KR20230156691A - Pd-l1 결합 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Pd-l1 결합 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230156691A
KR20230156691A KR1020237025615A KR20237025615A KR20230156691A KR 20230156691 A KR20230156691 A KR 20230156691A KR 1020237025615 A KR1020237025615 A KR 1020237025615A KR 20237025615 A KR20237025615 A KR 20237025615A KR 20230156691 A KR20230156691 A KR 20230156691A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
thr
antibody
seq
nos
Prior art date
Application number
KR1020237025615A
Other languages
English (en)
Inventor
지앙메이 리
웬치 후
펭 리
Original Assignee
베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드 filed Critical 베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20230156691A publication Critical patent/KR20230156691A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부위. 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 발현하는 방법도 제공된다. 본 개시는 또한 면역 접합체, 2중 특이성 분자, 키메라 항원 수용체, 종양 용해 바이러스 및 그의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 이용한 치료 방법을 제공한다.

Description

PD-L1 결합 항체 및 그의 용도
관련 응용 및 원용에 의한 포함
이 출원은 2021년 3월 16일에 출원된 중국 특허 출원 제202110284404.8호에 대한 우선권을 주장한다.
전술한 출원, 및 그 출원서 또는 그 심사 과정에서 인용된 모든 문서("출원 인용 문서") 및 본 출원서에 인용되거나 참조된 모든 문서(본 출원서에 인용된 모든 문헌 문서, 특허, 공개 특허 출원을 포함하지만 이에 제한되지 않음)("본 출원서에 인용된 문서") 및 본 명세서에 인용된 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서와 함께, 본 명세서에 언급된 모든 제품에 대한 제조업체의 지침, 설명서, 제품 사양 및 제품 시트는, 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 참조된 모든 문서는 각 개별 문서가 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되도록 지시된 것과 동일한 범위로, 원용에 의해 포함된다. 본 개시에서 언급된 모든 진뱅크(Genbank) 서열은, 본 개시의 가장 빠른 유효 출원일의 것이 되도록 진뱅크 서열과 함께 원용에 의해 포함된다.
본 출원에서 임의의 문서의 인용 또는 확인은, 해당 문서가 본 개시에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것은 아니다.
발명의 기술분야
본 개시는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 그의 제조 및 사용, 특히 암 및 전염병과 같은 PD-L1 신호전달(signaling)과 관련된 질병의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
T 세포-기반 면역은 병원균에 감염된 세포와 암세포를 포함한 비정상적인 세포를 인식하고 파괴하도록 진화해 왔다. T 세포 활동은 면역 체크포인트로 알려진 일련의 공동 자극 및 공동 억제 수용체와 이들의 리간드에 의해 조절되며, 이는 면역 체계가 무차별적으로 조직을 공격하는 것을 방지하여 자기 관용(self-tolerance)에 중요하다.
면역 체크포인트 경로 중에서, PD-L1/PD-1 신호전달은 임상적으로 유의한 이점이 있는 것으로 밝혀졌다. 면역 반응을 음성적으로(negatively) 조절하는 제1형 막단백질인 PD-1은, 말초 조직의 항원-경험(antigen-experienced) 기억 T 세포에서 주로 발현되며, B 세포, 활성화된 단핵구, 수지상 세포 및 자연 킬러 세포에서는 덜 일반적으로 발현된다(Keir ME et al., (2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704; Ishida Y et al., (1992) EMBO J. 11(11):3887-3895). PD-L1과 PD-L2는 PD-1의 리간드이다. PD-L1은, 두 개의 세포 외 도메인(IgV 및 IgC 유사 도메인), 막관통 도메인 및 세포 내 도메인으로 구성된 제1형 막관통 단백질이다. 항원 제시 세포, T 세포, B 세포, 단핵구 및 상피 세포에서 구성적으로 발현되며, 전-염증성 사이토카인이 존재할 때 이러한 세포의 여러 유형에서 상향 조절된다(Keir ME et al., (2008) supra; Chen J et al., (2016) Ann Oncol. 27(3):409-416). 연구에 따르면 PD-L1은 IL-10 방출을 유도하여 T 세포에 대한 억제 효과를 생성하는 것으로 나타났다(Dong H et al., (1999) Nat Med. 5(12):1365-1369). PD-L2 발현은 항원 제시 세포에 거의 제한되어 있으며, 유도 가능한 발현은 예를 들어 수지상 세포 및 대식세포에서 발견될 수 있다. 축적된 증거는, PD-1 축이 PD-L1과 결합할 때, 사이토카인(예: IFN-γ, TNF-α 및 IL-2) 생성에 영향을 미쳐 정상 세포/조직에 대한 T 세포 반응을 약화시키는 것을 보여주었다(Keir ME et al., (2008) supra; Chen J et al., (2016) supra). PD-1-PD-L1 상호작용은 또한 세포 생존 인자의 분비, 이펙터 세포 기능과 관련된 전사 인자의 발현, 활성화된 B 세포 및 NK 세포의 용해 활성을 억제한다(Terme M et al., (2011) Cancer Res. 71(16):5393-5399; Fanoni D et al., (2011) Immunol Lett. 134(2):157-160). PD-1은 또한 조절 T 세포(Treg)에서도 높게 발현되며, Treg 활성화 및 증식을 촉진하여 면역 반응을 더욱 억제할 수 있다(Francisco LM et al., (2009) J Exp Med. 206(13):3015-3029).
종양 세포는 숙주의 면역 감시를 회피하기 위해 PD-1 경로를 이용할 수 있다. 특히, 종양-침윤 림프구(TIL)의 상당수가 높은 수준의 PD-1을 발현하는 반면, 흑색종, 난소암, 폐암 및 신장암 세포를 포함한 많은 종양 세포는 PD-1의 리간드, 특히 PD-L1을 구성적으로 발현한다(Dong H et al., (2002) Nat Med. 8(8):793-800; Kim J et al., (2005) Am J Respir Cell Mol Biol. 33(3):280-289; Lee SK et al., (2005) J Dermatol Sci. 40(2):95-103). PD-L1은 미세 환경에서 대식세포와 수지상 세포의 하위 집합을 포함한 골수 세포에서도 발현된다. 따라서 미세 환경에서 PD-L1-PD-1 상호 작용은 T 세포 기능 장애 및 고갈, IL-10 방출, CD8+ T 세포에 의한 종양 세포에 대한 세포 독성 감소를 유발하여 종양 세포 성장을 초래한다(Zou W, Chen L. (2008) Nat Rev Immunol. 8(6):467-477; Sun Z et al., (2015) Cancer Res. 75(8):1635-1644). 면역 반응은 미세 환경의 Treg(Francisco LM et al., (2009) supra) 및 CD80-CTLA4 상호 작용을 약화시키는 PD-L1-CD80 헤테로다이머(Butte MJ et al., (2007) Immunity. 27(1):111-122; Paterson AM et al., (2011) J Immunol. 187(3):1097-1105)에 의해 더욱 저하될 수 있다.
예를 들어 항체에 의한 PD-1/PD-L1 차단은, 고형 종양 및 혈액 종양을 포함한 여러 암에서 지속적인 종양 완화(tumor remission)를 유도할 수 있다. 현재까지 흑색종, 비소세포폐암(NSCLC), 신세포암(RCC), 호지킨 림프종, 방광암, 두경부암, 신경내분비 종양, 고빈도-현미부수체 불안정성(microsatellite instable-high) (MSI-H)) 및 불일치 복구 결함(mismatch repair-deficient) (dMMR)과 같은 고형 종양, 및 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 미만성 거대 B세포 림프종, 및 소포성 림프종과 같은 혈액 종양의 치료를 위해 1,000건 이상의 임상시험에서 PD-L1-PD-1 축을 표적으로 하는 항체가 평가되고 있다(Akinleye A, Rasool Z. (2019) J Hematol Oncol. 12(1):92; Chong Sun et. al. (2018) Immunity 20;48(3):434-452). 아테졸리주맙(Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 및 아셀루맙(Acelumab)의 3가지 항 PD-L1 항체가 FDA의 승인을 받았다. 아테졸리주맙은 PD-L1-PD-1 및 PD-L1-CD80 결합을 차단할 수 있는 인간화 IgG1 항체로, 그것의 Fc 부위가 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 유발하지 않도록 디자인되어 PD-L1+ T 세포의 손상을 제거할 수 있다. 아테졸리주맙은 NSCLC, 흑색종, RCC, 대장암, 위암, 두경부 편평세포암, 및 요로상피세포암을 포함하는 고형 및 비고형 종양에 대한 임상적 효능을 보였다. 마찬가지로 인간화 항체 더발루맙은 PD-L1과, PD-1 또는 CD80의 결합을 차단할 수 있으며, PD-L1+ T 세포에 대한 ADCC를 회피하도록 디자인되었다. 예컨대 요로상피세포암과 NSCLC의 치료에 효과적이다. Fc 부위가 변형되지 않은 또 다른 인간화 IgG1 항체인 아벨루맙(Avelumab)은, PD-L1-PD-1 및 PD-L1-CD80 상호작용을 차단하고 종양 세포에 대한 ADCC를 유도할 수 있으며 메르켈세포암, 요로상피세포암, 및 삼중 음성 유방암(three-negative breast cancer)의 치료에서 양호한 임상 결과를 보여주었다. 임상시험 중인 다른 항 PD-L1 항체는 엔바폴리맙(Envafolimab)과 BMS-936559를 포함한다. 항 PD-L1 항체는 종양 성장을 더 잘 억제하기 위해 다른 항체, 표적 제제 및/또는 화학 요법제와 병용하여 사용할 수 있다.
그러나 항 PD-1/PD-L1 치료제의 광범위한 항종양 효과에도 불구하고 모든 환자가 항 PD-1/PD-L1 치료제에 반응하는 것은 아니며, 일부 환자는 초기에는 고무적인 반응을 보이다가 결국 치료제에 내성이 되었다. 이러한 후천성 내성의 원인을 규명하고 새로운 약제/치료법을 개발하는 것은 매우 중요할 것이다. 상이한 및/또는 개선된 약제학적 특성을 갖는 더 많은 항 PD-L1 항체, 에를 들어, 상이한 결합 친화력, PD-1-PD-L1에 대한 상이한 차단 능력, 및/또는 상이한 결합 에피토프를 갖는 항체에 대한 필요성이 남아 있다.
PD-L1/PD-1 차단은 급성 또는 만성 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염에 대한 임상 또는 전임상 연구에서도 양호한 효과를 보였다(Jubel JM et al., (2020) Front Immunol. 11:487). 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 또는 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV)에 의한 만성 감염에서, 항-PD-L1 항체를 투여하면 IFN-γ, IL-2 및 TNFα 방출이 증가하고, 기능적으로 T 세포 고갈이 역전되며, 및 바이러스 혈증이 개선되었다. 따라서 감염성 질환 치료를 위해서는 더 많은 항 PD-L1 항체가 필요하다.
발명의 요약
본 개시는 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1 및 원숭이 PD-L1)에 결합하는 분리된 단일클론 항체, 예를 들어, 마우스, 인간, 키메라 또는 인간화 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부위를 제공한다. 아테졸리주맙과 같은 종래 기술의 항체와 비교하여, 이것은 인간 및 원숭이 PD-L1 단백질에 대한 유사하거나 더 높은 결합력, PD-L1-PD-1 상호 작용에 대한 유사한 차단 활성, 유사하거나 양호한 T 세포 활성화 능력, 및 유사하거나 더 높은 생체내 항종양 활성을 가진다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 PD-L1 단백질의 검출 및 PD-L1 관련 질병의 치료를 포함하여 다양한 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 본 개시는 PD-L1과 결합하는, 분리된 단일클론 항체(예컨대, 인간화 항체) 또는 이의 항원 결합 부위에 관한 것으로서, i) VH-CDR1 영역, 인간화 항체, 예를 들어, 인간화 항체), 또는 PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위으로서,
i) VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역 및 VH-CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역으로서, 상기 VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역 및 VH-CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 1, 2 및 3; 또는 (2) 각각 서열번호 7, 8 및 9에 표시되거나 또는 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역; 및/또는 ii) VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역으로서, 상기 VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 4, 5 및 6; 또는 (2) 각각 서열번호 10, 11 및 12에 표시되거나 또는 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 개시의 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역, VH-CDR3 영역, VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6; 또는 (2) 각각 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 표시되거나 또는 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 중쇄 가변 영역은 서열번호 13-23 중 어느 하나에 표시되거나 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 경쇄 가변 영역은 서열번호 24-32 중 어느 하나에 표시되거나 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위는, (1) 각각 서열번호 13 및 24, (2) 각각 서열번호 14 및 25, (3) 각각 서열번호 14 및 26, (4) 각각 서열번호 14 및 27, (5) 각각 서열번호 15 및 25, (6) 각각 서열번호 15 및 26, (7) 각각 서열번호 15 및 27, (8) 각각 서열번호 16 및 25, (9) 각각 서열번호 16 및 26, (10) 각각 서열번호 16 및 27, (11) 각각 서열번호 17 및 25, (12) 각각 서열번호 17 및 26, (13) 각각 서열번호 17 및 27, (14) 각각 서열번호 18 및 28, (15) 각각 서열번호 19 및 29, (16) 각각 서열번호 20 및 30, (17) 각각 서열번호 20 및 31, (18) 각각 서열번호 20 및 32, (19) 각각 서열번호 21 및 30, (20) 각각 서열번호 21 및 31, (21) 각각 서열번호 21 및 32, (22) 각각 서열번호 22 및 30, (23) 각각 서열번호 22 및 31, (24) 각각 서열번호 22 및 32, (25) 각각 서열번호 23 및 30, (26) 각각 서열번호 23 및 31, 또는 (27) 각각 서열번호 23 및 32에 표시되거나 이들 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 개시의 분리된 단일클론 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 또는 이들의 기능적 단편일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 PD-L1+ 세포에 대해 감소된 ADCC를 유도하도록 변형되거나, 또는 PD-L1+ 세포에 대해 ADCC를 유도하지 않도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 N297A 돌연변이가 있는 인간 IgG1 불변 영역일 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 경쇄 불변 영역과 같은 카파 경쇄 불변 영역일 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역의 N 말단은 상기 중쇄 가변 영역의 C 말단에 연결되고, 상기 경쇄 불변 영역의 N 말단은 상기 경쇄 가변 영역의 C 말단에 연결된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성될 수 있으며, 여기서 각 중쇄는 전술한 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함하고, 각 경쇄는 전술한 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함한다. 본 개시의 항체는 전장 항체, 예를 들어 IgG4, IgG1 또는 IgG2 이소형(isotype)일 수 있다. 다른 구현예에서 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 단일 사슬 항체일 수도 있거나, Fab 또는 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편으로 구성될 수도 있다.
본 개시의 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 길항성이며, 인간/원숭이 PD-L1에 결합하고, PD-L1-PD-1 상호작용을 차단하고, T 세포 활성화를 유도하고, 및/또는 생체 내 항종양 효과를 갖는다.
본 개시는 또한 세포독소 또는 항암제와 같은 치료제에 결합된, 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 면역 접합체(immuneconjugate)를 제공한다. 본 개시는, 또한 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위와 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티(예를 들어, 제2 항체)에 결합된, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 2중 특이성 분자(bispecific molecule)를 제공한다. 다른 측면에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)의 일부로 만들어질 수 있다. 본 개시는 또한 본 개시의 CAR 또는 TCR을 갖는 면역 세포, 예컨대, T 세포 및 NK 세포를 제공한다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 또한 종양세포용해성(oncolytic) 바이러스에 의해 인코딩되거나 종양용해 바이러스와 함께 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자뿐 아니라, 그러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. (i) 숙주 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 발현하는 단계 및 (ii) 숙주 세포 또는 그 세포 배양액으로부터 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 분리하는 단계를 포함하는, 본 개시의 숙주 세포를 이용하여 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 제조하는 방법이 제공된다.
본 개시는, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 면역 접합체, 2중 특이성 분자, 면역 세포, 종양용해 바이러스, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 T 세포 활성화를 유도하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시는, 대상체에 본 개시의 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 방광암, 두경부암, 신경내분비 종양, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 및 여포성 림프종을 포함하되 이에 한정되지 않는 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물과 함께 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예컨대, 항-PD-1 항체, 항-STAT3 항체, 항-ROR1 항체, 항-TIM-3 항체, 및/또는 항-CTLA-4 항체가 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 조성물은 사이토카인(예컨대, IL-2 및/또는 IL-21) 또는 공동자극(costimulatory) 항체(예컨대, 항-CD137 및/또는 항-GITR 항체)와 함께 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 개시의 조성물은 세포 독성제일 수 있는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 부위을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 감염성 질환을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다. 감염성 질환은 만성 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 또는 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV) 감염과 같은 만성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 마이코플라즈마 감염일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위와 함께, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 또는 항마이코플라즈마제와 같은 적어도 하나의 추가적인 항감염제가 투여될 수 있다.
본 개시의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 진뱅크(Genbank) 항목, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
따라서, 본 발명의 목적은 이전에 공지된 제품, 제품의 제조 공정 또는 제품의 사용 방법을 본 발명의 범위 내에 포함하지 않는 것이며, 이에 따라 본 출원인은 이전에 공지된 제품, 공정 또는 방법에 대한 권리를 유보하고 이에 대한 권리포기서를 개시한다. 또한, 본 발명은 미국특허청(35 U.S.C. 제112조, 제1항) 또는 유럽특허청(EPC 제83조)의 발명의 설명 및 실시가능 요건을 충족하지 않는 임의의 제품, 공정, 제품의 제조 또는 제품의 사용 방법을 본 발명의 범위 내에 포함시키려는 의도가 없으므로, 본 출원인은 이전에 공개된 제품, 제품의 제조 공정 또는 제품의 사용 방법에 대한 권리를 유보하고 이에 따라 권리포기서를 개시한다는 점에 유의한다. 본 발명의 실시에 있어서, 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 제3자의 이전 출원에서 출원인의 특허결정된 특허(들)의 대상이 되는 실시예를 명시적으로 포기할 수 있는 모든 권리는 명시적으로 유보된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 약속으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시에서, 특히 특허청구범위 및/또는 단락에서, "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 부여된 의미를 가질 수 있고, 예를 들어, 그것들은 "함유하다", "함유되는", "함유하는" 등을 의미할 수 있으며, "본질적으로 구성된" 및 "본질적으로 구성하다" 등의 용어는 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 예를 들어, 그것들은 명시적으로 기재되지 않은 구성요소는 허용하지만 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 구성요소는 제외하는 것에 유의한다.
다음의 상세한 설명은 실시예적으로 제공되지만, 기재된 특정 구현예에만 본 발명을 한정하려는 의도는 아니며, 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 100㎍/ml(A) 또는 0.1-10㎍/ml(B)에서 마우스 항-PD-L1 항체의 처리가 T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 증가시켰음을 보여준다.
도 2는 키메라 항-PD-L1 항체의 HEK293A/인간 PD-L1 세포(A), HEK293A/원숭이 PD-L1 세포(B), 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포(C)에 대한 결합 능력을 보여준다.
도 3은 PD-1-PD-L1 상호작용을 차단하는 키메라 항 PD-L1 항체의 능력을 보여준다.
도 4는 용량 의존적 방식으로 T 세포에 의해 IFN-γ 분비를 유도한 키메라 항-PD-L1 항체를 보여준다.
도 5는 HEK293A/인간 PD-L1 세포(A), HEK293A/원숭이 PD-L1 세포(B) 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포(C)에 대한 인간화 3C2 항체의 결합 능력을 보여준다.
도 6은 HEK293A/인간 PD-L1 세포(A), HEK293A/원숭이 PD-L1 세포(B) 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포(C)에 대한 인간화 56E5 항체의 결합 능력을 보여준다.
도 7은 용량 의존적 방식으로 T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 유도한 인간화 56E5 및 3C2 항체를 보여준다.
도 8은 PD-L1 결합에 대한 3C2VH4VL4(A), 56E5VH5VL4(B), 아테졸리주맙(C), 아벨루맙(D) 및 두랄루맙(E)과 경쟁하는 항-PDL1 항체 56E5VH5VL4의 SPR 곡선을 보여준다.
도 9는 PD-L1 결합에 대해 3C2VH4VL4(A), 56E5VH5VL4(B), 아테졸리주맙(C), 아벨루맙(D) 및 두랄루맙(E)과 경쟁하는 항-PDL1 항체 3C2VH4VL4의 SPR 곡선을 보여준다.
도 10은 각각 56E5VH5VL4, 3C2VH6VL5 및 아벨루맙으로 처리된 그룹에서 인간 PD-L1을 갖는 형질전환 마우스의 평균 종양 부피(A) 및 평균 종양 중량(B)을 보여준다.
본 개시가 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반체 걸쳐서 명시되어 있다.
"PD-L1"이라는 용어는 프로그램된 사멸 리간드 1을 의미한다. "PD-L1"이라는 용어는 변종, 이소형, 동족체(homolog), 동원체(ortholog), 및 이원체(paralog)를 포함한다. 예를 들어, 인간 PD-L1 단백질에 특이적인 항체는 특정 경우에 인간 이외의 종(예: 원숭이)의 PD-L1 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 PD-L1 단백질에 특이적인 항체는 인간 PD-L1 단백질에 완전히 특이적이고 다른 종 또는 다른 유형에 대해 교차 반응성을 나타내지 않거나, 또는 특정 다른 종의 PD-L1과 교차 반응할 수 있지만 다른 모든 종과는 교차 반응하지 않을 수 있다.
"인간 PD-L1"이라는 용어는, 사람으로부터 유래한 아미노산 서열, 예를 들어, 진뱅크 기탁번호 AAI13735.1인 아미노산 서열(Strausberg R.L. et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26): 16899-16903) 또는 서열번호 35에 표시된 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 단백질을 의미한다. "원숭이 PD-L1"이라는 용어는 원숭이로부터 유래한 아미노산 서열, 예를 들어, NCBI 기탁번호 XP_005581836.1인 아미노산 서열 또는 서열번호 36에 표시된 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 단백질을 의미한다. "마우스 PD-L1"라는 용어는 마우스로부터 유래한 아미노산 서열, 예를 들어, 진뱅크 기탁번호 AAH66841.1인 아미노산 서열(Strausberg R.L. et al., (2002) supra) 또는 서열번호 37에 표시된 아미노산 서열을 갖는 PD-L1 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 언급되는 "항체"라는 용어는 예를 들어, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 전체 항체 및 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부위") 또는 그 단일 사슬을 포함한다. 전체 항체는 이황화 결합으로 상호 연결된 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VH 로 약칭)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3 의 3개의 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(이하 VL 으로 약칭)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL 로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성(hypervariability) 영역으로 더 세분화할 수 있으며, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재해 있다. 각 VH 및 V L 는 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 다음과 같은 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성 요소(C1q)를 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 항체의 "항원 결합 부위"(또는 단순히 "항체 부위")라는 용어는 항원(예: PD-L1 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 하나 이상의 항체 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 부위"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL VH, CL 및 C H1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된, dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH 은 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 그들이 연결될 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부위"라는 용어 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편들은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이러한 단편들은 온전한 항체들과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본 명세서에서 사용되는 "분리된 항체(isolated antibody)"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 PD-L1 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 인간 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종에서 유래한 PD-L1 단백질과 같은 다른 항원들에 교차 반응성을 가진다. 또한 분리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예: 이성질화, 아미드화)를 제외하고는 동일한 한 집단을 이루는 개별 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되는 매우 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정군(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정군에 대해 지시된다.
본 명세서에서 사용되는 "마우스 항체"라는 용어는 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 마우스 생식계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시의 마우스 항체는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 시험관내 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 본 명세서에서 사용되는 "마우스 항체"라는 용어는 다른 포유류 종의 생식계열에서 유래한 CDR 서열이 마우스 프레임워크 서열에 이식된(grafted) 항체를 포함하지 않는다.
"키메라 항체"라는 용어는 비인간의 유전 물질과 인간의 유전 물질을 결합하여 만든 항체를 지칭한다. 또는 더 일반적으로 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질과 다른 종의 유전 물질을 가진 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 "인간화 항체"라는 용어는 인간에서 자연적으로 생성되는 항체 변종과 유사성을 높이기 위해 단백질 서열이 변형된 비인간 종의 항체를 지칭한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 어구는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 혼용하여 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 PD-L1 단백질(및 가능하면 하나 이상의 비인간 종으로부터의 PD-L1 단백질)에 결합하지만, 비-PD-L1 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 항체는 인간 PD-L1 단백질에 "고친화성(high affinity)", 즉 5.0 x 10-8 M 이하의 KD, 더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하로 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 높은 친화력으로 결합하지 않는 것, 즉 단백질 또는 세포에 1.0 x 10-6 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상의 KD로 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는 표적 항원에 대해 1.0 x 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x 10-9 M 이하 및 더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화성" 결합은 KD 가 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "Kassoc" 또는 "Ka"이라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 결합률을 지칭하기 위한 것이나, 본 명세서에서 사용되는 "Kdis" 또는 "Kd"이라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하기 위한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "KD"라는 용어는 해리 상수를 지칭하기 위한 것으로, 이는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지며 몰 농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당해 기술분야에서 잘 확립된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용하는 것이며, BiacoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이 바람직한다.
반 최대 유효 농도(half maximal effective concentration)라고도 알려진 "EC50"라는 용어는 지정된 노출 시간 후 기준치와 최대치의 중간에서 반응을 유도하는 항체의 농도를 의미한다.
"항체 의존성 세포 독성", "항체 의존성 세포-매개 세포 독성" 또는 "ADCC"라는 용어는 면역계의 이펙터 세포가 항체에 의해 결합된 표적 세포를 적극적으로 용해하는 세포-매개 면역 방어의 기전을 의미한다.
"대상체"라는 용어에는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비인간 영장류, 예컨대, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류와 같은 비포유류를 포함하지만, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유류가 바람직하다.
"길항(antagonistic) PD-L1 항체" 또는 "길항 항-PD-L1 항체"라는 용어는 PD-L1에 결합하여 PD-L1과 PD-1과 같은 그의 리간드와의 상호 작용에 의해 유도되는 PD-L1 신호를 차단하는 항-PD-L1 항체를 지칭한다. 길항 항-PD-L1 항체는 T 세포 활성화 및 사이토카인 방출을 촉진하고 면역력을 강화하여 예를 들어 암 및 만성 감염의 치료에 사용될 수 있다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 질병 또는 상태(예컨대, 암)와 관련된 증상을 예방 또는 개선하거나/하고 질병 또는 상태의 심각성을 완화하기에 충분한 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 치료되는 상태의 맥락에서 이해되며, 실제 유효량은 당업자가 쉽게 식별할 수 있다.
본 개시의 다양한 측면은 다음 세부 항목에서 더 상세히 설명한다.
본 개시의 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 아테졸리주맙과 같은 종래 기술의 항-PD-L1 항체와 유사하거나 그보다 높은 결합력을 갖는 인간 및 원숭이 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합한다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 PD-L1-PD-1 결합 또는 상호작용을 차단할 수 있으며, 그 차단 활성은 아테졸리주맙과 같은 종래 기술의 항-PD-L1 항체와 유사하다.
더욱 중요하게도, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 아테졸리주맙과 같은 종래 기술의 항-PD-L1 항체와 비교하여, 더 높지는 않더라도 유사한 T 세포 활성화 능력 및 생체 내 항종양 활성을 갖는다.
본 개시의 바람직한 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 모노클로날이다. 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 예를 들어 마우스, 키메라 또는 인간화될 수 있다.
본 개시의 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 구조적 및 화학적으로 다음과 같은 특징을 갖는다. 그들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 서열 ID 번호는 표 1에 요약되어 있으며, 일부 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 동일한 중쇄/경쇄 가변 영역을 공유한다.
표 1의 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 그러나, 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, CDR 영역은 중쇄/경쇄 가변 영역 서열을 기반으로 하는 Chothia, IMGT, AbM 또는 Contact 넘버링 시스템/방법과 같은 다른 시스템에 의해서도 결정될 수 있다.
본 개시의 항체는 각각 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1 불변 영역, 예컨대 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 영역 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 본 개시의 항체는 각각 경쇄 불변 영역, 예를 들어 카파 경쇄 불변 영역, 예컨대, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 불변 영역 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
인간 PD-L1에 결합하는 다른 항-PD-L1 항체의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)은 본 개시의 항-PD-L1 항체의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬(또는 그러한 사슬 내의 CDR)이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VH/VL 페어링으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 페어링으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되는 것이 바람직한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다:
(a) 상기 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 상기 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 항체가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 다른 항-PD-L1 항체의 VL .
표 1. 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열번호
다른 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다:
(a) 상기 표 1에 열거된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역; 및
(b) 상기 표 1에 열거된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 또는 항체가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 다른 항-PD-L1 항체의 CDR.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 PD-L1과 결합하는 다른 항체의 CDR, 예를 들어, 중쇄 가변 영역으로부터의 CDR1 및/또는 CDR3, 및/또는 다른 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 결합된 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 CDR2 영역을 포함한다.
또한, CDR1 및/또는 CDR2 도메인과는 독립적으로 CDR3 도메인은 단독으로 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있으며, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 다수의 항체들이 예측 가능하게 생성될 수 있다는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Klimka et al.,, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al.,, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000); Rader et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al.,, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbas et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al.,, J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al.,, J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) 및 Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000) 참조. 또한, 미국 특허 번호 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 및 5,760,185 참조. 이러한 각 참조문헌은 원용에 의해 그 전문에 본 명세서에 포함된다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2 및 항-PD-L1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 CDR3, 또는 다른 항-PD-L1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 (a) PD-L1과 결합하기 위해 경쟁하고; (b) 기능적 특성을 유지하고; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 본 개시의 항-PD-L1 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는 것이 바람직하다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2, 또는 다른 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2를 더 포함할 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 항-PD-L1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, 또는 다른 항-PD-L1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1을 포함할 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 하나 이상의 보존적 변형(conservative modification)에 의해 본 개시의 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 부위과 다른 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 당해 기술분야에서 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, Brummell et al., (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int. Immunol.10:341-6 및 Beers et al., (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 참조.
따라서, 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서,
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 상기 표 1에 열거된 서열 및/또는 그의 보존적 변형체를 포함하고; 및/또는
(b) 상기 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 상기 표 1에 열거된 서열 및/또는 그의 보존적 변형체를 포함하고; 및/또는
(c) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열 및 그의 보존적 변형체를 포함하고; 및/또는
(d) 상기 경쇄 가변 영역 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열(들); 및/또는 그들의 보존적 변형체를 포함하고; 및
(e) 상기 항체가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 PD-L1에 대한 높은 친화성 결합, 및 PD-L1 양성 세포에 대한 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 능력의 감소 또는 제거와 같은, 상기 기술된 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 보유한다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는, 예를 들어, 마우스, 키메라, 인간 또는 인간화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "보존적 서열 변형"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 현저한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하기 위한 것이다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지향적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 당해 기술분야에서 알려진 표준 기술에 의해 본 개시의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 아미노산 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열이 당해 기술분야에 정의되어 있다. 이러한 계열에는 염기성 측쇄 (예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예:, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, 본 개시의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있고, 변경된 항체는 본 명세서에 개시된 기능 분석법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상술한 기능)을 검사할 수 있다.
본 개시의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본 개시의 항-PD-L1 항체의 VH/VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 하나 또는 양쪽 가변 영역(예컨대, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 예를 들어 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 불변 영역 내의 잔기를 변형함으로써 항체를 조작할 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 이식(CDR grafting)은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 간에 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이 되기 때문에, 상이한 특성을 가진 상이한 항체의 프레임워크 서열에 이식된 특정 자연 발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성하여 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. 참조. 또한 미국 86:10029-10033; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
따라서, 본 개시의 다른 구현예는 상술한 바와 같이, 본 개시의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 상술한 바와 같이, 본 개시의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위에 관한 것이다. 이들 항체들은 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하지만, 다른 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 인터넷으로 검색 가능)와 위에서 인용한 Kabat et al., (1991), Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836에서 찾을 수 있으며, 이들의 각 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 또 다른 예로, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음의 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 진뱅크 기탁번호: 1-69(NG--0010109, NT--024637 및 BC070333), 3-33(NG--0010109 및 NT--024637) 및 3-7(NG--0010109 및 NT--024637)에서 이용 가능하다. 또 다른 예로, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 진뱅크 기탁번호: 1-69(NG--0010109, NT--024637 및 BC070333), 5-51(NG--0010109 및 NT--024637), 4-34(NG--0010109 및 NT--024637), 3-30.3(CJ556644) 및 3-23(AJ406678)에서 이용 가능하다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 잘 알려진 갭 블라스트(Gapped BLAST)(Altschul et al., (1997), 위에)라고 칭하는 서열 유사성 검색 방법 중 하나를 사용하여 집대성된(compiled) 단백질 서열 데이터베이스와 비교된다.
본 개시의 항체에 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 개시의 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 서열이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 프레임워크 서열이 유래하는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 이식될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 생식계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임워크 영역에 이식될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기들을 돌연변이시키는 것이 유리하다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 관심 있는 항체의 하나 이상의 결합 특성(예: 친화력)을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다. 돌연변이(들)를 도입하기 위해 부위-지향적 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행할 수 있고, 항체 결합 또는 관심 있는 다른 기능적 특성에 대한 효과는 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 시험관 내 또는 생체 내 분석에서 평가할 수 있다. 바람직하게는 (당해 기술분야에 알려진 바와 같이) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실일 수 있지만, 치환이 바람직한다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 잔기가 변경되지 않는다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-PD-L1 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부위을 제공한다: (a) 본 개시의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 본 개시의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 본 개시의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 본 개시의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 본 개시의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 본 개시의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
본 개시의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 항체를 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 대응하는 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이(backmutate)"하는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과 다른 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교하여 식별할 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 하나 이상의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 접근법은 "면역 제거(deimmunization)"라고도 하며 미국 특허 공개 번호 20030153043에 보다 자세히 설명되어 있다.
또한, 프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 대한 대안으로서, 본 개시의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 독성을 변경하기 위해 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시의 항체는 화학적으로 변형될 수 있고(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경하기 위해 그의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다.
일 구현예에서, CH1 의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기재되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해, CH1 의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 수가 변경된다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역에 도입되어, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 스타필로코실(Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합을 손상시키도록 한다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745에 보다 상세히 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 글리코실화 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화력을 높이기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 참조.
추가적으로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체와 같이, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체를 만들 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구(glycosylation machinery)를 가진 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성할 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당해 기술분야에 개시되어 있으며, 본 개시의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(α(1,6)-푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있으므로, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체는 그들의 탄수화물에 푸코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는, 두 개의 치환 벡터(replacement vector)를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허 공개 번호 20040110704 및 Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 또 다른 예로서, 유럽특허 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주에 대해 설명하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합 관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 유럽특허 1,176,195는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 추가하기 위한 효소 활성이 낮거나 효소 활성이 없는 세포주(예: 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662))에 대해 설명한다. PCT 공개공보 WO 03/035835는 Asn(297)-연결 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소하여 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저푸코실화를 초래하는 변종 CHO 세포주인 Lec13 세포에 대해 설명한다(또한 Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개공보 WO 06/089231에 기재된 바와 같이 달걀에서 생산할 수 있다. 또는 변형된 글리코실화 프로파일을 가진 항체는 렘나(Lemna)와 같은 식물 세포에서 생산할 수 있다. PCT 공개공보 WO 99/54342는, 조작된 세포주에서 발현되는 항체가 항체의 ADCC 활성 증가를 초래하는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내도록, 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예: β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술한다(또한 Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180 참조). 또는, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다아제 효소를 사용하여 절단할 수 있다; 예를 들어, 푸코시다아제 α-L-푸코시다아제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 개시에 의해 고려되는, 본 명세서에서 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 예를 들어, 항체는 페길화되어 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체 또는 그의 단편은 전형적으로, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서, 반응성 에스테르 또는 PEG의 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응한다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 이와 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리에틸렌 글리콜"이라는 용어는 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴록시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 임의의 형태의 PEG를 포함하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 글리코실화된 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 본 개시의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EPO 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
본 개시의 항체는 그들의 다양한 물리적 특성으로 특징지어져서, 그의 상이한 클래스를 검출 및/또는 구별할 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 항체의 면역원성을 증가시키거나 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 pK를 변경할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 어떤 경우에는 가변 영역 글리코실화를 포함하지 않는 항-PD-L1 항체를 갖는 것이 바람직한다. 이는 가변 영역의 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택하거나 글리코실화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성질체 부위를 포함하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열에서 발생할 수 있으며, 그 결과 폴리펩타이드 사슬에 꼬임(kink)을 유발하고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔류물이 생성될 수 있다(이소아스파르트산 효과).
각 항체는 일반적으로 pH 6~9.5의 범위에 속하는 고유한 등전점(pI)을 가질 것이다. IgG1 항체의 pI는 전형적으로 pH 7~9.5의 범위에 속하며, IgG4 항체의 pI는 전형적으로 pH 6~8의 범위에 속한다. 정상 범위를 벗어난 pI를 가진 항체는 생체 내 조건에서 약간의 언폴딩(unfolding) 및 불안정성을 가질 수 있다고 추정되고 있다. 따라서 정상 범위에 속하는 pI 값을 포함하는 항-PD-L1 항체를 사용하는 것이 바람직한다. 이는 정상 범위의 pI를 갖는 항체를 선택하거나 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술에 의해 다른 세포 성분들 또는 다른 오염물질들, 예를 들어, 다른 세포 핵산들 또는 단백질들로부터 정제될 때 "분리"되거나 "실질적으로 순수하게" 된다. 본 개시의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현되는 항체(예를 들어, 후술하는 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 가진 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 복제 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리에서 얻은 항체의 경우(예를 들어, 파지 디스플레이(phage display) 기술 사용), 해당 항체를 코딩하는 핵산을 유전자 라이브러리에서 회수할 수 있다.
본 개시의 바람직한 핵산 분자는 PD-L1 단일클론 항체 또는 CDR의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이러한 DNA 단편은, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환하기 위해, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이러한 조작에서, VL 또는 VH 를 코딩하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 단백질을 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 본 문맥에서 사용되는 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"이라는 용어는, 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임으로(in-frame) 유지되도록 2개의 DNA 단편이 결합됨을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 분리된 DNA는, VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결하여 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 분리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 변환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는 다른 단편, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL 서열이, 가요성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 가진, 인접한(contiguous) 단일 사슬 단백질로 발현될 수 있다 (예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 개시의 단일클론 항체(mAb)는 Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495의 잘 알려진 체세포 혼성화(하이브리도마) 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 단일클론 항체를 생산하기 위한 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환 및 파지 디스플레이 기술을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체도 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370를 참조하며, 그 내용은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
또한, 본 개시의 항체는 예를 들어, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마(transfectoma)에서 제조될 수 있다(예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법에 의해 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 하나 이상의 발현 벡터에 삽입되어, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 한다. 이 문맥에서, "작동적으로 연결된"이라는 용어는 항체 유전자가 벡터에 결합되어(ligated), 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 수행함을 의미하는 것으로 의도된다.
"조절 서열(regulatory sequence)"이라는 용어는 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예: 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 기재되어 있다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마에서 유래한 프로모터 및/또는 인헨서와 같이, 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소들을 포함한다. 또한 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스 조절 서열을 사용할 수도 있다. 또한, SV40 초기 프로모터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 장 말단 반복 서열을 포함하는, SRα 프로모터 시스템과 같은 다양한 출처의 서열로 구성된 조절 요소도 있다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 호환되도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 가변 영역은 원하는 이소형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터에 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하는데 사용되어, VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트에 작동가능하게 연결되고, VL 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는, 신호 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인프레임으로 연결되도록, 벡터에 복제될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역 글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시의 재조합 발현 벡터는, 추가 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택 가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭이 있는 dhfr-숙주 세포에 사용) 및 네오 유전자(G418 선택용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염시킨다. "형질감염(transfection)"이라는 용어의 다양한 형태는 전기천공(electroporation), 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등과 같이, 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 도입하는 데 일반적으로 사용되는 다양한 기술을 포함하도록 의도된다. 이론적으로 본 개시의 항체를 원핵세포 또는 진핵세포 숙주 세포에서 발현하는 것이 가능하지만, 진핵세포, 특히 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것이 가장 바람직한데, 이는 진핵세포, 특히 포유류 세포가 원핵세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 개시의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621에 기술된 것과 같이 DHFR 선택 가능한 마커와 함께 사용된, Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히 NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되면, 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산되거나, 또는 더 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체가 분비됨으로써 항체가 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 치료제에 접합되어 항체-약물 접합체(ADC)와 같은 면역 접합체를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 세포 독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 결합제(groove binder), DNA 인터칼레이터, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 핵 수송 억제제(nuclear export inhibitor), 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 충격 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항유사분열제(anti-mitotic agent)를 포함한다. ADC에서, 항체와 치료제는 펩티딜, 디설파이드 또는 히드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 접합되는 것이 바람직한다. 더욱 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다. ADC는 미국 특허 번호 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개공보 WO 02/096910; WO 07/038,658; WO 07/051,081; WO 07/059,404; WO 08/083,312; 및 WO 08/103,693; 미국 특허공개공보 20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이 문헌의 개시 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 측면에서, 본 개시는 적어도 하나의 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 연결된 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 2중 특이성 분자를 특징으로 하여, 적어도 2개의 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 2중 특이성 분자를 생성한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "2중 특이성 분자(bispecific molecule)"는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다.
2중 특이성 분자는 다양한 형태와 크기로 존재할 수 있다. 크기 스펙트럼의 한쪽 끝에서, 2중 특이성 분자는 동일한 특이성을 가진 2개의 결합 암 대신, 각각 다른 특이성을 가진 2개의 결합 암을 갖는다는 점을 제외하면, 전통적인 항체 형식을 유지한다. 다른 극단에는, 소위 Bs(scFv) 2 구조인, 펩타이드 사슬로 연결된 2개의 단일 사슬 항체 단편(scFv')으로 구성된 2중 특이성 분자가 있다. 중간 크기의 2중 특이성 분자는 펩티딜 링커로 연결된 2개의 다른 F(ab) 단편을 포함한다. 이러한 형태와 다른 형태의 2중 특이성 분자는 유전공학, 체세포 혼성화 또는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 위에서 인용된, Kufer et al; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); and van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), 및 본 명세서에 인용된 참고문헌을 참조한다.
본 개시는, 본 개시의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및/또는 CDR을 포함하는 항-PD-L1 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
키메라 항원 수용체는 (a) 항-PD-L1 scFv를 포함하는 세포 외 항원 인식 도메인, (b) 막관통 도메인 및 (c) 세포 내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다.
종양용해 바이러스는 암세포를 우선적으로 감염 및 사멸시킨다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 종양용해 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 종양용해 바이러스가 인체에 도입될 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 면역 접합체, 2중 특이성 분자, 키메라 항원 수용체를 보유하는 면역 세포, 종양용해 바이러스, 핵산 분자, 발현 벡터 및/또는 본 개시의 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 선택적으로 항종양제, 항감염제, 또는 면역 증강제와 같은 하나 이상의 추가적인 약제학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은 예를 들어, 항종양제, 항감염제, 또는 면역 증강제와의 병용 요법으로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향료, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 방부제, 등장화제 및 이들의 조합을 포함한다. 적절한 부형제의 선택과 사용은 Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)에 시사되어 있으며, 이 문헌의 개시 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예: 주사 또는 주입)에 적합한다. 투여 경로에 따라, 활성 성분을 비활성화할 수 있는 산의 작용 및 기타 자연 조건으로부터 보호하기 위해, 활성 성분을 물질로 코팅할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "비경구 투여"라는 어구는 일반적으로 주사를 통한, 경구 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 개시의 항체는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여 경로와 같은 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 약학적 조성물은 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 고농도 약물에 적합한 기타 정렬된 구조로 제형화될 수도 있다.
단일 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 결합할 수 있는 활성 성분의 양은, 치료 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 치료 효과를 발생하는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로 100% 중 이 양은 약학적으로 허용되는 담체와 결합된 활성 성분의 약 0.01%에서 약 99% 범위일 것이다.
투여 요법은 원하는 최적의 반응(예: 치료 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스(single bolus)를 투여하거나, 시간에 따라 여러 분할 용량을 투여하거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 줄이거나 증가시킬 수 있다. 비경구용 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태(dosage unit form)로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료 대상에 대한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 성분을 함유한다. 대안적으로 항체를 서방성 제형으로 투여할 수 있으며, 이 경우 투여 빈도가 줄어든다.
항체 또는 이의 항원 결합 부위를 투여하는 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 주 1회 투여를 수반한다. 본 개시의 항-PD-L1 항체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 포함한다.
본 개시의 항-PD-L1 항체의 "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 질병 증상의 중증도의 감소, 질병 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질병 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 예를 들어, 종양 보유 대상체의 치료의 경우, "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 치료되지 않은 대상체에 비해, 종양 성장을 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 치료적 유효량의 치료용 항체는 종양 크기를 감소시키거나, 또는 전형적으로 인간 또는 다른 포유류일 수 있는 대상체에서 증상을 개선할 수 있다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리산 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체 적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조.
치료적 조성물은, (1) 바늘 없는 피하 주사 장치(예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,163, 5,383,851, 5,064,413, 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프(미국 특허 번호 4,487,603); (3) 경피 장치(미국 특허 번호 4,486,194); (4) 주입 기구(미국 특허 번호 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 장치(미국 특허 번호 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료 기기를 통해 투여될 수 있으며, 상기 문헌의 개시 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 단일클론 항체는 생체 내에서 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 치료용 항체가 혈액-뇌 장벽을 통과하도록 보장하기 위해, 그것들은, 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키는 표적 모이어티를 추가로 포함할 수 있는 리포좀으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; V. V. Ranade (1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273 참조.
본 개시의 약학적 조성물은 예를 들어 암 및 감염성 질환의 치료 및/또는 예방과 관련된 수많은 시험관 내 및 생체 내 유틸리티를 가질 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은 종양 성장을 억제하거나 병원균을 감소 또는 제거하기 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다.
암 세포의 증식 및 생존을 억제하는 본 개시의 항-PD-L1 항체의 능력을 고려할 때, 본 개시는 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 본 개시의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 개시의 항체에 의해 치료될 수 있는 종양의 비제한적인 예는 흑색종, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 방광암, 두경부암, 신경내분비 종양, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 및 여포성 림프종(원발성 및/또는 전이성)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 불응성 또는 재발성 악성 종양은 본 개시의 약학적 조성물을 사용하여 억제될 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시의 약학적 조성물은 병원균을 감소시키거나 제거할 수 있으므로, 본 개시는 대상체에 본 개시의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 마이코플라즈마 감염에 의해 야기될 수 있다. 감염성 질환은 만성 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 또는 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV) 감염일 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 데 효과적인 하나 이상의 추가적인 항체 또는 비항체 제제와 함께 본 개시의 약학적 조성물을 투여하는 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 항-VISTA 항체, 항-LAG-3 항체, 항-PD-1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체와 같은 하나 이상의 추가 항체와 함께 본 개시의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 개시의 약학적 조성물은 세포에 독성이 있는 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 항-PD-L1 항체와 병용될 수 있는 다른 요법은 인터루킨-2(IL-2) 투여, 방사선, 수술 또는 호르몬 박탈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 개시의 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 항체 또는 비항체 제제와 조합하여 바이러스, 박테리아, 진균 또는 마이코플라즈마와 같은 대상체에서의 병원균을 효과적으로 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 약학적 조성물은 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제 및 항마이코플라즈마제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항감염제와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 치료제의 조합은 약학적으로 허용되는 담체 내에서 단일 조성물로서 동시에 투여되거나, 약학적으로 허용되는 담체 내에서 각 약제와 개별 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료제의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 1회 초과의 병용 요법을 순차적으로 투여하는 경우, 각 투여 시점에서 순차적 투여의 순서를 바꾸거나 동일한 순서로 유지할 수 있으며, 순차적 투여는 동시 투여와 조합하거나 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 개시는 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이들 실시예는 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참조문헌, 진뱅크 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
실시예
실시예 1 . 인간, 원숭이 또는 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포주의 구축
인간, 원숭이 또는 마우스 PD-L1을 안정적으로 과발현하는 세포주는 HEK293A 세포(Cobioer, NJ, 중국)를 사용하여 제조하였다. 간단히 말해서, 인간, 원숭이 및 마우스 PD-L1 단백질을 각각 코딩하는 cDNA 서열(각각 서열번호 35, 36, 및 37에 표시된 아미노산 서열)을 합성한 다음, pLV-EGFP(2A)-Puro 벡터에 서브클로닝하였다(subcloned). 리포펙타민 3000 키트(미국 Thermo Fisher Scientific)의 지침에 따라 pLV-EGFP(2A)-Puro-PD-L1, psPAX 및 pMD2.G 플라스미드를 동시 형질감염시켜(cotransfection) HEK-293T 세포(Cobioer, NJ, 중국)에서 렌티바이러스를 생성했다. 동시 형질감염 3일 후, 세포 배양 배지(10%FBS(Cat#:FND500, Excell)이 포함된 DMEM 배지(Cat#:SH30022.01, Gibco))로부터 렌티바이러스를 회수했다. 마지막으로 HEK293A 세포에 렌티바이러스를 감염시켜 각각 인간, 원숭이, 및 마우스 PD-L1을 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포주, 즉 HEK293A/인간 PD-L1 세포, HEK293A/원숭이 PD-L1 세포, 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포를 생성했다. 그런 다음 형질감염된 HEK293A 세포를 0.2μg/ml 푸로마이신(Cat#:A11138-03, Gibco)을 함유한 배지(DMEM+10%FBS)에서 7일간 배양했다. 인간 PD-L1 및 사이노몰거스 PD-L1의 발현은 상업적으로 이용가능한 항-PD-L1 항체(PE 항-인간 PD-L1 항체, Cat#:393607, Biolegend, 미국)를 사용하여 FACS로 확인했다. 마찬가지로, 마우스 PD-L1의 발현은 상업적으로 이용 가능한 항-마우스 PD-L1 항체(PE 항-마우스 PD-L1 항체, Cat#:124307, Biolegend, 미국)를 사용하여 FACS로 확인했다.
실시예 2 . 인간 PD-L1에 대한 단일클론 마우스 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 생성
뮤린 항-인간 PD-L1 단일클론 항체(mAb)는 다음과 같이 일부 수정을 가한 기존의 하이브리도마 융합 기술을 사용하여 생성하였다.
면역화(Immunization)
하기 표 2의 계획에 따라 10마리의 BALB/c 마우스(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, 중국 베이징)에 재조합 인간 PD-L1(ECD)-hFc(Cat#:10084-H02H, 중국 Sino Biological) 및 재조합 사이노몰거스 PD-L1(ECD)-hFc(Cat#:90251-C02H, 중국 Sino Biological)를 주입했다. 인간 PD-L1 (ECD)-hFc 및 사이노몰거스 PD-L1 (ECD)-hFc를, 동일한 부피의 완전 프로인트 보강제(Complete Freund's Adjuvant)(Cat#:F5881-10*10ML, SIGMA, 미국), 불완전 프로인트 보강제(Cat#:F5506-6*10ML, SIGMA, 미국) 또는 PBS와 함께 초음파 처리하여 유화시켰다.
표 2. 면역화 계획
각 부스트 1주일 후, 재조합 인간 PD-L1 (ECD)-his(Cat#:10084-H08H, Sino Biological, CN) 및 사이노(cyno) PD-L1(ECD)-hFc (Cat#:90251-C02H, Sino Biological, CN)를 사용하여 ELISA에 의한 역가 측정을 위해 각 마우스로부터 50μl의 뮤린 혈청을 수집했다. 역가 측정은 또한 실시예 1에서 제조한 대로 인간 PD-L1, 사이노몰거스 PD-L1 및 마우스 PD-L1을 각각 과발현한 HEK293A 세포를 사용하여 FACS로 수행했다.
최종 부스트 후 ELISA 및 FACS 결과를 기초로 하여, 10마리의 마우스 모두를 하이브리도마 세포주 생성에 사용하였다.
하이브리도마 세포주 생성
하이브리도마 세포주는 다음과 같이 약간의 수정을 가한 기존의 하이브리도마 융합 기술을 사용하여 생성하였다.
최종 부스트 4일 후, 마우스를 희생하고 비장을 수집하고 PBS 내 단일 세포 현탁액으로 제조했다. 비장세포를 DMEM 배지(Cat#:SH30243.01B, Hyclone, 미국)로 3회 세척했다. 대수기(log-phase)에서 생존 가능한 골수종 세포 SP2/0(CRL-1581, ATCC, US)를 뮤린 비장세포와 1:4의 비율로 혼합하였다. 그런 다음 세포를 2회 세척한 후, PEG(Cat#:P7181, Sigma, US)를 사용하여 세포 융합을 수행했다. 융합 후 세포를 DMEM 배지로 3회 세척하고 10% FBS와 1X HAT(Cat#:H0262, Sigma)가 보충된 세포 성장 배지(RPMI 배지 1640(Cat#:C22400500CP, Gibco))에서 현탁시켰다. 세포 현탁액을 약 5Х104 개 세포를 함유하는, 웰당 200㎕의 96 웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃ 습도 5% CO2 인큐베이터에서 7일간 인큐베이션하였다. 그 후, 성장 배지를 10% FBS 및 1X HAT가 보충된 새로운 배지로 교체했다. 2일 내지 3일 후, ELISA 및 FACS에 의한 하이브리도마 세포 스크리닝을 위해 세포 배양 상청액을 수집했다.
ELISA를 이용한 하이브리도마 세포주의 스크리닝
인간 PD-L1 (ECD)-his (Cat#:10084-H08H, Sino Biological, CN)를 사용하여 인간 PD-L1에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론에 대한 스크리닝을 위해 고처리량(high-throughput) ELISA 결합 분석을 수행했다. 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 클론은 사이노몰구스 PD-L1 (ECD)-hFc(Cat#:90251-C02H, Sino Biological, CN)를 사용하여 사이노몰구스 PD-L1과 교차 반응하는 그들의 능력을 추가로 시험하였였다.
ELISA 분석을 통해 249개의 하이브리도마 클론이 인간 및 원숭이 PD-L1 모두에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다.
FACS를 이용한 하이브리도마 세포주의 스크리닝
249개의 하이브리도마 클론을, 실시예 1에서 제조한 HEK293A/인간 PD-L1 세포, HEK293A/원숭이 PD-L1 세포 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포를 사용하여, HEK293A 세포에서 발현된 인간, 사이노몰구스 및 마우스 PD-L1에 대한 그들의 결합 능력에 대해 추가로 시험하였다.
FACS 스크리닝을 기초로, HEK293A/인간 PD-L1 세포와 HEK293A/원숭이 PD-L1 세포 모두에 높은 결합력을 보이는 88개의 양성 클론을 얻었다.
항 PD-L1 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 서브클로닝
88개의 하이브리도마 클론을 2회 서브클로닝 하였다. 서브클로닝 중에, 각 모 클론으로부터 다수의 서브클론(n>3)을 선별하여 상기 설명한 대로 ELISA 및 FACS 분석으로 시험하였다. 이 과정을 통해 선별된 서브클론은 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로 정의하였다. 최종적으로 인간 및 원숭이 PD-L1 모두에 대해 높은 결합력을 가진 79개의 서브클론(각 모 클론으로부터 1개의 서브클론)을 얻었다.
실시예 3 . 마우스 항-PD-L1 단일클론 항체의 정제
실시예 2에서 얻은 79개의 클론 중에서, 인간 및 원숭이 PD-L1에 대한 결합력이 상대적으로 높은 10개의 클론을 추가로 특성화했다. 10개 클론으로부터 단일클론 마우스 항체를 먼저 정제했다. 간단하게, 각 서브클론의 하이브리도마 세포를, 1% HT 보충제(Cat#:11067-030, Gibco)가 포함된 각각 100ml의 신선한 무혈청 배지(Cat#:12045-076, Gibco, US)를 가진 T175 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포 배양액은 37℃에서 5% CO2가 포함된 인큐베이터에서 10일간 보관했다. 세포 배양액을 수집하여 3500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 0.22μm 캡슐을 사용하여 여과하여 세포 잔여물을 제거했다. 그 후 사전 평형화된(pre-equilibrated) 단백질-A 친화성 컬럼(Cat#:17040501, GE, US)을 사용하여 단일클론 항체를 정제하고 용출 완충액(20mM 구연산, pH3.0-pH3.5)으로 용출했다. 그런 다음 항체를 PBS 완충액(pH 7.0)에 보관하고 NanoDrop 기기를 사용하여 그 농도를 측정했다.
각각의 정제된 항체의 이소형은 제조업체의 설명서에 따라 카파 및 람다-마우스를 사용한 신속 이소형 키트(Rapid Isotyping Kit)(Cat#:26179, Thermal, US) 및 마우스 단일클론 항체 이소형 분석 시약(Cat#:IS02-1KT, Sigma, US)을 사용하여 측정했다.
3C2 및 56E5를 포함한 대부분의 클론은 IgG1/카파 항체를 생산했지만, 나머지 클론은 IgG2a/카파 또는 IgG2b/카파 항체를 생산했다. 클론 3C2 및 56E5에 대한 발현 역가는 각각 6.3 mg/L 및 7.8 mg/L였다.
실시예 4. HEK293A 세포에서 발현된 인간 및 원숭이 PD-L1에 결합된 마우스 항-PD-L1 단일클론 항체
항-PD-L1 항체가 인간, 원숭이 또는 마우스 PD-L1에 결합하는지 확인하기 위해, 실시예 1에서 생성된 바와 같이 인간, 원숭이 및 마우스 PD-L1을 각각 안정적으로 과발현시킨 HEK293A 세포를 사용하여 FACS로 세포-기반 결합 분석을 수행했다. 간단히 설명하면, 100μl 배양 배지 내의 105 HEK293A 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 여기에 50μl의 연속 희석된 항-PD-L1 항체를 추가했다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트는 PBST로 3회 세척했다. 그런 다음 500배 희석된 APC 결합(coupled) 염소 항-마우스 IgG(Cat#:405308, BioLegend, US)를 플레이트에 첨가했다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음, FACS 기계(BD)를 사용하여 세포 형광을 모니터링했다.
마우스 항-PD-L1 단일클론 항체 모두가 인간과 원숭이 PD-L1 둘다에 대해 높은 결합력을 보였으나, 마우스 PD-L1에는 결합하지 않았다. 대표적인 항체들의 EC50 값은 아래 표 3에 요약하였다.
표 3. 인간, 원숭이 및 마우스 PD-L1에 대한 마우스 항-PD-L1 항체의 결합력
실시예 5 . 에피토프 비닝(Epitope binning)
에피토프 비닝을 위해 경쟁 ELISA 분석을 수행했다. 간단히 말해, 96웰 플레이트를 밤새 4℃에서 웰당 100 μl씩, 0.5 μg/ml의 인간 PD-L1 (ECD)-His(Cat#:10084-H08H, Sino Biological, CN)로 코팅했다. 웰을 실온에서 2시간 동안 200μl 차단 완충액(1% BSA, 1% 염소 혈청 및 0.05% Tween 20을 함유한 PBS)으로 차단했다. 인간 IgG1(N297A)/카파 불변 영역과 WO2020226986에 개시된 아미노산 서열을 사용하여 제조된 아테졸리주맙(Atezolizumab), 인간 IgG1/카파 불변 영역과 WO2013079174A1에 개시된 아미노산 서열을 사용하여 제조된 아벨루맙(Avelumab), 인간 IgG1(L234F, L235E, P331S)/카파 불변 영역과 US20190276543A1에 개시된 아미노산 서열을 사용하여 제조된 두르발루맙(Durvalumab), 및 항-Hel 항체(Cat#:LT12031, LifeTein, US)를 각각 5μg/ml로 희석하고 웰당 100μl씩 플레이트에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 3회 세척한 후, 본 개시의 1 μg/ml 항체 100 μl를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 1:20000으로 희석한 항-마우스 Fc-HRP(Cat#:A9309-1MC, Sigma, US)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 새로 준비한 Ultra-TMB (Cat#:TMB-S-003, Huzhou Yingchuang, CN)로 실온에서 5분간 진행했다. 흡광도는 450nm에서 마이크로플레이트 판독기(Thermo Multiscan FC)에서 측정했다.
클론 3C2로부터의 항체를 포함하는 9개의 마우스 항체는 에피토프 결합에 대해 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 두르발루맙과 경쟁하지 않았으며, 이는 이들이 참조 항체와 비교하여 상이한 에피토프에 결합했음을 나타낸다. 클론 56E5로부터의 항체는 에피토프 결합에 대해 3개의 참조 항체 모두와 경쟁했으며, 이는 56E5 항체가 참조 항체와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합했음을 나타낸다.
실시예 6. 마우스 항 PD-L1 항체의 PD-1-PD-L1 상호작용 억제
보고된 바와 같이 PD-1은 PD-L1의 수용체이다. 실시예 1에서 생성된 인간 PD-L1을 안정적으로 과발현하는 HEK293A 세포를 사용하여, PD-1-PD-L1 상호 작용에 대한 항체의 차단 능력을 측정하기 위해 세포-기반 차단 분석을 FACS로 수행하였다. 간단히 설명하면, 100μl 배양 배지 중 105개의 HEK293A/인간 PD-L1 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 여기에 50μl의 연속적으로 희석된 항-PD-L1 항체를 추가했다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척했다. 그런 다음, 200 μg/ml의 PD1-hFc 단백질(Cat#:10377-H02H, Sino Biological, CN)을 웰당 100 μl씩 플레이트에 첨가했다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 500배 희석한 PE 결합(coupled) 염소 항-인간 IgG(Cat#:PAI-86078, Thermofisher, US)를 추가했다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척한 다음, FACS 기계(BD)를 사용하여 세포 형광을 모니터링했다.
데이터는, 2개의 항체만이 PD-L1-PD-1 상호작용을 차단할 수 없었고, 3C2 및 56E5를 포함하는 나머지 8개 항체는 PD-L1-PD-1 상호작용을 차단했음을 보여주었다. 대표적인 항체의 EC50 값은 표 4에 요약하였다.
표 4. PD-L1-PD-1 상호작용에 대한 마우스 항-PD-L1 항체의 차단 능력
실시예 7. 마우스 항-PDL1 항체의 T 세포 활성화 촉진.
혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 마우스 항-PDL1 항체가 APC-매개 T 세포 활성화에 미치는 영향을 연구했다.
간단히 말해서, 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 인간 공연자의 혈액 샘플로부터 PBMC를 수집한 다음, RPMI1640 배지에 재현탁했다. PBMC를 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하고, 용기 벽에 부착된 세포를 분리된 단핵구로서 수집했다. 단핵구는 10% FBS, 100ng/ml 재조합 인간 GM-CSF(Cat#:7954-GM, R&D, US) 및 100ng/ml 재조합 인간 IL-4(Cat#:6507-IL, R&D, US)가 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 3일 후 배지의 절반을 새로운 배지로 교체했다. 배양 6일째에 배양 배지를 100ng/ml의 재조합 인간 GM-CSF, 100ng/ml의 재조합 인간 IL-4, 10ng/ml의 rhTNF-α(Cat#:210-TA-100, R&D, US), 1000 U/ml의 rhIL-6(Cat#:7270-IL-025, R&D, US), 1 μg/ml의 PGE2(Cat#:363-24-6, TOCRIS, US) 및 10 ng/ml의 IL-1β(Cat#:210-LB-025, R&D, US)를 함유하는 새로운 배지로 교체했다. 세포를 2일간 더 배양했다. 그런 후, 밀도 구배 원심분리에 의해 다른 건강한 인간 공여자의 혈액 샘플로부터 PBMC를 수집한 다음, RPMI1640 배지에 재현탁했다. 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen Dynabeads Untouched Human CD4+ T 세포 분리 키트(Cat#:11346D, Thermal Fisher Scientific, US)를 사용하여 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분리했다. 첫 번째 공여자의 수지상 세포와 두 번째 공여자의 CD4+ T 세포를, 웰당 총 150㎕ 배양 배지에 각각 2.5Х104 세포/웰 및 5Х104 세포/웰로 96웰 U-바닥 플레이트에 시딩했다.
플레이트에 50 μl 항-PD-L1 항체(0.1-10 μg/ml) 또는 항-Hel 대조군(Cat#:LT12031, LifeTein, US)을 추가하고 72시간 동안 더 배양했다. IFN-γ 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 키트(Cat#:SIF50, R&D, US)로 측정했다. 분석은 3회 수행하였다.
도 1 (A)에 나타난 바와 같이, 가장 높은 IFN-γ 수준은 3C2 및 56E5 항체로 처리한 웰에서 검출되었다. 이러한 항체는 용량 의존적으로 항-Hel 이소형 대조군과 비교하여 T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 증가시켰다(도 1 (B)).
실시예 8. 키메라 항-PD-L1 항체의 발현 및 정제
3C2 및 56E5 항체를 추가로 연구했다. 두 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역 서열은 문헌()에 기재된 대로 프라이머 세트를 사용하여 표준 PCR 방법을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 클로닝하고(Juste et al., (2006), Anal Biochem. 349(1):159-61), 시퀀싱했다. 염기서열은 표 1과 표 8에 요약하였다. 가변 영역 서열 + 인간 IgG1(N297A)/카파 불변 영역 서열(각각 서열번호 33 및 34에 표시된 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열)을 코딩하는 서열을 pCDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, US)의 XhoI/BamHI 제한 부위(restriction site)에 삽입하여 발현 벡터를 구축하였다.
발현 벡터는 HEK-293F 세포(Cobioer, NJ, CN)에 PEI 형질감염시켰다. 구체적으로, HEK-293F 세포를 Free StyleTM 293 발현 배지(Cat#:12338-018, Gibco)에서 배양하고 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하는 발현 벡터로 세포 배지 밀리미터당 1.5㎍ DNA와 DNA:PEI 비율 1:3로 형질감염시켰다. 형질 전환된 HEK-293F 세포를 5% CO2의 37℃의 배양기에서 120RPM으로 흔들면서 배양했다. 10-12일 후, 상층액을 수확하고 실시예 3에 설명된 대로 단일클론 항체를 정제했다.
실시예 9. 인간 및 원숭이 PD-L1에 결합된 키메라 항-PD-L1 단일클론 항체
키메라 항 PD-L1 항체는 인간 PD-L1, 원숭이 PD-L1 및 마우스 PD-L1에 결합하는 능력에 대해 추가로 특성화되었다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트에 500ng/ml의 인간 PD-L1 (ECD)-his(Cat#:10084-H08H, Sino Biological, CN)를 웰당 100μl씩 4℃에서 하룻밤 동안 코팅했다. 웰을 실온에서 2시간 동안 200μl 차단 완충액(1% BSA, 1% 염소 혈청 및 0.05% Tween 20을 함유한 PBS)으로 차단하고, 100μl의 연속 희석된 항-PD-L1 항체(40μg/ml에서 시작)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 PBST(PBS+0.05% Tween 20)로 3회 세척하고 5000배 희석한 염소 항-인간 IgG-HRP(Cat#:31410, Thermal, US)를 추가한 후 실온에서 1시간 동안 배양했다. 새로 준비한 Ultra-TMB(Cat#:555214, BD, 미국)로 실온에서 5분간 배양했다. 흡광도는 450nm에서 SpectraMaxR i3X 판독기(Molecular Devies, 미국)로 판독했다.
원숭이 또는 마우스 PD-L1에 대한 항-PD-L1 mAb의 종 교차 반응성은 직접 ELISA를 통해 추가로 평가했다. 간단히 말해서, 96웰 ELISA 플레이트에 500ng/ml 원숭이 PD-L1 (ECD)-his(Cat#:90251-C08H, Sino Biological, CN) 또는 마우스 PD-L1 (ECD)-his(Cat#:50010-M08H, Sino Biological, CN)를 웰당 100μl 코팅한 후 100μl의 연속 희석된 항 PD-L1 항체(40μg/ml에서 시작)를 추가하여 배양했다. 그런 다음 HRP(Cat#:31410, Thermal, US)와 접합된 염소 항-인간 IgG를 플레이트에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트는 실온에서 5분간 새로 준비한 Ultra-TMB(Cat#:555214, BD, 미국)로 진행하였고, 흡광도는 450nm에서 SpectraMaxR i3X 리더기(Molecular Devies, 미국)로 판독되었다. 기준 항체로는 아테졸리주맙을 사용했다.
결합력 테스트에서 대표 항체의 EC50 값은 표 5에 요약되어 있다. 데이터에 따르면 모든 키메라 항체는 인간과 원숭이 PD-L1에 높은 결합력을 보였지만 마우스 PD-L1에는 결합하지 않았다. 키메라 3C2 및 56E5 항체의 결합 능력은 모체 항체와 비슷했으며 아테졸리주맙보다 높았다.
표 5. 인간, 원숭이, 마우스 PD-L1에 대한 키메라 항-PDL1 mAb의 결합 능력
항체들은 또한 실시예 4의 프로토콜에 따라 실시예 1에서 생성된 HEK293A/인간 PD-L1 세포, HEK293A/원숭이 PD-L1 세포 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포에 결합하는 능력을 테스트했다. 시험 결과는 도 2에서 도시되어 있다.
도 2에서 볼 수 있듯이 키메라 항체는 인간 PD-L1(도 2 (A))과 원숭이 PD-L1(도 2 (B))에 모두 높은 결합력을 보였으나 마우스 PD-L1(도 2 (C))에는 결합하지 못했다.
실시예 10 . 키메라 항 PD-L1 단일클론 항체의 PD-L1-PD-1 상호작용 억제
키메라 항-PD-L1 항체는 실시예 6의 프로토콜에 따라 실시예 1에서 생성된 HEK293A/인간 PD-L1 세포를 사용하여 PD-1-PD-L1 상호 작용에 대한 차단 능력을 추가로 특성화했다. 시험 결과는 도 3에 도시되어 있다.
도 3에 따르면 키메라 항체는 PD1-PD-L1 상호 작용을 분명히 차단했으며, 키메라 56E5가 아테졸리주맙보다 우수한 차단 효과를 나타냈습니다.
실시예 11. 키메라 항-PD-L1 단클론 항체의 T 세포 활성화 촉진
이러한 키메라 항체는 실시예 7의 프로토콜에 따라 T 세포 기능 분석에서 T 세포 반응을 자극하는 능력을 추가로 테스트했다. IFN-γ 수준은 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트(Cat#:STA00C, R&D, 미국)를 사용하여 측정했다.
도 4에 도시된 바와 같이, 테스트한 모든 키메라 항체는 IFN-γ 분비를 증가시키면서 T 세포 활동을 촉진했다. 키메라 56E5 항체는 저용량(예: 0.01 μg/mL)에서 아테졸리주맙보다 T 세포 활성화에 더 강력했다. 키메라 3C2 항체의 T 세포 활성화 능력은 모든 시험 용량에서 아테졸리주맙보다 높았다.
실시예 12. 항-PD-L1 항체의 인간화
위의 분석에 따라 3C2와 56E5를 인간화하여 추가 조사를 실시했다. 쥐 항체의 인간화는 아래에 자세히 설명된 대로 잘 확립된 CDR 이식 방법(미국 특허 번호 5,225,539, 여기에 전체 참조로 통합됨)을 사용하여 수행되었다.
쥐 항체 3C2와 56E5의 인간화를 위한 수용체 프레임워크를 선택하기 위해 3C2와 56E5의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 NCBI 웹사이트(http:// www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/)의 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에서 서열분석했다. 3C2 및 56E5와 상동성이 가장 높은 인간 생식세포 IGVH 및 IGVK가 인간화 수용체로 선택되었다. 3C2의 경우, 선택된 인간 중쇄 수용체는 IGHV1-46*01이고, 선택된 인간 경쇄 수용체는 IGKV1-33*01이다. 56E5의 경우, 선택된 인간 중쇄 수용체는 IGHV4-31*02이고, 선택된 인간 경쇄 수용체는 IGKV4-1*01이다.
CDR 루프 구조를 지지하는 데 중요한 역할을 할 수 있는 주요 프레임워크 잔기를 식별하하기 위하여 3C2 및 56E5의 가변 도메인에 대해 3차원 구조를 시뮬레이션하여 인간화 항체의 복귀 돌연변이를 설계하였다.
위에서 설명한 구조 모델링을 기반으로 3C2의 중쇄에 대해 10개의 잠재적 복귀 돌연변이(M48I, M70L, R72V, R87T, R38K, A40R, T28S, Y95F, R67K, V68A)와 경쇄에 대해 7개의 복귀 돌연변이(K45R, Y49S, F71Y, T22S, K42N, T85V, F73L)를 식별했다. 56E5의 경우, 중쇄에서 10개의 잠재적 복귀 돌연변이(S30T, W47Y, I48M, S70T, R87T, K43N, G44K, V71R, V67I, T68S)가 확인되었고, 경쇄에서 4개의 복귀 돌연변이(I21M, R18K, A19V, V89L)가 확인되었다.
3C2에 대해 5개의 인간화 중쇄 가변 영역과 4개의 인간화 경쇄 가변 영역을 설계하여 총 13개의 인간화 항체를 얻었다. 56E5에 대해 4개의 인간화 중쇄 가변 영역과 3개의 인간화 경쇄 가변 영역을 설계하여 총 12개의 인간화 항체를 얻었다. 이러한 인간화 항체의 서열은 표 1과 표 8에 요약되어 있다.
표 6. 복귀 돌연변이
중쇄 가변 영역과 N297A 돌연변이가 있는 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열과 경쇄 가변 영역과 인간 카파 불변 영역을 암호화하는 서열(중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 33 및 34에 명시됨)을 화학적으로 합성한 후 각각 EcoR I/ Xho I 및 Cla I/ Hind III 제한 부위를 사용하여 GS 발현 벡터(Invitrogen, 미국)에 서브클론닝했다. 모든 발현 구조는 DNA 시퀀싱을 통해 확인되었다. 실시예 8에 설명된 프로토콜에 따라 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 EXPiCHO 발현 시스템(Invitrogen, 미국)에 감염시키고 25개의 인간화 항-PD-L1 항체를 일시적으로 발현시켰습니다. 인간화 항체는 실시예 3에 기술된 바와 같이 정제되었다.
실시예 13. 인간화 항-PD-L1 항체의 결합 능력/친화성
인간화 항-PD-L1 항체는 실시예 4에 설명된 프로토콜에 따라 HEK293A/인간 PD-L1 세포, HEK293A/원숭이 PD-L1 세포 및 HEK293A/마우스 PD-L1 세포에 결합하는 능력을 특성화했다. 결과는 도 5 및 도 6에 도시되어 있다.
이 항체들은 또한 인간 및 원숭이 PD-L1에 대한 결합 친화성에 대한 SPR 분석에서 BIAcoreTM 8K 기기(GE 생명과학)를 사용하여 테스트되었다. 간단히 말해서, 인간 PD-L1 (ECD) - his 단백질(Cat#:10084-H08H, Sino Biological, 중국) 또는 원숭이 PD-L1 (ECD) - his 단백질(Cat#:90251-C08H, Sino Biological, 중국)의 100-200 반응 단위(RU)를 CM5 바이오센서 칩(Cat#:BR-1005-30, GE Life Sciences, 미국)에 연결하고 반응하지 않는 그룹은 1M 에탄올아민으로 차단했다. 0.3μM ~ 10μM 범위의 농도로 연속적으로 희석된 항체를 30μL/분으로 SPR 실행 완충액(HBS-EP 완충액, pH7.4, Cat#:BR-1006-69, GE Life Sciences, 미국)에 주입했다. 결합 친화도는 블랭크 대조군의 RU를 뺀 값으로 계산했다. 결합률(ka)과 해리율(kd)은 일대일 랭뮤어 결합 모델(BIA 평가 소프트웨어, GE 생명과학)을 사용하여 계산했으며, 평형 해리 상수 KD 는 kd/ka 비율로 계산했다. 결과는 표 7에 나와 있다.
도 5와 도 6에서 볼 수 있듯이 인간화 항 PD-L1 항체는 인간 PD-L1과 원숭이 PD-L1에 모두 높은 결합력을 보였으며, 이는 각각의 키메라 항체와 비슷한 수준이다.
표 7에 따르면, 인간화 3C2 및 56E5 항체는 아테졸리주맙과 비교했을 때 인간 PD-L1에 대한 결합 친화력이 비슷하거나 더 높았다.
표 7. 인간/원숭이 PD-L1에 대한 인간화 항 PD-L1 항체의 결합 친화성
실시예 14. 인간화 항-PD-L1 항체의 T 세포 활성화
이 항체들은 실시예 7의 프로토콜에 따라 MLR 분석에서 T 세포 반응을 자극하는 능력을 추가로 테스트했다. IFN-γ 수치는 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트(Cat#:STA00C, R&D, 미국)를 사용하여 측정했다.
도 7에서 볼 수 있듯이, 모든 인간화 항체는 용량 의존적인 방식으로 T 세포 활성화를 촉진하고 IFN-γ 분비를 증가시켰다. 항체 56E5VH5VL4 및 3C2VH4VL4는 T 세포 활성화에서 가장 높은 능력을 보였다.
실시예 15 . 에피토프 비닝
에피토프 비닝을 위해 경쟁 SPR 분석을 수행했다. 간단히 말해서, 1μg/ml 인간 PD-L1(ECD) 단백질(Cat#:10084-H08H, Sino Biological, 중국)을 CM5 바이오센서 칩(Cat#:BR-1005-30, GE Life Sciences, 미국)에 연결하고 반응하지 않은 그룹은 1 M 에탄올아민으로 차단했다. 그런 다음 5 μg/ml 56E5VH5VL4 또는 3C2VH4VL4 항체를 SPR 실행 완충액(HBS-EP 완충액, pH7.4, Cat#:BR-1006-69, GE Life Sciences, 미국)에 30μL/분으로 주입한 다음, 두 번째 항-PDL1 항체(56E5VH5VL4, 3C2VH4VL4, 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 두발루맙) 5μg/ml를 30μL/분으로 주입했다. 결합 친화도는 블랭크 대조군의 RU를 뺀 값으로 계산했다. 그런 다음 1:1 상호작용 모델을 사용하여 데이터를 맞췄다.
도 8과 도 9에서 볼 수 있듯이 56E5VH5VL4와 아테졸리주맙은 PD-L1 분자와 동시에 결합하지 않았으며, 이는 이들이 동일하거나 유사한 에피토프에 결합할 수 있음을 시사한다. 마찬가지로 56E5VH5VL4는 아벨루맙 및 퍼발루맙과 에피토프 결합을 놓고 경쟁했다. 56E5VH5VL4와 3C2VH4VL4는 동시에 PD-L1 분자에 결합했지만, 이는 서로 다른 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다. 항체 3C2VH4VL4는 56E5VH5VL4, 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 퍼발루맙과 동시에 PD-L1 분자에 결합했으며, 이는 3C2VH4VL4가 다른 항체가 결합한 것과는 다른 새로운 에피토프에 결합할 수 있음을 시사하였다.
실시예 16 . 인간화 항-PDL1 항체의 생체 내 항종양 효과
인간 IgG1(N297A)/카파 불변 영역을 갖는 항 PD-L1 항체 56E5VH5VL4 및 3C2VH6VL5의 생체 내 항종양 활성을 인간 PD-L1(GemPharmatech Co. Ltd, 중국)과 트랜스제닉 마우스에 MC38 뮤린 결장 선암종을 이식함으로써 확립된 동물 모델에서 연구하였다. 0일차에 마우스의 한쪽 옆구리에 1Х106 MC38 세포를 피하 주사하고 그룹당 8마리씩 7개 그룹으로 무작위로 배정했다. 그런 다음 이 동물들에게 0일, 4일, 7일, 11일, 14일, 18일에 각각 56E5VH5VL4(10 mg/kg), 3C2VH6VL5(10 mg/kg), 아벨루맙(10 mg/kg) 및 PBS를 복강 내로 투여했다.
종양의 크기와 마우스의 몸무게를 시간에 따라 모니터링했다. 종양의 크기는 종양의 길이(가장 긴 직경)와 너비(길이에 수직인 직경)를 캘리퍼스로 측정하고 종양의 부피를 0.5 x D x d2 로 계산하여 결정했다. 대조군의 종양 크기가 3.5cm3 에 도달하기 전에 실험을 종료했다. 그룹 간 종양 크기 차이를 확인하기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)을 사용했다.
도 10에서 볼 수 있듯이 모든 항 PD-L1 항체는 마우스의 종양 성장을 유의미하게 억제했으며, 56E5VH5VL4와 3C2VH6VL5의 항종양 효과는 아벨루맙보다 더 우수했다.
본 출원의 서열은 표 8에 다음과 같이 요약되어 있다.
표 8. 서열
이와 같이 본 개시의 바람직한 실시예를 상세히 설명하였으므로, 본 개시의 정신이나 범위를 벗어나지 않으면서 많은 명백한 변형이 가능하므로, 상기 항들에 의해 정의된 개시는 상기 설명에 기재된 특정 세부 사항에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd <120> ANTIBODIES BINDING PD-L1 AND USES THEREOF <130> 55556 00060 <150> CN202110284404.8 <151> 2021-03-16 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 1 Asp Tyr His Val Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 2 Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 3 Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 4 Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 5 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of mouse, chimeric and humanized 3C2 antibodies <400> 6 Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 7 Ser Asp Tyr Trp Asn 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 8 Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 9 Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu 1 5 10 15 Thr <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 11 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of mouse, chimeric and humanized 56E5 antibodies <400> 12 Gln Asn Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric 3C2 antibodies <400> 13 Gln Val Gln Leu Asn Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Ala Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Leu Ser Phe Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Met Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanzed antibodies 3C2-VH2VL2, 3C2-VH2VL3, and 3C2-VH2VL4 <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 3C2-VH3VL2, 3C2-VH3VL3, and 3C2-VH3VL4 <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 3C2-VH4VL2, 3C2-VH4VL3, and 3C2-VH4VL4 <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 3C2-VH5VL2, 3C2-VH5VL3, and 3C2-VH5VL4 <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibody 3C2-VH6VL5 <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse and chimeric 56E5 antibodies <400> 19 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 56E5-VH2VL2, 56E5-VH2VL3, and 56E5-VH2VL4 <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 56E5-VH3VL2, 56E5-VH3VL3 and 56E5-VH3VL4 <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 56E5-VH4VL2, 56E5-VH4VL3 and 56E5-VH4VL4 <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized antibodies 56E5-VH5VL2, 56E5-VH5VL3 and 56E5-VH5VL4 <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse and chimeric 3C2 antibodies <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 3C2-VH2VL2, 3C2-VH3VL2, 3C2-VH4VL2 and 3C2-VH5VL2 <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 3C2-VH2VL3, 3C2-VH3VL3, 3C2-VH4VL3 and 3C2-VH5VL3 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 3C2-VH2VL4, 3C2-VH3VL4, 3C2-VH4VL4 and 3C2-VH5VL4 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibody 3C2-VH6VL5 <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse and chimeric 56E5 antibodies <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 30 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 56E5-VH2VL2, 56E5-VH3VL2, 56E5-VH4VL2 and 56E5-VH5VL2 <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 31 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 56E5-VH2VL3, 56E5-VH3VL3, 56E5-VH4VL3 and 56E5-VH5VL3 <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized antibodies 56E5-VH2VL4, 56E5-VH3VL4, 56E5-VH4VL4 and 56E5-VH5VL4 <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 constant region (N297A) <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human kappa constant region <400> 34 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 35 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 36 <211> 290 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 36 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Thr Ile Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 37 <211> 290 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu 1 5 10 15 Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu 35 40 45 Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val 50 55 60 Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp 130 135 140 Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly 165 170 175 Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val 180 185 190 Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys 195 200 205 Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile 210 215 220 Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp 225 230 235 240 Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val 245 250 255 Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys 260 265 270 Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu 275 280 285 Glu Thr 290

Claims (15)

  1. PD-L1에 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위로서,
    VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역 및 VH-CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    여기서, 상기 VH-CDR1 영역, VH-CDR2 영역, VH-CDR3 영역, VL-CDR1 영역, VL-CDR2 영역 및 VL-CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6; 또는 (2) 각각 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  2. 제1항에 있어서,
    중쇄 가변 영역은 서열번호 13-23 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  3. 제1항에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 서열번호 24-32 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 (1) 서열번호 각각 13 및 24, (2) 서열번호 각각 14 및 25, (3) 서열번호 각각 14 및 26, (4) 서열번호 각각 14 및 27, (5) 서열번호 각각 15 및 25, (6) 서열번호 각각 15 및 26, (7) 서열번호 각각 15 및 27, (8) 서열번호 각각 16 및 25, (9) 서열번호 각각 16 및 26, (10) 서열번호 각각 16 및 27; (11) 서열번호 각각 17 및 25; (12) 서열번호 각각 17 및 26; (13) 서열번호 각각 17 및 27; (14) 서열번호 각각 18 및 28; (15) 서열번호 각각 19 및 29; (16) 서열번호 각각 20 및 30; (17) 서열번호 각각 20 및 31; (18) 서열번호 각각 20 및 32; (19) 서열번호 각각 21 및 30, (20) 서열번호 각각 21 및 31, (21) 서열번호 각각 21 및 32, (22) 서열번호 각각 22 및 30, (23) 서열번호 각각 22 및 31, (24) 서열번호 각각 22 및 32, (25) 서열번호 각각 23 및 30, (26) 서열번호 각각 23 및 31 또는 (27) 서열번호 각각 23 및 32과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 33과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 중쇄 가변 영역에 연결된 중쇄 불변 영역을 포함하거나 포함하고,
    서열번호 34와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 경쇄 가변 영역에 연결된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 인간 PD-L1에 결합하고, (b) 원숭이 PD-L1에 결합하고, (c) 마우스 PD-L1에 결합하지 않고, (d) PD-L1-PD-1 상호작용을 차단하고, (e) T 세포 활성화를 촉진하고 및/또는 (f) 생체 내 항종양 활성을 갖는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  7. 제1항에 있어서,
    항체가 마우스, 키메라 또는 인간화 항체인, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나에 따른 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나에 따른 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부위 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 따른 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 암을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 비소세포폐암, 신세포암, 호지킨 림프종, 방광암, 두경부암, 신경내분비종양, 맨틀세포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종 및 여포성 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  14. 제11항에 따른 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 감염성 질환을 치료하는 방법.
  15. 제15항에 있어서,
    상기 감염성 질환은 만성 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 또는 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV) 감염인, 방법.
KR1020237025615A 2021-03-16 2021-08-30 Pd-l1 결합 항체 및 그의 용도 KR20230156691A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110284404.8A CN115073599B (zh) 2021-03-16 2021-03-16 结合pd-l1的抗体及其用途
CN202110284404.8 2021-03-16
PCT/CN2021/115301 WO2022193561A1 (en) 2021-03-16 2021-08-30 Antibodies binding pd-l1 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230156691A true KR20230156691A (ko) 2023-11-14

Family

ID=83245803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237025615A KR20230156691A (ko) 2021-03-16 2021-08-30 Pd-l1 결합 항체 및 그의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11718674B2 (ko)
EP (1) EP4308604A1 (ko)
JP (1) JP2024506449A (ko)
KR (1) KR20230156691A (ko)
CN (1) CN115073599B (ko)
AU (1) AU2021434937A1 (ko)
CA (1) CA3208621A1 (ko)
WO (1) WO2022193561A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073599B (zh) * 2021-03-16 2023-04-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合pd-l1的抗体及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076560A2 (en) * 2006-11-15 2008-06-26 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to btla and methods of use
WO2015095766A2 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Stem Centrx, Inc. Novel anti-lingo1 antibodies and methods of use
MA42971A (fr) * 2015-03-13 2018-08-15 Cytomx Therapeutics Inc Anticorps anti-pdl1, anticorps anti-pld1 activables, et leurs procédés d'utilisation
CN106699891B (zh) * 2017-01-25 2019-04-09 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗pd-l1抗体、其药物组合物及其用途
KR20210056288A (ko) * 2018-06-01 2021-05-18 타유 후아시아 바이오테크 메디컬 그룹 컴퍼니 리미티드 질환 또는 병태를 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
CN109053891B (zh) * 2018-09-17 2021-12-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用
CN111234017B (zh) * 2018-11-28 2022-09-09 优迈生物科技(连云港)有限公司 一种抗人pd-l1抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用
KR20210132664A (ko) * 2019-02-21 2021-11-04 유큐(베이징) 바이오파마 코., 엘티디 항pd-l1 항체 및 그의 용도
CN113795510A (zh) * 2019-08-29 2021-12-14 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
CN115073599B (zh) * 2021-03-16 2023-04-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合pd-l1的抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN115073599A (zh) 2022-09-20
WO2022193561A1 (en) 2022-09-22
JP2024506449A (ja) 2024-02-14
US20220298244A1 (en) 2022-09-22
CN115073599B (zh) 2023-04-28
EP4308604A1 (en) 2024-01-24
CA3208621A1 (en) 2022-09-22
US11718674B2 (en) 2023-08-08
AU2021434937A1 (en) 2023-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6927639B2 (ja) ヒトクローディン−１８．２を結合する抗体およびその使用
WO2021136308A1 (en) Antibodies binding bcma and uses thereof
US11091558B2 (en) Anti-OX40 antibodies and uses thereof
US10946092B1 (en) Antibodies binding LAG3 and methods of treatment using them
US10662249B1 (en) Antibodies targeting CD40 and uses thereof
US10577424B1 (en) Antibodies binding VISTA and uses thereof
WO2021170020A1 (en) Antibodies binding il4r and uses thereof
KR20210010998A (ko) 항체 결합 피디 1 및 그의 용도
WO2022193561A1 (en) Antibodies binding pd-l1 and uses thereof
WO2022257279A1 (en) Antibodies binding tigit and uses thereof
WO2023202672A1 (en) Antibodies targeting sirp-alpha and uses thereof