie bemerkt, daß von der Fraktion F₃ keine Plasminaktivität festgestellt wurde.

Beispiel 23 Lyophilisiertes Produkt, das für die Herstellung injizierbarer Formulierungen geeignet ist

Die gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK-Lösung wurde mittels eines Membranfilters konzentriert und dann mit physiologischer Salzlösung und einem 0,05 M Phosphatpuffer versetzt. Die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines Membranfilters keimfrei filtriert. Das Filtrat wurde portionsweise in sterilisierte Ampullen gegossen und dann lyophilisiert. Die fibrinolytische Aktivität des lyophilisierten Produktes aus PEG-DCT-UK für die Herstellung injizierbarer Formulierungen wurde mittels des Fibrin- Platten-Verfahrens mit 57 000 IE/Ampulle bestimmt.

Beispiel 24 Lyophilisiertes Produkt, das sich zur Herstellung injizierbarer Formulierungen eignet

Die gemäß Beispiel 9 erhaltene PEG-DCT-UK-Lösung wurde mittels eines Membranfilters konzentriert und dann mit physiologischer Salzlösung versetzt. Die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines Membranfilters keimfrei filtriert. Das Filtrat wurde portionsweise in sterilisierte Ampullen gegossen und dann lyophilisiert. Die fibrinolytische Aktivität des so erhaltenen, lyophilisierten Produktes von PEG-DCT-UK, das für die Herstellung injizierbarer Formulierungen geeignet ist, wurde mittels des Fibrin-Platten- Verfahrens mit 67 000 IE/Ampulle bestimmt.

Claims

1. Derivat eines vom Menschen stammenden, nichtimmunisierenden Plasminogen-Aktivators, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Polyalkylenglykol, das mit mindestens einem Kupplungsmittel an Aminosäure- Seitenketten des Plasminogen-Aktivators gebunden ist, umfaßt, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthält.

2. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator Urokinase ist.

3. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol aus der Gruppe der Polyäthylen- und Polypropylenglykol, welche wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthalten können, gewählt ist.

4. Derivat nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol ein Polyäthylenglykol-monoalkyläther ist.

5. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 10 000 besitzt.

6. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel ein Cyanurhalogenid ist.

7. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator eine Monomethyläther-polyäthylenglykol- 4,6-dichlor-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase ist, deren Polyäthylenglykol-Anteil ein mittleres Molekulargewicht von 5000 besitzt.

8. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator eine Polypropylenglykol- 4-chlor-6-hydroxy-1,3,5-triazin-modifizierte Urokinase ist, deren Polypropylenglykol-Anteil ein mittleres Molekulargewicht von 4000 besitzt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Derivats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gekuppeltes Produkt aus mindestens einem Polyalkylenglykol und mindestens einem Kupplungsmittel mit einem Plasminogen-Aktivator umsetzt, wobei das Polyalkylenglykol ein Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 20 000 besitzt und wahlweise eine oder mehrere Alkyl- und/oder Alkanoylgruppen als Substituentengruppen enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator Urokinase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das gekuppelte Produkt und der Plasminogen-Aktivator bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, in einer wäßrigen Lösung, wie einem Puffer, umgesetzt werden, wobei der Aktivator nicht seine physiologische Aktivität verliert.

12. Thrombolytisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Derivat eines vom Menschen stammenden nichtimmunisierenden Plasminogen-Aktivators nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 umfaßt.