JP5376574B2 - 自己免疫疾患の治療のためのエフェクター機能欠乏抗体の使用 - Google Patents

自己免疫疾患の治療のためのエフェクター機能欠乏抗体の使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、抗体の投与による自己免疫疾患および障害の治療に関する。
発明の背景
重症筋無力症（MG）は、身体の骨格筋の種々の程度の弱化によって特徴付けられる慢性自己免疫神経筋病である。MGの最も普通の原因は、筋肉のニコチン酸アセチルコリン受容体（AChR）に対する自己抗体の存在である。
AChRは、α2、β、γ、およびδの化学量論における5つのサブユニットから構成されるペンタマー膜貫通タンパク質である。成人においては、受容体γサブユニットはε-サブユニットによって置き換えられる。AChRは神経筋肉接合（NMJ）のシナプス後膜において高密度で局所化されている。神経終末によって放出されるアセチルコリン（ACh）の結合の後に、AChRはシナプス後膜の脱分極を容易とし、筋肉繊維の収縮に導く。抗-AChR抗体はAChRの喪失を誘導し、損なわれた神経筋伝達に導く。この結果、使用と共に悪化し、および休息に伴って改善される骨格筋弱化の変動がもたらされる。AChRの収縮が非常に低いならば、電気生理学によって効果を測定することもでき、反復的神経刺激後に複合筋活動電位（CMAP）の応答の減少を示す。
全てのIgGサブクラスの抗-AChR抗体はMG患者において見出されているが、常に存在する唯一のイソタイプはIgG1である（Rodgaard, A.et al., Clin Exp Immunol 67, 82（1987））。病原的メカニズムは、補体活性化によるシナプス後膜の病巣溶解によるNMJの損傷、受容体の増大した内部化および分解に導くAChRの架橋（抗原性変調）（Heinemann, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 74, 3090（1977））およびKao, I. et al., Science 196, 527（1977）、イオンチャネル機能の阻害（Lang, B. et al., J Neuroimmunol 19, 141（1988））、およびACh結合部位のブロッキング（Almon, RR. et al., Science 186, 55（1974））を含む。αサブユニットの細胞外ドメインは、病原性MG抗体の主な部分がそれに向けられる主免疫原性領域（MIR）を含有する（Tzartos, SJ et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 755（1980）, Tzartos, SJ et al., Proc Natl Acad Sci USA 79, 188（1982）およびTzartos, SJ. et al., Immunol Rev 163, 89（1998）。抗-MIR抗体は抗原変調におても非常に効果的である。
NMJのタンパク質に向けられた自己抗体の効果は、実験的自己免疫重症筋無力症（EAMG）といわれるMGの動物モデルで実験することができる。MGの原因の発見に導いた元来の実験モデルは、慢性EAMGを誘導したElectrophorus electricusの電気器官からのAChRでのウサギの免疫化である（Patrick, J. et al., Science 180, 871（1973））。引き続いて、ヒトMGに対する同様性は、アカゲザル（Macaca mulatta）を反復用量のTorpedo californica AChRで免疫化することによって証明された（Tarrab-Hazdai, R. et al., Nature 256, 128（1975））。筋電図検査は、反復的神経刺激の後に減少した活動電位を示し、損なわれた神経筋伝達が確認された。げっ歯類慢性EAMGモデルにおいて、免疫化動物のAChRと交差反応するTorpedoまたはElectrophorus AChRに対する抗体の亜集団が、長期間続く病気に導く、NMJに対する損傷の原因として同定された。（Lindstrom, JM. et al., Ann N Y Acad Sci 274, 254（1976））。MG患者からの血清、AChR免疫化動物、およびモノクローナル抗-AChR抗体もまた、ナイーブ動物に注射した場合にMG兆候を誘導したことが示された（受動的導入EAMG）（Toyka, KV et al., Science 190, 397（1975）, Toyka, KV et al., N Engl J Med 296, 125（1977）およびLindstrom, JM et al., J Exp Med 144, 739（1976））。受動導入は、数日間続く可逆的な筋肉弱化を引き起こす。
抗イディオタイプAb、mAb-競合ペプチド、耐性誘導、および遺伝子工学により作成された抗原提示細胞によるAChR特異的T細胞の排除を含むいくつかの具体的免疫療法アプローチがEAMGモデルでテストされている（Souroujon, MC et al., Neurology 36, 622（1986）, Verschuuren, JJ et al., J Immunol 146, 941（1991）, Luo, GX et al., J Immunol Methods 251, 177（2001）, Wang, ZY et al., J Neuroimmunol 44, 209（1993）, Im, SH et al., Faseb J 15, 2140（2001）, Wu, JM et al., Cell Immunol 208, 137（2001））。これらのアプローチのいずれも、現在まで、効果的なMG療法に導かなかった。
別のアプローチは、AChRの自己抗体結合部位の直接的ブロッキングである。このアプローチは、MG患者における循環自己抗体の大きな割合がMIRに向けられているので、うまくいきそうである。患者由来抗-AChR Fab-637は、種々の無関係なMG患者に由来する血清由来ポリクローナル抗-AChR抗体の、インビトロでのヒトAChRへの結合をブロックすることができることが示されている（Graus, YF et al., J Immunol 158, 1919（1997））。抗-MIR Fab断片は機能的AChRの喪失を誘導する固有の特性を有していないので、それらは補体を活性化せず、抗原変調を誘導し、またはAChRを機能的に阻害するので、抗-MIR Fab断片を首尾よく用いて、ラットおよびマウスにおいてEAMGの受動的導入を妨げた（Loutrari, H. et al., Eur J Immunol 22, 2449（1992）, Toyka, KV. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 43, 836（1980）およびPapanastasiou, DK et al., J Neuroimmunol 104, 124（2000））。ヒト抗ヒトAChR Fab断片はクローン化されており、MG血清Abをブロックするそれらの能力は探索されている（Rey, E. et al., Clin Immunol 96, 269（2000）, Farrar, J. et al., Int Immunol 9, 1311（1997）, Protopapadakis, E. et al., Eur J Immunol 35, 1960（2005）およびStassen, MH et al., J Neuroimmunol 135, 56（2003））。しかしながら、それ以上のインビボ概念証拠は得られておらず、とりわけ、それらの短い半減期のため、Fab分子は患者の治療で不適当である。
一般に、5つの治療方法が現在MGで用いられている（Sieb, JP, Curr Opin Pharmacol 5, 303（2005）。1）神経筋伝達を改良し、筋肉強度を増加させるのを助けるアセチルコリンの作用を延長する、ネオスチグミンおよびピリドスチグミンのようなアセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤を用いる神経筋伝達の増強、2）自己抗体の生産を抑制することを目的とした、プレドニゾン、サイクロスポリン、およびアザチオプリンのような薬物を用いる免疫抑制、3）胸腺切除、4）血漿交換による自己抗体の排除、および5）静脈内免疫グロブリンによる自己免疫応答の変調。
しかしながら、これらの治療方法のいずれも非常に効果的にまたは特異的というのではなく、したがって、重症筋無力症および他の自己免疫疾患を治療するための改良された方法に対する要望が存在する。
発明の概要
本発明は、対象における抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物の調製のためのエフェクター機能欠乏抗体の使用を提供し、エフェクター機能欠乏抗体は、標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の一つまたは複数と競合することができ、およびエフェクター機能欠乏抗体は多価抗体である。
1つの態様において、エフェクター機能欠乏抗体IgG4イソタイプである。IgG4は、IgG1と同様な半減期を有し、補体活性化およびFc受容体結合のようなエフェクター機能が欠乏している。
具体的には、本発明は、抗-AChR抗体の病理的効果の予防のための、患者由来Fab（IgG4-637）に基づくIgG4変種の使用を開示する。アカゲザルにおいてMGの兆候を誘導することができるIgG1全抗体637とは対照的に、IgG4-637は実験的MGのいずれの兆候も誘導しない。驚くべきことに、サルに注射されたIgG4-637はインビトロにてAChRに架橋できたにかかわらず、IgG4-637は、IgG1-637に対して過剰に同時投与した場合、IgG1-637の病理学的効果をブロックすることができることが観察された。これは本明細書において実施例1〜7に記載されている。
いずれの特定の理論によっても拘束されることなく、本明細書において実施例8に記載された結果は、IgG4-637がインビトロにてサル免疫グロブリンと交換でき、その結果、AChRに対して一価にて結合するに過ぎず、従って、AChRに架橋する能力を喪失した修飾分子がもたらされることを示唆する。いずれの特定の理論にも拘束されず、これは、抗体媒介自己免疫疾患の治療に一価抗体も用いることができることを示唆し、但し、とりわけ、許容される薬物動態プロフィールを得ることができるものとする。実施例9〜16に示されているように、ヒンジ領域において修飾された一価抗体はこの基準を満たす。
したがって、関連する局面において、本発明は、対象における抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物を調製するためのエフェクター機能欠乏抗体の使用を提供し、エフェクター機能欠乏抗体は、標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、エフェクター機能欠乏抗体は軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、IgG1サブタイプの場合には、定常（CL）領域のアミノ配列は、それが、Igの定常（CL）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有結合の形成に参画することができるいずれのアミノ酸も含有しないように修飾されており、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびヒトIgの定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、定常（CH）領域のアミノ酸配列が、ヒンジ領域および、Igサブタイプによる要求に応じて、CH3領域のようなCH領域の他の領域が、ヒトIgの定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有または非共有重鎖間結合の形成に参画するいずれのアミノ酸残基も含有しないように修飾されている。
配列表の簡単な記載
SEQ ID NO:1は、IgG4-637のVH領域の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:2は、IgG4-637のVH領域のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:3は、IgG4-637のVL領域の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:4は、IgG4-637のVL領域のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:5は、IgG4-637のCH領域の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:6は、IgG4-637のCH領域のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:7は、IgG4-637の領域の定常λ鎖の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:8は、IgG4-637の領域の定常λ鎖のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:9〜18および21〜33は、組換えDNA技術においてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの核酸配列を示す。
SEQ ID NO:19：ヒトIgG4の野生型CH領域のアミノ酸配列。
SEQ ID NO:20：ヒトIgG4のヒンジレスCH領域のアミノ酸配列。
発明の詳細な記載
本発明は、対象における抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物の調製のためのエフェクター機能欠乏抗体の使用を提供し、エフェクター機能欠乏抗体は、標的自己抗原への結合に対して、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、およびエフェクター機能欠乏抗体は、
多価抗体；または
軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、IgG1サブタイプの場合には、定常（CL）領域のアミノ配列は、それが、Igの定常（CL）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有結合の形成に参画することができるいずれのアミノ酸も含有しないように修飾されており、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびヒトIgの定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、定常（CH）領域のアミノ酸配列は、ヒンジ領域および、Igサブタイプによる要求に応じ、CH3領域のようなCH領域の他の領域が、ヒトIgの定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有または非共有重鎖間結合の形成に参画するいずれのアミノ酸残基も含有しないように修飾されている。
また、本発明は抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療方法を提供し、本方法はそれを必要とする対象にエフェクター機能欠乏抗体を投与することを含み、エフェクター機能欠乏抗体は、標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、およびエフェクター機能欠乏抗体は、
多価抗体；または
軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、IgG1サブタイプの場合には、定常（CL）領域のアミノ配列は、それが、Igの定常（CL）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有結合の形成に参画できるいずれのアミノ酸も含有しないように修飾されており、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびヒトIgの定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、定常（CH）領域のアミノ酸配列は、ヒンジ領域および、Igサブタイプによる要求に応じ、CH3領域のようなCH領域の他の領域が、ヒトIgの定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有または非共有重鎖間結合の形成に参画するいずれのアミノ酸残基も含有しないように修飾されている。
また、本発明は、標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、エフェクター機能欠乏抗体は、
多価抗体；または
軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、IgG1サブタイプの場合には定常（CL）領域のアミノ配列は、それが、Igの定常（CL）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有結合の形成に参画できるいずれのアミノ酸も含有しないように修飾されており、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびヒトIgの定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、定常（CH）領域のアミノ酸配列は、ヒンジ領域および、Igサブタイプによる要求に応じ、CH3領域のようなCH領域の他の領域がヒトIgの定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有または非共有重鎖間結合の形成に参画するいずれのアミノ酸残基も含有しないように修飾されている。
本発明との関係で抗体という用語は、少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間以上、約48時間以上、約3、4、5、6、7日以上等、あるいは（抗原に結合する抗体に関連する生理学的応答を誘導し、促進し、増強させ、および/または変調するのに十分な時間のような）いずれかの他の関連する機能的に定義された期間のような有意な期間の半減期にて典型的な生理学的条件下で抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体をいう。
免疫グロブリンという用語は、2対のポリペプチド鎖、1対の軽（L）低分子量鎖、および1対の重（H）鎖を含む構造的に関連した糖タンパク質のクラスをいい、全ての4つはジスルフィド結合によって相互連結されている。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch.7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.（1989））参照。簡単に述べれば、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（VHと本明細書において略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（VLと本明細書において略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、1つのドメインCLを含む。VHおよびVL領域は、さらに、フレームワーク領域（FR）といわれるより保存された領域が散在する相補性決定領域（CDR）ともいわれる、超可変性の領域（または配列および/または構造的に規定されたループの形態において超可変であり得る超可変領域）に細分することができる。
各VHおよびVLは、典型的には、以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された3つのCDRおよび4つのFRから構成される（また、Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917（1987）参照）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（1991）に記載された方法によって行われる（本明細書において、Kabatにおけるような、またはKabatに従う可変ドメイン残基ナンバリングのようなフレーズとは、重鎖可変ドメイン、または軽鎖可変ドメインについてのこのナンバリングシステムをいう）。このナンバリングシステムを用い、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少数のまたはさらなるアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、VH CDR2の残基52の後の単一アミノ酸インサート（Kabatによると残基52a）、および重鎖FR残基82後の挿入された残基（例えば、Kabatによると残基82a、82b、および82c等）を含むことができる。残基のKabatナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Kabatのナンバリングされた配列との相同性の領域における整列によって所与の抗体について決定することができる。
免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。免疫グロブリン分子の定常領域が異なる機能を有し、したがって、例えば、（エフェクター細胞のような）免疫系の種々の細胞、および古典的な補体系の第一の成分（C1q）を含む宿主の組織または因子への、あるいは例えば、IgGをエンドサイトーシス後の細胞内分解から保護する新生Fc受容体（FcRn）への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
前記で示したように、本明細書において、抗体という用語は、文脈上別のことが述べられていたり、明瞭に矛盾するのでなければ、抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって実行することができることが示されている。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらが、VLおよびVH領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖抗体または一本鎖Fv（scFv）としても公知である。例えば、Bird et al., Science 242, 423-426（1988）およびHuston et al., PNAS USA 85, 5879-5883（1988））として作成されるのを可能とする合成リンカーによって、組換え方法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体は、文脈上他のことが述べられていたり、または明瞭に矛盾するのでなければ、抗体という用語の中に含まれる。二重特異性抗体のような一本鎖抗体の他の形態は抗体という用語の中に含まれる。そのような断片は一般には抗体の意味内に含まれるが、それらは集合的にかつ、各々、独立して、異なる生物学的特性および利用性を呈する本発明のユニークな特徴である。本発明の関係でこれらのおよび他の有用な抗体断片は本明細書においてさらに議論される。
また、抗体という用語は、一般には、文脈上他のことが示され、または明瞭に矛盾するのでなければ、酵素切断、ペプチド合成、および組換え技術のようないずれかの公知の技術によって提供される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、キメラ抗体およびヒト化抗体のような抗体様ポリペプチド、抗体に対する抗イディオタイプ（抗-Id）抗体、および抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体断片（抗原結合断片）を含むことが理解されるべきである。一般化された抗体はいずれのイソタイプも保有することができる。
1つの態様において、エフェクター機能欠乏抗体は、例えば、異なるIgG4抗体、または他のエフェクター機能欠乏抗体の抗体カクテルの形態のポリクローナル抗体である。
1つの態様において、エフェクター機能欠乏抗体はモノクローナル抗体である。本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は単一結合特異性、および特定のエピトープに対する親和性を呈する。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一結合特異性を呈する抗体をいう。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスのようなトランスジェニックまたはトランス染色体非ヒト動物から得られたB細胞を含むハイブリドーマによって生成し得る。
さらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体はヒトモノクローナル抗体である。もう1つのさらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体はヒト化抗体である。もう1つのさらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体はキメラ抗体である。もう1つのさらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体は、ヒトとは異なる哺乳動物種から全部が由来するモノクローナル抗体である。さらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体は十分にマウスモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体とは、均一な構造および特異性を有する均質な抗体集団を含む組成物をいう。典型的には、モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体であり、すなわち、集団内に含まれる個々の抗体は少量で存在し得る可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、各モノクローナル抗体は、典型的には、異なるエピトープに対して向けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、単一のエピトープに対して向けられる。抗体がモノクローナルであることは、いずれかの特別な方法による抗体の生産を必要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体はKohler et al., Nature 256, 495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって生産できるか、あるいは組換えDNA方法によって生産することができる。また、モノクローナル抗体は、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624-628（1991）およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597（1991）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
モノクローナル抗体はいずれかの適当な源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体は、例えば、表面に抗原を発現する細胞の形態の対象となる抗原、または対象となる抗原をコードする核酸で免疫化されたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから得ることができる。また、モノクローナル抗体は、免疫化されたヒト、またはラット、イヌ、霊長類等のような非ヒト哺乳動物の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。
1つの態様において、エフェクター機能欠乏抗体はヒト抗体である。
本明細書において、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体はヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボにて体細胞突然変異によって導入された突然変異）。
本明細書において、ヒト抗体は、抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを免疫化することによって、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト免疫グロブリン配列を用いる系から得られるならば、特定の生殖系配列に「由来」し、選択されたヒト抗体は、生殖系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が、少なくとも95％のような少なくとも90％、例えば、少なくとも97％のような少なくとも96％、例えば、少なくとも99％のような少なくとも98％同一である。典型的には、重鎖CDR3領域の外部では、特定のヒト生殖系配列に由来するヒト抗体は、生殖系免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列から5以下、例えば、4、3、2または1以下のアミノ酸の差のような10アミノ酸以下の差を呈する。
本発明で用いるのに適したヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫系の一部を運ぶトランスジェニックまたはトランス染色体マウスを用いて生成し得る。そのようなトランスジェニックおよびトランス染色体マウスは、各々、HuMAbマウスおよびKMマウスということもできるマウスを含み、本明細書において、集合的に「トランスジェニックマウス」といわれる。
HuMAbマウスが、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と共に、未再編成ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する。（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859（1994））。従って、マウスが免疫化に応答してマウスIgMまたはκの低下した発現を呈し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトIgG、κモノクローナル抗体を生じる（Lonberg, N. et al. （1994）, 前記；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101（1994）, Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93（1995）およびHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546（1995）にレビューされている）。HuMAbマウスはTaylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295（1992）, Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656（1993）, Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920（1994）, Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591（1994）, Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851（1996）に詳細に記載されている。また、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,877,397号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,874,299号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,545,807号、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918およびWO 01/09187参照。
HCo7マウスは（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830（1993）に記載されているような）それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるJKD破壊、（WO 01/14424の実施例1に記載された）それらの内因性重鎖遺伝子におけるCMD破壊、（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851（1996）に記載された）KCo5ヒトκ軽鎖導入遺伝子、および（米国特許第5,770,429号に記載された）HCo7ヒト重鎖導入遺伝子を有する。HCo12マウスは、（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830（1993）に記載された）それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるJKD破壊、（WO 01/14424の実施例1に記載された）それらの内因性重鎖遺伝子におけるCMD破壊、（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851（1996）に記載された）KCo5ヒトκ軽鎖導入遺伝子、および（WO 01/14424の実施例2に記載された）HCo12ヒト重鎖導入遺伝子を有する。KMマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子はChen et al., EMBO J. 12, 811-820（1993）に記載されたようにホモ接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子はWO 01/09187の実施例1に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851（1996）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子KCo5を運ぶ。このマウス株は、WO 02/43478に記載されているように、染色体14断片hCF（SC20）から構成されるヒト重鎖トランス染色体を運ぶ。KMマウスはヒト重鎖トランス染色体およびヒトκ軽鎖導入遺伝子を含有する。内因性マウス重鎖および軽鎖遺伝子もまた、マウスの免疫化がマウス免疫グロブリンよりはむしろヒト免疫グロブリンの生産に導くように、KMマウスにおいて破壊されている。KMマウスの構築、およびヒト免疫グロブリンを生起させるためのそれらの使用はWO 02/43478に詳細に記載されている。
これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、周知の技術に従って、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生じさせることができる。そのようなトランスジェニック哺乳動物は、本発明で用いるのに適した抗体の発現についてコードする操作可能な核酸配列を含む哺乳動物、一つまたは複数のそのような核酸配列で安定にトランスフェクトされた哺乳動物等は、本発明のさらなる特徴である。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、対象となる免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックであるもう1つの非ヒト哺乳動物または植物の生成、およびそれらからの回収可能な形態の抗体の生産を通じてトランスジェニック的に生じさせることもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック生産との関連で、抗体をヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳において生産することができ、およびそれから回収することができる。例えば、米国特許第5827690号、米国特許第5756687号、米国特許第5750172号および米国特許第5741957号参照。
さらに、本発明のヒト抗体または他の種からの本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて、限定されることなく、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の技術を含むディスプレイタイプの技術を介して生成させることができ、そのような技術は当技術分野において周知のように、得られた分子はアフィニティー成熟のようなさらなる成熟に供することができる（例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381（1991）（ファージディスプレイ）, Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309（1996）（ファージディスプレイ）、Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942（1997）（リボソームディスプレイ）、Parmley and Smith, Gene 73, 305-318（1988）（ファージディスプレイ）、Scott TIBS 17, 241-245（1992）, Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382（1990）, Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085（1993）, Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68（1992）, Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84（1992）、および米国特許第5,733,743号参照）。ディスプレイ技術を利用してヒトでない抗体を生産するならば、そのような抗体は、例えば、本明細書において他の箇所で記載するようにヒト化することができる。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、本明細書において、「組換えヒト抗体」であり、（a）（本明細書においてさらに他の箇所で記載される）トランスジェニックであるか、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランス染色体である（マウスのような）動物、またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（b）トランスフェクトーマからのように、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（c）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（d）他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むいずれかの他の手段によって調製され、発現され、創生され、または単離された抗体のような組換え手段によって調製され、発現され、創生され、または単離される全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様においては、そのような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異誘発（または、ヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物を用いる場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VHおよびVL配列に由来し、かつそれに関連する配列であり、天然では、インビボにてヒト抗体生殖系レパートリー内に存在しない。
ヒト化抗体は非ヒト種に由来する抗体であり、フレームワーク、ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインにおけるあるアミノ酸は、ヒトにおける免疫応答を回避し、またはそれを無くするように突然変異されている。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFv断片領域（FR）残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体において、またはドナー抗体において見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに磨くためになされる。一般には、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫ブロブリン配列のそれである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細は、Jones et al., Nature 321, 522-525（1986）, Riechmann et al., Nature 332, 323-329（1988）およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596（1992）参照。本発明に従って用いるのに適したヒト化モノクローナル抗体が、ヒト抗体からの定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合させることによって生じさせることができる。ヒト化抗体をどのようにして作成するかの例は、例えば、米国特許第6,054,297号、米国特許第5,886,152号および米国特許第5,877,293号に見出すことができる。ヒト化抗体は、動物-由来モノクローナル抗体よりもヒト免疫グロブリンに対してより大きな相同性を有するように設計される。「輸入」（動物）可変ドメインからの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には、ヒト「骨格」にトランスフェクトされる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類相補性決定領域（「CDR」）またはCDR配列で置き換えることによって、Winterおよび共同研究者の方法（Jones et al., Nature 321, 522-525（1986）, Riechmann et al., Nature 332, 323-327（1988）, Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536（1988））に従って実質的に行うことができる。
用語「キメラ抗体」とは、1つの抗体からの一つまたは複数の領域、および一つまたは複数の他の抗体からの一つまたは複数の領域を含有する抗体をいう。二価キメラ抗体は、少なくとも1つのジスルフィド架橋を通じて会合した2つのHLダイマーによって形成されたテトラマー（H2L2）である。典型的には、キメラ抗体とは、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、またはそれに相同であり、他方、鎖の残りは、もう1つの種に由来する、またはもう1つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一であるか、またはそれに相同である抗体、ならびにそれが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片をいう（例えば、米国特許第4,816,567号およびMorrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855（1984）参照）。キメラ抗体は当技術分野において周知の組換えプロセスによって生産される（例えば、Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277（1984）, Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855（1984）, Boulianne et al., Nature 312, 643-646（1984）, EP125023, Neuberger et al., Nature 314, 268-270（1985）, EP171496, EP173494, WO86/01533, EP184187, Sahagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074（1986）, WO87/02671, Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443（1987）, Sun et al., PNAS USA 84, 214-218（1987）, Better et al., Science 240, 1041-1043（1988） and Harlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., （1988）参照）。また、キメラ免疫ブロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は当技術分野において公知である（例えば、Liu et al., PNAS USA 84, 3439（1987）およびJ. Immunol. 139, 3521（1987）参照）。mRNAが抗体を生産するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、cDNAを生じさせるのに用いられる。対象となるcDNAは、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応によって増幅させることができる（米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号）。あるいは、ライブラリーを作成し、それをスクリーニングして、対象となる配列を単離する。次いで、抗体の可変領域をコードするDNA配列をヒト定常領域配列に融合させる。ヒト定常領域（ならびに可変領域）の配列はKabat et al., （1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H.公開番号91-3242に見出すことができ、より最近の関連するデータはhttp：//www.biochem.ucl.ac.uk/〜martin/abs/GeneralInfo.htmlにアクセスすることができる。イソタイプの選択は、典型的には、補体固定、または抗体依存性細胞傷害性における活性のような所望のエフェクター機能によってガイドされる。例示的なイソタイプはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域、κまたはλのいずれも用いることができる。次いで、従来の方法によって、キメラヒト化抗体を発現させることができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、ヒトリンパ球に由来するmRNAから調製されたヒトVLおよびVH cDNAで作成することができるscFvファージディスプレイライブラリーのような組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから回収することができ、またはそれから回収された抗体に由来することができる。そのようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作り出すための多数の市販されているキットがある。また、抗体ディスプレイライブラリーを作り出し、それをスクリーニングするのに用いることができる他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第5,223,409号、WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/010147、WO 92/09690、Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372（1991）, Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3,81-85（1992）, Huse et al., Science 246, 1275-1281（1989）, McCafferty et al., Nature 348, 552-554（1990）, Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734（1993）, Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896（1992）, Clackson et al., Nature 352, 624-628（1991）, Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580（1992）, Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377（1991）, Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19, 4133-4137（1991）およびBarbas et al., PNAS USA 88, 7978-7982（1991参照）。適当なVLおよびVH核酸配列は、いずれかの適当な方法を用いて選択することができる。例えば、VLおよびVH核酸は、WO 93/06213に記載されたエピトープインプリンティング方法を使用することによって選択することができる。scFvライブラリーのような抗体ライブラリーは、例えば、WO 92/01047、McCafferty et al., Nature 348, 552-554（1990）およびGriffiths et al., EMBO J 12, 725-734（1993）に記載されたもののような公知かつ適当な方法を用いて調製し、スクリーニングすることができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体の質および/または多様性をさらに改良するには、VL/VH対のVLおよびVHセグメントは、天然免疫応答の間における抗体の親和性成熟化を担うインビボ体細胞成熟プロセスと類似のプロセスにて、例えばVHおよび/またはVLのCDR3領域内でランダムに突然変異させることができる。このインビトロ親和性成熟化は、各々、VH CDR3またはVL CDR3に対して相補的なPCRプライマーを用いてVHおよびVL領域を増幅させることによって達成することができ、そのプライマーは、典型的には、得られたPCR産物が、その中にランダム突然変異がVHおよび/またはVL CRD3領域に導入されたVHおよびVLセグメントをコードするように、ある位置において4つのヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」される。これらのランダムに突然変異されたVHおよびVLセグメントは、問題とする標的自己抗原に対する結合について再度スクリーニングすることができる。
スクリーニングに続いて、選択された抗体をコードする核酸は（例えば、ファージゲノムからの）ディプレイパッケージから回収し、標準的な組換えDNA技術によって適当なベクターにサブクローンすることができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換え抗体を発現させるためには、典型的には、抗体をコードする配列を含む核酸を組換え発現ベクターにクローン化し、核酸の発現および抗体の生産に適した条件下で、適当な宿主細胞（哺乳動物細胞、酵母細胞など）に導入される。
ヒト一本鎖Fv（scFv）およびFab抗体断片のような高親和性抗体ペプチドは、対象となる抗原がマイクロタイタープレートまたはビーズのような固体表面に固定化されたパニング技術を用いてそのようなライブラリーから単離することもできる（例えば、Barbas and Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234（1996） and Aujame et al., Hum. Antibodies 8, 155-68（1997）参照）。大きなナイーブライブラリーのファージディプレイもまた、免疫化なくして直接的にヒト抗体を単離することを可能とする（例えば、de Haard et al., J. Biol. Chem. 274（26）, 18218-18230（1999）参照）。
本発明に従って用いるのに適した抗体は変種抗体であってもよい。「変種」抗体は、CDRまたは他のVHおよび/またはVL配列において、置換、欠失、挿入、または末端配列付加である一つまたは複数の適当なアミノ酸残基改変によって親抗体とは異なる抗体である（但し、親抗体のエピトープ結合特徴の少なくとも相当量は、そのような変化によって改良されなかったとしても保持されるものとする）。
抗体変種における変形は、単一変種抗体におけるフレームワーク領域、定常ドメイン、および/または可変領域（またはそのいずれか一つまたは複数のCDR）の各々においてなすことができる。あるいは、変形は、抗体におけるフレームワーク領域、可変領域（またはその単一CDR）、または定常ドメインの1つのみにおいてなすことができる。Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085（1989）によって記載されているようなアラニン走査突然変異誘発技術を用いて、変種VL、VH、または特別なCDR配列を含む本発明に従って用いるのに適した抗体を作り出すことにおいて置換または欠失のための適当な残基を同定することができるが、他の適当な突然変異誘発技術を適用することもできる。多数のアミノ酸置換をなすことができ、Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241, 53-57（1988）またはBowie and Sauer, PNAS USA 86, 2152-2156（1989）によって記載されたもののような突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いてテストすることもできる。
したがって、例えば、抗体変種において、一つまたは複数のアミノ酸残基を、一つまたは複数のCDRにおけるような親抗体の一つまたは複数の超可変領域に、またはそれに隣接して導入し、または挿入することができる。本発明に従って用いるのに適した抗体の変種は、いずれかの数の挿入されたアミノ酸残基を含むことができ、但し、再度、親抗体のエピトープ結合特徴の少なくとも相当量は保持されるものとする。そのような抗体変種は、例えば、約1〜30の挿入されたアミノ酸残基、例えば約2〜10のような約1〜10、例えば約1〜5の挿入されたアミノ酸残基のような2〜5の残基を含むことができる。同様に、そのような抗体変種は、例えば約1〜30の欠失されたアミノ酸残基、例えば約2〜10のような約1〜10、例えば約1〜5の欠失されたアミノ酸残基のような2〜5の残基を含むことができる。同様に、そのような抗体変種は、例えば、約1〜30の置換されたアミノ酸残基、例えば約2〜10のような約1〜10のような、例えば約1〜5の置換されたアミノ酸残基のような2〜5の残基を含むことができる。同様に、そのような抗体変種は、例えば、約1〜30の末端配列アミノ酸残基付加、例えば約2〜10のような約1〜10、例えば1〜5の末端配列アミノ酸残基付加のような2〜5の付加を含むことができる。そのような抗体変種は、2以上のそのような挿入、欠失、置換および末端配列アミノ酸残基付加の組合せを含むことができ、但し、変種は問題とする標的エピトープに対する親抗体の親和性、特異性、および/または選択性の少なくとも実質的割合を保有するものとする。
典型的には、保存的置換変形のようなアミノ酸配列改変は親配列の構造的特徴を望ましくは実質的には変化させないものとする（例えば、置換アミノ酸は親配列の機能を特徴付ける二次的構造を破壊する傾向がないべきである）。当技術分野において認められたポリペプチドの二次的および三次的構造の例は、例えば、Proteins, Strucutures and Molecular Principles（Creighton, Ed., W.H.Freeman and Company, New York（1984））, Introduction to protein Structure（C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.（1991））およびThornton et al., Nature 354, 105（1991）に記載されている。ペプチド変種の設計および構築に関するさらなる原理は、例えば、Collinet et al., J Biol Chem 275（23）, 17428-33（2000）に議論されている。
抗体のアミノ酸配列変種は、適当なヌクレオチド変化を（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）抗体コーディング核酸に導入することによって、または化学的ペプチド合成によって得ることができる。そのような変種は、例えば、本明細書において実施例の抗体のアミノ酸配列内にある残基からの欠失、および/またはそれへの挿入および/またはその置換、および/またはその末端配列付加を含む。欠失、挿入、および置換のいずれの組合せも所望の変種に到達させることができ、但し、変種は親抗体のエピトープ結合特徴の少なくとも実質的割合を保有するものとする。親抗体に関して、アミノ酸配列の変化は、グリコシル化部位の数または位置を変換させるなどのような親抗体に関する変種抗体の翻訳後プロセスを改変することができる。
本発明の変種抗体は、CDRにおけるような超可変領域における改変を含むことができる。そのようなCDR変種を含む本発明に従って用いるのに適した抗体の例は本明細書において他の箇所に記載されている。
本発明に従って用いるのに適した変種抗体は、例えば、Fc領域において超可変領域の外部にあるフレームワーク（FR）改変を含むことができ、その改変は抗体の機能的または薬物動態特性の変換のような有利な特性を伴うことができる。例えば、フレームワーク領域または定常ドメインにおける置換または他の修飾（挿入、欠失、末端配列付加、またはいずれかのその組合せ）は、親抗体に関する変種抗体の半減期の増大を伴うことができ、または親抗体に関する変種抗体の免疫原性を改変させて、もう1つの分子への共有または非共有結合のための部位を提供し、または補体固定としてのそのような特性を改変することができ、例えば、C1q結合およびCDC、またはFcgR結合、および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）の減少をもたらす。FcR1に結合する抗体の能力を改変し、それにより、今度は補体を固定する抗体の能力を減少させるC1qに結合する抗体の能力を減少させるCH2ドメインのN末端領域において突然変異を有する抗体を開示するWO 94/29351を参照することができる。
抗体のインビボ半減期は、分子が無傷CH2ドメインまたは無傷Ig Fc領域を含まないように、Ig定常ドメインまたはIg様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを修飾することによって改良することもできる。米国特許第6,121,022号および米国特許第6,194,551号参照。インビボ半減期は、さらに、Fc領域において突然変異を行うことによって、例えば、位置252におけるロイシンに代えてスレオニンで置換し、位置254におけるセリンに変えてスレオニンで置換することによって、または位置256におけるフェニルアラニンに代えてスレオニンで置換することによって増加させることができる。米国特許第6,277,375号参照。
1つの態様において、本発明は、本発明に従って用いるのに適した変種抗体を提供し、抗体における潜在的T細胞エピトープは合理的な設計を介して低下されるか、または無くされている。脱免疫化抗体の設計および構築は、いずれかの適当な公知の技術によって達成することができる（例えば、脱免疫化抗体を調製するための方法に関するWO 9852976参照）。ヒトにおける免疫原性は、そのような変種抗体を用いる場合に、無くされるか、または実質的に低下すると予測される。
他のフレームワーク突然変異は、タンパク質分解に対する感受性を低下させ、酸化に対する感受性を低下させ、および/または関連変種抗体について他の物理化学的または機能的特性を付与し、またはそれを修飾することができる配列変化を含むことができる。
フレームワークにおけるアミノ酸配列変形は、親抗体に対して変種抗体における改変されたグリコシル化パターンをもたらすこともできる。改変するとは、親抗体で見出される一つまたは複数の炭水化物部分を欠失すること、および/または親抗体に存在しない一つまたは複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合またはO結合いずれかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。Xがプロリンを除くいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付着のための共通する認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的グリコシル化部位を作り出すことができる。O結合グリコシル化とは、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのような糖のヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンを用いることもできる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、便宜には、それが（N結合グリコシル化部位のための）前記したトリペプチド配列の一つまたは複数を含有するように、アミノ酸配列を改変することによって達成することができる。改変は、（O結合グリコシル化部位のための）元来の抗体の配列への一つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれによる置換によってなすこともできる。
抗体は、Fcの位置297におけるAsnへ付着された炭水化物に通常は付着されたフコース単位を付加しないトランスフェクトーマで発現させて、今度は、NK細胞の存在下で抗体の増大したADCCをもたらすFcgRIIIに対するFcの親和性を増強させることもできる。Shield et al., J. Biol. Chem. 277, 26733（2002）参照。さらに、ガラクトシル化の修飾を行って、CDCを修飾することができる。さらに、改変されたグリコ形態および改良されたADCC活性を有するモノクローナル抗体の発現をもたらす、GntIIIを発現するように作製されたCHO細胞系を開示するWO 99/54342およびUmana et al., Nat. Biotechnol. 17, 176（1999）を参照することができる。
CDR変種を作り出すのに公知の多数の技術があり、そのいずれかの適当な技術、または組合せを、実施例の抗体のCDRのCDR変種を作りだすために本発明との関係で用いることができる。そのような技術の例は、Studnicka et al., Protein Engineering 7, 805-814（1994）に記載された非必須残基の除去（また、Soderlind et al., Immunotechnology, 4（3-4）, 279-85（1999）参照）。CDRウォーキング突然変異誘発および他の人工的親和性突然変異技術（例えば、Yang et al., Journal of Molecular Biology 254（3）, 392-403（1995）参照）、典型的には、CDRが、合成オリゴヌクレオチドを任意で含む遺伝子鋳型の多用な組から増幅され、VL、VHおよび/またはCDRの定常領域が増幅され、および種々の断片が（一本鎖または二本鎖様式で）混合され、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）によって組み立てられて、マスターフレームワークに導入されたシャッフルドCDRを運ぶ遺伝子産物をコードする抗体断片の組を生じ、これは、挿入された制限部位を越える部位へアニーリングする外部プライマーを用いて増幅されて、全長産物の生産を確実とし、これは選択されたベクターに挿入され、これを用いて変種CDR含有タンパク質を発現するCDRシャッフリング技術を含む。適当な構造は、例えば、NMR溶液構造の比較による、変種/ミメティック構造および親配列の構造の重ね合わせによって決定することができる。CDR配列変種の合理的な設計のための有用な方法は、例えば、WO 91/09967およびWO 93/16184に記載されている。抗体を調製するための他の潜在的に適当な技術はCDRウォーキング突然変異誘発、抗体鎖シャッフリング、「節減突然変異誘発」（Balint and Larrick, Gene 137, 109-118（1993））、および他の親和性成熟化技術（例えば、Wu et al., PNAS USA 95, 6037-42（1998）参照）を含む。レパートリークローニング手法もまた、変種抗体の生産で有用である（例えば、WO 96/33279参照）。そのような方法のさらなる例は本明細書において他の箇所で提供される。
本発明に従って用いるのに適した抗体は一本鎖抗体を含むこともできる。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖Fv領域が、例えば、本発明に従って用いるのに適した抗体のFvにおける重鎖および軽鎖を、単一ペプチド鎖における（典型的には、約10、12、15以上のアミノ酸残基の）柔軟なペプチドリンカーと連結することによって結合されるペプチドである。そのような抗体を生産する方法は、例えば、米国特許第4,946,778号、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315（1994）, Bird et al., Science 242,423-426（1988）, Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883（1988）およびMcCafferty et al., Nature 348, 552-554（1990）に記載されている。一本鎖抗体は、単一のVHおよびVLのみを用いるのであれば一価であり得；2つのVHおよびVLを用いるのであれば二価であり；あるいは2より多いVHおよびVLを用いるのであれば多価であり得る。
本発明に従って用いるのに適した抗体は一つまたは複数のさらなる機能的分子、例えば、（Fab’断片のような）もう1つのペプチドまたはタンパク質に誘導体化し、または連結させて、多数の結合部位または標的エピトープに結合する多特異的分子を作り出すことができる。例えば、本発明の抗体は、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合その他によって）もう1つの抗体、ペプチドまたは結合ミメティックのような一つまたは複数の他の結合分子に機能的に連結させることができる。
1つの態様において、本発明の多特異的分子は、結合特異性として、例えば、Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、またはscFvを含む少なくとも1つのさらなる抗体を含む。さらなる抗体は、米国特許第4,946,778号においてLadner et al.によって記載されたような軽鎖または重鎖ダイマー、あるいはFvまたは一本鎖構築体のようなそのいずれかの最小断片であってもよい。抗体はUS 2003/0118592およびUS 2003/0133939に開示されたような結合-ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。
本発明に従って用いるのに適した抗体は抗体誘導体も含む。抗体誘導体は、放射性同位体、タンパク質、または他の剤/部分/化合物を、抗体またはそのサブユニット（例えば、抗体H鎖、L鎖、またはその標的特異的/選択的断片）のN末端側またはC末端側に、適当な置換基または側鎖に、または抗体における糖鎖に化学的にコンジュゲートさせることによって生産することができる（例えば、Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan（1994）参照）。誘導体は、適切であれば、内部側鎖または糖におけるコンジュゲーションによって作り出すこともできる。
抗体誘導体は、例えば、抗体のアミノ酸残基の一つまたは複数が（例えば、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって）化学的に修飾されている、または一つまたは複数の異種置換基（例えば、親油性置換基、PEG部分、適当な有機部分リンカーによって連結されたペプチド側鎖など）と共有結合している抗体であり得る。一般に、本発明で用いるのに適した本明細書において記載された抗体は、いずれかの適当な数のそのような修飾されたアミノ酸を含めること、および/またはそのようなコンジュゲートされた置換基との会合によって修飾することができる。この関係での適合性は、一般には、非誘導体化親抗体と関連する選択性、特異性および/または他の抗体特異的機能性を少なくとも実質的に保留する能力によって決定する。一つまたは複数の修飾されたアミノ酸を含めることは、例えば、ポリペプチド血清半減期を増大させ、ポリペプチド抗原性を低下させ、またはポリペプチド貯蔵安定性を増加させることにおいて有利であり得る。アミノ酸は、例えば、（例えば、哺乳動物細胞における発現の間のN-X-S/TモチーフにおけるN結合グリコシル化によって）組換え生産の間に共翻訳的にまたは翻訳後に修飾され、あるいは合成手段によって修飾される。修飾されたアミノ酸の非限定的例はグリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化またはゲラニルゲラニル化された）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、ホスホリル化アミノ酸などを含む。アミノ酸の修飾において当業者をガイドするのに適切な参照は文献全体を通じて豊富である。例としてのプロトコルはWalker（1998）Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ.に見出される。修飾されたアミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、または有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択することができる。
例えば、抗体は、ポリマーへの共有結合コンジュゲーションによって化学的に修飾して、例えば、それらの循環半減期を増大させることができる。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、例えば米国特許第4766106号、米国特許第4179337号、米国特許第4495285号および米国特許第4609546号に示されている。さらなる説明的なポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）を含む（例えば、約2000〜約20,000のような約1,000〜約40,000の間の、例えば、約3,000〜12,000の分子量を有するPEG）。
「エフェクター機能が欠乏した抗体」または「エフェクター機能欠乏抗体」とは、補体活性化またはFc受容体結合のような一つまたは複数のエフェクターメカニズムを活性化する有意に低下した能力を有する、またはその能力を有しない抗体をいう。したがって、エフェクター機能欠乏抗体は、補体依存性細胞傷害性（CDC）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ADCC）を媒介する有意に低下した能力を有し、またはその能力を有しない。そのような抗体の例はIgG4である。
「補体活性化が欠乏した抗体」または「補体活性化欠乏抗体」は、例えば、古典的補体系の第一の成分（C1q）に結合する能力の欠如によって、またはC3活性化の欠如のような補体系の他の成分に結合し、またはそれを活性化する能力の欠如によって、インビボで補体を活性化する有意に低下した能力を有し、またはその能力を有しない抗体である。
このエフェクター機能欠乏は問題とする抗体の固有の特徴であり得る。抗体は、例えば、例としてIgG2またはIgG4イソタイプのようなインビボで補体を活性化することができないイソタイプであり得る。エフェクター機能の活性化の欠乏はフレームワーク突然変異によっても導入でき、これは、例えば、本明細書において他の箇所で記載されたように補体を固定する抗体の能力を減少させる。
本発明の好ましい態様において、エフェクター機能欠乏抗体はIgG4抗体である。さらなる態様において、抗体は、例えば、Reddy et al. （2000）J. Immunol. 164：1925-33に記載された残基置換のため、野生型IgG4と比較してなおさらに低下したFc受容体結合活性を有する変種IgG4抗体である。もう1つの態様においてエフェクター機能欠乏抗体は、エフェクター機能を媒介する抗体の定常領域において一つまたは複数の突然変異を含有する変種IgG1、IgG2またはIgG3である。
エフェクター機能を活性化する所与の抗体の能力のなさは、例えば、便宜には、補体活性化について、本明細書の実施例4に記載されたアッセイを用いることによって決定することができる。補体を活性化する所与の抗体の能力を決定する他の方法は当業者に公知である。その例は、Current Protocols in Immunology, Eds, Coligan et al., John Wiley ＆ Sons Inc.に見出すことができる。
1つの態様において、補体を活性化する補体活性化欠乏抗体の能力または能力の欠如を、（本明細書において他の箇所に記載された）IgG1-637、または補体をIgG1-637とほぼ同程度まで活性化するもう1つのIgG1抗体の能力と比較する。1つの態様において、補体活性化欠乏抗体の補体活性化はIgG1抗体の補体活性化の25％未満、例えば、75％未満のような50％未満、例えば、95％未満のような90％未満、例えば、99％未満である。
1つの態様において、補体を活性化する補体活性化欠乏抗体の能力または能力の欠如は、C1q結合を測定することによって決定される。C1qに結合する補体活性化欠乏抗体の能力または能力の欠如を、（本明細書において他の箇所に記載された）IgG1-637、またはIgG1-637とほぼ同程度まで補体を活性化して、C1qに結合するもう1つのIgG1の能力と比較する。1つの態様において、補体活性化欠乏抗体のC1q欠乏は、IgG1抗体のC1q結合の25％未満、例えば、75％未満のような50％未満、例えば、95％未満、例えば99％未満のような、90％未満である。
多価抗体は、問題とする標的自己抗原に対する1より多い同一の結合特異性を含む抗体である（二価抗体は2つのそのような結合特異性を含む）。古典的な例は典型的な二価免疫グロブリン分子である。
したがって、本明細書において議論は全免疫グロブリン分子としての抗体に焦点を当てることができるが、多価抗体の態様および特徴は、F（ab）2およびF（ab’）2断片のような抗体断片、ならびにscFvペプチド、抗体様ペプチド（CDRを含むペプチド）および二および多特異的抗体に同等に適用することができると理解されるべきであり、ただし、これらは対応する完全な抗体の抗原結合特性の少なくとも実質的な割合を保有するものとし、およびこれらは多価であるものとする。場合によっては、抗体断片はより低い抗原結合親和性を伴うことができるが、親和性におけるいずれのそのような喪失に対しても相殺することができる他の有利な特徴を供することができる。
1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体は二価抗体である。
1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体は、標的自己抗原の活性を変調することができる。そのような変調は、例えば、Ludwig et al, Oncogene 22, 9097（2003）に記載されているように、例えば、発現の変調、抗原の下方変調、抗原の内部化、抗原異化、抗原架橋結合、および/または細胞シグナリングの変調として記載することができる。AChRのそのような変調を決定する例は実施例5に記載されている。
もう1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体は、例えば、内因性免疫グロブリンとのインビボ交換のため、標的自己抗原の活性を変調することができず、あるいはインビボにて標的自己抗原の活性を少なくとも変調することができない。
標的抗原への結合についての、エフェクター機能欠乏抗体、および抗体媒介エフェクター機能-自己免疫疾患または傷害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体の間の競合の存在は、当業者に公知の多数の方法において、例えば、ELISAアッセイにおいて決定することができる。
本発明との関係での競合とは、エフェクター機能欠乏抗体の存在下において標的抗原に結合する自己抗体についての特性のいずれの検出可能な有意な低下もいう。典型的には、競合は、エフェクター機能欠乏抗体の存在下における、自己抗体および標的抗原の間の結合の、少なくとも約15％のような少なくとも約10％、例えば、少なくとも約25％のような少なくとも約20％、例えば、少なくとも約35％のような少なくとも約30％、例えば、少なくとも約45％のような少なくとも約40％、例えば、少なくとも約55％のような少なくとも約50％、例えば、少なくとも約65％のような少なくとも約60％、例えば、少なくとも約75％のような少なくとも約70％、例えば、少なくとも約85％のような少なくとも約80％、例えば、少なくとも約95％のような少なくとも約90％、例えば、少なくとも約99％の低下を意味する。
競合の評価は、典型的には、第一の分子の第一の量；第二の分子の第二の量；および第三の分子の第三の量を用いる相対的阻害結合の評価（または、現実の一時的なデータに対する代わりとしての第一および第二の分子に対する新しい結合データと合理的に比較することができる結合実験によって決定された標準）を含み、第一、第二、および第三の量は、全て、他の本分子に関する問題とする分子の選択性および/または特異性についての情報を与える比較を行うのに十分なものである。第一、第二、および第三の量は関係する抗体および標的の性質に伴って変化し得る。通常、ELISA評価のためには、競合が存在するか否かを評価するのに約5〜50μg（例えば、約10〜50μg、約20〜50μg、約5〜20μg、約10〜20μgなど）の抗体および/または標的が必要である。条件は結合にも適すべきである。典型的には、生理学的または生理学的に近い条件（例えば、約20〜40℃の温度、約7〜8のpHなど）が抗体抗原結合に適する。
しばしば、競合は、ELISA分析によって決定して約5％よりも有意に大きな相対的阻害によって特徴付けられる。従って、例えば、少なくとも約10％の相対的阻害が検出され；少なくとも約15％の相対的阻害が検出され；または少なくとも約20％の相対的阻害がエフェクター機能欠乏抗体の前で検出され、および一つまたは複数の自己抗体が十分に競合的であると考えられる競合性に対する基準を設定するのが可能である。エフェクター機能欠乏抗体および自己抗体についてのエピトープが抗原において近くに位置し、および本明細書において他の箇所に記載されたように、この場合には、エフェクター機能欠乏抗体および自己抗体が同一のエピトープに結合する場合には、競合は標的抗原に対する自己抗体結合の約40％を超える相対的阻害（例えば、少なくとも約50％阻害のような少なくとも約45％阻害、例えば、少なくとも約60％阻害のような少なくとも約55％阻害、例えば、少なくとも約70％阻害のような少なくとも約65％阻害、例えば、少なくとも約80％阻害のような少なくとも約75％阻害、例えば、少なくとも約90％阻害のような少なくとも約85％阻害、例えば、少なくとも約95％阻害、またはより高いレベルの相対的阻害）によって特徴付けることができる。
競合阻害を測定するためのさらなる方法は、例えば、Harlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., （1992, 1993）,およびMuller, Meth. Enzymol. 92,589-601（1983）に見出すことができる。
以下は、本発明の選択されたさらなる態様のリストである。
態様55：
主要な態様において、本発明は、対象における抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物の調製ための抗体の使用に関し、抗体は標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、および抗体は軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、IgG1サブタイプの場合には、定常（CL）領域のアミノ配列は、それが、Igの定常（CL）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有結合の形成に参画することができるいずれのアミノ酸も含有しないように修飾されており、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびヒトIgの定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、定常（CH）領域のアミノ酸配列は、ヒンジ領域および、Igサブタイプによる要求に応じ、CH3領域のようなCH領域の他の領域が、ヒトIgの定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合または共有または非共有重鎖間結合の形成に参画するいずれのアミノ酸残基も含有しないように修飾されている。
態様56:ヒトIgがIgG1、IgG2またはIgG4抗体のようなIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgGA抗体である、態様55記載の使用。
態様57：対象における抗体媒介自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物の調製のための抗体の使用、抗体は標的自己抗原への結合について、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合することができ、および抗体は軽鎖および重鎖を含む一価抗体であり、
a）軽鎖は、選択された抗原特異的抗体の可変（VL）領域のアミノ酸配列、およびIgの定常（CL）領域のアミノ酸配列を含み、および
b）重鎖は選択された抗原特異的抗体の可変（VH）領域のアミノ酸配列、およびIgG4の定常（CH）領域のアミノ酸配列を含み、重鎖のアミノ酸配列は、ヒンジ領域に対応する領域に存在するいずれのアミノ酸残基もヒトIgG4の定常（CH）領域の同一アミノ酸配列を含む他のペプチドとのジスルフィド結合の形成に参画できないように修飾されている。
態様58：CL領域がヒトIgGのκ軽鎖の定常領域である、態様55〜57のいずれか記載の使用。
態様59：CL領域がヒトIgGのλ軽鎖の定常領域である、態様55〜58いずれかの記載の使用。
態様60：軽鎖および重鎖が一つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に結合している、態様55〜59いずれかの記載の使用。
態様61：軽鎖および重鎖がアミド結合を介して相互に結合している、態様55〜60いずれかの記載の使用。
態様62：重鎖のアミノ酸配列が、ヒンジ領域に対応する領域がいずれのシステイン残基を含まないように修飾されている、態様55〜61のいずれか記載の使用。
態様63：重鎖のアミノ酸配列が、いずれのシステイン残基も含むヒンジ領域に対応する領域のアミノ酸残基の少なくとも一つが欠失され、および/または他のアミノ酸残基で置換されているように修飾されている、態様55〜62のいずれか記載の使用。
態様64：ヒンジ領域のシステイン残基が、非荷電極性側鎖、または非極性側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、態様55〜63いずれかの記載の使用。
態様65：非荷電極性側鎖を有するアミノ酸が、独立して、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファンから選択され、および非極性側鎖を有するアミノ酸が、独立して、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンから選択される、態様64記載の使用。
態様66：重鎖のアミノ酸配列が、重鎖がCH領域を含むように修飾されており、SEQ ID NO:19の配列のアミノ酸106および109に対応するアミノ酸が欠失されている、態様65記載の使用。
態様67：重鎖のアミノ酸配列が、重鎖がIgG4 CH領域を含むように修飾されており、SEQ ID NO:19の配列のアミノ酸残基106〜109に対応する少なくともアミノ酸残基が欠失されている、態様63または態様66記載の使用。
態様68：重鎖のアミノ酸配列が、重鎖がIgG4 CH領域を含むように修飾されており、SEQ ID NO:19の配列のアミノ酸残基99〜110に対応する少なくともアミノ酸残基が欠失されている、態様63〜67いずれかの記載の使用。
態様69：全ヒンジ領域が欠失されている、態様63〜68のいずれか記載の使用。
態様70：重鎖がSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む態様63〜69いずれかの記載の使用。
態様71：重鎖のアミノ酸配列が、重鎖がIgG4 CH領域を含むように修飾されており、SEQ ID NO:19の配列のアミノ酸残基106および109に対応するアミノ酸残基がシステインとは異なるアミノ酸残基で置換されている、態様63記載の使用。
態様72：重鎖のアミノ酸配列が、重鎖がCH領域を含むように修飾されており、SEQ ID NO:19の配列のアミノ酸残基106および109に対応するアミノ酸残基の一つが、態様67または68に開示されたアミノ酸残基のようなシステインとは異なるアミノ酸残基で置換されており、およびSEQ ID NO:19の配列のアミノ酸残基106および109に対応するアミノ酸残基の他方が欠失されている、態様63の記載の使用。
態様73：アミノ酸残基106に対応するアミノ酸残基が態様64または65に開示されたアミノ酸残基のようなシステインとは異なるアミノ酸残基で置換されており、アミノ酸残基109に対応するアミノ酸残基は欠失されている、態様72記載の使用。
態様74：アミノ酸残基106に対応するアミノ酸残基が欠失されており、およびアミノ酸残基109に対応するアミノ酸残基が態様64または65に開示されたアミノ酸残基のようなシステインとは異なるアミノ酸残基で置換されている、態様72記載の使用。
態様75：その一価抗体が、kg当たり4mgの用量にてインビボで投与される場合に7日より多く、10μg/mlを超える血漿濃度を有する、態様55〜74のいずれか記載の使用。
態様76：一価抗体が、kg当たり4mgの用量にてSCIDマウスにおいてインビボで投与された場合に7日より多く、10μg/mlを超える血漿濃度を有する、態様75記載の使用。
態様77：その一価抗体が、F（ab’）2断片の血漿クリアランスよりも10倍より多く遅い血漿クリアランスを有する、態様55〜76のいずれか記載の使用。
態様78：F（ab’）2断片の配列が一価抗体の対応する領域に配列と同一である、態様77記載の使用。
態様79：血漿クリアランスがSCIDマウスを用いて測定される、態様77記載の使用。
態様80：F（ab’）2断片のVH領域およびVL領域が一価抗体のVH領域およびVL領域と同一である、態様79記載の使用。
態様81：一価抗体がインビボで投与した場合に少なくとも5日の半減期を有する、態様55〜80のいずれか記載の使用。
態様82：一価抗体が少なくとも14日の半減期を有する、態様55〜80いずれか1記載の使用。
態様83：一価抗体が少なくとも21日の半減期を有する、態様55〜80いずれか1記載の使用。
態様84：一価抗体がSCIDマウスにおいてインビボで投与した場合に少なくとも5日の半減期を有する、態様81記載の使用。
態様85：抗体がFcRnに結合することができる、態様55〜84のいずれか記載の使用。
態様86：一価抗体が、標的分子に結合した場合に、標的分子の多量体化および/または凝集を阻害する、態様55〜85のいずれか記載の使用。
態様87：一価抗体がポリクローナルヒトIgGの存在下で一価形態である、態様55〜86のいずれか記載の使用。
態様88：一価抗体がヒトに投与された場合に一価形態である、態様55〜86のいずれか記載の使用。
態様89：一価抗体がポリクローナルヒトIgGの存在下で一価形態に解離する、態様55〜86のいずれか記載の使用。
態様90：一価抗体がヒトに投与された場合に一価形態に解離する、態様55〜86のいずれか記載の使用。
態様91：一価抗体の重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の、各々、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様55〜90のいずれか記載の使用。
態様92：一価抗体がヒト抗体である、態様55〜91のいずれか記載の使用。
態様93：抗体媒介自己免疫疾患または障害が重症筋無力症である、態様55〜92のいずれか記載の使用。
態様94：標的自己抗原が筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体である、態様55〜93のいずれか記載の使用。
態様95：一価抗体が抗-AChR Fab-637に由来する、態様55〜94のいずれか記載の使用。
態様96：エフェクター機能欠乏抗体の重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗-AChR Fab-637の、各々、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様55〜95のいずれか記載の使用。
態様97：一価抗体がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域を含む態様55〜96のいずれか記載の使用。
態様98：一価抗体がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するVL領域を含む態様55〜97のいずれか記載の使用。
前記態様で用いた一価抗体は標準的な組換えDNAおよび異種発現技術、例えば、本明細書において言及したものによって構築することができる。そのような抗体の構築は、参照により本明細書に組み入れられる、28-11-2006に出願された「Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof」と題されたPCT出願（Genmab）にも記載されている。
本発明の使用のさらなる態様において、エフェクター機能欠乏抗体は自己抗体の一つまたは複数と同一のエピトープに結合する。
用語「エピトープ」は抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖の分子の表面グループ分けよりなり、通常、特異的な三次元の構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。立体配座および非立体配座エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われる点で区別される。エピトープは、（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）結合に直接的に関与するアミノ酸残基、および効果的に抗体によってブロックされるアミノ酸残基のような結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基（換言すれば、アミノ酸残基は抗体のフットプリント内にある）を含むことができる。本発明の関係でのエピトープは、免疫グロブリンに対して特異的に結合することができる任意のペプチドまたはペプチド-誘導体決定基も含む。エピトープが任意の適当な位置、向き、アミノ酸組成（および結果的には、少なくとも部分的には、電荷）の、任意の適当な数のアミノ酸を含むことができる。したがって、例えば、エピトープは、標的抗原の一次配列に対して一つまたは複数の連続的または非連続的位置における、約3〜10のアミノ酸、典型的には3〜8アミノ酸から構成され得る（例えば、エピトープは標的抗原中の1、2、3、4または5の非連続的位置に分布した2、3、4、5、6、7または8のアミノ酸残基から実質的になることができる）。あるいは、例えば、エピトープは、標的抗原における約5〜40の連続アミノ酸残基（例えば、約7〜30アミノ酸残基、約5〜20のアミノ酸酸基、または約3〜15のアミノ酸残基）の領域によって規定されると考えることができる。いくつかのエピトープにおいて、丁度1つのアミノ酸残基、または数個のアミノ酸残基がCDRまたは複数のCDR認識に臨界的であることがあてはまるケースである（それにより、抗体抗原親和性および親和力に最も重要である）。そのようなものとして、エピトープは、他の残基はエピトープに対して幾分低い貢献をなすこともできるという認識で、そのような臨界的残基の一つまたは複数に基づいて特徴付けることができる。アミノ酸の領域によって規定されるエピトープの場合、領域における一つまたは複数のアミノ酸は、残基をエピトープの「喪失」をもたらすことなく適当な異なる残基での置換に供することができるように、抗体結合にほんのわずかな寄与、または無視できる程度の寄与をなす。
自己抗体によって結合されたエピトープは、標準的マッピングおよび特徴付け技術を介して同定することができ、そのさらなる改良はその多数の例が当業者に入手可能な任意の適当な技術によって同定することができる。そのようなマッピング/特徴付け方法の1つの例として、所与の自己抗体に対するエピトープは、標的抗原における露出したアミン/カルボキシルの化学的修飾を用いてエピトープ「フット-プリンティング」によって決定することができる。そのようなフット-プリンティング技術の1つの例はHXMS（マススペクトルメトリーによって検出された水素-ジュウーテリウム交換）の使用であり、受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素/ジューテリウム交換、結合、および戻し交換が起こり、タンパク質結合に参画する骨格アミド基は戻し交換から保護され、従って、ジューテリウム化されたままである。関連領域はペプチドタンパク質分解、速マイクロボア高性能液体クロマトグラフィー分離、および/または電子スプレイイオン化マススペクトルメトリーによってこの時点で同定することができる。例えば、Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol.267（2）252-259（1999）および/またはEngen, J.R. and Smith, D.L. （2001）Anal. Chem. 73, 256A-265A参照。適当なエピトープ同定技術のもう1つの例は核磁気共鳴エピトープマッピング（NMR）であり、典型的には、遊離抗原、および抗体のような抗原結合ペプチドで複合体化された抗原の二次元NMRスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、典型的には、抗原に対応するシグナルのみがNMR-スペクトルで観察され、抗原結合ペプチドからのシグナルは観察されないように、15Nで選択的に同位体で標識される。抗原結合ぺプチドとの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的には、遊離抗原のスペクトルと比較して複合体のスペクトルにおける位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのようにして同定することができる。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop. （44）, 149-67（2004）, Huang et al., Journal of Molecular Biology 281（1）, 61-67（1998）およびSaito and Patterson, Methods. 9（3）, 516-24（1996）参照。
エピトープマッピング/特徴付けは、マススペクトルメトリー方法を用いて行うこともできる。例えば、Downward, J Mass Spectrom. 35（4）, 493-503（2000）およびKiselar and Downard, Anal Chem. 71（9）, 1792-801（1999）参照。
プロテアーゼ消化技術もまた、エピトープマッピングおよび同定の関係で有用であり得る。抗原決定基関連領域/配列は、例えば、37℃およびpH7〜8における消化に際して標的抗原に対して約1：50の比率でトリプシンを用いることによるプロテアーゼ消化、続いての、ペプチド同定のためのマススペクトルメトリー（MS）分析によって決定することができる。抗体によるトリプシン切断から保護されたペプチドは、引き続いて、トリプシン消化に供された試料、および標的抗原と共にインキュベートされ、次いで、例えば、トリプシンによる消化に供された試料の比較によって同定することができ（それにより、バインダーについてのフットプリントを明らかにする）。キモトリプシン、ペプチン等のような他の酵素もまた、あるいは別法として、同様なエピトープ特徴付け方法で用いることもできる。これらの測定において自己抗体とかなり同一の結果を与えるエフェクター機能欠乏抗体は、自己抗体と同一のエピトープと結合する抗体であると見なされる。例えば、同様な技術の議論については、Manca, Ann Ist Super Sanita. 27（1）, 15-9（1991）参照。
1つはビオチニル化されている2つの抗体との標的抗原への競合的結合によるエピトープマッピングは、関連抗原性決定基領域を同定するためのもう1つの方法である。
種々のファージディスプレイ技術を用いて、エピトープを同定することもできる。例えば、Wang and Yu, Curr Drug Targets. 5（1）, 1-15（2004）, Burton, Immunotechonology. 1（2）, 87-94（1995 Aug）, Cortese et al., Immunotechnology. 1（2）, 87-94（1995）およびIrving et al., Curr Opin Chem Biol. 5（3）, 314-24（2001）参照。コンセンサスエピトープは、議論のために、修飾されたファージディスプレイ関連技術を介して同定することもできる（http：//www.cs.montana.edu/〜mumey/papers/jcb03.pdf参照）。
エピトープをマッピングするにおいて潜在的に助けとなる他の方法は結晶学技術、（Poljakらによって1970年代〜1980年代に開発されたX-線回折/配列実験技術のような）X-線回折技術、およびマルチピンペプチド合成技術（Multipin Peptide Synthesis Technology）の適用を含む。配列分析および三次元構造分析およびドッキングのようなコンピュータ-ベースの方法を用いて、抗原決定基を同定することもできる。例えば、エピトープは、個々のモノクローナル抗体のFab断片の構造のドッキングと共に標的抗原の構造を用いる分子モデリングによって決定することもできる。これらおよび他のマッピング方法は、Epitope Mapping A Practical Approach（Westwood and Hay Eds.）2001 Oxford University Pressに議論されている。
1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体に由来する。「由来」とは、自己抗体のCDR領域の配列を用いて、エフェクター機能欠乏抗体の配列を設計して、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体と同一の結合特異性を有するエフェクター機能欠乏抗体を達成することを意味する。
1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体の重鎖CDR3領域は、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の重鎖CDR3領域と同一の配列を有する。
1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域は、抗体媒介自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する。
「自己免疫疾患または障害」は、対象が、その免疫応答が身体に対して有害な効果を有する、自己抗原としても公知の自己抗原に対する免疫応答を経験する疾患または障害である。自己抗原に対する免疫応答は自己免疫応答といわれ、それは、自己免疫疾患に罹った対象における場合を除いて正常な健康な対象においてある程度起こり得るのであり、自己免疫応答は病理学的である。自己免疫疾患または障害の臨床的兆候は、自己抗原に反応性である抗体またはTリンパ球の存在である。自己反応性抗体は自己抗体として知られ、細胞は自己反応性Tリンパ球として公知である。抗体媒介自己免疫疾患または障害は、（例えば、Chalkiadakis et al., Am J Gastroenterol. 94, 2551（1999）；Boehm et al., Eur J Clin Invest. 24, 248（1994）；Jacob and Viard, Eur J Med. 1, 425（1992）において）全身エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患についての研究によって例示されているように、病理学的応答が自己抗体によって媒介される疾患または障害である。「抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害」は抗体媒介自己免疫疾患または障害であり、抗体媒介自己免疫疾患または障害の存在および/または発生は活性な補体系に依存する。そのような補体依存性は、例えば、（例えば、Lennon and Lambert, Annais NY Acad. Sci. 377, 77（1981）において）補体欠乏動物において、あるいは自己免疫病巣における補体-沈積を示すことによって、あるいはAntonelli et al., Clin Exp Rheumatol. 15, S31（1996）に例示されている、患者血清中の補体活性化および/または消費を測定することによって、疾患モデルにおいて示すことができる。
1つの態様において、抗体媒介自己免疫疾患または障害は重症筋無力症である。さらなる態様において、標的抗原は筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体のようなイオンチャネルである。さらなる態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は患者由来抗-AChR Fab 637に由来する。1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は抗-AChR Fab-637のCDR3領域と同一のアミノ酸配列のVHCDR3領域を有する。さらなる態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域は、抗-AChR Fab-637の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域、および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する。1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するVL領域を含む。1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は、AChRに対する結合について抗-AChR Fab-637と競合する。1つの態様において、多価エフェクター機能欠乏抗体のようなエフェクター機能欠乏抗体は抗-AChR Fab-637と同一のエピトープに結合する。
もう1つの態様において、抗体媒介自己免疫疾患は、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身強皮症および硬化症、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病、潰瘍性結腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全症、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年型糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫合併症腎炎、IgA腎障害、IgM多発性神経障害、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少紫斑病のような免疫媒介血小板減少症、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身エリテマトーデス、関節リウマチ（RA）、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核症、HIV、およびヘルペスウイルス関連病から選択される。さらなる例は重症急性呼吸窮迫症候群および脈絡網膜炎である。
1つの態様において、抗体媒介自己免疫疾患または障害は関節リウマチまたは全身エリテマトーデスであって、および標的自己抗原はカルパスタチンである。
1つの態様において、抗体媒介自己免疫疾患または障害は関節リウマチであって、標的自己抗原はフォリスタチン関連タンパク質である。
1つの態様において、自己媒介自己免疫疾患または障害は関節リウマチまたは全身エリテマトーデスであって、標的自己抗原はRo60 kDaである。
「治療上有効量」とは、所望の治療的結果を達成するのに必要な用量および期間において効果的な量をいう。本発明に従って用いるのに適した抗体の治療上有効量は、個体の病気状態、年齢、性別および体重、および個体において所望の応答を惹起する抗体の能力に従って変化し得る。治療上有効量は、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害効果よりも、治療的に有益な効果がまさるものでもある。
本明細書において、用語「対象」はいずれのヒトまたは非ヒト霊長類も含む。
「治療」は、兆候または病気状態を予防し、軽減し、改善し、または根絶する（治癒する）目的での本発明の治療上活性な化合物の有効量の投与を意味する。
本発明による抗体は、典型的には、少なくとも実質的に単離された-または単純に単離された-形態で用いられ、または提供される。実質的に単離された分子は組成物における主要な種である分子であり、それはそれが属する分子のクラスに関して見出され（すなわち、それは組成物における分子のタイプの少なくとも50％を占め、典型的には、組成物において、分子の種、例えばペプチドの、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％以上を占める（例えば、組成物は全ての存在するペプチド種との関係で抗体に対して少なくとも約98％、98％、または99％均質性を呈する））。
単離された分子とは、抗体が生産される細胞または動物内に含有された標的自己抗原に結合しない生体分子のような任意の外来性および望ましくない生理学的因子の（約1％を超える、約2％を超える、約3％を超える、または約5％を超えるような）有意なレベルと会合しない分子をいう。単離された分子は、（自動、手動または双方を問わず）ヒト介入によるそのような純度の段階を通過したいずれの分子もいう。一つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む組成物におけるような本発明によって提供される種々の組成物の多くにおいて、抗体は組成物中（例えば、多量の薬学的に許容される担体、安定化剤および/または保存剤を含む組成物の場合）の合計分子種の数に換算して比較的少量で存在させることができる。いくつかの場合、BSAのようなさらなるペプチドを従前に精製された抗体を含むそのような組成物に含めることができる。しかしながら、組成物のそのようなさらなる構成要素が抗体の意図した適用で許容されるならば、そのような組成物は、依然として、本発明による単離された抗体を含むものとして記載することができる。そのような組成物は1より多いそのような単離された抗体を含むこともできる。
本明細書において、用語「kd」（sec-1）とは、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡速度をいう。値はkoff値ともいう。
本明細書において、用語「ka」（M-1×sec-1）とは、特定の抗体抗原相互作用の会合平衡速度をいう。
本明細書において、用語「KD」（M）とは、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数をいう。
本明細書において、用語「KA」（M-1）とは、特定の抗体抗原相互作用の会合平衡定数をいい、kaをkdで割ることによって得られる。
本明細書において、「グリコシル化パターン」は、タンパク質に、より特異的には免疫グロブリン（抗体）タンパク質に共有結合する炭水化物ユニットのパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が、異種抗体のグリコシル化パターンを、導入遺伝子のCH遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種におけるグリコシル化の該パターンにより同様であると認識する場合、非ヒトトランスジェニック動物の種によって生産される抗体に天然で起こるグリコシル化パターンに実質的に同様であると特徴付けることができる。
本明細書において、「イソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgEまたはIgM）をいう。
本明細書において、「イソタイプスイッチング」とは、抗体のクラスまたはイソタイプによって、1つの免疫グロブリンクラスから他の免疫グロブリンクラスの1つに変化する現象をいう。
本明細書において、用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞をいうことを意図する。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も示すことを意図することが理解されるべきである。ある種の修飾は成熟または環境いずれかの影響のため後の世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でないかもしれないが、依然として、本明細書において用いる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、例えば、CHO細胞、NS/0細胞、およびリンパ球細胞のようなトランスフェクトーマを含む。
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. （1990）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存し得ることは当業者には十分理解される。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例は、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマーに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーのような哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメントを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列を用いることができる。
本明細書において、「特異的結合」とは、所定の抗原への、抗体のような抗原結合ペプチドの結合をいう。典型的には、抗体のような抗原結合ペプチドは、例えば、リガンドとして抗原および分析物として抗体を用いるBIAcore 3000機器における表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって測定した場合に、約10-9 M以下、約10-10 M以下、または約10-11 Mまたはそれ以下のような約10-8 M以下のような約10-7 M以下のKDに対応する親和性でもって結合し、所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも100倍低いような少なくとも10倍低い、例えば、少なくとも10,000倍低いような少なくとも1000倍低い、例えば、少なくとも100,000倍低いKDに対応する親和性をもって所定の抗原に結合する。それにより親和性がより低い量は、抗原結合ペプチドのKDが非常に低い場合（すなわち、抗原結合ペプチドが高度に特異的である場合）、それにより抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い量で少なくとも10,000倍となれるように、抗原結合ペプチドのKDに依存する。フレーズ「抗原を認識する抗原結合ペプチド」および「抗原に対して特異的な抗原結合ペプチド」は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合する抗原結合ペプチド」と相互交換的に用いられる。同様に、フレーズ「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と本明細書において相互交換的に用いられる。
本明細書において、用語「トランスフェクトーマ」は、CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌のような抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を含む。
用語「トランスジェニック非ヒト動物」とは、（動物の天然ゲノムDNAに組込まれた、または組込まれてない）一つまたは複数のヒト重鎖および/または軽鎖導入遺伝子、またはトランス染色体を含むゲノムを有し、かつ十分にヒト抗体を発現することができる非ヒト動物をいう。例えば、トランスジェニックマウスは、該マウスが、抗原および/または抗原を発現する細胞で免疫化された場合に所与の標的抗原に対するヒト抗体を生産するように、ヒト軽鎖導入遺伝子、およびヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖トランス染色体いずれかを有することができる。トランスジェニックマウス、例えば、HCo7またはHCo12マウスのようなHuMAbマウスの場合に当てはまるように、ヒト重鎖導入遺伝子はマウスの染色体DNAに組込むことができるか、あるいはWO 02/43478に記載されているように、トランス染色体KMマウスに当てはまるように、ヒト重鎖導入遺伝子を染色体外で維持することができる。そのようなトランスジェニックおよびトランス染色体マウス（本明細書において、集合的に「トランスジェニックマウス」という）は、V-D-J組換えおよびイソタイプスイッチングを受けることによって、（IgG、IgA、IgM、IgDおよび/またはIgEのような）所与の抗原に対する多数イソタイプのヒトモノクローナル抗体を生産することができる。また、例えば、遺伝子を、動物の乳中で発現される遺伝子に操作可能に連結することにより、そのような特異的な抗体をコードする遺伝子を導入することによって、トランスジェニック非ヒト動物を、特異的抗原に対する抗体の生産で用いることができる。
本明細書において、用語「ベクター」とは、それが連結されているもう1つの核酸を輸送することができる核酸分子をいうことを意図する。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループをいう。ベクターのもう1つのタイプはウィルスベクターであり、そこでは、さらなるDNAセグメントをウィルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製できる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。（非エピソーム哺乳動物ベクターのような）他のベクターを、宿主細胞の導入に際して宿主細胞のゲノムに組込むことができ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターはそれらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターを、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。一般に、組換えDNA技術における用途の発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は相互交換可能に用いることができる。というのは、プラスミドはベクターの最も普通に用いられる形態だからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす（複製欠陥レトルウィルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスのような）ウィルスベクターのような発現ベクターの他の形態などを含むことを意図する。
1つの態様において、本発明は、本発明で用いるのに適した抗体をコードする核酸を提供する。
本明細書において、用語「核酸分子」は、DNA分子およびRNA分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。核酸は全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在させることができる。アルカリ性/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他を含む標準的な技術によって、他の細胞核酸またはタンパク質のような他の細胞成分または他の汚染物から精製された場合に、核酸は「単離されている」または「実質的に純粋」とされている。F.Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York（1987）参照。
そのような核酸は任意の適当な特徴を有することができ、任意の適当な特徴またはその組合せを含む。したがって、例えば、そのような核酸はDNA、RNA、またはそのハイブリッドの形態であってよく、天然に生じない塩基、修飾された骨格（例えば、核酸の安定性を促進するホスホチオエート骨格）、または双方を含んでもよい。核酸は、有利には、標的宿主細胞における所望の発現、複製、および/または選択を促進する特徴を含む。そのような特徴の例は複製起点成分、選択遺伝子成分、プロモーター成分、エンハンサーエレメント成分、VHコード領域、VLコード領域、定常重鎖コード領域、定常軽鎖コード領域、ポリアデニル化配列成分、終止成分などを含む。
1つの態様において、本発明はそのような核酸を含むベクターを提供する。本発明との関係でベクターは染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御エレメントの適当な組を含む核酸配列）を含む任意の適当なベクターであってもよい。そのようなベクターの例はSV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、およびウイルス核酸（RNAまたはDNA）ベクターを含む。ベクターは、例えば、細菌細胞における、酵母系における、または哺乳動物系における抗体の発現に適したものとすることができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体をコードする核酸は任意の適当なプロモーター、エンハンサー、および他の発現を容易とするエレメントを含むことができ、またはそれと会合することができる。1つの態様において、核酸はウィルスベクターを介して宿主細胞または宿主動物中に位置させ、および/またはそこへ送達することができる。
本発明の他の特徴は核酸、ベクター、またはそのいずれかまたは双方の組合せを含む酵母、細菌、および哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）のような組換え細胞を含む。例えば、1つの態様において、本発明が、本発明に従って用いるのに適した抗体の発現についてコードする配列を含む細胞ゲノムに安定に組込まれた核酸を含む細胞を提供する。1つの態様において、本発明が、本発明に従って用いるのに適した抗体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファゲミド、または線状発現エレメントのような組込まれていない核酸を含む細胞を提供する。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、例えば、細胞または動物の任意の適当なタイプにおける組換え発現によって調製することができる。本発明に従って用いるのに適した組換え抗体は、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、トランスジェニック動物のような動物から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリンをコードする核酸配列を、ヒト免疫グロブリンをコードする核酸およびヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に対して外来性の他の核酸配列にスプライシングすることを含むいずれかの他の手段によって調製され、発現され、創生され、または単離された抗体も含む。組換えヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。ある態様においては、しかしながら、そのような組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（またはヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物を用いる場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VHおよびVL配列に由来し、かつそれに関連しつつ、インビボにてヒト抗体生殖系レパートリー内に天然では存在しない配列であってよい。ヒト抗体の双方のタイプは本発明によって提供される。抗体生産のための適当な方法は当技術分野において知られており、例えば、Harlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., （1988）, Harlow and Lane：Using Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1999））, US 4,376,110およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publising Assoc. and Wiley InterScience N.Y.,（1987,1992）に記載されているものを含む。モノクローナル抗体はKohler et al., Nature 256, 495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用い、または他の周知の引き続いて開発された方法（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.59-103（Academic Press, 1986）参照）によって作製することができる。本発明に従って用いるのに適した抗体の生産で有用なハイブリドーマもまた本発明によって提供される。形質転換された不死化B細胞を用いて、本発明の抗体を効果的に生産することもでき、またこれは本発明によって提供される。したがって、安定なかつ連続的および/または不死化細胞、および本発明に従って用いるのに適した抗体を発現する細胞系は本発明の特徴である。本発明に従って用いるのに適した抗体を発現する非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、厳格な組合せ免疫欠乏（SCID）マウスおよび他の免疫不全動物種族のようなそれらの修飾された種族を含むハムスター、モルモット、およびラット）、イヌなどのようなトランスジェニック動物も本発明によって提供される。
本発明に従って用いるのに適した抗体をコードする外来性核酸を含む組換え細胞は任意の適当な技術（例えば、リン酸カルシウム沈殿促進トランスフェクション、受容体媒介標的化およびトランスフェクション、バイオリスティック送達、エレクトロポレーション、デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト融合、直接的マイクロインジェクションなどによって細胞に送達された抗体をコードする配列（または複数配列）を含む裸のDNAプラスミドベクター、ウィルスベクター、侵入性細菌細胞ベクターまたは他の全細胞ベクターなどでのトランスフェクション/形質転換）によって調製することができる。細胞を形質転換/トランスフェクトする方法は当技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Sring Harbor Laboratory Press（2d Edition, 1989 and 3rd Edition, 2001）およびF. Ausubel et al., ed. Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York（1987）参照）。そのような組換え細胞は本発明の特徴である。
組換えタンパク質発現のために宿主として入手可能な細胞系は当技術分野において周知であり、American Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Hep G2）、A549細胞、および多数の他の細胞系を含む。用いることができる他の細胞系はSf9細胞のような昆虫細胞系である。本発明に従って用いるのに適した抗体をコードする核酸（または核酸含有ベクター）を哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を、宿主細胞中での抗体の発現を可能とするのに十分な時間の間培養することによって、または宿主細胞が増殖される培養基への抗体の分泌によって、抗体を生産することができる。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養基から回収することができる。抗体は、分泌シグナルなくして直接的に発現された場合、宿主細胞溶解物から回収することもできる。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、種々の他の技術、例えば、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いるファージディスプレイ技術によって生産することもできる。1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、マウス系で作りだされたハイブリドーマを用いることによって生産される。マウスにおけるハイブリドーマ生産は非常によく確立された手法である。免疫化プロトコル、および融合のための免疫化脾細胞の単離のための技術は当技術分野において公知である。融合パートナー（例えば、マウスミエローマ細胞）および融合手法も公知である。
本発明に従って用いるのに適した十分にヒトのモノクローナル抗体を作り出すには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランス染色体（例えば、HCo12、HCo7、HCo17、HCo20またはKMマウス）を、例えば、Lonberg et al., （1994）, 前記, Fishwild et al., （1996）, 前記およびWO 98/24884によって記載されているように標的抗原を発現する特異的標的抗原および/または細胞の豊富化された調製物で免疫化することができる。あるいは、マウスを、標的抗原をコードするDNAで免疫化することができる。
自己抗体と同一の抗原特異性を有するIgG4抗体は、自己抗体のVLおよびVHコード領域を、標準的なクローニングおよび発現技術を用い、ヒトIgG4の定常領域をコードする発現ベクターに導入することによって作製することができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、例えば、当技術分野において周知のように、組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて宿主細胞トランスフェクトーマにおいて生産することもできる。例えば、Morrison, S., Science 229, 1202（1985）参照。例えば、抗体、またはその抗体断片を発現させるためには、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするDNAを標準的な分子生物学技術（例えば、PCR増幅、部位特異的突然変異誘発）によって得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。この関係で、用語「操作可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を発揮するように、抗体遺伝子がベクターに連結されていることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができ、またはより典型的には、双方の遺伝子を同一発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結、または制限部位が存在しなければ平滑末端連結）によって発現ベクターに挿入することができる。本明細書において記載された抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに操作可能に連結され、かつVLセグメントがベクター内のCLセグメントに操作可能に連結されるように、所望のイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体イソタイプの全長抗体遺伝子を作り出すことができる。加えて、あるいは別法として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易とするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にイン-フレームにて連結されるようにベクターにクローン化することができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫ブロブリンたんぱく質からのシグナルペプチド）であってよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を可能とし、それを制御する調節配列を運ぶ。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子のようなさらなる配列を運ぶことができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易とする（例えば、米国特許第4399216号、米国特許第4634665号および米国特許第5179017号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが挿入された宿主細胞に関して、G418、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物に耐性を付与する。選択マーカー遺伝子の例は（メトトレキセート選択/増幅でdhfr宿主細胞で用いる）ジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）遺伝子、および（G418選択のための）neo遺伝子を含む。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。宿主細胞は哺乳動物宿主細胞のような原核生物または真核生物であってよい。例えば、抗原結合断片は原核生物宿主細胞において発現させることができ、全長抗体は真核生物宿主細胞で発現させることができる。
1つの態様において、抗体は哺乳動物宿主細胞のような真核生物細胞において発現される。本発明の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞の例は、（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621（1982）に記載された、DHFR選択マーカーで用いられる、Urlaub and Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220（1980）に記載されたdhfr-CHO細胞を含む）CHO細胞、NS/0ミエローマ細胞、COS細胞、HEK293細胞およびSP2.0細胞を含む。特に、NS/0ミエローマ細胞で用いるための、発現系のもう1つの例は、WO87/04462、WO89/01036およびEP338 841に開示されたGS（グルタミンシンテターゼ）遺伝子発現系である。
1つの態様において、本発明は、本発明に従って用いるのに適した抗体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,1995に開示されたもののような従来の技術に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤で処方することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤ならびにいずれかの他の公知の補助剤および賦形剤は、選択された抗体および選択された投与態様で適しているべきである。薬学的組成物の担体および他の成分の適合性は、本発明の選択された化合物または薬学的組成物の所望の生物学的特性に対する有意な負のインパクト（例えば、抗原結合に対する実質的インパクト未満（10％以下の相対的阻害、5％以下の相対的阻害など））の欠如に基づいて決定される。本発明で用いるのに適した抗体の薬学的組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤（例えば、Tween-80のようなノニオン性洗剤）、安定化剤（例えば、糖または無タンパク質アミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、および/または薬学的組成物に含めるのに適した他の材料も含むことができる。
薬学的組成物中の抗体の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく、特定の患者に対する所望の治療的応答、組成、および投与の態様を達成するのに効果的な有効成分の量を得るように変化させることができる。選択された用量レベルは、使用する特定の抗体、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、使用される特定の抗体の投与の経路、投与の時間、排出の速度、治療の持続、使用される特定の組成物との組合せで用いる他の薬物、化合物および/または材料、治療されるべき患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康およびこれまでの医療履歴、および医療分野で周知の同様の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。
薬学的組成物は、任意の適当な経路および態様によって投与することができる。インビボおよびインビトロにて本発明の化合物を投与する適当な経路は当技術分野において周知であり、当業者によって選択することができる。本発明に従って用いるのに適した抗体は任意の適当な経路を介して投与することができる。
1つの態様において、薬学的組成物は非経口投与される。本明細書において、フレーズ「非経口投与」および「非経口的に投与する」は、通常、注射による腸および局所投与以外の投与の手段を意味し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、鞘下、クモ膜下、脊髄内、頭蓋内、胸内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。1つの態様において、薬学的組成物は静脈内、または皮下注射または注入によって投与される。1つの態様において、抗体は皮下注射によって結晶形態で投与される。Yang et al., PNAS USA 100（12）, 6934-6939（2003）参照。
薬学的組成物は当技術分野において公知の医療機器で投与することができる。例えば、1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、米国特許第5,399,163号、米国特許第5,383,351号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,064,413号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,790,824号、または米国特許第4,596,556号に開示された機器のような針不要型皮下注射機器で投与することができる。本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬を分注するための移植可能なミクロ-注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号；皮膚を介して薬を投与するための治療機器を開示する米国特許第4,486,194号；正確な注入速度で薬を送達するための薬注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号；連続的薬物送達のための可変流動移植可能な注入装置を開示する米国特許第4,447,224号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,439,196号；および浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,475,196号を含む。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールは当業者に公知である。
他の箇所で述べたように、薬学的組成物は、経口、鼻、局所（頬、経皮および舌下を含む）、直腸、膣および/または非経口投与のような特定の投与経路のために処方することができる。薬学的組成物は、便宜には、単位投与形態で供することができ、製薬の分野で公知の任意の方法によって調製することができる。担体物質と組合せて、単一の投与形態を得ることができる有効成分の量は、治療すべき対象、および特定の投与態様に依存して変化する。担体物質と組合せて、単一投与形態を得ることができる有効成分の量は、一般には、治療効果を生じる組成物のその量である。一般には、100パーセントの内、この量は約0.1％〜約70％、例えば、約1％〜約30％のような有効成分の約0.01％〜約99％の範囲である。
選択される投与経路に関わらず、薬学的に許容される塩の形態で、または適当な水和形態で用いることができる本発明に従って用いるのに適した抗体、および/または薬学的組成物が、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される投与形態に処方される。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望まない毒物学的効果も付与しない塩をいう（例えば、Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66, 1-19（1977）参照）。そのような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などのような無毒性無機酸、ならびに脂肪族モノ-およびジカルボン酸、フェニル-置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属、ならびにN,N’-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性有機アミンに由来するものを含む。
薬学的に許容される担体は、本発明の化合物と生理学的に適合する任意のおよび全ての適当な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的組成物で使用することができる適当な水性および非水性担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、エタノール、デキストロース、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような）ポリオール、およびその混合物、オリーブ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油およびゴマ油のような植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガム、およびオレイン酸エステルのような注射用有機エステル、および/または種々の緩衝液を含む。他の担体は医薬技術分野で周知である。薬学的に許容される担体は滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即席製剤用の滅菌粉末を含む。そのような媒体および医薬上活性な物質のための剤の使用は当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または剤が抗体に不適合である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用は考慮される。
適切な流動性は、例えば、レクチンのようなコーティング物質の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
薬学的組成物は薬学的に許容される抗酸化剤、例えば、（1）アスコルビン酸、システイン塩酸、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（2）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤も含むことができる。薬学的組成物は糖のような等張剤、マンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは塩化ナトリウムのようなポリアルコールを組成物中に含むこともできる。
薬学的に許容される希釈剤は生理食塩水および水性緩衝溶液を含む。
薬学的組成物は、薬学的組成物の有効期限または有効性を増強させることができる、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤または緩衝液のような選択された投与経路に適した一つまたは複数の補助剤も含有することができる。本発明に従って使用するのに適した抗体は、例えば、ラクトース、スクロース、粉末（例えば、澱粉粉末）、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび/またはポリビニルアルコールと混合することができる。補助剤の他の例はQS21、GM-CSF、SRL-172、ヒスタミン二塩酸塩、チモカルチン、Tio-TEPA、モノホスホリル-脂質A/マイコバクテリア組成物、ミョウバン、フロイントの不完全アジュバント、モンタニドISA、ribiアジュバント系、TiterMaxアジュバント、シンテックスルアジュバント処方、免疫-刺激複合体（ISCOM）、ゲルブアジュバント、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、リポ多糖、およびポリイノシン酸：ポリシチジル酸である。
微生物の存在の予防は、滅菌手法によって、および種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっての双方で確保することができる。加えて、注射用医薬形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含めることによって実現することができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体を含む本発明の薬学的組成物は、従って、適当な塩を含むこともできる。任意の適当な形態のアルカリ土類金属塩のような任意の適当な塩（例えば、緩衝塩）も、抗体の安定化で用いることができる。適当な塩は、典型的には塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムを含む。1つの態様において、アルミニウム塩を用いて、薬学的組成物中の本発明に従って用いるのに適した抗体を安定化させ、そのアルミニウム塩は、そのような組成物を患者に投与した場合にアジュバントとして働くこともできる。
薬学的組成物は種々の適当な形態とすることができる。そのような形態は、例えば、液体溶液（例えば、注射用および注入用溶液）のような液体、半固体および個体投与形態、分散液または懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲル、クリーム、顆粒、粉末、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、デンドリマーおよび他のナノ粒子（例えば、Baek et al., Methods Enzymol. 362, 240-9（2003）, Nigavekar et al., Pharm Res. 21（3）, 476-83（2004）参照）、ミクロ粒子および坐薬を含む。最適な形態は選択された投与態様、組成物の性質、および治療的適用に依存する。処方は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含有する半固体混合物を含むことができる。前記のいずれも本発明に従う治療および療法で適切である。但し、薬学的組成物中の抗体は処方によって不活化されず、処方は生理学的に適合し、かつ投与の経路で許容できるものとする。また、例えば、医薬化学者に周知の賦形剤および担体に関連するさらなる情報については、Powell et al., 「Compendium of excipients for parenteral formulations」 PDA J Pharm Sci Technol. 52, 238-311（1998）、およびその中の引用参照。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出処方のような迅速放出に対して化合物を保護する担体で調製することができる。そのような担体はゼラチン、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリル、酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性生態適合性ポリマーを、単独で、もしくはワックスと共に、または当技術分野において周知の他の物質を含むことができる。そのような処方を調製するための方法は一般的には当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
ある投与経路によって本発明に従って用いるのに適した抗体を投与するためには、化合物を、その不活化を妨げるための物質で化合物をコーティングし、または物質と共に抗体を共投与する必要がある。例えば、抗体を適当な担体、例えば、リポソームまたは希釈剤中で対象に投与することができる。リポソームは水中油中水型CGFエマルジョンならびに従来のリポソーム（Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27（1984））を含む。
投与の経路に依存して、化合物を不活化し得る酸の作用および他の天然条件から化合物を保護する材料で抗体を被覆することができる。例えば、抗体は、適当な担体、例えば、リポソーム中にて対象に投与することができる。リポソームは水中油中水型CGFエマルジョンならびに従来のリポソーム（Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27（1984））を含む。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、インビボでの適切な分布を確保するように処方することができる。本発明の治療化合物が（所望ならば）BBBと交差することを確実とするためには、それらを、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第4,522,811号、米国特許第5,374,548号、および米国特許第5,399,331号参照。リポソームは、特異的細胞または器官に選択的に輸送され、したがって、標的化薬物送達を増強させる一つまたは複数の部位を含むことができる（例えば、V.V.Ranade J.Clin. Pharmacol. 29, 685（1989）参照）。例示的な標的化部位は、その異なる種は本発明の薬学的組成物を含むことができる、フォレートまたはビオチン（例えば、米国特許第5,416,016号参照）、マンノシド（Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038（1988））、抗体（P.G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140（1995）, M.Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180（1995））、界面活性剤プロテインA受容体（Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233, 134（1995））、ならびに発明された分子の成分、p120（Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090（1994））を含む。また、K. Keinanen, M.L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123（1994）およびJ.J. Killion, I.J. Fidler, Immunomethods 4, 273（1994）参照。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、標的化部位を含むリポソームのようなリポソーム中に処方することができる。リポソーム中の抗体はボーラス注射によって所望の領域に近接した部位、例えば、炎症または感染部位、または腫瘍の部位に送達することができる。組成物は、容易なシリンジ性が存在する程度まで流体であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保持されるべきである。
本発明に従って用いるのに適した抗体は、胎盤を横切ってのそれらの輸送を妨げ、または低下させるように処方することができる。これは当技術分野において公知の方法によって、例えば、化合物のペグ化によって、またはF（ab’）2断片の使用によってなすことができる。さらに、Cunningham-Rundles C et al., J Immunol Methods. 152, 177-190（1992）およびLandor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283（1995）に言及することができる。
非経口投与用の薬学的に許容される担体は滅菌水性溶液または分散溶液、および滅菌注射用溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。医薬上活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性な抗体に適合しない場合を除き、薬学的組成物におけるその使用が考えられる。補充的な活性化合物も組成物に取り込むことができる。
注射用の薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵条件下で滅菌されており、かつ安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に対して適当な他の秩序だった構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような）ポリオール、およびその適当な混合物、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含有する水性または非水性溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを含めることによって実現することができる。滅菌注射用溶液は、例えば、必要に応じて先に列挙した成分の1つまたは組合せと共に、適当な溶媒に必要量の活性な抗体を配合し、続いて、滅菌ミクロ濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒体、および例えば前記で列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法の例は真空乾燥および凍結-乾燥（凍結乾燥）であり、それは、その従前に滅菌濾過された溶液から有効成分に加え任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて先に列挙した成分の組合せと共に適当な溶媒に必要量の活性化合物を配合し、続いて、滅菌ミクロ濾過を行うことによって調製することができる。一般には、分散液は、基本的分散媒体、および先に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性な化合物を配合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法の例は真空乾燥および凍結-乾燥（凍結乾燥）であり、これは、先に滅菌濾過したその溶液から有効成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
薬学的組成物は、本発明に従って用いるのに適した1つの抗体、または本発明に従って用いるのに適した抗体の組合せを含有することができる。
投与養生法は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割された用量を経時的に投与することができ、あるいは用量は治療的状況の緊急事態によって比例的に低下させ、または増加させることができる。非経口組成物は、投与の容易性および用量の不均一性のために投与単位形態に処方することができる。本明細書において投与単位形態とは、治療すべき対象のための単位の用量として適した物理的に区別される単位をいい、各単位は、必要な医薬担体と組合せて所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。投与単位形態についての仕様は、（a）活性化合物のユニークな特徴、および達成すべき特定の治療効果、および（b）個体における感度のよい治療のためのそのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって指示され、かつそれに直接的に依存する。
本発明に従って用いるのに適した抗体のための有効用量および投与養生法は当業者によって決定され得る。本発明に従って用いるのに適した抗体の治療上有効量についての非限定的範囲は約0.1〜50mg/kgのような約0.1〜100mg/kg例えば、約0.1〜10mg/kgのような約0.1〜20mg/kg、例えば、約0.3、約1、約3mg/kgのような約0.5である。
当技術分野において通常の技量を有する医師または獣医は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定することができ、それを処方することができる。例えば、医師または獣医が、所望の治療効果を達成するのに必要なよりも低いレベルにて抗体の用量を開始させ、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができよう。一般に、本発明に従って用いるのに適した抗体の適当な日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量である。そのような有効量は、一般には、前記した因子に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であってよく、例えば、標的に近接した部位に投与することができる。所望であれば、薬学的組成物の有効日用量は、任意で、単位投与形態にて、一日を通じて適当な間隔で別々に投与される2、3、4、5、6以上のサブ-用量として投与することができる。抗体を単独で投与することができるが、化合物を前記した薬学的組成物として投与するのが好ましい。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、注入によって、200〜400mg/m2のような10〜500mg/m2の週用量で投与することができる。そのような投与は、例えば、3〜5回のように1〜8回反復することができる。投与は、2〜12時間のように2〜24時間の時間にわたって連続的注入によって行うことができる。
1つの態様において、本発明に用いるのに適した抗体は、24時間を超えるように長時間にわたってゆっくりとした連続的注入によって投与して、毒性副作用を低下させることができる。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、4〜6回のように8回まで、例えば、300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mgまたは2000mgのように250mg〜2000mgの週用量で投与することができる。投与は、2〜12時間のように、2〜24時間にわたって連続的注入によって行うことができる。そのような養生法は、例えば、6ヶ月または12ヶ月後に必要に応じて1回以上反復することができる。用量は、例えば、生物学的試料を採取し、本発明に従って用いるのに適した抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、投与に際して血液中の本発明の化合物の量を測定することによって決定し、または調整することができる。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、例えば、6ヶ月以上の間に一週間につき1回のように維持療法によって投与することができる。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、本発明に従って用いるのに適した抗体の1回の注入を含む養生法、続いての、放射性同位体にコンジュゲートした本発明に従って用いるのに適した抗体の注入によって投与することができる。養生法は、例えば、7〜9日後に反復することができる。
非限定的例として、本発明による治療は、24、12、8、6、4または2時間毎の単一または分割用量、またはそのいずれかの組合せを用い、治療の開始から日1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40の少なくとも1つ、または別法として週1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の少なくとも1つにて、日当たり0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90または100mg/kgのように約0.1〜100mg/kgの量で本発明に従って用いるのに適した抗体の日用量として供することができる。
本発明に従って用いるのに適した抗体を含む薬学的組成物は組合せ療法にて、すなわち、治療すべき疾患または障害に関連する他の治療剤と組合せて投与することもできる。そのような投与は同時、別々または順次であってよい。同時投与では、剤は適切には1つの組成物として、または別々の組成物として投与することができる。また、本発明は、したがって、他の箇所に記載された障害を治療する方法を提供し、本方法は、後に記載する一つまたは複数のさらなる治療剤と組合せて、本発明に従って用いるのに適した抗体を投与することを含む。
1つの態様において、組合せ療法は、高用量Ig I.V.と共に、本発明に従って用いるのに適した抗体の投与を含むことができる。
1つの態様において、組合せ療法は、少なくとも1つの抗炎症剤、少なくとも1つの免疫抑制剤および/または免疫変調剤、神経筋肉伝達のエンハンサーと共に本発明に従って用いるのに適した抗体を投与することを含むことができ、および/またはそのような組合せ療法は血漿交換による自己抗体の排除を含むことができる。
1つの態様において、本発明は、対象において抗体媒介自己免疫疾患または障害を治療する方法を提供し、本方法は治療上有効量の本発明に従って用いるの適した抗体、および少なくとも1つの抗炎症剤をそれを必要とする対象に投与することを含む。
1つの態様において、本発明は重症筋無力症を治療または予防する方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明に従って用いるのに適した抗体、および少なくとも1つの抗炎症剤をそれを必要とする対象に投与することを含む。
1つの態様において、本発明は、重症筋無力症を治療または予防するための少なくとも1つの抗炎症剤と共に投与すべき薬学的組成物の調製のための本発明に従って用いるのに適した抗体の使用を提供する。
1つの態様において、そのような抗炎症剤はステロイド薬物およびNSAID（非ステロイド抗炎症薬物）から選択することができる。
1つの態様において、そのような抗炎症剤はアスピリンおよび他のサリシレート、（ロフェコキシブおよびセレコキシブのような）Cox-2阻害剤、（イブプロフェン、フェノプロフェン、ナプロキセン、スリンダック、ジクロフェナック、ピロキシカム、ケトプロフェン、ジフルニザール、ナブメトン、エトドラック、オキサプロジン、およびインドメタシンのような）NSAID、抗-IL6R抗体、抗-IL8抗体、抗-IL15抗体、抗-IL15R抗体、抗-CD4抗体、抗-CD11a抗体（例えば、エファリズマブ）、抗-α-4/β-1インテグリン（VLA4）抗体（例えば、ナタリズマブ）、炎症病の治療用のCTLA4-Ig、プレドニゾロン、プレドニゾン、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジンのような病気修飾抗リウマチ薬物（DMARD）、（レフルノミドのような）ピリミジン合成阻害剤、（アナキンラのような）IL-1受容体ブロッキング剤、（エタネルセプト、インフリキシマブ、およびアダリムマブのような）TNF-aブロッキング剤、および同様な剤から選択することができる。
1つの態様において、本発明は対象において抗体媒介自己免疫疾患または障害を治療する方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明に従って用いるのに適した抗体、および少なくとも1つの免疫抑制剤および/または免疫変調剤をそれを必要とする対象に投与することを含む。
1つの態様において、本発明は重症筋無力症を治療または予防する方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明に従って用いるのに適した抗体、および少なくとも1つの免疫抑制剤および/または免疫変調剤をそれを必要とする対象に投与することができる。
1つの態様において、本発明は、重症筋無力症を治療または予防するための少なくとも1つの免疫抑制剤および/または免疫変調剤と共に投与すべき薬学的組成物の調製のための本発明に従って使用するのに適した抗体の使用を提供する。
1つの態様において、そのような免疫抑制剤および/または免疫変調剤はサイクロスポリン、アザチオプリン、マイコフェノール酸、マイコフェノレートモフェチル、プレドニゾンのようなコルチコステロイド、メトトレキセート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア、ブレキナール、レフルノミド、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン、6-メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（FK-506）、OKT3、抗胸腺細胞グロブリン、サイモペンチン、サイモシン-aおよび同様な剤から選択することができる。
1つの態様において、そのような免疫抑制および/または免疫変調剤は、IL-2受容体のp75に結合する抗体、または例えばMHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD20、CD28、B7、CD40、CD45、IFNγ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-10、CD11aまたはCD58に結合する抗体、またはそれらのリガンドに結合する抗体のような免疫抑制抗体から選択することができる。
1つの態様において、そのような免疫抑制および/または免疫変調剤は可溶性IL-15R、IL-10、B7分子（B7-1、B7-2、その変種、およびその断片）、ICOS、およびOX40、（CTLA4に対する抗体のような）負のT細胞レギュレーターの阻害剤、および同様な剤から選択することができる。
1つの態様において、本発明に従って用いるのに適した抗体は、プレドニゾンおよびサイクロスポリン；プレドニゾン、サイクロスポリン、およびアザチオプリン；またはプレドニゾン、サイクロスポリンおよびマイクロフェノレートモフェチルとの組合せのような2つ以上の免疫抑制および/または免疫変調剤との組合せで投与することができる。
前記したように、本発明に従って用いるのに適した抗体を含む薬学的組成物は、組合せ療法にて、すなわち、別々の薬学的組成物としての、または前記した一つまたは複数のさらなる治療剤に適合する本発明の化合物とでの、治療すべき病気または疾患に関連する一つまたは複数の剤と組合せて投与することができる。そのような組合せ療法はより低い用量の抗体および/または共投与される剤を必要とし、したがって、種々の単独療法に伴う可能な毒性または合併症を回避することができる。
1つの態様において、本発明は、対象において抗体媒介自己免疫疾患または障害を治療する方法を提供し、本方法は治療上有効量の本発明に従って用いるのに適した抗体、および少なくとも1つの神経筋肉伝達の増強剤をそれを必要とする対象に投与することができる。そのような増強は、例えば、神経筋肉伝達を改良し、および筋肉の強さを増大させるのを助ける、アセチルコリンの作用を延長する、ネオスチグミンおよびピリドスチグミンのようなアセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤の使用によって達成することができる。
1つの態様において、本発明は、免疫変調サイトカイン、幹細胞成長因子、（TNFαのようなTNFのような）リンホトキシン、または造血因子のような免疫モジュレーターにコンジュゲートされた本発明に従って用いるのに適した抗体を提供する。コンジュゲートとして有用であり得るそのような分子の例はIL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18およびIL-21、（顆粒球-コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）のような）コロニー刺激因子、（IFNα、IFNβ、およびIFNγのような）インターフェロン、「S1因子」と命名された幹細胞成長因子、エリスロポエチン、およびトロンボポエチン、その活性断片、その誘導体、その変種、または任意のその組合せを含む。
また、本発明は、本発明の化合物の薬学的組成物、および使用のための指示書を含むキットを提供する。キットは、さらに、一つまたは複数のさらなる治療剤、または本発明に従って用いるのに適した一つまたは複数のさらなる抗体を含むことができる。本発明のキットは診断剤および/または他の治療剤を含むこともできる。1つの態様において、本発明のキットは本発明に従って用いるのに適した抗体、およびそのような抗体の投与によって治療できる障害の状態または存在を診断するための診断方法で用いることができる診断剤を含む。1つの態様において、キットは、高度に安定な組成物と混合して、注射用組成物を形成することができる薬学的に許容される担体と組合せて、（凍結乾燥形態のような）高度に安定な形態の本発明に従って用いるのに適した抗体を含む。
以下に本発明の選択された態様のリストを掲げる。
態様1：対象において抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の治療用の薬学的組成物を調製するための多価補体活性化欠乏抗体の使用、補体活性化欠乏抗体は、標的自己抗原への結合について、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合する。
態様2：多価補体活性化欠乏抗体が二価抗体である、態様1記載の使用。
態様3：多価補体活性化欠乏抗体がIgG4抗体である、態様1または態様2記載の使用。
態様4：多価補体活性化欠乏抗体が標的自己抗原の活性を変調することができる、態様1〜3のいずれか記載の使用。
態様5：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体と同一のエピトープに結合する、態様1〜4のいずれか記載の使用。
態様6：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体に由来する、態様1〜5のいずれか記載の使用。
態様7：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の重鎖CDR3領域と同一である配列を有する、態様1〜6のいずれか記載の使用。
態様8：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一である配列を有する、態様7記載の使用。
態様9：抗体がヒト抗体である、態様1〜8のいずれか記載の使用。
態様10：抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害が重症筋無力症である、態様1〜9のいずれか記載の使用。
態様11：標的自己抗原が筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体である、態様10記載の使用。
態様12：多価補体活性化欠乏抗体が患者由来抗-AChR Fab-637に由来する、態様11記載の使用。
態様13：多価補体活性化欠乏抗体が抗-AChR Fab-637のCDR3領域と同一のアミノ酸配列のCHCDR3領域を有する、態様11または態様12記載の使用。
態様14：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗-AChR Fab-637の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様13記載の使用。
態様15：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域を含む態様11〜14のいずれか記載の使用。
態様16：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するVL領域を含む態様11〜15のいずれか記載の使用。
態様17：多価補体活性化欠乏抗体がAChRへの結合について抗-AChR Fab-637と競合する、態様11〜16のいずれか記載の使用。
態様18：多価補体活性化欠乏抗体が抗-AChR Fab-637と同一のエピトープに結合する、態様11〜16のいずれか記載の使用。
態様19：対象の抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の治療方法であって、本方法は多価補体活性化欠乏抗体をそれを必要とする対象に投与することを含み、補体活性化欠乏抗体が、標的自己抗原への結合について、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する一つまたは複数の自己抗体と競合する。
態様20：多価補体活性化欠乏抗体が二価抗体である、態様19記載の方法。
態様21：多価補体活性化欠乏抗体がIgG4抗体である、態様19または態様20記載の方法。
態様22：多価補体活性化欠乏抗体が標的自己抗原の活性を変調することができる、態様19〜21のいずれか記載の方法。
態様23：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体と同一のエピトープに結合する、態様19〜22のいずれか記載の方法。
態様24：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体に由来する、態様19〜23のいずれか記載の方法。
態様25：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の重鎖CDR3領域と同一の配列を有する、態様19〜24のいずれか記載の方法。
態様26：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一である配列を有する、態様25記載の方法。
態様27：抗体がヒト抗体である、態様19〜26のいずれか記載の方法。
態様28：抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害が重症筋無力症である、態様19〜27のいずれか記載の方法。
態様29：標的自己抗原が筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体である、態様28記載の方法。
態様30：多価補体活性化欠乏抗体が患者由来抗-AChR Fab-637に由来する、態様29記載の方法。
態様31：多価補体活性化欠乏抗体が、抗-AChR Fab-637のCDR3領域と同一のアミノ酸配列のCH CDR3領域を有する、態様29または態様30記載の方法。
態様32：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗-AChR Fab-637の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様31記載の方法。
態様33：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域を含む態様29〜32のいずれか記載の方法。
態様34：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するVL領域を含む態様29〜33のいずれか記載の方法。
態様35：多価補体活性化欠乏抗体がAChRへの結合について抗-AChR Fab-637と競合する、態様29〜34のいずれか記載の方法。
態様36：多価補体活性化欠乏抗体が抗-AChR Fab-637と同一のエピトープに結合する、態様29〜34のいずれか記載の方法。
態様37：標的自己抗原への結合について、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に寄与する一つまたは複数の自己抗体と競合する多価補体活性化欠乏抗体。
態様38：多価補体活性化欠乏抗体が二価抗体である、態様37記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様39：多価補体活性化欠乏抗体がIgG4抗体である、態様37または態様38のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様40：多価補体活性化欠乏抗体が標的自己抗原の活性を変調することができる、態様37〜39のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様41：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体と同一のエピトープに結合する、態様37〜40のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様42：多価補体活性化欠乏抗体が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体に由来する、態様37〜41のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様43：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の重鎖CDR3領域と同一の配列を有する、態様37〜42のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様44：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害の媒介に関与する自己抗体の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様43記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様45：抗体がヒト抗体である、態様37〜44のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様46：抗体媒介補体依存性自己免疫疾患または障害が重症筋無力症である、態様37〜45のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様47：標的自己抗原が筋肉のニコチン性アセチルコリン受容体である、態様46記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様48：多価補体活性化欠乏抗体が患者由来抗-AChR Fab-637に由来する、態様47記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様49：多価補体活性化欠乏抗体が抗-AChR Fab-637のCDR3領域と同一のアミノ酸配列のCH CDR3領域を有する、態様47または態様48のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様50：多価補体活性化欠乏抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域が、抗-AChR Fab-637の、各々、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域と同一の配列を有する、態様49記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様51：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域を含む態様47〜50のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様52：多価補体活性化欠乏抗体がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するVL領域を含む態様47〜51のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様53：多価補体活性化欠乏抗体がAChRへの結合について抗-AChR Fab-637と競合する、態様47〜52のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
態様54：多価補体活性化欠乏抗体が抗-AChR Fab-637と同一のエピトープに結合する、態様47〜52のいずれか記載の多価補体活性化欠乏抗体。
本明細書において引用した全ての特許、係属する特許出願および他の刊行物は参照により本明細書にその全体を組み入れる。
以下の実施例によって本発明をさらに説明し、これはさらに限定するものと解釈されるべきではない。
実施例
実施例1
IgG1-637およびIgG4-637の生成
オリゴヌクレオチドプライマーおよびPCR増幅
オリゴヌクレオチドプライマーをIsogen Bioscience（Maarssen,The Netherlands）によって合成し、定量した。プライマーを100ピコモル/μlまでH2Oに溶解させ、-20℃で貯蔵した。全てのPCRおよび配列決定プライマーのまとめを図1において表とする。PCRについては、製造業者の指示に従ってPfuTurbo（登録商標）Hotstart DNAポリメラーゼ（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands）を用いた。各反応ミックスは、20μlの合計容量の（ポリメラーゼを供給した）PCR反応緩衝液中に、200μMの混合dNTP（Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands）、6.7ピコモルの順方向および逆方向の両プライマー、100ngのゲノムDNAまたは1ngのプラスミドDNAおよび1単位のPfuTurbo（登録商標）Hotstart DNAポリメラーゼを含有した。PCR反応は、32-サイクルのプログラム：2分間の95℃における変性；30秒間の95℃、30秒間の60〜70℃グラジエント（またはもう1つの特別なアニーリング温度）、および3分間の72℃の30サイクル；10分間の72℃における最終延長を用い、TGradient Thermocycler 96（Whatman Biometra, Goettingen, Germany）で行った。適切であれば、さらなる分析またはプロセッシングまでPCR混合物を4℃で貯蔵した。
アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動は、1×トリス酢酸EDTA緩衝液中、50mlのゲルを用い、Sambrook（Sambrook J. and Russel, D.V. Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3nd Ed., Cold Spring Harbor, 2000）に従って行った。ゲル中に臭化エチジウムを含む、UV光下で観察することによって、DNAを可視化した。ゲルイメージは、CCDカメラおよびイメージ分析システム（GeneGnome；Syngene, via Westburg B.V., Leusden, The Netherlands）によって記録した。
PCR産物および酵素消化産物の分析および精製
所望のPCR断片の精製は、製造業者の指示に従い、MinElute PCR Purification Kit（Qiagen, via Westburg, Leusden, The Netherlands；製品番号28006）を用いて行った。単離されたDNAはUV分光測定によって定量し、質はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
あるいは、1％トリス酢酸ETDAアガロースゲルを用いて（例えば、多数の断片が存在する場合には）アガロースゲル電気泳動によってPCRまたは消化産物を分離した。所望の断片をゲルから切り出し、製造業者の指示に従って、QIAEX II Gel Extraction Kit（Qiagen；製品番号20051）を用いて回収した。
UV分光測定によるDNAの定量
製造業者の指示に従い、NanoDrop ND-1000分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を用い、核酸の光学密度を決定した。DNA濃度は、260nmにおける光学密度（OD）の分析によって測定した（1 OD260nm 単位/cm＝50μg/ml）。全ての試料について、核酸を溶解させた緩衝液を参照として用いた。
制限酵素消化
制限酵素および補充物はNew England Biolabs（Beverly, MA, USA）またはFermetas（Vilnius, Lithuania）から入手し、製造業者の支持に従って用いた。
DNA（100 ng）を10μlの最終容量の適当な緩衝液中で5ユニットの酵素で消化した（反応容量は適切にスケールアップした）。消化は推奨される温度にて最小60分間インキュベートした。適合しない緩衝液または温度要件を含む制限酵素での二重消化を必要とする断片では、消化を順次行った。もし必要ならば、消化産物をアガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製した。
DNA断片の連結
DNA断片の連結は、製造業者の指示に従い、Quick Ligation Kit（New England Biolabs）で行った。各連結では、ベクターDNAをほぼ3倍モル過剰のインサートDNAと混合した。
大腸菌（E.coli）の形質転換
製造業者の指示に従い、熱ショック方法を用い、プラスミドDNA（1〜5μlのDNA溶液、典型的には2μlのDNA連結ミックス）をOne Shot DH5a-T1RまたはMACH-1 T1Rコンピテント大腸菌細胞（Invitrogen, Breda, The Netherlands；製品番号12297-016）に形質転換した。次に、細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含有するLuria-Bertani（LB）寒天プレート上で平板培養した。プレートを、細菌コロニーが明らかとなるまで37℃にて16〜18時間インキュベートした。
PCRによる細菌コロニーのスクリーニング
HotStarTaq Master Mix Kit（Qiagen；製品番号203445）、および適当な順方向および逆方向プライマーを用い、コロニーPCRを介して、細菌コロニーを、所望の配列を含有するベクターの存在についてスクリーニングした。選択されたコロニーを20μlのピペットの先端に軽く触れさせ、小規模の培養のために2mlのLB中で軽く触れさせ、次いで、PCRミックスに再懸濁させた。PCRは、35-サイクルのプログラム：15分間の95℃における変性；30秒間の94℃、30秒間の55℃および2分間の72℃の35サイクル；続いての、72℃における10分の最終延長工程を用いてTGradient Thermocycler 96で行った。適切であれば、アガロースゲル電気泳動による分析まで、PCR混合物を4℃で貯蔵した。
大腸菌培養からのプラスミドDNAの単離
製造業者の指示に従い、Qiagen（via Westburg, Leusden, The Netherlands）からの以下のキットを用い、プラスミドDNAを大腸菌培養から単離した。バルクプラスミド調製（50〜150ml培養）では、HiSpeed Plasmid Maxi Kit（製品番号12663）またはa HiSpeed Plasmid Midi Kit（製品番号12643）を用いた。小規模のプラスミドの調製（±2mlの培養）では、Qiaprep Spin Miniprep Kit（製品番号27106）を用い、（キットと共に提供された）50μlの溶出緩衝液にDNAを溶出させた。
DNA配列決定
配列分析では、プラスミドDNA試料をAGOWA（Berlin, Germany）に送った。配列は、ベクターNTI最新ソフトウエア（Informax, Oxford, UK）を用いて分析した。
HEK-293F細胞における一過性発現
Freestyle(商標)293-F（懸濁増殖および化学的に規定されたFreestyle培地に適合したHEK-293サブクローン、例えば、HEK-293F）細胞はInvitrogenから入手し、293fectin（Invitrogen）を用いる製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。
IgG1-637の生成
Fab-637（Graus, YF et al., J Immunol 158, 1919（1997））の軽鎖およびFdコード配列を、pComb3細菌発現ベクターから、ヒトIgG1 Fcのための配列を含有する哺乳動物ベクターplgG1にクローン化した。Fd配列はXhoIおよびBstEIIを用いてクローン化し、XbalおよびSacIを軽鎖配列で用いた。得られたプラスミドをplgG1-637と命名した。plgG1-637においては、各鎖の発現は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサー（hCMV P/E）エレメントによって調節し、H鎖の分泌はマウスH鎖リーダーペプチドによって調節し、およびL鎖の分泌はマウスκリーダーペプチドによって調節した。
CHO-K1細胞（ATCC番号CCL-61）は、10％胎児ウシ血清（Bodinco, Alkmaar, The Netherlands）を補足したHAM’s F12（Gibco/Invitrogen）中で培養した。製造業者のマニュアルに従い、リポフェクチン（Gibco/Invitrogen）を用いて細胞をplgG1-637でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を懸濁培養に適合させた。モノクローナル安定トランスフェクト細胞は、栄養要求株-ベースの選択および限界希釈によって得た。最高の生産者を大規模な生産のために選択された。中空繊維培養により、558mgのプロテインG-精製IgG1-637を得た。
IgG1-637フラグの生成
フラグタグを、競合実験のために、IgG1-637重鎖のカルボキシ末端に付加した。HCの停止コドンを含有する3268bpの断片を、XhoIおよびSalIを用いてplgG1-637からpBluescribe IIKS＋（Invitrogen）にサブクローンし、プラスミドpBS-HCが得られた。停止コドンを置き換えるNheI制限部位は、製造業者のマニュアルに従い、QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA, USA）と共にプライマーON-Nhel-mutm（図1）および相補的プライマーを用いる突然変異誘発によって挿入し、ベクターpBS-HC-NheIを得た。pBS-HCの停止コドンおよびSalI部位の間の領域を、順方向プライマーON-Nhel-Flag（図1）を用いるPCRによって増幅した。プライマーON-Nhel-FlagはNheI部位およびフラグタグ（DYKDDDDK）のコード配列、続いて、停止コドンをPCR産物に付加した。断片を精製し、NheIおよびSalIでpBS-HC-NheIにクローン化し、その結果、プラスミドpBS-HC-NheI-フラグを得た。pBS-HC-NheI-フラグからのXhoI-SgrAI断片をplgG1-637にサブクローンした。
pConLamMGの構築：IgG4-637の軽鎖の生産のためのベクター
抗-MGのVLコード領域は、プライマーMGLCexforおよびRACElambda1（図1）を用い、plgG1-637からPCRによって増幅し、pConLam2へのクローニングのための適当な制限部位および理想的なKozak配列を導入した。PCR産物およびpConLam2（Lonza Biologics）ベクターをHindIIIおよびAvrIIで消化し、ゲルから精製した。VL断片およびpConLam2HindIII-AvrII断片を連結させ、コンピテントDH5a-T1R細胞に形質転換した。（プライマーpConG1seq1およびpEE13.4seqrev（図1）を用いる）コロニーPCRによって10のコロニーをチェックし、8は正しいインサートサイズを含むことが判明した。2つの陽性コロニーから、50mlの培養を増殖させた。プラスミドDNAを単離し、インサートの配列分析によって構築体をチェックし、正しいことが判明した。1つのクローンをさらなる増殖のために選択し、pConLamMGと命名した。
pTomG4の構築；ヒトIgG4の定常領域と共にヒトIgGの可変重鎖領域の発現用のベクター
ゲノムDNAをボランティアの血液試料から単離し、プライマーIgG4gene2fおよびIgG4gene2r（図1）でのPCRにおいて鋳型として用い、IgG4の重鎖の完全なゲノム定常領域を増幅し、クローニング用の適当な制限部位を哺乳動物発現ベクターpEE6.4（Lonza Biologics）に導入した。PCR断片を精製し、pEE6.4にクローン化した。このために、PCR産物をHindIIIおよびEcoRIで消化し、続いて、制限酵素を加熱不活化した。pEE6.4ベクターをHindIIIおよびEcoRIで消化し、続いて、制限酵素を加熱不活化し、エビアルカリ性ホスファターゼでベクター断片を脱リン酸化し、続いて、ホスファターゼを加熱不活化した。IgG4断片およびpEE6.4HindIII/EcoRI脱リン酸化ベクターを連結し、コンピテントMACH1-T1R細胞（Invitrogen）に形質転換した。3つのクローンをLB中で増殖させ、プラスミドDNAを小さな培養（1.5ml）から単離した。制限消化は、pEE6.4ベクター中のIgG4断片のクローニングに合致するパターンを明らかにした。2つのクローンからのプラスミドDNAをDH5a-T1RE. coliに形質転換し、プラスミドDNAを単離し、構築体をインサートの配列分析によってチェックし、1つのクローンが、イントロン中のいくつかの些細な差以外は、GenbankデータバンクからのゲノムIgG4クローンと同一であることが判明した。これらの差は、恐らくは、Genbank配列における多形またはPCR-導入変化いずれかである。プラスミドをpTomG4と命名した。
pTomG4MGの構築：IgG4-637の重鎖の生産のためのベクター
プライマーMGHCexforおよびMGHCexrev（図1）を用い、抗-MGのVHコード領域をplgG1637からPCRによって増幅し、pTomG4へのクローニング用の適当な制限部位、および理想的なKozak配列を導入した。PCR断片をゲル精製し、pTomG4にクローン化した。このために、PCR産物をHindIIIおよびEsp3Iで消化し、ゲル精製した。pTomG4ベクターをHindIIIおよびEsp120Iで消化し、ベクター断片をゲルから単離した。VH断片およびpTomG4HindIII-Bsp120I断片を連結し、コンピテントDH5a-T1R細胞に形質転換した。（プライマーpConG1seq1およびpEE13.4seqrevを用いる）コロニーPCRによって12のコロニーをチェックし、正しいインサートサイズを全てが含有することが判明した。2つの陽性コロニーから、50mlの培養を増殖させた。プラスミドDNAを単離し、構築体をインサートの配列分析によってチェックし、pIgG1-637プラスミドが提供された配列とは異なる2ヌクレオチド置換を除いて正しいことが判明した。これらの2つの置換はサイレントであって、それらは結果を伴わないことを除いて元の配列中の失敗に由来すると結論された。選択されたクローンをpTomG4MGと命名した。
IgG4-637の生産のための、CHO-K1SV細胞におけるpTomG4MGおよびpConLamMGの安定な共-トランスフェクション
pTomG4MGおよびpConLamMGベクターをSalIで線状化し、精製した。線状化されたベクターは、製造業者の指示に従い、ヌクレオフェクター（Amaxa）を用いるヌクレオフェクションによってCHO-K1SV細胞（Lonza Biologics）にトランスフェクトした。グルタミン欠乏培地中の50 μM MSXを用いて、ベクターの安定な組込みにつき選択し、最高量のIgG4を生じるクローンを選択した。最終クローンをスピナーフラスコ中の5リットルバッチ培養としてCD-CHO（Invitrogen）中で増殖させた。
電子顕微鏡測定。3mm直径の肋間筋バイオプシー断片を固定緩衝液（0.1Mリン酸緩衝液pH＝7.4中の2.5％グルタルアルデヒド）に沈め、0.1リン酸緩衝液pH7.4中の1％四酸化オスミウムで後固定し、段階的エタノールシリーズを通じて脱水し、エポキシ樹脂（Glycid ether 100, Serva, Heidelberg, Germany）中に包埋した。終板をトルイジン青色-染色セミ-薄セクションに位置させた。選択された領域からの超薄セクションを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛でコントラストをつけ、Philips CM 100電子顕微鏡で分析した。
実施例2
IgG4-637抗体の精製
IgG4-637は組織培養上清から精製した。先ず、上清を0.20μMデッド-エンドフィルターで濾過した。次いで、上清を5mlのプロテインAカラム（rProtein A FF, Amersham Bioscience）上に負荷し、0.1Mクエン酸-NaOH、pH3で溶出させた。溶出物を2Mトリス-HCl、pH9で直ちに中和し、12.6mMリン酸ナトリウム、140 mM NaCl、pH 7.4（B.Braun, Oss, The Netherlands）に対して一晩透析した。透析の後、試料を0.20 μMデッド-エンドフィルターで滅菌濾過した。
試料をネフロメトリーおよび280nmにおける吸光度によってIgGの濃度についてテストした。
実施例3
IgG4-637抗体の非還元SDS-PAGE分析
実施例2に記載された精製の後、IgG4-637を非還元SDS-PAGEで分析した。用いたビス-トリス電気泳動方法はLaemmli方法（Laemmli, UK, Nature 227, 680（1970））の修飾であり、そこでは、試料を中性pHで泳動させた。SDS-PAGEゲルをクーマシーで染色し、GeneGenius（Synoptics, Cambridge, UK）を用いてデジタル的にイメージした。
図2で理解できるように、IgG4-637は、テトラマーIgG4分子を表す主なバンド以外に、文献（Schuurman, J. et al., Mol Immunol 38, 1（2001）, Angal, S. et al., Mol Immunol 30, 105（1993）, Colcher, D. et al., Cancer Res 49, 1738（1989）, King, DJ et al., Biochem J 281（Pt 2）, 317（1992）, Petersen, JG et al., J Biol Chem 249, 5633（1974））に記載されているように、実質的量の半分子（すなわち、1つの重鎖、1つの軽鎖）を有することが示される。
実施例4
IgG1-637およびIgG4-637抗体の補体結合の分析
IgG1-637、IgG4-637およびポリクローナルイソタイプ対照の補体結合はELISAによってテストされた。簡単に述べれば、マイクロタイタELISAプレート（Greiner, Germany）を、PBS中に10μg/ml〜0.15μg/mlまで系列希釈したテスト抗体で室温にて一晩被覆した。プレートを空にし、ウエルを、C1q ELISAについてはウエル当たり200μlのC1q緩衝液（0.1％w/vゼラチンおよび0.05％ v/v tween-20）を補足したPBS）で、およびC3およびC4 ELISAについてはウエル当たり200μlのPBS/BSA緩衝液（1％BSAを補足したPBS）でブロックした。ELISAを室温にて60分間インキュベートした。引き続いて、プレートを空にした。C3およびC4 ELISAでは、ウエルを200μl PBST（0.05％（v/v）Tween-20を補足したPBS）で3回洗浄した。引き続いて、C1q ELISAでは、ウエルを、C1q緩衝液（100μl/ウエル、37℃、1時間）中の2μg/mlのヒトC1q（Quidel, San Diego, CA, USA, A400）と共にインキュベートした。C4およびC4 ELISAでは、ウエルを、TBS緩衝液（15 mMトリスpH 7.45, 145mM NaCl, 10mM CaCl2, 5mM MgCl2, 0.2％ BSA、1時間37℃）中に1：33希釈した100μlのヒトプール血清と共にインキュベートした。プレートをC3およびC4 ELISAではPBSTで、C1qELISAではC1q緩衝液で洗浄した（3×）後、C1q ELISAでは、ウエルを、C1q緩衝液中に希釈した（1：1000,100μl/ウエル、室温、1時間）ウサギ抗ヒトC1q（DAKO, Glostrup, Denmark, A0136）と共にインキュベートした。C3 ELISAでは、プレートを、PBST/BSA（0.1％BSAを補足したPBST）中に1：100希釈した（1：100,100μl/ウエル、室温、1時間）マウス抗ヒトC3（DAKO, クローンHAV3-4, M0836）と共にインキュベートした。C4 ELISAでは、プレートを、PBST/BSA中に希釈した（1：2000,100μl/ウエル、室温、1時間）マウス抗ヒトC4（Brunschwig,Basel,Switzerland,Hyb 162-02）と共にインキュベートした。プレートをC3およびC4 ELISAについてはPBSTで、およびC1q ELISAではC1q緩衝液で洗浄した（3×）後、C1q ELISAでは、ウエルを、ELISA緩衝液中に希釈した（1：2500,100μl/ウエル、室温、1時間）HRP-コンジュゲーテッドブタ抗ウサギIgG-Fc（DAKO, P0399）と共にインキュベートした。C3およびC4 ELISAでは、ウエルを、PBST 0.1％BSA（100μl/ウエル、1時間,室温）中に希釈したHRPコンジュゲーテッドウサギ抗マウスIgG（Jackson Immuno Research, Westgrove, USA, 315-035-046）と共にインキュベートした。その後、プレートを3回洗浄し、アッセイを、新たに調製した1mg/ml ABTS溶液（ABTS：2,2’-アジノ-ビス［3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸］；10mlのABTS緩衝液中の5mgの2つの錠剤,Boehringer Mannheim, Ingelheim, Germany）で、暗所にて、室温で30分間展開させた。吸光度はELISAプレートリーダー（Biotek Instruments Inc., Winooski, USA）で405nmにて測定した。分析するために、ヒトIgGイソタイプによる補体活性化が補体の源に依存するならば、ヒトおよびアカゲザル双方の血清をテストした。
図3に示すように、精製されたIgG1-637はポリクローナルヒトIgG1と同程度効果的に補体に結合し、それを活性化させた。IgG4-637およびポリクローナルIgG4対照は補体に結合せず、またはそれを活性化しなかった。
実施例5
IgG1-637、IgG1-637-フラグおよびIgG4-637抗体の特異性および結合特性の分析
ラジオイムノアッセイによる特異性の決定
IgG1-637、IgG1-637-flagおよびIgG4-637の特異性は、（ヒトTE671横紋筋肉種細胞系（Luther, MA et al., J Neurosci 9, 1082（1989）から調製された）ヒトAChR、（Torpedo californicaから調製された）Torpedo AChR、ハイブリッドAChR（ヒトα1サブユニットおよびTorpedo b,gおよびdサブユニット（Loutrari, H et al., Clin Exp Immunol 109, 538（1997））、または組換えヒトα1-210ペプチドを用い、ラジオイムノアッセイ（Lindstrom, JB et al., Methods Enzymol 74（Pt C）, 432（1981））によって決定した。AChRを125I-標識α-ブンガロトキシン（Amersham）で標識し、異なる試料濃度および共沈殿としてのヒト血清と共にインキュベートした。ヒトIgGは、ポリクローナルヤギ抗ヒトIgとの4℃における4時間のインキュベーション、および15000gでの10分間の遠心によって沈殿させた。ペレットを0.5％ トリトン X-100 PBSで2回洗浄し、γ-カウンターで測定した。
IgG1-637は、TE671細胞の膜抽出物からのヒトAChRに結合した（図4A）。AChRのヒトαサブユニットについてのFab-637の特異性は、全長サイズのIgG1-637で保持され、それは、ヒトα1およびTorpedo bgdサブユニットと共に組換えヒト/TorpedoハイブリッドAChR（図4C）に結合したが、野生型Torpedo AChRに結合しなかった（図4D）。IgG1-637もまた組換えヒトα1-210ペプチドに結合せず（図4B）、立体配座エピトープに対する特異性が確認された。ヒトAChR以外で、霊長類筋肉の免疫組織化学染色によって判明したように、IgG1-637はアカゲザルのAChRに結合したが、通常のマーモセットサルのものには結合しなかった。
IgG1-637およびIgG4-637のヒトAChRへの結合を、ヨウ素化ブンガロトキシンを用いるラジオイムノアッセイによって比較した。図5A中の結果は、双方の抗体がほぼ1.7nMの同一解離定数にてヒトAChRに結合することを示す。
フローサイトメトリーを用いるAChRへの結合の測定
TE671またはMITC細胞（Wakkach, A. et al., Am J Pathol 155, 1229（1999））上で発現されるAChRへのIgG1-637の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Moutain View, CA, USA）によって測定した。トリプシン処理した細胞を同一抗体試料と共にインキュベートし、続いて、FITC-コンジュゲーテッドヤギ抗ヒトIgと共にインキュベートした。シグナルはEASキット（Flow-Amp Systems, Cleveland, USA）によって増幅した。細胞質AChRへのIgG1-637結合の検出には、細胞にパラホルムアルデヒド溶液（2％）を浸透させた。
図6で理解できるように、IgG1-637は無傷TE671およびMITC細胞に、および細胞質AChRに結合した。
ラジオイムノアッセイにおけるIgG1-637およびIgG4-637とIgG1-637-フラグとの競合の測定
IgG4-637およびIgG1-637とIgG1-637-フラグとの競合は、TE671細胞膜抽出物からのAChRを用いるラジオイムノアッセイによって測定した。この目的では、異なる濃度のIgG1-637またはIgG4-637を固定した濃度のIgG1-637-フラグと予備混合し、次いで、これを125I-a-ブンガロトキシンで標識したヒトAChRと共にインキュベートした。ほぼ2ナノモルのAChRを過剰の125I-a-ブンガロトキシンで標識し、合計容量75μL中の5ナノモルのIgG1-637-フラグおよび異なる濃度のIgG1-637またはIgG4-637と共に4°Cにて8時間インキュベートした。各試料に、2μgのマウス抗-FLAG M2（Sigma）および1μLの正常マウス血清（共沈殿）を加え、さらに12時間インキュベートした。マウス抗体を、ポリクローナルヤギ抗マウス抗体を含有する100μLの予め吸収されたヤギ血清で4°Cにて4時間沈殿させた。予め吸収させたヤギ血清を、ヒト血清（1：1（v/v））との37°Cにおける2時間のインキュベーションによって調製し、遠心および濾過-滅菌によって清澄化した。次いで、試料を遠心し、前記したように処理した。
図5Bで理解できるように、フラグタグド抗体の沈殿は、2倍過剰のIgG1-637またはIgG4-637においてほぼ50％まで容量-依存的に減少した。これにより、IgG1-637およびIgG4-637の結合特性の同様性が確認される。
AChRの抗原変調
抗体によるTE671細胞の表面AChRの増強された分解は、IgG1-637、IgG4-637およびヒトIVIgの系列希釈と共に密集細胞をインキュベートすることによって測定した。細胞を、40μMシクロヘキシミドを補足したDMEM中に希釈した抗体と共に3時間インキュベートした。残存するAChRを、抗体を含まない同一培地中の過剰の125I-標識a-ブンガロトキシンで1時間標識し、PBSで3回洗浄した。非特異的結合は、125l-a-ブンガロトキシンとのインキュベーションに先立って、細胞を未標識ブンガロトキシンと共にインキュベートすることによって測定した。
図7は、IgG1-637およびIgG4-637双方は、培養したTE671細胞の細胞表面のAChRレベルを低下されることによって抗原を変調できたことを示す。ヒトIVIg調製物からの対照免疫グロブリンはAChRレベルに対して効果を有しなかった。
実施例6
IgG1-637を用いるMGについての受動的導入モデルの確率
インビボにてIgG1-637と競合するIgG4-637の能力をテストするために、動物モデルを確立した。IgG1-637のみがヒトおよびマカクザルAChRに結合するので、アカゲザル（Macaca mulatta）におけるIgG1-637での受動的導入実験を行った。
動物実験は、オランダ政府の規定に従って、Committee on Animal Welfare（DEC）の許可の下にBiomedical Primate Research Center（Rijswijk, The Netherlands）で行った。まず、ヒトおよびサルバイオプシーにおける終板へのIgG1-637の結合を免疫組織化学によって分析した。染色強度の定量的比較によって、IgG1-637はヒト受容体と比較して10倍低下した親和性でもってサル受容体に結合したと見積もられた。これより、0.5mg/kgまたは1mg/kgの3つの容量を安全に用いることができたと計算された。3および4kgの間の雌Macaca mulattaサルに3容量の抗体を連続日に注射した。動物が呼吸器系の問題と共に筋無力症クリーゼを生じた場合には、アセチルコリンエステラーゼ処置を注射するよう準備した。しかしながら、処置したサルのいずれもMGの臨床的兆候を示さなかった（表1）。
第一の注射から7日後に、動物を麻酔し、反復神経刺激後に筋肉化合物活動電位（CMAP）を測定することによって神経筋肉伝達をテストした。このために、複合筋活動電位（CMAP）の減少を屈曲第5指（flexi digiti quinti）で測定した。サルはケタミンで麻酔した。刺激および記録のために、2つの小さな単極針電極を皮膚の下に入れた。減少した応答を検出するために、0.2ミリ秒の10反復刺激をEMGシステム（Nicolet Biomedical Inc., Madison, WI, USA）で3.5および10Hzにおいて与えた。同一筋肉の3連続測定の平均がCMAPの負の（上方向）ピークの振幅および面積双方の少なくとも10％の減少を示した場合、テストは陽性と考えられた。0.5mg/kg/日を注射した動物は正常な神経筋肉伝達を有したが、1mg/kg/日を注射したサルはCMAPの減少する応答を有し、これはMGの典型的な兆候である。
引き続いて、より高い用量のIgG1-637をテストした。1.7mg/kg/日および5mg/kg/日（連続日における3用量の抗体、合計用量5mg/kgおよび15mg/kg）において、IgG1-637は全ての動物において臨床的兆候を引き起こした（表1および図12）。兆候は最初の注射から1および3日のちの間に開始し、7日まで継続した。病気のピークに置いて、動物は余り活動的ではなく、肢、手および足の弱化のため登ることができず、食べるのが困難であったが（Osserman, grade2a（Osserman, KE. et al., Mt Sinai J Med 38, 497（1971））、呼吸器系の問題は有しなかった。この相は2〜3日間継続した。1.7mg/kg/日あるいは5mg/kg/日のIgG1-637を注射した全ての動物は、それらの条件が既に改良し始めたとしても、最初の注射から7日後にCMAPの減少する応答を有した。臨床的兆候は動物の血清中の抗体力化と平行し、これはIgG1-637の第2の注射後にゆっくりと減少した（図8、合計用量は図面に示す）。
（表１）IgG1-637の受動的導入
Figure 0005376574
実施例7
原理の証明：MGについての受動的導入モデルを用いるインビボ競合実験におけるIgG4-637の効果
IgG4-637の効果をインビボ競合実験でテストした（図12）：5mg/kg/日（合計用量15mg/kg）のIgG4-637またはヒト静脈内免疫グロブリン（IVIg）を3連続日の朝に注射した。最初の注射から6時間後に、3実験日の各々に、動物に1.7mg/kg/日（合計用量5mg/kg）のIgG1-637またはIVIgの第2の注射を与えた。血液試料を異なる日に採取し、アセチルコリン受容体自己抗体RRAキット（Acetylcholine Receptor Autoantibody RRA Kit）（IBL, Hamburg Germany）を用いて抗ヒトAChR力価について分析した。
5mg/kg/日 IvIgおよび1.7mg/kg/日 IgG1-637を受ける動物（N＝4）は臨床的には病気であり、CMAPの減少した応答を有した。負（上向き）ピークの面積および振幅の双方は3および5Hzにおいて22％を超えて減少した（図9Aおよび図9D、合計用量は図面中に示す）。5mg/kg/日 IgG4-637およびIvIgを受ける2匹の動物はいずれの臨床的兆候も示さず（図12）、また、この動物における神経筋肉伝達は正常であった（図9Bおよび図9E）。興味深いことには、実験日の朝にIgG4-637、および後にIgG1-637を受けた動物（n＝5）はいずれの臨床的兆候も生じなかった（図12）。これらの動物は、これらはAChRに対する最高力価の抗体を生じた（図8B）という事実に拘わらず、損なわれた神経筋肉伝達を有しなかった（図9Cおよび図9F）。
肋間筋肉のバイオプシーを抗体の最初の注射から7日後に採取した。バイオプシーを融解イソペンタン上で直ちに凍結させ、-80°Cで貯蔵した。投与されたIgG1-637およびIgG4-637を可視化するために、ヒトアロタイプGm1（a）（HP6184）およびヒトIgG4（HP6196）に対して向けられたマウス抗体を用いた。この点に関し、HP6184はIgG1-637（アロタイプa）を含むヒトIgG1のサブセットのみに対して特異的であることに注意するのは重要である。加えて、HP6184およびHP6196の双方をアカゲザルにおけるヒトIgG1およびIgG4の検出について選択した。というのは、双方のマウス抗体は免疫組織化学によって決定されるようにアカゲザルの内因性IgGと交差反応性ではないことを示したからである。
免疫組織化学では、肋間筋肉の凍結されたバイオプシーをクリオトームを用いて6μmで切断し、アセトン中で固定し（10分,室温）、内因性ペルオキシダーゼについてブロックし、10％正常ヤギ血清を用いてFc-受容体に対する非特異的結合についてブロックした。クリオセクションを所定の最適希釈にてHP6184およびHP6196と共にインキュベートし、引き続いて、FITCコンジュゲーテッドヤギ-抗マウスIgG（GaM IgG-FITC）（1：100；30分）およびペルオキシダーゼコンジュゲーテッドヒツジ-抗-FITC（Sh-抗-FITC-PO）（1：100；30分）と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ（活性）をアミノ-エチル-カルバゾール（AEC；赤色）で可視化し、核をヘマトキシリン（青色）で染色した。アカゲザル筋肉におけるAchRの極所化を確認するために、クリオセクションをAlexa 495コンジュゲーテッドブンガロトキシン（1：300,30分）で染色した。
7日にIgG1-637およびIgG4-637で処理した動物から採取した肋間バイオプシーは、IgG1-637およびIgG4-637双方が神経筋肉接合に位置することを示した（図10C、図10D）。HP6184またはHP6196の省略の結果、陰性染色がもたらされた。筋肉バイオプシーにおける神経筋肉接合の極所化は、ブンガロトキシンでの陽性染色によって確認された。
終板はAChR（a-ブンガロトキシンを使用,図10B,左側）、および膜攻撃複合体（MAC, C5b-9）（図10B,中央）双方について強く二重に染色された。補体タンパク質C4についての染色を用いて同一の結果が得られた（図示せず）。未処理対照動物の終板では活性化された補体タンパク質は見出されなかった（図10A）。したがって、IgG4-637はアカゲザル終板に結合したが、IgG1-637の結合および補体の活性化を完全には妨げなかったようである。しかしながら、バイオプシーの電子顕微鏡分析は、シナプス後膜の超構造が保持されたことを示した（図10E）。シナプス後折り畳みの典型的な筋無力性破壊は存在せず、これは、シナプス後膜はある程度の補体活性化を許容したことを示す。
図10Fは、肋間筋肉における終板領域の電子顕微鏡写真を示す。アスタリスクは神経終末を示し、矢印および矢じりはシナプス後膜の折り畳みを示す。図10F〜Aは、5mg/kg IgG1-637で処理した動物の終板領域を示す。この動物は軽い筋肉弱化を有したが、CMAPの減少を有しなかった。シナプス後膜はひどく損傷され、シナプス間隙は広がり（ダガーで示す）、シナプス後折り畳みは浅く、広がっている（矢じりによって示す）。図10F-Bは、15mg/kg IgG4-637で処理された動物の終板領域を示す。矢印は、無傷シナプス後折り畳みを示し；シナプス間隙は神経終末と隣接している。図10F-Cおよび10F-Dは、5mg/kg IgG1-637および15mg/kg IgG4-637で処理された2匹の動物の終板領域を示す。シナプス後膜の折り畳みは無傷である（矢印）。
アカゲザルからの複合筋活動電位の分析を図11に示す。（合計用量はこの図面中で示す）。
実施例8
IgG1-637および/またはIgG4-637処理サルからの血清によるTE671細胞の表面AChRの抗原変調
抗原変調によってAChR喪失を誘導する能力は、処理後異なる時点において抗体処理サルから得られた血清において決定した（図13A）。実施例7に示したのと同一のサルを用いた。簡単に述べると、0、1および2日に、サルを各抗体で実施例7に記載したように注射した。密集TE671細胞をシクロヘキシミドおよび抗体処理マウスからの血清で処理した；血清を0.1nMの637抗体濃度の最終濃度まで希釈した。IgG1-637処理動物からの血清は3日までに表面にAChRの最大分解を誘導した。IgG4-637処理動物からの血清は同一抗体濃度において抗原変調を誘導しなかった。IgG1-637およびIgG4-637の組合せを注射したサルからの血清は、中程度のレベルの抗原変調を誘導した。したがって、抗原変調を誘導するIgG4-637の能力は、アカゲザルにおけるこの抗体の存在の後に変化した（実施例5および図7を比較されたい）。これは、アカゲザルにおける存在の間に、IgG4-637の特性が、IgG4-637が一価結合特性を得て、それにより、AChRと架橋結合する能力を失うように変化したことを示す。IgG4-637が一価結合特性を得ることができる1つのメカニズムは、ヒトにおいて提案されたメカニズム（Aalberse and Schuurman（2002）Immunology 105：9-19）と同様にサルIgG4とのインビボ交換である。
637処理サルから誘導された血清の保護効果を調べるために、TE671細胞を1 nM lgG1 637および（10、1または0.1nMの637抗体濃度の最終濃度まで希釈した）サル血清の希釈物で処理した（図13B）。IgG1-637で処理されたサルの血清の添加はAChRの喪失を大きくした。IgG4-637で処理されたマウスからの5日に得られた血清は、抗原変調をほとんど完全に妨げた。これは、再度、IgG4-637の特性がアカゲザルにおけるインキュベーションの後に変化したことを示し、IgG4-637が、IgG1-637によって誘導される抗原変調をブロックすることができる一価結合特性を得たことを示唆する。
実施例9
pConG1f7D8の構築：7D8-IgG1の重鎖の生産のためのベクター
CD20特異的HuMab-7D8（WO 04/035607）のVHコード領域は、プライマー7D8VHexforおよび2F8HCexrev（図1）を用いる、この領域を含有するpGemT（Promega, Madison, USA）ベクターからのPCRによって増幅させ、pConG1f0.4（Lonza Biologics, Slough, UK）へのクローニング用の適当な制限部位、ヒトIgG1のゲノム定常領域（アロタイプf）を含有する哺乳動物発現ベクター、および理想的なKozak配列（GCCGCCACC, （Kozak M et al., Gene 234（2）, 187-208（1999））を導入した。製造業者の指示に従い、PCR-Script（登録商標）Cam Cloning Kit（Stratagene）を用い、PCR断片をpPCR-Script CAM（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands）にクローン化した。いくつかのクローンを配列決定し、予測された配列を含有するクローンを将来用いるために選択した。
VH断片をゲル精製し、pConG1f0.4にクローン化した。このために、HindIIIおよびApaIでの消化およびゲル精製の後に、VH断片をpPCR-Script CAMベクターから単離した。
pConG1f0.4ベクターをHindIIIおよびApaIで消化し、ベクター断片をゲルから単離し、続いて、エビアルカリ性ホスファターゼ（New England Biolabs）で脱リン酸化した。VH断片およびpConG1f0.4 HindIII-ApaI脱リン酸化断片を連結し、コンピテントDH5a-T1R細胞（Invitrogen）に形質転換した。8つのコロニーを（プライマー）pConG1seq1およびHCseq5（図1）を用いる）コロニーPCRによってチェックし、全てのコロニーは正しいインサートサイズを含むことが判明した。クローンをさらなる実験ために選択し、pConG1f7D8と命名した。
実施例10
pConK7D8の構築：7D8-IgG1、7D8-IgG4および7D8-HGの軽鎖の生産のためのベクター
プライマー7D8VLexforおよび7D8VLexrev（図1）を用い、CD20特異的HuMab-7D8（WO 04/035607）のVLコード領域をこの領域を含有するプラスミドから増幅し、pConKappa0.4（Lonza Biologics）へのクローニング用の適当な制限部位、ヒトIgGの定常κ軽鎖領域（アロタイプkm3）を含有する哺乳動物発現ベクター、および理想的なKozak配列を導入した。
PCR産物およびpConKappa0.4ベクターをHindIIIおよびBsiVVIで消化した。ベクターおよびVL断片を精製し、ベクターをエビアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。VL断片およびpConKappa0.4HindIII-BsiVVI消化ベクターを連結し、コンピテントDH5a T1R E. coliに形質転換した。10のコロニーを（プライマーpConKseq1およびLCseq3（図1）を用いる）コロニーPCRによってチェックし、9のコロニーは正しいインサートサイズを含むことが判明した。
4つのクローンから、プラスミドDNAを単離し、VL領域を配列決定した。3つのクローンは予測された配列を含有し、1つのクローンをさらに用いるために選択し、pConK7D8と命名した。
実施例11
pTomG4の構築：ヒトIgG4の定常領域を有するヒトIgGの可変重鎖領域の発現のためのベクター
ゲノムDNAをボランティアの血液試料から単離し、プライマーIgG4gene2fおよびIgG4gene2r（図1）でのPCRにおいて鋳型として用い、IgG4の重鎖の完全なゲノム定常領域を増幅し、哺乳動物発現ベクターpEE6.4（Lonza Biologics）へのクローニング用の適当な制限部位を導入した。PCR断片を精製し、pEE6.4にクローン化した。このために、PCR産物をHindIIIおよびEcoRIで消化し、続いて、制限酵素を加熱不活化した。pEE6.4ベクターをHindIIIおよびEcoRIで消化し、続いて、制限酵素を加熱不活化し、エビアルカリ性ホスファターゼでベクター断片を脱リン酸化し、続いて、ホスファターゼを加熱不活化した。IgG4断片およびpEE6.4 HindIII/EcoRI脱リン酸化ベクターを連結し、コンピテントMACH1-T1R細胞（Invitrogen）に形質転換した。3つのクローンをLB中で増殖させ、プラスミドDNAを小さな培養（1.5ml）から単離した。制限消化は、pEE6.4ベクターにおけるIgG4断片のクローニングに合致するパターンを明らかにした。ふたつのクローンからのプラスミドDNAをDH5a T1R E. coliにおいて形質転換し、プラスミドDNAを単離し、構築体をインサートの配列分析によってチェックし、1つのクローンは、イントロンにおけるいくつかの些細な差を除いて、GenbankデータベースからのゲノムIgG4クローンと同一であることが判明した。これらの差は、恐らくは、Genbank配列における多形または配列の誤りいずれかである。プラスミドをpTomG4と命名した。SEQ ID NO:14はpTomG4によってコードされたIgG4領域の配列を示す。
実施例12
pTomG47D8の構築：7D8-IgG4の重鎖の生産のためのベクター
pConG1f7D8からのプラスミドDNAをHindIIIおよびApaIで消化し、VH断片をゲル精製した。pTomG4ベクターをHindIIIおよびApaIで消化し、ベクター断片をゲルから単離した。VH断片およびpTomG4HindIII-ApaI断片を連結し、コンピテントDH5a-T1R細胞に形質転換した。4つのコロニーを（プライマーpConKseq1およびHCseq11（図1）を用いる）コロニーPCRによってチェックし、2つは正しいインサートサイズを含むことが判明し、pTomG4骨格の存在はコロニーPCR断片上のMspIでの消化によって確認した。クローンの1つを将来用いるために選択した。このプラスミドをpTomG47D8と命名した。
実施例13
pTomG47D8HGの構築；7D8-HGの重鎖の発現のためのベクター
部位特異的突然変異誘発を用いて、pTomG47D8プラスミド中のIgG4のヒンジエクソンのスプライスドナー部位を破壊した。部位特異的突然変異誘発反応は、プライマーIgG4S228PfおよびIgG4S228Prを用いるQuickChange XL部位特異的突然変異誘発方法に従って行った。24のコロニーをコロニーPCRおよびXmaI消化によってスクリーニングし、（過剰のXmaI部位は突然変異誘発の間に導入した）、全てのコロニーは正しいヌクレオチド変化を含むように見えた。2つの陽性コロニーを一晩増殖させ、プラスミドDNAを単離し、配列決定して、正しい突然変異が導入されたことを確認した。双方は正しい配列を含有せず、1つを将来の増殖のために選択し、pTomG47D8HGと命名した。突然変異誘発プロセスの間のさらなる突然変異の導入を排除するために、pTomG47D8HGの全IgG4コード領域を再度配列決定し、さらなる突然変異は見出されなかった。最終ベクターをpTomG47D8HGと命名した。
実施例14
Hek-293F細胞における一過性発現による7D8-IgG4および7D8-HG（ヒンジレス）の生産
全ての構築体の抗体は、製造業者の指示に従い、293fectinを用い、HEK-293細胞における関連重鎖および軽鎖ベクターを共トランスフェクトすることによって生産した。7D8-IgG1については、pConG1f7D8およびpConK7D8を共発現させた。7D8-IgG4については、pTomG47D8およびpConK7D8を共発現させた。7D8-HGについては、pTomG47D8HGおよびpConK7D8を共発現させた。
実施例15
IgG4およびIgG4-ヒンジレス抗体の精製
全てのIgG4およびヒンジレス抗体を精製した。まず、上清を0.20μMデッド-エンドフィルターで濾過した。次いで、上清を5mlのプロテインAカラム（rProtein A FF, Amersham Bioscience）に負荷し、0.1Mクエン酸-NaOH、pH3で溶出させた。溶出物を2Mトリス-HCl、pH9で直ちに中和し、12.6mMリン酸ナトリウム、140mM NaCl、pH7.4（B. Braun, Oss, The Netherlands）に対して一晩透析した。透析の後、試料を0.20μMデッド-エンドフィルターで滅菌濾過した。
抗体を1単位のPNgase F（Roche）/μg抗体と共に37°Cにて一晩インキュベートすることによって脱グリコシル化し、続いて、プロテインAで精製した。
試料をネフロメトリーおよび280nmにおける吸光度によってIgGの濃度について分析した。
実施例16
ヒトIgG-補足SCIDマウスにおけるIgG4ヒンジレス突然変異体抗体の薬物動態評価
18および22gの間の体重を有する16匹のSCIDマウス（C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River）を実験で用いた。マウスを中央研究所動物施設（Central Laboratory Animal Facility）（Utrecht, The Netherlands）のバリアーユニットに収容し、水および食物を自由に供給したフィルター-トップケージ中で滅菌条件下で維持した。全ての実験はユトレヒト大学の動物倫理委員会によって認可された。
ヒンジレスIgG4変種の薬物動態を調べるために免疫欠乏SCIDマウスを選択した。なぜならば、これらのマウスは、1週間を超えて持続するクリアランス実験に影響し得るヒトタンパク質に対する抗体応答を発生しないからである。これらのIgG-欠乏マウスに高用量の静脈内免疫グロブリン（ヒトマルチドナーポリクローナルIgG）を補足して、生理学的に関連する濃度でのヒトIgGの存在下でヒンジレスIgG4突然変異体のクリアランスを調べた。これは、ヒトにおける条件を密接に表すマウスモデルを提供する。何故ならば、1）二価形態へのヒンジレスIgG4の会合は、IVIGの存在によって妨げられ、および2）ヒンジレスIgG4は新生Fc受容体（FcRn）への結合について他のIgGと競合するはずだからである。FcRnへの結合は、エンドサイトーシス後に細胞内分解からIgGを保護し、その長い血漿中半減期の原因である。
このモデルにおいては、ヒトCD20特異的ヒトmAbクローン7D8からの変種の血漿クリアランスを調べた。ヒンジレスIgG4変種（7D8-HG, ロット992-001-EP）のクリアランス速度を、7D8 IgG1（7D8-F（ab’）2, ロット892-020-XX）からのF（ab’）2断片の正常なヒトIgG4（7D8-IgG4, ロット992-002-EP）のそれと比較した。加えて、酵素的に脱グリコシル化されたヒンジレス変種の調製物をテストした（TH3001-7D8-HG deglyc, ロット991-004-EP）。各抗体を、体重kg当たり約5mg用量に対応する200μl中の0.1mgの用量にて尾静脈を介して4匹のマウスに投与した。モノクローナル抗体を静脈内免疫グロブリンとの1：1混合物にて投与した（60mg/ml, Sanquin, The Netherlands, JFK108ST,請求番号04H04H443A）。合計注射用量は400μl/マウスであり、マウス当たり12.5mgのIVIG用量を与えた。
50μlの血液試料を投与から15分、5時間、24時間、2日、3日、7日および10日後に伏在静脈から収集した。血液をヘパリン含有バイアルに収集し、14,000gにおいて10分間遠心した。血漿をmAb濃度の決定のために-20°Cで貯蔵した。7D8変種の血漿濃度はサンドイッチELISAを用いて決定した。マウスmAb抗-7D8-イディオタイプ抗体（クローン2F2 SAB 1.1（LD2）、ロット0347-028-EP）を捕獲抗体として用いた。0.05％Tweenおよび2％ニワトリ血清を補足したPBSでプレートをブロッキングした後、試料を加え、ELISA緩衝液（0.05％Tween20および2％ニワトリ血清を補足したPBS）中に系列的に希釈し、プレートシェーカー上で室温（RT）にて2時間インキュベートした。注入された抗体を参照として用いた。洗浄の後、プレートを引き続いてペルオキシダーゼ-標識ヤギ抗ヒトF（ab’）2特異的（109-035-097, Jackson Immunoresearch, West Grace, PA）と共にインキュベートし、2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンズジアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）で展開させた。吸光度は405nmにおいてマイクロリーダー（Biotek, Winooski, VT）で測定した。合計ヒトIgG血漿濃度は同様なELISAを用いて決定した。マウスmAb抗ヒトIgG-κクローンMH16（＃M1268, CLB Sanquin, The Netherlands）を捕獲抗体として用いた。ペルオキシダーゼ-標識ヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（＃109-035-098, Jackson, West Grace, PA）を検出のために用いた。
薬物動態分析は、テール修正を施して、濃度-時間曲線からの曲線下面積（AUC）を決定することによって行った。血漿クリアランス速度は用量/AUC（ml/日）として計算した。統計学的検定はGraphPad PRISM vs.4（Graphpad Software）を用いて行った。
図14は上方パネルにおいて時間に対するmAb 7D8変種の濃度の半対数プロット、および下方パネルにおいて合計ヒトIgG濃度を示す。初期合計ヒトIgG濃度は平均して2.3mg/mlであり、10日後に0.47mg/mlまで減少した。7D8 IgG4およびIgG4 HG変種の初期血漿中濃度は94〜180μg/mlの範囲にあり、これはマウスの血漿区画への初期の分布に合致する。F（ab’）2断片については、初期濃度は幾分より低く、平均して62μg/mlであった。上方パネルは、脱グリコシル化調製物を含むヒンジレス変種のクリアランスが無傷IgG4のそれよりも幾分速いが、F（ab’）2断片のそれよりもかなり遅いことを明瞭とする。以下の表は濃度-時間曲線から計算されたクリアランス速度を示す。ヒンジレス変種のクリアランス速度は正常なIgG4のそれよりも2〜3倍高かった。しかしながら、それはF（ab’）2断片のそれよりもほとんど10倍遅かった。重要なことには、脱グリコシル化はヒンジレスIgG4変種のクリアランスの速度に対して有意な効果を有しなかった。
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したがって、生理学的に関連する濃度のヒトIgGの存在下において、ヒンジレス変種のクリアランスは、匹敵する分子サイズを有するF（ab’）2断片のそれよりもかなり遅い。この実験は、生理学的に関連する濃度の競合ヒトIgGの存在下で、ヒンジレスIgG4変種は新生Fc受容体（FcRn）と機能的に相互作用できることを示す。さらに、実験は、ヒンジレスIgG4変種のグリコシル化は血漿クリアランスに影響せず、および非グリコシル化ヒンジレスIgG4は十分にグリコシル化された形態と同様なインビボでの半減期を有することを示す。
配列表
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プライマーの詳細。 IgG4-637抗体を非還元SDS-PAGEで評価した。レーン1：予め染色されたマーカーSeuBlueプラス2（Invitrogen BV, The Netherlands）、レーン2：内部対照、レーン3：IgG4-637。 C1q結合、およびIgG1-637（塗りつぶした四角）、IgG4-637（塗りつぶした丸）およびヒトIgG1およびIgG4イソタイプ対照（対応する塗りつぶしていない記号）の補体活性化。補体活性化は異なる段階でELISAによって決定した。（AおよびB）C1q結合；（CおよびD）C4b沈積；（EおよびF）C3b沈積。ヒト血清をA、CおよびEで用い、アカゲザル血清をB、DおよびFで用いた。 ラジオイムノアッセイによって決定されたヒト抗-AChR mAb IgG1-637の特異性。（A）IgG1-637はTE671細胞からの膜抽出物からのヒトAChRに結合する。（B）ヒトAChRのαサブユニットの細胞外部分を表す、組換えペプチドa1-210への結合は無かった。（C）IgG1-637は、ヒトa1およびTorpedo βγδサブユニットを発現する細胞の膜抽出物からの組換えハイブリッドAChRに結合する。（D）IgG1-637は野生型Torpedo AChRに結合しない。また、対照MG血清はTorpedo AChRと交差反応しなかった。＊NHS-正常ヒト血清；＊MGS-重症筋無力症患者からの血清。 ラジオイムノアッセイによって測定された、TE671細胞からのAChRへのIgG1-637およびIgG4-637の結合。（A）抗体の希釈およびAChRの固定量を用いる結合曲線。データを直角双曲線にフィットさせた。Kbは双方の抗体について1.7ナノモル/Lである。（B）IgG1-637とIgG4-637との比較。固定量のAChRおよびIgG1-637-フラグを競合体抗体と共にインキュベートした。フラグタグド抗体はマウス抗フラグmAb M2で特異的に沈殿した。IgG1-637-フラグの結合は、濃度がそれらのKdを超えれば、IgG1-637およびIgG4-637によって同等に低下した。 IgG1-637のFACS分析。細胞系TE671を発現するヒト胎児筋肉AChRをIgG1-637と共にインキュベートした。ヤギ抗ヒトIg FITC（A）またはヤギ抗ヒトIg FITCでの引き続いての染色のFL-1強度、引き続いてのEASキット（B）を用いるシグナル増幅を示す（特異的染色は灰色で示し、黒色はバックグラウンド染色を示す）。（C）において、浸透したTE671細胞の染色を示す。ヒト胎児および成人筋肉AChRを発現する細胞系MITCをIgG1-637と共にインキュベートし、ヤギ抗ヒトIg FITC（D）で染色した。 TE671細胞の表面AChRの抗原変調。密集細胞をシクロヘキシミドおよび抗体と共にインキュベートした。IgG1-637およびIgG4-637は表面AChRを同等に低下させ、他方、免疫グロブリン（IVIg）は抗体無しの培地と比較して効果を有しなかった。 アカゲザルの血清における抗-AChR抗体力価。（A）0、1および2日に異なる用量のIgG1-637で注射したサルにおける抗-AChR抗体力価。（B）IgG1-637（n＝4）、IgG4-637（n＝2）およびIgG1-637＋IgG4-637＋IVlg（n＝5）で0、1および2日に注射したサルにおける平均抗-AChR抗体力価（±SD）。IVIgのさらなる注射を与えて、ヒト抗体の同等の合計用量を得た。 腓骨神経のRNSの間における短趾伸筋の複合筋活動電位（CMAP）（A、B、C：3Hz刺激；D、E、F：5Hz刺激）。（A,D）5mg/kg IgG1 637を受けた動物におけるCMAP。（B、E）15mg/kg IgG4-637を受けた動物におけるCMAP。（C、F）15mg/kg IgG4-637および5mg/kg IgG1-637を受けた動物におけるCMAP。 5mg/kg/日 IgG4-637および1.7mg/kg/日 IgG1-637の最初の注射から7日後における（A）未処理対照アカゲザルおよび（B〜D）アカゲザルからの肋間バイオプシーにおける終板の分析。（A、B）クリオセクションを、ローダミン標識a-ブンガロトキシンを用いてAChRについて、およびmAb aE11を用いて補体の膜攻撃複合体について二重染色した。（C、D）ヒトIgG1およびIgG4の染色。双方の抗体は、各々、マウス-抗ヒトIgG1（HP6184）およびマウス-抗ヒトIgG4（MH164-4）で検出したように神経筋肉接合に存在する（太い矢印）。核をヘマトキシリンで染色した。（E）終板領域の電子顕微鏡写真。矢印は無傷の折り畳みシナプス後膜のいくつかを示し、アスタリスクは神経終末を示し、矢じりは調製人工物を示す。（F）肋間筋肉における終板領域の電子顕微鏡写真。アスタリスクは神経終末を示し、矢印および矢じりはシナプス後膜の折り畳みを示す。（10F-A）5mg/kg IgG1-637で処理した動物の終板領域。（10F-B）15mg/kg IgG4-637で処理した動物の終板領域。（10F-Cおよび10F-D）5mg/kg IgG1-637および15mg/kg IgG4-637で処理した2匹の動物の終板領域。 実施例7に記載したようなアカゲザルからの複合筋活動電位の分析。 IgG4-637とIgG1-637とのインビボ競合。 IgG1-637および/またはIgG4-637処理サルからの血清によるTE671細胞の表面AChRの抗原変調。（A）抗原変調によるAChR喪失は、抗体処理の開始後に異なる時点で採取したサル血清の添加によってTE671細胞で決定した。サルに0、1および2日に各抗体を注射した。密集TE671細胞を、0.1nMの637抗体濃度の最終濃度まで希釈したシクロヘキシミドおよび血清で処理した。（B）TE671細胞を、10、1または0.1nMの637抗体濃度の最終濃度まで希釈された1 nM IgG1 637およびサル血清で処理することによって、抗原変調からの保護を調べた。 IVIG補足SCIDマウスにおける7D8変種のクリアランス。図面は、上方パネルにおいて、時間に対するmAb 7D8変種の濃度の半対数プロット、および下方パネルにおいて、合計ヒトIgG濃度を示す。

Claims (13)

  1. エフェクター機能欠乏抗体を含有する、重症筋無力症の治療用の薬学的組成物：
    ここで、該エフェクター機能欠乏抗体は、抗-AChR Fab-637の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域ならびに軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域の各々と同一の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域ならびに軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を有し、筋肉のニコチン酸アセチルコリン受容体に結合する全長IgG4抗体である。
  2. エフェクター機能欠乏IgG4抗体が多価抗体である、請求項1記載の薬学的組成物。
  3. IgG4多価抗体がIgG4二価抗体である、請求項2記載の薬学的組成物。
  4. エフェクター機能欠乏抗体が補体活性化欠乏抗体である、請求項2または3記載の薬学的組成物。
  5. エフェクター機能欠乏抗体が、Fc受容体結合が欠乏している、請求項2〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  6. エフェクター機能欠乏抗体が標的自己抗原の活性を変調できる、請求項2〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  7. 抗体がヒト抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  8. エフェクター機能欠乏抗体が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するV L 領域を含む、請求項１〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  9. 抗-AChR Fab-637の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域ならびに軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域の各々と同一の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域ならびに軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3領域を有し、筋肉のニコチン酸アセチルコリン受容体に結合する全長IgG4抗体である、エフェクター機能欠乏抗体。
  10. エフェクター機能欠乏抗体が、多価抗体である、請求項9記載のエフェクター機能欠乏抗体。
  11. エフェクター機能欠乏抗体が、二価抗体である、請求項10記載のエフェクター機能欠乏抗体。
  12. エフェクター機能欠乏抗体が、ヒト抗体である、請求項9〜11のいずれか一項記載のエフェクター機能欠乏抗体。
  13. エフェクター機能欠乏抗体が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するV H 領域およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するV L 領域を含む、請求項9〜12のいずれか一項記載のエフェクター機能欠乏抗体。
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