KR20240082409A - Cd24를 표적화하는 항체와 이의 제조 및 용도 - Google Patents

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KR20240082409A
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원즈 톈
송 리
디안제 전
후칭 구오
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이뮨원코 바이오파마슈티컬즈 (상하이) 인크.
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Abstract

CD24에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 개시된다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포, 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제조하는 방법, 및 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 사용하여 CD24 과발현과 관련된 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

CD24를 표적화하는 항체와 이의 제조 및 용도
본 출원은 CD24에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 및 이의 제조 및 용도, 특히, 종양 치료에서의 용도에 관한 것이다.
암 세포는 숙주의 면역 감시를 회피하기 위해 다음을 포함하는 몇 가지 메커니즘을 개발하였다: 1) 면역 세포 표면 상의 Siglec-10 수용체에 결합할 수 있는 막 단백질인 CD24를 고도로 발현시켜 면역 반응의 활성화를 억제함으로써 대식 세포, T 림프구, B 림프구 및 자연 살해 세포의 면역 감시를 회피함; 2) 대식 세포 표면 상의 신호 조절 단백질 알파(signal regulatory protein alpha: SIRPα)에 결합하여 대식 세포에 의한 암 세포의 식세포 작용을 억제하는 억제 신호의 생성을 유도하는 CD47의 높은 수준을 발현함으로써 대식 세포(Mφ)에 의한 면역 감시를 회피함. 암 세포는 매우 "영리"하며 자신이 개발한 회피 메커니즘에 따라 빠르게 증식할 수 있음을 알 수 있다. 그러므로, 암 세포를 사멸시키기 위한 효과적인 항암제의 개발은 이들 메커니즘에 초점을 맞출 수 있다.
CD24 및 Siglec-10
시알산 결합 면역글로불린 유사 렉틴(Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin: Siglec)은 면역글로불린 유사 I형 막 관통 단백질이다. Siglec 계열 구성원 중에서, Siglec-10은 억제 수용체이며 대식 세포, B 세포, NK 세포 및 활성화된 T 세포를 비롯한 면역 세포 상에서 널리 발현된다. 이는 5개의 세포외 Ig 유사 도메인, 막 관통 영역 및 세포질 미부 영역을 가지고 있다. Siglec-10의 IgV 도메인은 시알산 인식에 핵심인 아르기닌 잔기를 포함한다(문헌 [Yin, et al., 2020]). T 세포 상의 Siglec-10 발현은 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I(major histocompatibility complex class I: MHC-I)-펩타이드 복합체의 형성과 T 세포 수용체 관련 키나아제 Lck 및 ZAP-70의 인산화를 억제함으로써 T 세포 활성화를 방해할 수 있다(문헌 [Yin, el at., 2020]). B 세포 및 NK 세포 상에 발현된 Siglec-10은 BCR 매개성 및 NK 세포 매개성 신호 전달을 억제할 수 있다(문헌 [Yin, et al., 2020]).
CD24는 발달 중인 T 림프구와 대부분의 B 림프구의 표면 상에 존재하는 글리코실-포스파티딜이노시톨 고정된 단백질이다(문헌 [Yin et al., 2020]). 난소암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), 담관암종, 방광암, 췌장암, 위 선암종 및 교모세포종을 비롯한 많은 암세포도 또한 CD24를 고도로 발현한다(문헌 [Barkal et al., 2019]; [Liu et al., 2013]). 암 세포 상의 CD24는 면역 감시를 회피하고 면역 공격으로부터 종양 세포를 보호하기 위해 면역 세포 상의 Siglec-10과 상호 작용하여 "나를 먹지 마라"라는 신호를 생성한다.
연구에 따르면, CD24 발현은 방광암 재발과 상관 관계가 있는 것으로 나타났다(문헌 [Liu et al., 2013]). 난소암 환자에서, CD24 발현은 전체 생존율의 독립적 예측 인자이고, 종양 병기, 복막 및 림프절 전이와 관련이 있었으며; CD24 양성 세포는 증진된 증식 및 매우 공격적인 표현형을 나타내며 난소 암 세포에서 시스플라틴 저항성과 관련이 있었다(문헌 [Nakamura et al. 2017]).
연구에 따르면, 항-CD24 단클론 항체는 방광암 및 삼중 음성 유방암 마우스 모델에서 폐 전이를 감소시키고 전체 생존율을 연장할 수 있는 것으로 나타났다. 문헌은 또한 항체에 의한 CD24-Siglec-10 상호 작용의 차단이 종양 성장의 대식 세포 매개성 감소를 초래하고 종양 보유 마우스의 생존을 연장할 수 있음을 나타냈다(문헌 [Barkal, et al., 2019; Chan et al., 2019; Overdevest et al., 2011]).
또한, 이전 연구는 항-CD47/CD24 이중 특이적 항체가 뇌의 골수성 면역을 효과적으로 활성화할 수 있음을 나타냈다(문헌 [Wu H, et al, 2021]). 항-CD24 항체와 항-CD47 항체의 조합 요법은 사람 난소암 세포의 식세포 작용을 증대시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Barkal et al., 2019]). Barakal 등은 또한 항-CD24 항체와 세툭시맙의 조합 요법이 단일 요법과 비교하여 췌장 선암종 세포의 식세포 작용을 더욱 증진시켰음을 밝혀냈는 데, 이는 항-CD24 항체의 조합 요법이 상승적 항종양 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
다른 연구는 CD24 상향 조절이 급성 이식편 대 숙주 질환(문헌 [Toubai, T., et al., 2014]), 항-AIDS 칵테일 요법에 기인하는 염증(지방간 질환 및 간 섬유증, 저밀도 지질단백질 증후군 등 포함)(문헌 [Tian, R.R., et al., 2018]), 대사 관련 지방간 질환(문헌 [Fairbridge, N.A., et al., 2015]), 진성 당뇨병(문헌 [El-Mokhtar, M.A., et al., 2020]), 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(문헌 [Tan, Y., et al., 2016]) 및 패혈증(문헌 [Chen, G.Y., et al., 2011)과 밀접하게 관련되어 있을 수 있음을 나타냈다. 진행 중인 많은 임상 시험도 또한 CD24 과발현이 상기 질환에 미치는 역할을 나타냈다(참고 문헌 8~16 참조).
요구되는 특성을 갖는 보다 많은 항-CD24 항체가 당해 분야에 필요하다.
본 출원에서 임의의 문서의 인용은 이러한 문서가 본 출원에 대한 선행 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것이 아니다.
본 출원은 CD24+ 세포에 결합하고 CD24+ 세포에 대한 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity: ADCC)을 유도하고 강력한 생체내 항종양 효과를 가질 수 있는 신규한 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 특히, 본 출원의 항-CD24 항체의 특정 용량 투여는 종양 보유 동물에서 종양을 완전히 제거할 수 있다. 또한, 완전한 종양 제거 후 종양 세포의 재이식은 항체 투여의 부재에도 종양 형성을 초래하지 않을 것이다.
그러므로, 한 양태에서, 본 출원은 i) VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역 및 VH-CDR3 영역(여기서, VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역 및 VH-CDR3 영역은 각각 서열 번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열, 또는 상기에 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 ii) VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역(여기서, VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역은 각각 서열 번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열, 또는 상기에 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는, CD24에 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 관한 것이다.
본 출원의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분 중 중쇄 가변 영역은 서열 번호 7 또는 10의 아미노산 서열, 또는 상기에 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분 중 경쇄 가변 영역은 서열 번호 8, 9 또는 10의 아미노산 서열, 또는 상기에 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 출원의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 (1) 각각 서열 번호 7 및 8; (2) 각각 서열 번호 7 및 9; 또는 (3) 각각 서열 번호 10 및 11의 아미노산 서열, 또는 상기에 언급된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD24에 결합한다.
본 출원의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 FcR 결합 친화성을 갖거나 갖도록 조작된 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 불변 영역은, 예를 들어, 서열 번호 12와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사람 IgG1 중쇄 불변 영역일 수 있다. 경쇄 불변 영역은, 예를 들어, 서열 번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 사람 카파 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역의 N 말단은 중쇄 가변 영역의 C 말단에 연결되며, 경쇄 불변 영역의 N 말단은 경쇄 가변 영역의 C 말단에 연결된다.
특정 실시 형태에서, 본 출원의 항-CD24 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하거나 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 IgG 항체일 수 있으며, 여기서, 각각의 중쇄는 상기에 언급된 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 상기에 언급된 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함한다. 본 출원의 항체는, 예를 들어, IgG4, IgG1 또는 IgG2 전장 항체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단일 쇄 가변 단편이거나 Fab 또는 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편으로 이루어질 수 있다.
본 출원의 항체는, 예를 들어, 마우스, 키메라, 사람 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 사람 CD24에 결합하고, CD24-Siglec-10 결합/상호 작용을 차단하고, 생체내 항종양 효과를 가질 수 있다.
본 출원은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 면역 접합체를 제공하며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 세포독소 또는 항암제와 같은 치료제에 연결되어 있다. 본 출원은 또한 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중 특이적 분자를 제공하며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 제2 작용 모이어티(moiety), 예를 들어, 제2 항체에 연결되어 있고, 제2 작용 모이어티는 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 상이한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) 또는 유전자 변형 T 세포 수용체(engineered T cell receptor: TCR)의 일부일 수 있다. 본 출원은 T 세포, NK 세포 등을 비롯하여 상기에 언급된 CAR 및/또는 TCR을 갖는 면역 세포를 추가로 제공한다.
본 출원은 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 출원은 (i) 항체를 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 (ii) 항체를 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 항-CD24 항체를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
본 출원은 또한 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 면역 접합제, 이중 특이적 분자, 면역 세포, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 치료학적 유효량의 본 출원의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CD24와 관련된 질환을 치료하거나 완화시키는 방법을 제공한다.
특정 실시 형태에서, CD24와 관련된 질환은 암이다. 암은 난소암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 담관암종, 방광암, 췌장 선암종, 위 선암종, 교모세포종 및 결장암을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고형암 또는 혈액학적 암일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 출원의 약제학적 조성물은 CD47을 표적화하는 단백질, 예를 들어, SIRPαD1-Fc 단백질과 같은 적어도 하나의 추가의 항암제와 함께 투여될 수 있으며, 여기서, 단백질은 서열 번호 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 해당 부위의 돌연변이가 SIRPαD1으로부터 글리코실화 부위의 제거를 초래할 수 있는 서열 번호 19의 80번 위치에 N80A를 포함한다.
특정 실시 형태에서, CD24와 관련된 질환은 급성 이식편 대 숙주 질환, 항-AIDS 칵테일 요법에 기인하는 염증(지방간 질환 및 간 섬유증, 저밀도 지질단백질 증후군 등 포함), 류마티스관절염 및 전신 홍반성 루푸스를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 염증성 질환이다.
본 출원의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 CD24와 관련된 다른 질환은 대사 관련 지방간 질환, 진성 당뇨병, 다발성 경화증 및 패혈증을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 항체는 또한 시험관내 CD24 검출에 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 다른 특징과 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이며, 상세한 설명 및 실시예는 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 인용된 참고 문헌, GenBank 엔트리, 특허 및 공개된 특허 출원은 본 출원에 참조로 포함된다.
상세한 설명은 예로서 제공되지만, 기재된 바와 같은 특정 실시 형태에 대한 적용을 제한하려는 의도가 아니며, 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 출원의 항-CD24 항체인 IMM47C, IMM47 및 IMM47H의 구조의 개략도이다. IMM47C는 마우스 중쇄 가변 영역 및 마우스 경쇄 가변 영역, 구체적으로는 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 8의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함하는 IgG 항체이다. IMM47은 마우스 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역, 구체적으로는 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함하는 IgG 항체이다. IMM47H는 인간화 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역, 구체적으로는 서열 번호 10의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 11의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함하는 IgG 항체이다.
도 2는 CD24+CD47+ MCF-7 사람 유방암 세포에 대한 IMM47H의 결합 활성을 도시한 것이며, hIgG-Fc는 음성 대조군으로서 사용된다.
도 3은 CD47+CD24+ REH 사람 급성 림프종 세포에 대한 IMM47H의 결합 활성을 도시한 것이며, IMM01(SIRP알파D1-Fc, 서열 번호 19) 및 hlgG-Fc는 대조군으로서 사용된다.
도 4는 CD24+CD47+ MCF-7 사람 유방암 세포에 대해 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 유도하는 IMM47C의 능력을 도시한 것이며, hlgG1-Fc는 음성 대조군으로서 사용된다.
도 5는 CD24+CD47+ REH 사람 급성 림프종 세포에 대해 ADCC를 유도하는 IMM47C의 능력을 도시한 것이며, 매우 낮은 ADCC 활성을 갖는 hlgG1-Fc 및 IMM01은 대조군으로서 사용된다.
도 6은 사람 CD24를 발현하도록 유전적으로 조작된 MC38-hCD24 뮤린(murine) 결장암 세포에 대해 ADCC를 유도하는 IMM47의 능력을 도시한 것이며, hIgG1-Fc는 음성 대조군으로 사용된다.
도 7은 CD24+CD47+ MCF-7 사람 유방 종양으로 이종 이식된 CB17-SCID 마우스에서 IMM47C, 및 IMM47C와 IMM01의 조합의 생체내 항종양 효과를 도시한 것이다.
도 8a 및 8b는 MC38-hCD24 결장암 세포로 동종 이식된 B6-Siglec10 유전자 이식 마우스에서 IMM47 및 IMM47C의 효능을 도시한 것이며, 각각의 그룹에서 평균 종양 크기(도 8a) 및 개별 종양 크기(도 8b)를 나타낸다.
도 9는 MC38-hCD24KI 세포로 동종 이식된 사람 Siglec10 유전자를 보유하는 B6 마우스에서 IMM47C, IMM47 및 IMM47H의 항종양 효과를 도시한 것이다.
본 출원을 보다 용이하게 이해하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
본 출원의 "CD24"는 열 안정한 항원 CD24로도 또한 불리는 분화 클러스터 24를 지칭한다. 이러한 용어는 변이체, 동족체, 병렬 상동체 및 직렬 상동체를 포함한다. 예를 들어, 사람 CD24에 대해 특이적인 항체는 특정한 경우에서 원숭이와 같은 또 다른 종의 CD24 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 사람 CD24 단백질에 대해 특이적인 항체는 사람 CD24 단백질에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 다른 종 또는 다른 유형의 단백질과 교차 반응하지 않거나, 다른 모든 종은 아니지만 특정한 다른 종의 CD24 단백질과 교차 반응할 수 있다.
본 출원의 "항체(antibody)"라는 용어는, 예를 들어, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 전체 항체, 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 전체 항체는 적어도 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 당단백질이며, 여기서, 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL의 하나의 도메인을 포함한다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역, 즉, CDR 영역으로 추가로 세분화될 수 있으며, 보다 보존적인 프레임워크 영역(framework region: FR)은 CDR 영역 사이에 분포되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 중쇄 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯하여 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 특히, 중쇄 불변 영역은 항체의 이펙터 기능, 즉, 항체가 특정 세포 수용체 또는 기타 방어 단백질과 상호 작용하는 방법을 결정하는 도메인인 Fc 영역을 포함할 수 있다. Fc 수용체(Fc receptor: FcR)는 B 림프구, 여포 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식 세포, 호중구, 호산구, 호염구 및 비만 세포를 비롯한 특성 세포의 표면 상의 단백질이다. Fc 영역은 Fc 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호 작용하여 면역계 및/또는 보체계를 활성화시킬 수 있다.
본 출원의 항체의 "항원 결합 부분(antigen-binding portion)"(또는 간단히 "항체 부분(antibody portion)")이라는 용어는 항원(예를 들어, CD24 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 확인되었다. 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에 이황화 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH로 이루어진 Fv 단편; (v) VH로 이루어진 dAb 단편(문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR); 및 (vii) 단일 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 인코딩되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며, 여기서, VL과 VH 영역은 쌍을 이루어 단일 쇄 Fc(scFv)로서 공지된 1가 분자를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 상기 용어에 포함된다. 이들 항체 단편은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 일반적인 기술에 의해 수득되며, 이러한 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 출원에 사용되는 "단리된 항체(isolated antibody)"라는 용어는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 예를 들어, CD24에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD24 단백질 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다. 그러나, 사람 CD24 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어, 다른 종의 CD24 단백질에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없다.
"단클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "단클론 항체 조성물(monoclonal antibody composition)"이라는 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.
"마우스 항체(mouse antibody)"라는 용어는 가변 영역 프레임워크와 뮤린 생식 세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 CDR 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 이는 또한 뮤린 생식 세포 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 마우스 항체는 뮤린 생식 세포 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기, 예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러나, "마우스 항체"라는 용어는, 다른 포유 동물 종 유래의 CDR 서열이 마우스 프레임워크 서열에 삽입된 항체를 포함하지 않는다.
"키메라 항체(chimeric antibody)"라는 용어는 비사람 유전 물질과 사람 유전 물질을 조합하여 수득된 항체를 지칭한다. 또는 보다 일반적으로, 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질을 또 다른 종의 유전 물질과 조합한 항체이다.
"인간화 항체(humanized antibody)"라는 용어는 비사람 종으로부터 유래되었지만 자연 발생 사람 항체와의 유사성을 증가시키기 위해 단백질 서열이 변형된 항체를 지칭한다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 단편 내의 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 당해 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 CDR은 또한, 예를 들어, Chothia, Kabat, AbM 또는 Contact 넘버링 시스템/방법에 의해 결정될 수 있다.
"항체 의존적 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)", "항체 의존적 세포 매개성 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) " 또는 "ADCC"라는 용어는, 항-CD24 항체와 같은 항체에 의해 세포막 표면 항원이 결합된 암 세포와 같은 표적 세포를 면역계의 이펙터 세포가 능동적으로 용해시키는 세포 매개성 면역 방어를 지칭한다.
"항체 의존적 세포성 식세포 작용(antibody dependent cellular phagocytosis)" 또는 "ADCP"라는 용어는, 항-CD24 항체와 같은 항체 또는 SIRPα-Fc와 같은 항체 유사 단백질이 대식 세포와 같은 면역 세포 상의 FcR에 결합하여 대식 세포와 같은 면역 세포에 의해 항-CD24 항체 또는 SIRPα와 같은 항체에 결합된 표적 세포의 식세포 작용을 촉발함으로써 표적 세포의 세포내 함입과 분해를 초래하는 과정을 지칭한다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"라는 용어는, 항-CD24 항체와 같은 항체 또는 SIRPα-Fc와 같은 항체 유사 단백질이 C1q와 같은 보체계 단백질에 결합하여 보체 경로를 활성화시킴으로써 표적 세포 용해를 초래하는 과정을 지칭한다.
"대상체(subject)"라는 용어는 임의의 사람 또는 비사람 동물을 포함한다. "비사람 동물(nonhuman animal)"이라는 용어는 모든 척추 동물, 예를 들어, 포유 동물 및 비-포유 동물, 예를 들어, 비사람 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하지만, 비사람 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유 동물이 바람직하다.
최대 효과 절반 농도로도 또한 공지된 "EC50"이라는 용어는 최대 반응의 절반을 유발하는 항체 농도를 지칭한다.
최대 억제 절반 농도로도 또한 공지된 "IC50"이라는 용어는 최대 억제 효과의 절반을 유발하는 항체 농도를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 "서열 동일성(sequence identity)"은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 서열 사이의 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후 참조 서열 내의 뉴클레오타이드/아미노산 잔기와 동일한 서열 내의 뉴클레오타이드/아미노산의 백분율을 지칭한다. 당해 분야의 통상의 기술자는 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율을 결정하기 위해 다양한 방식을 통해, 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 쌍별 또는 다중 서열 정렬을 수행할 수 있다. 이러한 컴퓨터 소프트웨어는, 예를 들어, ClustalOmega, T-coffee, Kalign 및 MAFFT이다.
본 출원의 항체는 하나 이상의 보존적 변형에 의해 본 출원의 항-CD24 항체와 상이한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 특정 보존적 서열 변형은 항원 결합 활성을 제거하지 않는 것으로 당해 분야에서 이해된다.
본 출원에 사용되는 "보존적 서열 변형(conservative sequence modifications)"은 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개성 돌연변이 유발과 같은 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 본 출원의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 그룹은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 아미노산 잔기 그룹은 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 출원의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 그룹 유래의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 수득된 항체는 본 출원에 기재된 기능성 검정을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에 제시된 기능)에 대해 테스트될 수 있다.
본 출원의 항체는 본 출원의 항-CD24 항체의 VH/VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 출발 물질로 사용하여 유전자 조작된 항체로서 제조될 수 있다. 항체는 가변 영역 중 하나 또는 둘 다(즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시켜 결합 친화성을 개선시키고/시키거나 특정 종의 자연 발생 항체와의 유사성을 증가시킴으로써 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역은 인간화 항체를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 항체는, 예를 들어, 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 유전자 조작될 수 있다.
특정 실시 형태에서, CDR 이식을 사용하여 항체의 가변 영역을 조작할 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 잔기는 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체의 프레임워크 서열에 이식된 특정 자연 발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다.
그러므로, 본 출원의 또 다른 실시 형태는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 관한 것이며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 상기에 기재된 바와 같은 본 출원의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기에 기재된 바와 같은 본 출원의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하지만, 이들은 상이한 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식 세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개 참고 문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식 세포 DNA 서열은, 예를 들어, Vbase 사람 생식 세포 서열 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 또 다른 실시 형태로서, 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식 세포 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 본 출원의 항체에 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 출원의 항체에 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은, 프레임워크 서열이 유래되는 생식 세포 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 이식될 수 있거나, CDR 서열은 생식 세포 서열과 비교하여 하나 이상의 유전자를 포함하는 프레임워크 영역에 이식될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에서, 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 증진시키는 것이 유리하다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다. 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR 매개성 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있으며, 관심 항체 결합 또는 다른 기능적 특성에 대한 효과는 당해 분야에 공지된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가될 수 있다. 바람직하게는, 당해 분야에 공지된 바와 같은 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 전형적으로, CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
본 출원의 유전자 조작된 항체는, 예를 들어, 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL의 프레임워크 잔기에서 유전자 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 대응하는 생식 세포 서열로 "복귀 돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪는 항체는, 항체가 유래되는 생식 세포 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체가 유래되는 생식 세포 서열과 항체 프레임워크 서열을 비교함으로써 식별될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다.
또한, 프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어지는 변형에 대한 대안으로서, 본 출원의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항체 의존적 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 출원의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 이의 글리코실화를 변경시켜 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키도록 변형될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, CH1 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어, 증가 또는 감소되도록 변형된다. CH1 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 중쇄와 경쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
또 다른 실시 형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다.
더 또 다른 실시 형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크의 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 또한, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화 항체 또는 이등분 GlcNac 구조가 증가된 항체와 같은 글리코실화 유형이 변경된 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 시스템을 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 수행될 수 있다. 변경된 글리코실화 시스템을 갖는 세포는 당해 분야에 공지되어 있으며, 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위해 본 출원의 재조합 항체를 발현하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
본 출원의 단클론 항체는 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 체세포 하이브리드화(하이브리도마) 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 단클론 항체를 생산하는 다른 실시 형태는 B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질 전환 및 파지 디스플레이 기술을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체도 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
본 출원의 항체는 또한, 예를 들어, 재조합 DNA 기술과 유전자 형질 감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 형질 감염 종에서 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]). 하나의 실시 형태에서, 표준 분자 생물학 기술에 의해 수득된 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA는, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되도록 하나 이상의 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 맥락에서, "작동적으로 연결된(operatively linked)"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자(들)의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터에 연결되는 것을 의미한다.
"조절 서열(regulatory sequence)"이라는 용어는 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, Goeddel(문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)])에 기재되어 있다. 포유 동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유 동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 대안으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스 조절 서열이 사용될 수 있다. 또한, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터의 서열과 사람 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 긴 말단 반복부를 포함하는 SRα 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원의 서열로 구성된다(문헌 [Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472]). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용 가능도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 가변 영역은 VH가 벡터 내의 CH에 작동적으로 연결되고 VL이 벡터 내의 CL에 작동적으로 연결되도록 목적하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터에 이를 삽입함으로써 전장 항체 유전자를 생성하도록 사용된다. 대안으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩타이드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인프레임(in-frame)으로 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 추가하여, 본 출원의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 원점) 및 선택 마커 유전자와 같은 추가의 서열을 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 US 4,399,216, US 4,634,665 및 US 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 유전자(dhfr-숙주 세포에서 메토트렉세이트 선택/증폭에 사용하기 위함) 및 네오 유전자(G418 선택을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질 감염된다. 다양한 형태의 "형질 감염"이라는 용어는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어, 전기 천공, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질 감염을 포함한다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 출원의 항체를 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포에서의 항체의 발현이 바람직하고, 포유 동물 숙주 세포에서의 발현이 가장 바람직한 데, 그 이유는 이러한 진핵 세포, 특히, 포유 동물 세포가 조립되어 적절하게 폴딩된 면역학적 활성 항체를 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 높기 때문이다.
본 출원의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유 동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포를 사용하는 경우, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유 동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 시간, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate: ADC)와 같은 면역 접합체을 형성하기 위해 치료제와 접합될 수 있다. 적합한 치료제는 세포독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 결합제(minor groove binder), DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 핵 방출 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포아이소머라아제 I 또는 II 억제제, 열 충격 단백질 억제제, 타이로신 키나아제 억제제, 항생제 및 항-유사분열제를 포함한다. ADC에서, 항체와 치료제는 바람직하게는 펩티딜, 이황화물 링커 또는 하이드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중 특이적 분자를 생성하기 위해 적어도 하나의 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체 리간드)에 연결된 본 출원의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중 특이적 분자를 특징으로 한다. "이중 특이적 분자"라는 용어는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 이중 특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-CD24 결합 특이성에 추가하여 제3 특이성을 갖는다. 예를 들어, 제3 특이성은 CD47에 대해 면역 세포와 같은 다른 CD24+ 세포를 방출하면서 종양 세포를 보다 정확하게 표적화할 수 있다.
이중 특이적 분자는 다양한 형식과 크기로 존재할 수 있다. 크기 스펙트럼의 한쪽 말단에서, 이중 특이적 분자는 동일한 특이성을 갖는 2개의 결합 아암을 갖는 대신 각각 상이한 특이성을 갖는 2개의 결합 아암을 갖는다는 점을 제외하고는 전통적인 항체 형식을 보유한다. 다른 극단에는 흔히 Bs(scFv)2 작제물로 호칭되는 펩타이드 쇄에 의해 연결된 2개의 단일 쇄 항체 단편(scFv)으로 이루어진 이중 특이적 분자가 있다. 중간 크기의 이중 특이적 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 2개의 상이한 F(ab) 단편을 포함한다. 이들 형식 및 다른 형식의 이중 특이적 분자는 유전자 조작, 체세포 하이브리드화 또는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
항-CD24 단일 쇄 항체 단편 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체가 또한 본 출원에 제공되며, scFv는 본 출원에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항-CD24 키메라 항원 수용체는 (a) 항-CD24 scFv 함유 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막 관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄/경쇄 가변 영역 또는 CDR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염 물질, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 제공"된다. 본 출원의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 출원의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 사람 면역글로불린 유전자를 보유하는 유전자 이식 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우, 이러한 항체를 인코딩하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 수집될 수 있다.
본 출원의 바람직한 핵산 분자는 항-CD24 단클론 항체의 VH 및 VL 서열 또는 CDR을 인코딩하는 것들을 포함한다. 일단 VH 및 VL을 인코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편은, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환하기 위해, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VH 또는 VL을 인코딩하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결된다. "작동적으로 연결된"이라는 용어는 2개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 인프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되어 있음을 의미한다.
VH 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VH를 인코딩하는 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH를 인코딩하는 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.
VL 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VL을 인코딩하는 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 불변 영역은 κ 및 λ 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH 및 VL을 인코딩하는 DNA 단편은 VH 및 VL 서열이 유연한 링커를 통해 연결된 VH 및 VL 영역과 연속적 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 5~20개 아미노산 잔기의 펩타이드와 같은 유연한 링커를 인코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 본 출원의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 면역 접합체, 면역 세포, 이중 특이적 항체 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 출원의 조합 요법에 사용되는 하나 이상의 추가의 약제학적 유효 성분, 예를 들어, 또 다른 항종양 단백질, 예를 들어, SIRP알파D1-Fc 융합 단백질인 IMM01을 임의로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 계면활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제 및 이들의 조합을 포함한다.
약제학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합할 수 있다. 투여 경로에 따라, 유효 성분은 이를 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 자연 조건의 작용으로부터 이를 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다. "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 대안으로, 본 출원의 항체는 비경구 경로, 예를 들어, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투여 형태(dosage form)를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 유효 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 치료학적 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이러한 양은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 유효 성분의 약 0.01% 내지 약 99%의 범위일 것이다.
투여 방법은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있으며, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료학적 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 출원에 사용되는 투여 단위 형태는 치료될 대상체를 위한 단일 투약량으로 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 유효 성분을 함유한다. 대안으로, 항체는 지효성 제형으로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우에는 덜 빈번한 투여가 요구된다.
항체 투여의 경우, 투약량은 약 0.001 내지 100 mg/숙주 체중 kg의 범위일 수 있다.
본 출원의 항-CD24 항체의 "치료학적 유효 용량(therapeutically effective dose)"은 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간 증가를 초래한다. 예를 들어, 종양 보유 대상체의 치료를 위해, "치료학적 유효 용량"은 바람직하게는 종양 성장을 치료되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 치료학적 유효량의 치료학적 항체는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 증상을 개선시킬 수 있으며, 대상체는 전형적으로 사람 또는 또 다른 포유 동물일 수 있다.
약제학적 조성물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료학적 조성물은 (1) 무바늘 피하 주사 디바이스(예를 들어, 미국 특허 US 5,399,163, US 5,383,851, US 5,312,335, US 5,064,413, US 4,941,880, US 4,790,824 및 US 4,596,556); (2) 마이크로-주입 펌프(미국 특허 US 4,487,603); (3) 경피 디바이스(미국 특허 US 4,486,194); (4) 주입 장치(미국 특허 US 4,447,233 및 US 4,447,224); 및 (5) 삼투 디바이스(미국 특허 US 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료 장치를 통해 투여될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 출원의 단클론 항체는 적절한 생체내 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 치료학적 항체가 혈뇌 장벽을 통과하는 것을 보장하기 위해, 이들은 특정 세포 또는 장기로의 선택적 수송을 증진시키기 위해 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있는 리포좀으로 제형화될 수 있다.
본 출원의 약제학적 조성물은 다중 시험관내 및 생체내 용도를 갖는다. 이는 암 치료에, 또는 보다 일반적으로는 종양 환자에서 면역 반응을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 종양 성장을 억제하기 위해, 사람 대상체에게 투여될 수 있다.
종양 세포의 증식 및 생존을 억제하는 본 출원의 약제학적 조성물의 능력을 고려해 볼 때, 본 출원은 종양 성장이 대상체에서 억제되도록 본 출원의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 출원의 항체에 의해 치료될 수 있는 종양의 비제한적인 예는 원발성 또는 전이성 난소암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 담관암종, 방광암, 췌장암, 위 선암종, 교모세포종 및 결장암을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 출원의 약제학적 조성물은 대상체에서 종양 성장을 억제하는데 효과적인 하나 이상의 추가의 항체 또는 비-항체 치료제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 본 출원은 대상체에게 항-CD24 약제학적 조성물 및 SIRP알파D1-Fc 융합 단백질인 IMM01을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 출원의 약제학적 조성물은 급성 이식편 대 숙주 질환, 항-AIDS 칵테일 요법에 기인하는 염증(지방간 질환 및 간 섬유증, 저밀도 지질단백질 증후군 등 포함), 류마티스관절염 및 전신 홍반성 루푸스와 같은 염증성 질환을 치료하거나 완화시키는 데 추가로 사용될 수 있다.
본 출원의 약제학적 조성물은 대사 관련 지방간 질환, 진성 당뇨병, 다발성 경화증 및 패혈증을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 CD24 관련 질환을 치료하거나 완화시키는 데 추가로 사용될 수 있다.
본 출원에 논의된 치료제의 조합은 약제학적으로 허용되는 담체 중의 단일 조성물로서 동시에, 또는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 각각의 제제와 함께 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 치료제의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 조합 요법의 다중 용량이 순차적으로 투여되고, 순차적 투여의 순서는 각각의 투여 시점에서 역전되거나 동일하게 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여 또는 이의 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 출원은 하기 비제한적인 실시예와 함께 추가로 기재될 것이다.
실시예
도 1은 본 출원의 항-CD24 항체인 IMM47C, IMM47 및 IMM47H의 구조를 도시한 것이다.
IMM47C는 마우스 중쇄 가변 영역과 마우스 경쇄 가변 영역을 포함하는 IgG 항체이다. 구체적으로, IMM47C는 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 8의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
IMM47은 마우스 중쇄 가변 영역과 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 IgG 항체이다. 구체적으로, IMM47은 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
IMM47H는 인간화 중쇄 가변 영역과 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 IgG 항체이다. 구체적으로, IMM47H는 서열 번호 10의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 11의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
IMM01은 이량체성 Fc 단편에 연결된 2개의 SIRPαD1 돌연변이체를 포함하는, 미국 특허 출원 공개 US 2021/0024598 A1에 기재된 바와 같은 CD47에 결합하는 SIRPαD1-Fc 융합 단백질이며, 여기서, 각각의 SIRPαD1-Fc 단량체성 단편은 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 포함한다. IMM01 중의 SIRPαD1은 야생형 SIRPαD1과 비교하여 서열 번호 19의 80번 위치에 N80A 돌연변이를 포함하며, 이는 탈글리코실화 효과를 달성한다.
실시예 1. 항-CD24 항체의 생성 및 인간화, 발현 벡터의 작제 및 항체 발현
마우스에 사람 CD24 단백질을 접종하고, 혈청을 수집하고, 역가가 높은 마우스를 선별하였다. 이들 마우스로부터 비장 세포를 수확하고, 항-CD24 항체를 생산하는 하이브리드 세포주를 하이브리도마 기술에 의해 제조하고, IMM47C를 생산하는 세포 클론을 비롯하여 높은 CD24 결합 활성을 갖는 단클론 항체를 생산하는 세포 클론을 CD24 결합 능력 테스트 검정에 의해 선택하였다. IMM47C의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 서열 분석하고, 이의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 7 및 8에 제시하였다.
CDR 이식 방법을 사용하여 인간화를 위해 IMM47C를 변형하고, 부분 인간화(경쇄 가변 영역에서만) 항체 IMM47과 완전 인간화 항체 IMM47H를 수득하였으며, 여기서, IMM47은 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역을 포함하였고, IMM47H는 서열 번호 10의 중쇄 가변영역과 서열 번호 11의 경쇄 가변 영역을 포함하였다.
IMM47C, IMM47 및 IMM47H의 코딩 서열을 인위적으로 디자인하였다.
구체적으로, IMM47C의 중쇄의 경우, 마우스 IgG1 중쇄 신호 펩타이드(서열 번호 21)를 인코딩하는 57개의 뉴클레오타이드를 IMM47C의 중쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 14)의 5' 말단에 부가하고, 코작 서열(서열 번호 22)을 신호 펩타이드 서열의 5' 말단에 부가하였다. 마지막으로, HindIII 및 NheI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. IMM47C의 경쇄의 경우, 동일한 신호 펩타이드 서열뿐만 아니라 코작 서열을 IMM47C의 경쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 15)의 5' 말단에 부가하고, HindIII 및 XbaI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. 생성된 서열을 GenScript Biotech Corporation에 의해 합성하고, 각각 pMac-H 및 pMac-L 벡터에 클로닝하였다.
IMM47의 중쇄의 경우, 마우스 IgG1 중쇄 신호 펩타이드(서열 번호 21)를 인코딩하는 57개의 뉴클레오타이드를 IMM47의 중쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 14)의 5' 말단에 부가하고, 코작 서열(서열 번호 22)을 신호 펩타이드 서열의 5' 말단에 부가하였다. 마지막으로, HindIII 및 NheI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. IMM47의 경쇄의 경우, 동일한 신호 펩타이드 서열뿐만 아니라 코작 서열을 IMM47의 경쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 16)의 5' 말단에 부가하고, HindIII 및 XbaI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. 생성된 서열을 GenScript Biotech Corporation에 의해 합성하고, 각각 pMac-H 및 pMac-L 벡터에 클로닝하였다.
IMM47H의 중쇄의 경우, 마우스 IgG1 중쇄 신호 펩타이드(서열 번호 21)를 인코딩하는 57개의 뉴클레오타이드를 IMM47H의 중쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 17)의 5' 말단에 부가하고, 코작 서열(서열 번호 22)을 신호 펩타이드 서열의 5' 말단에 부가하였다. 마지막으로, HindIII 및 NheI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. IMM47H의 경쇄의 경우, 동일한 신호 펩타이드 서열뿐만 아니라 코작 서열을 IMM47H의 경쇄 가변 영역-불변 영역의 코딩 서열(서열 번호 18)의 5' 말단에 부가하고, HindIII 및 XbaI 제한 효소 부위를 각각 생성된 서열의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. 생성된 서열을 GenScript Biotech Corporation에 의해 합성하고, 각각 pMac-H 및 pMac-L 벡터에 클로닝하였다.
작제된 발현 벡터를 사용하여 CHO-S 세포의 일시적 형질 감염에 의해 단백질을 발현시켰다. 과정은 대략 다음과 같았다: 1) 일시적 형질 감염 1일 전에 CHO-S 세포를 6 mM 글루타민을 함유하는 일시적 형질 감염 배지(TransFx-CTMCHO 일시적 형질 감염 배지, Hyclone)에 1×106개 세포/ml의 밀도로 씨딩하고; 3) PEI(폴리에틸렌이민 하이드로클로라이드, MW 40,000, polysciences)를 4:1의 PEI:DNA 질량비로 1 mg/ml로 제조하여, TransFx-CTMCHO 일시적 형질 감염 배지 부피의 1/20인 OPTI-MEM 배지(Gibco)에 첨가하고; 4) 희석된 DNA에 PEI 희석물을 천천히 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고; 5) PEI/DNA 혼합물을 세포 배양물에 첨가하고, 세포를 110 rpm으로 진탕시키면서 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고; 6) 형질 감염 증진제(1 mM 나트륨 부티레이트, 0.25% V/V DMSO)를 2일 후에 첨가하고, 배양 온도를 33℃로 감소시키고; 7) 세포 생존율이 50% 이하로 떨어질 때, 3000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 세포 배양물 상청액을 수확하고, 단백질 A 크로마토그래피 배지를 사용하여 친화성 정제를 수행하였다.
실시예 2. 항-CD24 항체는 CD24 + CD47 + MCF-7 세포에 결합하였다
CD24+CD47+ MCF-7 세포의 세포 밀도를 1×106개/ml로 조정하고, 100 μl의 CD24+CD47+ MCF-7 세포를 첨가하고, 각각 4℃에서 1 시간 동안 30 μg/ml로 시작하여 3배 연속 희석된 IMM47H 100 μl과 함께 인큐베이션하고, hIgG-Fc를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 냉 PBS로 2회 세척한 다음, 사람 IgG-Fc(Cat# F9512, Sigma)에 대한 FITC 접합된 2차 항체 100 μl과 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 그 다음, 유세포 측정기(Merck Millipore, Guava® easyCyte 5HT)를 사용하여 세포에 FACS 분석을 수행하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, IMM47H를 포함하는 본 출원의 항-CD24 항체는 CD24+CD47+ MCF-7 세포에 특이적으로 결합할 수 있었다.
실시예 3. 항-CD24 항체는 CD24 + CD47 + REH 세포에 결합하였다
CD24+CD47+ REH 세포의 세포 밀도를 1×106개/ml로 조정하고, 100 μl의 CD24+CD47+ REH 세포를 첨가하고, 각각 4℃에서 1 시간 동안 30 μg/ml로 시작하여 3배 연속 희석된 IMM47H 100 μl과 함께 인큐베이션하고, hIgG-Fc를 대조군으로 사용하였다. 세포를 냉 PBS로 2회 세척한 다음, 사람 IgG-Fc(Cat# F9512, Sigma)에 대한 FITC 접합된 2차 항체 100 μl과 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 200 μl의 PBS에 재현탁시켰다. 그 다음, 유세포 측정기(Merck Millipore, Guava® easyCyte 5HT)를 사용하여 세포에 FACS 분석을 수행하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, IMM47H는 CD47 결합 단백질인 IMM01보다 약간 더 높은 활성으로 CD24+CD47+ REH 세포에 특이적으로 결합하였다.
실시예 4. 항-CD24 항체는 CD24 + CD47 + MCF-7 세포에 대해 높은 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 유도하였다
1 mM의 CFSE(Cat#21888-25 mg, Sigma)를 1:500 희석하고, MCF-7 세포를 라벨링하는 데 사용하였다.
6×105개/ml의 세포 밀도의 MCF-7 세포(표적 세포) 50 μl을 FcγRIIIa(158 V)를 안정적으로 발현하는 6×105개/ml의 NK92MI 세포(이펙터 세포) 100 μl과 2:1의 이펙터:표적 비율로 혼합하였다. 혼합 세포를 각각 1000 ng/ml로 시작하여 3배 연속 희석된 IMM47C 50 μl과 함께 5% CO2 하에 37℃에서 4 시간 동안 배양하고, hIgG-Fc를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포 배양물에 프로피디움 요오다이드(PI)(Cat#P4170, Sigma)를 5 μg/ml의 농도로 첨가한 다음, PI 신호에 대해 FACS 분석을 수행하였다. ADCC에 기인하는 세포 용해 백분율을 하기 수학식에 따라 계산하였다:
용해 % = (IMM47C로 처리된 PI 양성 표적 세포 % - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %)/(100 - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %) × 100
도 4에 도시된 바와 같이, IMM47C는 CD24+CD47+ MCF-7 사람 유방암 세포에 대해 높은 수준의 ADCC를 유도하였다.
실시예 5. 항-CD24 항체는 CD24 + CD47 + REH 세포에 대해 높은 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 유도하였다
1 mM의 CFSE(Cat#21888-25 mg, Sigma)를 1:500 희석하고, REH 세포를 라벨링하는 데 사용하였다.
6×105개/ml의 세포 밀도의 REH 세포(표적 세포) 50 μl을 FcγRIIIa(158 V)를 안정적으로 발현하는 6×105개/ml의 NK92MI 세포(이펙터 세포) 100 μl과 2:1의 이펙터:표적 비율로 혼합하였다. 혼합 세포를 각각 1000 ng/ml로 시작하여 3배 연속 희석된 IMM47C 50 μl과 함께 5% CO2 하에 37℃에서 4 시간 동안 배양하고, hIgG-Fc를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포 배양물에 프로피디움 요오다이드(PI)(Cat#P4170, Sigma)를 5 μg/ml의 농도로 첨가한 다음, PI 신호에 대해 FACS 분석을 수행하였다. ADCC에 기인하는 세포 용해 백분율을 하기 수학식에 따라 계산하였다:
용해 % = (IMM47C로 처리된 PI 양성 표적 세포 % - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %)/(100 - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %) × 100
도 5에 도시된 바와 같이, IMM47C는 CD24+CD47+ REH 사람 급성 림프아구성 백혈병 세포에 대해 높은 수준의 ADCC를 유도하였다.
실시예 6. 항-CD24 항체는 CD24 + MC38-hCD24 세포에 대해 높은 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 유도하였다
1 mM의 CFSE(Cat#21888-25 mg, Sigma)를 1:500 희석하고, MC38-hCD24 뮤린 결장암 세포를 라벨링하는 데 사용하였다.
6×105개/ml의 세포 밀도의 MC38-hCD24 세포(표적 세포) 50 μl을 FcγRIIIa(158 V)를 안정적으로 발현하는 6×105개/ml의 NK92MI 세포(이펙터 세포) 100 μl과 2:1의 이펙터:표적 비율로 혼합하였다. 혼합 세포를 각각 1000 ng/ml로 시작하여 3배 연속 희석된 IMM47 50 μl과 함께 5% CO2 하에 37℃에서 4 시간 동안 배양하고, hIgG-Fc를 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음, 세포 배양물에 프로피디움 요오다이드(PI)(Cat#P4170, Sigma)를 5 μg/ml의 농도로 첨가한 다음, PI 신호에 대해 FACS 분석을 수행하였다. ADCC에 기인하는 세포 용해 백분율을 하기 수학식에 따라 계산하였다:
용해 % = (IMM47로 처리된 PI 양성 표적 세포 % - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %)/(100 - 음성 대조군 단백질로 처리된 PI 양성 표적 세포 %) × 100
도 6에 도시된 바와 같이, IMM47은 사람 CD24 발현 MC38-hCD24 뮤린 결장암 세포에 대해 높은 수준의 ADCC를 유도하였다.
실시예 7 . 항-CD24 항체는 유방암으로 이종 이식된 마우스에서 강력한 생체내 항종양 활성을 나타냈다
암 세포 접종 3일 전에 β-에스트라디올 지연 방출 정제(0.36 mg)를 40 마리의 6~8주령 SCID 마우스 각각의 좌측 등에 삽입하였다. 그 다음, 마우스 당 1×107개의 MCF-7 유방암 세포 세포를 마우스의 우측 겨드랑이에 피하 주사하였다. 종양 크기가 100~150 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위로 그룹 당 8 마리의 마우스로 5개 그룹으로 나누고, 그룹화 수행일을 0 일차로 명명하였다. 이날부터, 이들 그룹의 마우스에 각각 PBS, IMM47C(2.5 mg/kg), IMM01(2.5 mg/kg) 및 IMM01 + IMM47C(2.5 mg/kg + 2.5 mg/kg)의 복강내 주사를 4주 동안 주 2회 제공하였다. 4주 후에 투여를 중단하고, 실험 종료까지 또 다른 주 동안 마우스를 관찰하였다. 종양 크기와 마우스 체중을 3~4일마다 측정하였다. PBS 그룹의 평균 종양 체적이 3000 mm3에 도달할 때, 모든 테스트를 중단하였다.
종양 체적(V)을 (길이 × 너비2)/2로 계산하였다. TGI(%) = [1-(마지막 투여일에 특정 투여 그룹의 평균 종양 크기 - 투여 시작 시 해당 그룹의 평균 종양 크기)/(처리 종료 시 비히클 대조군의 평균 종양 크기 - 처리 시작 시 비히클 대조군의 평균 종양 크기)]×100%.
테스트 방식 및 결과는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
IMM47C 및 기타 치료제의 항종양 효과
투여 시작 후 28 일차에, 비히클 대조군의 종양 보유 마우스의 종양 크기는 646.87 mm3에 도달하였다. 비히클 대조군과 비교하여, IMM47C 처리 그룹과 IMM01 처리 그룹 모두는 종양 성장이 둔화되고, 이들 두 그룹의 종양 크기는 28 일차에 각각 463.26 mm3(T/C=71.60%, TGI=37.30%, p= 0.009) 및 562.24 mm3(T/C=86.92%, TGI=17.19%, p=0.375)이었다. IMM47C+IMM01 조합 그룹은 최고의 종양 억제 효과를 나타내고, 이러한 그룹의 종양 크기는 28 일차에 192.63 mm3(T/C=29.81%, TGI=92.22%, p=0.001)이었다.
IMM47C와 IMM01의 조합 사용은 상승 효과를 생성하고, 전체적인 항종양 효과는 IMM47C 단독 또는 IMM01 단독보다 훨씬 우수하였음을 표 1 및 도 7로부터 알 수 있다.
실시예 8 . 항-CD24 항체는 결장암으로 동종 이식된 마우스에서 강력한 생체내 항종양 활성을 나타냈다
MC38-hCD24 세포를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 배지는 10% 불활성화된 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지이었다. 3~4일마다 계대 배양을 수행하였다. 세포 계수를 위해 대수 증식기의 MC38-hCD24를 PBS 중에 재현탁시키고, 세포 밀도를 1.0×107개/mL로 조정하였다. 1 mL 주사기를 사용하여 마우스 당 약 1.0×106개의 종양 세포를 포함하는 세포 현탁액 100 μL을 30 마리의 B6-Siglec10 마우스(사람 Siglec10을 발현시키기 위해 유전자 조작된 B6 마우스)의 우측 겨드랑이에 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 100 mm3에 도달하였을 때, 동물을 종양 크기에 따라 무작위로 그룹 당 10 마리의 마우스로 3개의 그룹으로 나누었다. 그룹화 수행일을 0 일차로 명명하고, 이날부터 상이한 그룹의 마우스에 각각 IMM47H(10 mg/kg), IMM47C(10 mg/kg) 및 PBS의 복강내 주사를 주 2회 제공하였다. 4회 투여 후, 각각의 군에서 7 마리의 마우스를 무작위로 선택하고, 18 일차에 MC38-hCD24 종양 세포를 다시 주사하였으며, 여기서, 1 mL 주사기를 사용하여 마우스 당 약 1.0×106개의 종양 세포를 포함하는 세포 현탁액 100 μL을 마우스의 좌측 겨드랑이에 피하 접종하였다. 종양 성장을 주 2회 모니터링하였다. 동물 복지 기준에 따르면, 종양 크기가 3000 mm3를 초과할 때 마우스에 안락사를 수행해야 한다.
종양 체적(V)을 (길이 × 너비2)/2로 계산하였다. TGI(%) = [1-(마지막 투여일에 특정 투여 그룹의 평균 종양 크기 - 투여 시작 시 해당 그룹의 평균 종양 크기)/(처리 종료 시 비히클 대조군의 평균 종양 크기 - 처리 시작 시 비히클 대조군의 평균 종양 크기)]×100%.
전체 테스트 방식은 도 8b 및 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
IMM47H 및 IMM47C 처리 후의 종양 크기 및 데이터 분석
표 2 및 도 8a~8b에 도시된 바와 같이, 종양 보유 마우스의 종양은 IMM47H 및 IMM47C의 4회 투여 후 완전히 제거된 반면, 비히클 대조군은 969.92±143.93 mm3의 종양 크기를 나타냈으며; 투여를 계속하지 않았기 때문에, 종양 형성은 18 일차에 종양 세포의 2차 주사 후에 PBS 그룹의 7 마리 중 5 마리의 마우스에서 발견된 반면(즉, 대조군의 5 마리의 마우스는 종량 발생을 나타냈음), 어떠한 종량 형성도 IMM47H 및 MM47C 그룹의 마우스에서 발견되지 않았다.
상기 결과에 따르면, IMM47C 및 IMM47H는 MC38-hCD24KI 세포 종양으로 동종 이식된 B6-Siglec10 유전자 이식 마우스에서 종양 성장 억제에 대한 강력한 효과를 나타냈으며, 어떠한 종양 형성도 종양 세포의 2차 주사 후에 발견되지 않았기 때문에, 적응성 면역 반응이 투여 그룹의 마우스에서 촉발될 수 있다.
실시예 9 . 항-CD24 항체는 결장암으로 동종 이식된 마우스에서 강력한 생체내 항종양 활성을 나타냈다
MC38-hCD24 세포를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 배지는 10% 불활성화된 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지이었다. 3~4일마다 계대 배양을 수행하였다. 세포 계수를 위해 대수 증식기의 MC38-hCD24를 PBS 중에 재현탁시키고, 세포 밀도를 1.0×107개/mL로 조정하였다. 1 mL 주사기를 사용하여 마우스 당 약 1.0×106개의 종양 세포를 포함하는 세포 현탁액 100 μL을 24 마리의 B6-Siglec10 수컷 마우스(사람 Siglec10을 발현시키기 위해 유전자 조작된 B6 마우스)의 우측 겨드랑이에 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 100 mm3에 도달하였을 때, 동물을 종양 크기에 따라 무작위로 그룹 당 6 마리의 마우스로 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹화 수행일을 0 일차로 명명하고, 이날부터 상이한 그룹의 마우스에 각각 IMM47(3 mg/kg), IMM47H(3 mg/kg), IMM47C(3 mg/kg) 및 PBS의 복강내 주사를 4주 동안 주 2회 제공하였다.
일부 마우스의 종양 크기가 21 일차에 미리 설정된 임계값을 초과하였기 때문에, 0 일차부터 21 일차까지의 데이터를 분석에 사용하였다.
[표 3]
IMM47, IMM47H 또는 IMM47C 처리 후의 종양 크기 및 데이터 분석
표 3 및 도 9에 도시된 바와 같이, IMM47, IMM47C 및 IMM47H는 MC38-hCD24KI 세포 종양으로 동종 이식된 B6-Siglec10 유전자 이식 마우스에서 종양 성장 억제에 대한 강력한 효과를 나타냈다. 구체적으로, 3 mg/kg의 용량에서, 종양은 IMM47C 그룹의 6 마리의 마우스 모두에서 완전히 제거되었고, IMM47 그룹의 4 마리의 마우스는 종양이 완전히 제거되었고, 나머지 2 마리의 마우스는 종양 성장이 둔화되었고, IMM47H 그룹의 5 마리의 마우스는 종양이 완전히 제거되었고, 나머지 1 마리의 마우스는 종양이 점진적으로 발달하였다.
본 출원의 서열은 하기와 같이 요약된다.
본 출원은 하나 이상의 실시 형태와 관련하여 상기에 기재되었지만, 본 출원은 이러한 실시 형태에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 출원의 기재 내용은 첨부된 청구범위의 사상 및 범위 내에 포함될 수 있는 모든 변형 및 균등물을 포괄하도록 의도된다. 본 출원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
참고 문헌
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Claims (14)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD24에 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서,
    상기 중쇄 가변 영역은 HV-CDR1 영역, HV-CDR2 영역 및 HV-CDR3 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 LV-CDR1 영역, LV-CDR2 영역 및 LV-CDR3 영역을 포함하고, 여기서, 상기 HV-CDR1 영역, HV-CDR2 영역, HV-CDR3 영역, LV-CDR1 영역, LV-CDR2 영역 및 LV-CDR3 영역은 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 7 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 8, 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 i) 각각 서열 번호 7 및 8; ii) 각각 서열 번호 7 및 9; 또는 iii) 각각 서열 번호 10 및 11의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제1항에 있어서,
    IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입(isotype)인, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. 제1항에 있어서,
    각각 서열 번호 12 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제1항에 있어서,
    마우스, 키메라 또는 인간화 항체인, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는, 핵산 분자.
  9. 제8항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  10. 제9항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 제8항의 핵산 분자, 제9항의 발현 벡터 또는 제10항의 숙주 세포와 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. CD24 과발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제11항의 약제학적 조성물의 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 질환은 난소암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), 담관암종, 방광암, 췌장암, 위 선암종, 교모세포종 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택되는, 용도.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 질환은 급성 이식편 대 숙주 질환, 항-AIDS 칵테일 요법에 기인하는 염증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 대사 관련 지방간 질환, 진성 당뇨병, 다발성 경화증 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는, 용도.
KR1020247015860A 2021-10-13 2022-08-25 Cd24를 표적화하는 항체와 이의 제조 및 용도 KR20240082409A (ko)

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