JP5847881B2 - Ｓｐ３５抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は神経学、神経生物学及び分子生物学に関する。より詳細には、本発明は脊髄傷害のような神経学的な疾患、障害及び傷害の治療のための分子及び方法に関する。
（発明の背景）
軸索及び樹状突起はニューロンから伸長する。伸長する軸索の遠位の尖端、即ちニューライトは、成長円錐として知られている特殊化された領域を含む。成長円錐は環境の手掛かり、例えば表面接着性、成長因子、神経伝達物質及び電場に応答する。成長円錐は一般的に一日当たり１〜２ミリメートルの速度で前進する。成長円錐はラメリポディウム及びフィロポディウムとして分類される延長により、その前方及び両側にある領域を探索する。延長が望ましくない表面に接触すれば、それは撤退する。延長が望ましい成長表面に接触すれば、それは伸長を継続し、成長円錐をその方向に案内する。成長円錐が適切な標的細胞に到達すればシナプス連結が生じる。
神経細胞の機能はニューロンとその直接の環境における他の細胞の間の接触により影響される（非特許文献１）。これ等の細胞は特殊神経膠細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）中の稀突起神経膠細胞、及び末梢神経系（ＰＮＳ）中のシュワン細胞を包含し、これ等はニューロン軸索をミエリンで被覆する（非特許文献２）。
ＣＮＳニューロンは傷害後に再生する固有の能力を有するが、これは、ミエリン中に存在する抑制蛋白の存在のため、それを行うことを抑制される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
稀突起神経膠細胞上に存在する数種のミエリン抑制蛋白が特性化されており、例えば、ＮｏｇｏＡ（非特許文献６）、ミエリン関連糖蛋白（非特許文献７；非特許文献８）及び稀突起神経膠細胞糖蛋白（ＯＭ−ｇｐ）（非特許文献９）が挙げられる。これ等の蛋白の各々は別個にニューロンＮｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）のリガンドであることが解っている（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ等、Ｎｅｕｒｏｎ ２００２，オンライン発表、６月２８日（２００２））。
Ｎｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）は８ロイシンリッチリピートを含有するＧＰＩ−アンカリング膜蛋白である（非特許文献１３）。抑制性蛋白（例えばＮｏｇｏＡ、ＭＡＧ及びＯＭ−ｇｐ）との相互作用により、ＮｇＲ１複合体は成長円錐の虚脱及びニューライトの派生の抑制をもたらすシグナルを伝達する。
ＮｇＲ１媒介成長円錐虚脱及びその結果として生じるニューライトの派生の抑制を抑制するための分子及び方法が必要とされている。更に又、ニューロンの生存及び軸索の再生を増大させる分子が必要とされている。特に軸索の傷害、ニューロン又は稀突起神経膠細胞の細胞死、脱髄又は髄鞘発育不全の関与する、又は一般的に神経系に関連する疾患、障害、又は傷害の治療が挙げられる。
そのような疾患、障害、又は傷害は限定しないが例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）及びウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツバイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニヤーミ症候群、異染性白質委縮症、三叉神経痛、及びベル麻痺を包含する。これらの疾患のうち、ＭＳが最も蔓延しており、世界中で約２５０万人が罹患している。
ＭＳは一般的に神経学的な関与の回帰−軽減パターンを伴って開始され、次いで増大する神経学的損傷を伴った慢性相に進行する。ＭＳは慢性患部に局在したミエリン、稀突起神経膠細胞および軸索の破壊を伴う。ＭＳにおいて観察される脱髄は必ずしも永久的ではなく、そして再髄鞘形成は疾患の早期において報告されている。ニューロンの再髄鞘形成には稀突起神経膠細胞が必要である。
種々の疾患変調治療がＭＳに対して使用可能であり、例えばコルチコステロイド及び免疫モジュレーター、例えばインターフェロンベータ及びＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）の使用が挙げられる。更に又、ＭＳにおける稀突起神経膠細胞及び髄鞘形成の中枢的役割のため、稀突起神経膠細胞数を増大又は髄鞘形成を増強する療法を開発するために研究がおこなわれている。例えばＣｏｈｅｎ等、特許文献１；非特許文献１４を参照できる。しかしながら、ＭＳおよび他の脱髄および髄鞘発育不全の障害のための追加的療法を考案することがなお急務である。
米国特許５，５７４，００９号明細書
Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，等、１９８８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：８１９ Ｌｅｍｋｅ，１９９２，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ，Ｅｄ．，ｐ．２８１，Ｓｉｎａｕｅｒ Ｂｒｉｔｔｉｓ等、２００１，Ｎｅｕｒｏｎ ３０：１１−１４ Ｊｏｎｅｓ等、２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３ Ｇｒｉｍｐｅ等、２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０ Ｃｈｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９；Ｇｒａｎｄｐｒｅ等、Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０３，４３９−４４４ ＭＡＧ，ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ等、Ｎｅｕｒｏｎ １９９４，１３，８０５−８１１ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ等、Ｎｅｕｒｏｎ １９９４，１３，７５７−７６７ Ｍｉｋｏｌ等、１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１２７３−１２７９ Ｗａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１７，９４１−９４４ Ｇｒａｎｄｐｒｅ等、Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０３，４３９−４４４ Ｃｈｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３４１−３４６ Ｃｈａｎｇ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
（発明の簡単な要旨）
本発明はＳｐ３５（Ｓｐ３５は又文献においてはＬＩＮＧＯ−１およびＬＲＲＮ６とも表記されている）が稀突起神経膠細胞及びニューロン細胞において発現され、そして稀突起神経膠細胞／ニューロンの分化、生存及び軸索髄鞘形成を負の方向に調節することの発見に基づいている。更に又、Ｓｐ３５の特定の拮抗剤は稀突起神経膠細胞およびニューロン細胞の生存、増殖及び分化、並びにニューロンの髄鞘形成を促進する。これらの発見に基づいて、本発明は一般的にＳｐ３５の拮抗剤として使用できる抗体、その抗原結合フラグメント又は誘導体に関する。更に又、本発明は一般的にＳｐ３５拮抗剤抗体又は抗原結合フラグメントの投与による、脱髄、髄鞘発育不全、稀突起神経膠細胞／ニューロン細胞死又は軸索傷害に関連する種々の疾患、障害又は傷害を治療するための方法に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
３Ｂ５．２、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及びＬｉ８１よりなる群から選択されるレファレンスモノクローナル抗体と同じＳｐ３５エピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２）
Ｓｐ３５に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体又はそのフラグメントが３Ｂ５．２、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及びＬｉ８１よりなる群から選択されるレファレンスモノクローナル抗体を競合的に抑制する、上記抗体又はそのフラグメント。
（項目３）
Ｓｐ３５に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体又はそのフラグメントが３Ｂ５．２、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及びＬｉ８１よりなる群から選択される、上記抗体又はそのフラグメント。
（項目４）
線状エピトープに結合する項目１〜３の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目５）
非線状コンホーメーションエピトープに結合する項目１〜３の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目６）
前記Ｓｐ３５のＬＲＲドメインに結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目７）
前記Ｓｐ３５のＬＲＲＮＴ又はＬＲＲＣＴドメインに結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目８）
配列番号２のアミノ酸４１７〜５３２又は配列番号２のアミノ酸４９５〜５３２に由来する前記Ｓｐ３５の領域に結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目９）
前記Ｓｐ３５の塩基性領域ドメインに結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１０）
配列番号２のアミノ酸４１５〜４２４又は配列番号２のアミノ酸４１７〜４２４に結合する項目９に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１１）
前記Ｓｐ３５の免疫グロブリンドメインに結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１２）
配列番号２のアミノ酸４１９〜４９３に結合する項目１１に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１３）
前記Ｓｐ３５のＬＬＲＣＴドメインに結合する項目１〜５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１４）
配列番号２のアミノ酸３６３〜４１４又は配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６に結合する項目１３に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１５）
多価であり、そして重鎖を少なくとも２つ及び軽鎖を少なくとも２つ含む、項目１〜１４の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１６）
多重特異性である項目１〜１５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１７）
２重特異性である項目１６に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１８）
ヒト化された項目１〜１７の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目１９）
キメラである項目１〜１７の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２０）
霊長類化された項目１〜１７の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２１）
完全ヒト型の項目１〜１７の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２２）
Ｆａｂフラグメントである項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２３）
Ｆａｂ’フラグメントである項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２４）
Ｆ（ａｂ）２フラグメントである項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２５）
Ｆｖフラグメントである項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２６）
単鎖抗体である項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２７）
前記レファレンスモノクローナル抗体に関する解離定数（ＫＤ）より低値である解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目１、２又は４〜２６の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２８）
５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目１〜２６の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目２９）
ネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較してヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する項目１〜２８の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３０）
Ｓｐ３５媒介神経突起伸張抑制の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３１）
Ｓｐ３５媒介ニューロン細胞死の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３２）
Ｓｐ３５媒介髄鞘形成抑制の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３３）
Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３４）
Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化抑制の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３５）
Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖抑制の拮抗剤である項目１〜２９の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３６）
自身に融合した異種ポリペプチドを更に含む項目１〜３５の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３７）
前記抗体が治療薬、プロドラッグ、ペプチド、蛋白、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬品、又はＰＥＧよりなる群から選択される剤にコンジュゲートされた項目１〜３６の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
（項目３８）
項目１〜３７の何れか１項に記載の抗体又はそのフラグメント、及び担体を含む組成物。
（項目３９）
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、該ＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ、レファレンスポリペプチド配列番号４１６及び配列番号４１７；配列番号４３３及び配列番号４３４；又は配列番号４３５及び配列番号４３４と少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含み、そしてここで、該ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する上記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４０）
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、該ＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ、レファレンスポリペプチド配列番号４１６及び配列番号４１７；配列番号４３３及び配列番号４３４；又は配列番号４３５及び配列番号４３４と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４１）
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、該ＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ、
（ｉ）配列番号４１６及び配列番号４１７；及び、
（ｉｉ）配列番号４３０及び４３２；
（ｉｉｉ）配列番号４３１及び４３２；
（ｉｖ）配列番号４３３及び４３４；及び、
（ｖ）配列番号４３５及び４３４；
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む、上記抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４２）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ポリペプチド配列配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２；又は配列番号４３６、配列番号４３７、及び配列番号４３８と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目４３）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ポリペプチド配列配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２；又は配列番号４３６、配列番号４３７及び配列番号４３８と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目４４）
前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれポリペプチド配列配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２又は配列番号４３６、配列番号４３７及び配列番号４３８を含む、項目４２又は４３の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目４５）
免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、配列番号４２４、配列番号４２５、及び配列番号４２６；又は配列番号４３９、配列番号４４０及び配列番号４４１の核酸配列によりコードされている、上記ポリヌクレオチド。
（項目４６）
配列番号４１６、配列番号４３３又は配列番号４３５のレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも９０％同一であるＶＨ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目４７）
２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、配列番号４１６、４３２、４３３又は４３５のレファレンスＶＨポリペプチド配列と同一であるＶＨ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目４８）
前記ＶＨが前記レファレンスＶＨに同一である項目４６又は４７の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目４９）
前記ＶＨが配列番号４２２、４４８又は４５０の核酸配列によりコードされる項目４６又は４７の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５０）
前記ＶＨに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む、項目４２〜４９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５１）
前記ＶＨに融合したＣＨ１ドメインをコードする核酸を更に含む、項目４２〜４９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５２）
前記ＶＨに融合したＣＨ２ドメインをコードする核酸を更に含む、項目４２〜４９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５３）
前記ＶＨに融合したＣＨ３ドメインをコードする核酸を更に含む、項目４２〜４９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５４）
前記ＶＨに融合したヒンジ領域をコードする核酸を更に含む、項目４２〜４９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５５）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１と同じエピトープに特異的に結合する項目４２〜５４の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５６）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する項目４２〜５４の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５７）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目４２〜５４の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５８）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１３、４１４および４１５、又は配列番号４４２、４４３及び４４４と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目５９）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１３、４１４および４１５、又は配列番号４４２、４４３及び４４４と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目６０）
前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれポリペプチド配列配列番号４１３、４１４及び４１５又は配列番号４４２、４４３及び４４４を含む、項目５８又は５９の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６１）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、配列番号４２７、配列番号４２８、及び配列番号４２９；又は配列番号４４５、配列番号４４６及び配列番号４４７の核酸配列によりコードされている、上記ポリヌクレオチド。
（項目６２）
配列番号４１７又は配列番号４３４のレファレンスＶＬポリペプチド配列に少なくとも９０％同一であるＶＬ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目６３）
２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、配列番号４１７；配列番号４３０；配列番号４３１；配列番号４４２；配列番号４４３および配列番号４４４よりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリペプチド配列と同一であるＶＬ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリヌクレオチド。
（項目６４）
前記ＶＬが前記レファレンスＶＬに同一である項目６２又は６３の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６５）
前記ＶＬが配列番号４２３又は配列番号４４９の核酸配列によりコードされる項目６４に記載のポリヌクレオチド。
（項目６６）
前記ＶＬに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を更に含む、項目５８〜６５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６７）
前記ＶＬに融合したＣＨ１ドメインをコードする核酸を更に含む、項目５８〜６５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６８）
前記ＶＬに融合したＣＨ２ドメインをコードする核酸を更に含む、項目５８〜６５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６９）
前記ＶＬに融合したＣＨ３ドメインをコードする核酸を更に含む、項目５８〜６５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７０）
前記ＶＬに融合したヒンジ領域をコードする核酸を更に含む、項目５８〜６５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７１）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１と同じエピトープに特異的に結合する項目５８〜７０の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７２）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１を競合的に抑制する項目５８〜７０の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７３）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目５８〜７２の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７４）
異種ポリヌクレオチドを更に含む項目４２〜７３の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７５）
前記異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする項目７４に記載のポリヌクレオチド。
（項目７６）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが線状エピトープに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７７）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが非線状コンホーメーションエピトープに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７８）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲドメインに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。（項目７９）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８０）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８１）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の免疫グロブリンドメインに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８２）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の塩基性領域に特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８３）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖を少なくとも２つ及び軽鎖を少なくとも２つ含む多価抗体分子である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８４）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが多重特異性である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８５）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが２重特異性である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８６）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが１価、２価、多価、又は２官能性である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８７）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化されている項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８８）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラである項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８９）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが霊長類化されている項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９０）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが完全ヒト型である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９１）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメントである項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９２）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂ’フラグメントである項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９３）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦ（ａｂ）２フラグメントである項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９４）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦｖフラグメントである項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９５）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが単鎖抗体である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９６）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９７）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較してヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９８）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介神経突起伸張抑制の拮抗剤である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９９）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介髄鞘形成抑制の拮抗剤である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１００）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死の拮抗剤である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０１）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化抑制の拮抗剤である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０２）
前記ＶＨ又は前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖抑制の拮抗剤である項目４２〜７５の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０３）
項目４２〜１０２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目１０４）
ＶＨコードポリヌクレオチド及びＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、ここで該ＶＨコードポリヌクレオチド及び該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、レファレンスポリペプチド配列番号４１６及び配列番号４１７；又は配列番号４３３及び配列番号４３４；又は配列番号４３５及び配列番号４３４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、そしてここで、該ＶＨ及びＶＬコードポリヌクレオチドは一緒にＳｐ３５に特異的に結合する抗体又はその結合フラグメントをコードする、上記組成物。
（項目１０５）
ＶＨコードポリヌクレオチド及びＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、ここで該ＶＨコードポリヌクレオチド及び該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、レファレンスポリペプチド配列番号４１６及び配列番号４１７；又は配列番号４３３及び配列番号４３４；又は配列番号４３５及び配列番号４３４と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＨ及びＶＬコードポリヌクレオチドは一緒にＳｐ３５に特異的に結合する抗体又はその結合フラグメントをコードする、上記組成物。
（項目１０６）
ＶＨコードポリヌクレオチド及びＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、ここで該ＶＨコードポリヌクレオチド及び該ＶＬコードポリヌクレオチドが、それぞれ、（ｉ）配列番号４１６及び配列番号４１７；
（ｉｉ）配列番号４３０及び配列番号４３２；
（ｉｉｉ）配列番号４３１及び４３２；
（ｉｖ）配列番号４３３及び４３４；及び、
（ｖ）配列番号４３５及び４３４；
よりなる群から選択されるレファレンスポリペプチドに同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、上記組成物。
（項目１０７）
前記ＶＨコードポリヌクレオチド及び前記ＶＬコードポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号４２２及び配列番号４２３；又は配列番号４４８及び配列番号４４９；又は配列番号４５０及び配列番号４４９のヌクレオチド配列を含む、項目１０４〜１０６の何れか１項に記載の組成物。
（項目１０８）
前記ＶＨコードポリヌクレオチド及び前記ＶＬコードポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨ及びＶＬポリペプチドを単鎖抗体又はそのフラグメント内に含むように、同じオープンリーディングフレーム内に含有されている、項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１０９）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが線状エピトープに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１０）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが非線状コンホーメーションエピトープに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１１）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲドメインに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１２）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１３）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１４）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の免疫グロブリンドメインに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１５）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の塩基性領域に特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１６）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖を少なくとも２つ及び軽鎖を少なくとも２つ含む多価抗体分子である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１７）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが多重特異性である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１８）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが２重特異性である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１１９）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが１価、２価、多価、又は２官能性である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２０）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化されている項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２１）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラである項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２２）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが霊長類化されている項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２３）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが完全ヒト型である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２４）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメントである項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２５）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂ’フラグメントである項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２６）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦ（ａｂ）２フラグメントである項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２７）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦｖフラグメントである項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２８）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが単鎖抗体である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１２９）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３０）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、ネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較してヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３１）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介神経突起伸張抑制の拮抗剤である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３２）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介髄鞘形成抑制の拮抗剤である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３３）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死の拮抗剤である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３４）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化抑制の拮抗剤である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３５）
前記ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖抑制の拮抗剤である項目１０４〜１０７の何れか１項に記載の組成物。
（項目１３６）
項目４２〜１０２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１３７）
前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に会合している項目１３６に記載のベクター。
（項目１３８）
ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチド及びＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドがインフレームに融合され、それらに作動可能に会合している単一のプロモーターから同時転写され、そして単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント内に同時翻訳される、項目１３６に記載のベクター。
（項目１３９）
ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチド及びＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドがそれらに作動可能に会合している単一のプロモーターから同時転写されるが、別個に翻訳される、項目１３６に記載のベクター。
（項目１４０）
ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドとＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドとの間に配設されたＩＲＥＳ配列を更に含む項目１３９記載のベクター。
（項目１４１）
ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチド及びＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドは別個に転写され、各々が別個のプロモーターと作動可能に会合している項目１３９に記載のベクター。
（項目１４２）
前記別個のプロモーターが同じプロモーターのコピーである項目１４１に記載のベクター。
（項目１４３）
前記別個のプロモーターが非同一である項目１４１に記載のベクター。
（項目１４４）
項目１３６〜１４３の何れか１項に記載のベクターを含む組成物。
（項目１４５）
項目４５〜５７又は７４〜１０２の何れか１項に記載のＶＨコードポリヌクレオチドを含む第１のベクター、及び、項目５８〜７３又は７４〜１０２の何れか１項に記載のＶＬコードポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む組成物。
（項目１４６）
項目４２〜１０２の何れか１項に記載のポリヌクレオチド又は項目１３６〜１４５の何れか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１４７）
第１及び第２のベクターを少なくとも含む宿主細胞であって、ここで該第１及び該第２のベクターは非同一であり、ここで該第１のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする項目４２〜５７又は７４〜１１２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、そしてここで該第２のベクターは免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする項目５８〜７３又は７４〜１０２の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、上記宿主細胞。
（項目１４８）
抗Ｓｐ３５抗体を製造する方法であって、項目１４６〜１４７の何れか１項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び該抗体を回収する工程を含む、上記方法。
（項目１４９）
項目１４８に記載の方法により製造された抗Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント。
（項目１５０）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２；又は配列番号４３６、配列番号４３７、及び配列番号４３８と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１５１）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２；又は配列番号４３６、配列番号４３７及び配列番号４３８と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１５２）
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、配列番号４１０、配列番号４１１、及び配列番号４１２；又は配列番号４３６、配列番号４３７及び配列番号４３８である、上記ポリペプチド。
（項目１５３）
配列番号４１６、配列番号４３３又は配列番号４３５のレファレンスＶＨ配列に少なくとも９０％同一であるＶＨを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。（項目１５４）
配列番号４１６、配列番号４３３又は配列番号４３５のレファレンスＶＨと、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であるＶＨを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１５５）
前記ＶＨが配列番号４１６又は配列番号４３３又は配列番号４３５である項目１５３に記載のポリペプチド。
（項目１５６）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１と同じエピトープに特異的に結合する項目１５０〜１５５の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１５７）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する項目１５０〜１５５の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１５８）
前記ＶＨを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目１５０〜１５７の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１５９）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１３、配列番号４１４、及び配列番号４１５；又は配列番号４４２、配列番号４４３、及び配列番号４４４と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１６０）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、それぞれレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列配列番号４１３、配列番号４１４、及び配列番号４１５；又は配列番号４４２、配列番号４４３及び配列番号４４４と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であり、そしてここで、該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１６１）
免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、配列番号４１３、配列番号４１４、及び配列番号４１５；又は配列番号４４２、配列番号４４３及び配列番号４４４である、上記ポリペプチド。
（項目１６２）
配列番号４１７又は配列番号４３４のレファレンスＶＬ配列に少なくとも９０％同一であるＶＬを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１６３）
配列番号４１７又は配列番号４３４のレファレンスＶＬ配列と、２０より少ない保存的なアミノ酸置換を除き、同一であるＶＬを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的に結合する、上記ポリペプチド。
（項目１６４）
前記ＶＬが配列番号４１７又は配列番号４３４である項目１６２又は１６３のいずれか項に記載のポリペプチド。
（項目１６５）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１と同じエピトープに特異的に結合する項目１５９〜１６４の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１６６）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記モノクローナル抗体３Ｂ５．２又はＬｉ８１がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する項目１５９〜１６４の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１６７）
前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する項目１５９〜１６６の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１６８）
自身に融合した異種ポリペプチドを更に含む項目１５０〜１６７の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１６９）
前記ポリペプチドが治療薬、プロドラッグ、ペプチド、蛋白、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬品、又はＰＥＧよりなる群から選択される剤にコンジュゲートされた項目１５０〜１６８の何れか１項に記載のポリペプチド。
（項目１７０）
前記ＶＨ及び前記ＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５に特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
（項目１７１）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが線状エピトープに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７２）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが非線状コンホーメーションエピトープに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７３）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲドメインに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７４）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７５）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５のＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７６）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の塩基性領域に特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７７）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが前記Ｓｐ３５の免疫グロブリンドメインに特異的に結合する項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７８）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖を少なくとも２つ及び軽鎖を少なくとも２つ含む多価抗体分子である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１７９）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが多重特異性である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８０）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが２重特異性である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８１）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが１価、２価、多価、又は２官能性である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８２）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト化されている項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８３）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラである項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８４）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが霊長類化されている項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８５）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが完全ヒト型である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８６）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメントである項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８７）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂ’フラグメントである項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８８）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦ（ａｂ）２フラグメントである項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１８９）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＦｖフラグメントである項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１９０）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが単鎖抗体である項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１９１）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントが５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する、項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。（項目１９２）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較してヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する、項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０に記載の組成物。
（項目１９３）
項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド及び担体を含む組成物。
（項目１９４）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５媒介神経突起伸張抑制の拮抗剤である項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０〜１９３の何れか１項に記載の組成物。
（項目１９５）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５媒介髄鞘形成抑制の拮抗剤である項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０〜１９３の何れか１項に記載の組成物。
（項目１９６）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死の拮抗剤である項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０〜１９３の何れか１項に記載の組成物。
（項目１９７）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化抑制の拮抗剤である項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０〜１９３の何れか１項に記載の組成物。
（項目１９８）
前記ＶＨ、前記ＶＬ、又は該ＶＨ及びＶＬの両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントがＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖抑制の拮抗剤である項目１５０〜１９２の何れか１項に記載のポリペプチド又は項目１７０〜１９３の何れか１項に記載の組成物。
（項目１９９）
項目１５０〜１６９の何れか１項に記載のポリペプチドを含む単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２００）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量をＣＮＳのような傷害に罹患した動物に投与することを含むＣＮＳ傷害を処置するための方法。
（項目２０１）
前記ＣＮＳ傷害が外傷性脳傷害、脊髄傷害、及び視神経傷害よりなる群から選択される項目２００に記載の方法。
（項目２０２）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量を前記ＣＮＳにおけるニューロン成長の抑制に関連する疾患又は障害の処置を必要とする動物に投与することを含む、該処置のための方法。
（項目２０３）
前記疾患又は障害がＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、及び卒中よりなる群から選択される項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量を稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害の処置を必要とする動物に投与することを含む、該処置のための方法。
（項目２０５）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量をＣＮＳのニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全に関連する疾患又は障害の処置を必要とする動物に投与することを含む、該処置のための方法。
（項目２０６）
前記疾患又は障害が多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、ウォーラー変性、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）よりなる群から選択される項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
前記疾患又は障害が多発性硬化症である項目２０６に記載の方法。
（項目２０８）
前記動物が哺乳類である項目２００〜２０７の何れか１項に記載の方法。
（項目２０９）
前記動物がヒトである項目２０８に記載の方法。
（項目２１０）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量にＮｇＲ１を接触させることを含む、ＮｇＲ１によるシグナルトランスダクションを抑制する方法。
（項目２１１）
項目１〜４１又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量に中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンを接触させることを含む、該ニューロンの軸索成長の抑制を低下させる方法。
（項目２１２）
項目１〜４２又は１９９の何れか１項に記載の単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、項目４２〜１０２の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目１５０〜１９２又は１９４〜１９８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド、又は項目１０３〜１３５、１４４又は１９３の何れか１項に記載の組成物よりなる群から選択される剤の有効量にＣＮＳニューロンを接触させることを含む、該ニューロンの成長錐体虚脱を抑制する方法。
特定の実施形態においては、本発明は２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるレファレンスモノクローナル抗体と同じＳｐ３５エピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する。
本発明の特定の実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドを包含し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は表４に示すポリペプチド配列から選択されるか、又は表４に示すポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるか、又はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
本発明の特定の実施形態は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドを包含し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は表５に示すポリペプチド配列から選択されるか、又は表５に示すポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるか、又はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
本発明の特定の実施形態は、表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６、又は該表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるか、又は、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるものよりなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドを包含する。
本発明の特定の実施形態は、表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１、３８５及び４１７、又は該表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１、３８５および４１７に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるか、又は、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるものよりなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドを包含する。
別の実施形態においては、本発明は免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は表４に示すポリヌクレオチド配列から選択されるか、又は表４に示すポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。
別の実施形態においては、本発明は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は表５に示すポリヌクレオチド配列から選択されるか、又は表５に示すポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。
本発明の他の実施形態は、表７に示す配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８、３８２及び４２２又は表７に示す配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８、３８２及び４２２に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるものよりなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。
本発明の他の実施形態は、表９に示す配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９、３８３及び４２３又は表９に示す配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９、３８３及び４２３に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるものよりなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。
特定の実施形態においては、本発明は本明細書に記載した抗体又は抗原結合フラグメントを含む組成物を包含する。
別の実施形態においては、本発明は単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、又は該抗体又はそのフラグメントを含む組成物よりなる群から選択される剤の有効量をＣＮＳ傷害、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害及び卒中の治療が必要な動物に投与することを含む、そのような治療のための方法を包含する。
他の実施形態においては、本発明は単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、又は該抗体又はそのフラグメントを含む組成物よりなる群から選択される剤の有効量を稀突起神経膠細胞の成長又は分化；ＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全の抑制に関連する疾患又は障害、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、ウォーラー変性、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）の治療が必要な動物に投与することを含む、そのような治療のための方法を包含する。
本発明の他の実施形態は、単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、又は該抗体又はそのフラグメントを含む組成物よりなる群から選択される剤の有効量にＮｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）を接触させることを含む、ＮｇＲ１によるシグナルトランスダクションを抑制する方法を包含する。
本発明の別の実施形態は、単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、又は該抗体又はそのフラグメントを含む組成物よりなる群から選択される剤の有効量に中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンを接触させることを含む、そのようなニューロンの軸索成長の抑制を低下させる方法を包含する。
本発明の別の実施形態は、単離されたＳｐ３５抗体又はそのフラグメント、又は該抗体又はそのフラグメントを含む組成物よりなる群から選択される剤の有効量にＣＮＳニューロンを接触させることを含む、そのようなニューロンの成長円錐虚脱を抑制する方法を包含する。
モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３によるＳｐ３５の免疫沈降を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３はＳｐ３５を発現するＣＯＳ−７又は２９３細胞には結合したが、Ｓｐ３５発現を示さない対照細胞には結合しなかったＦＡＣＳ結果である。 ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３はＳｐ３５を発現するＣＯＳ−７又は２９３細胞には結合したが、Ｓｐ３５発現を示さない対照細胞には結合しなかったＦＡＣＳ結果である。 ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３はＳｐ３５を発現するＣＯＳ−７又は２９３細胞には結合したが、Ｓｐ３５発現を示さない対照細胞には結合しなかったＦＡＣＳ結果である。 ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３はＳｐ３５を発現するＣＯＳ−７又は２９３細胞には結合したが、Ｓｐ３５発現を示さない対照細胞には結合しなかったＦＡＣＳ結果である。 ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３は神経突起伸長のミエリン媒介抑制からＤＲＧニューロンを保護した。 モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３又は対照抗体で処理したＤＲＧニューロン及び稀突起神経膠細胞の同時培養の免疫組織化学的染色（「ＩＨＣ」）。パネルＤおよびＥはそれぞれパネルＢ及びＣを拡大したものである。軸索を識別するための抗−βＩＩＩ−チューブリン抗体、又は稀突起神経膠細胞を識別するための抗−ＭＢＰ抗体による染色。Ｆ：１Ａ７又は２Ｆ３との同時培養の処理によるＭＢＰ＋髄鞘形成細胞の定量。Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３で処理したＤＲＧニューロン及び稀突起神経膠細胞の同時培養から生成されたＭＢＰを定量するためのウエスタンブロット分析。 モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３又は対照抗体で処理したＤＲＧニューロン及び稀突起神経膠細胞の同時培養の免疫組織化学的染色（「ＩＨＣ」）。パネルＤおよびＥはそれぞれパネルＢ及びＣを拡大したものである。軸索を識別するための抗−βＩＩＩ−チューブリン抗体、又は稀突起神経膠細胞を識別するための抗−ＭＢＰ抗体による染色。Ｆ：１Ａ７又は２Ｆ３との同時培養の処理によるＭＢＰ＋髄鞘形成細胞の定量。Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３で処理したＤＲＧニューロン及び稀突起神経膠細胞の同時培養から生成されたＭＢＰを定量するためのウエスタンブロット分析。 Ａ：キュプリゾンモデルにおけるマウス稀突起神経膠細胞のＣＣ１抗体染色。Ｂ：キュプリゾンモデルにおけるマウスニューロンの抗ＭＢＰ蛋白抗体又はルクソールファーストブルー染色。Ｃ：４週間及び６週間におけるＣＣ１抗体陽性稀突起神経膠細胞の定量。 生存ＲＧＣ。モノクローナル抗体１Ａ７による処置。抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処置動物は各々約５０％のニューロン生存を示したのみであった対照抗体又はＰＢＳ処置動物と比較して有意なニューロン生存（８０％）を示した。 実施例８に記載する脊髄傷害後の抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７を投与されたマウスのＢＢＢ評点。 実施例９に記載する抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５、Ｌｉ０６及び３、１０及び３０ｍｇのＳｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ）と共にインキュベートした後の同時培養稀突起神経膠細胞及びＤＲＧのウエスタンブロット。 Ａ）正常ラット；Ｂ）ミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラット；及びＣ）Ｓｐ３５抗体１Ａ７で処置したミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラット。各視神経の電子顕微鏡写真を視神経の各写真の下部に示す。 視神経クラッシュ後のＳｐ３５抗体１Ａ７の硝子体内注射を受けた動物において計数された切片当たりの再生ニューロン線維の数のグラフ。 Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞にＭＡｂ３Ｂ５．２（３Ｂ５）及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９（１Ｄ５）が結合したことを示すＦＡＣＳの結果。
Ｉ．定義
「ある」との単数標記の実体はその実体の１つ以上を指し；例えば単数標記の「あるＳｐ３５抗体」は１つ以上のＳｐ３５抗体を表すものとする。従って、「ある」、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」は本明細書においては互換的に使用できる。
本明細書においては、「ポリペプチド」という用語は単数標記の「ポリペプチド」並びに複数標記の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、そしてアミド結合（ペプチド結合としても知られている）により線状に連結された単量体（アミノ酸）を含む分子を指す。「ポリペプチド」という用語はアミノ酸２つ以上の何れかの鎖を指し、そして特定の長さの生成物を指さない。即ち、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「蛋白」、「アミノ酸鎖」又はアミノ酸２つ以上の鎖を指すために使用される何れかの他の用語は「ポリペプチド」の定義に包含され、そして「ポリペプチド」という用語はこれ等の用語の何れとも、その代替として、又は互換的に使用してよい。「ポリペプチド」という用語は又、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定しないが、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解的切断又は非天然存在アミノ酸による修飾の産物も指すことを意図している。ポリペプチドは天然の生物学的原料から誘導してよく、又は、組み換え技術により製造してよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されなくともよい。また、化学合成を包含する何れかの態様において形成してよい。
本発明のポリペプチドはアミノ酸約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさであってよい。ポリペプチドは所定の３次元構造を有してよいが、必ずしもそのような構造を有する必要は無い。所定の３次元構造を有するポリペプチドは折畳型と称し、そして所定の３次元構造を有さないがむしろより多数の異なるコンホーメーションに適合できるポリペプチドは、非折畳型と称する。本明細書においては、糖蛋白という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の酸素含有又は窒素含有側鎖を介して蛋白に結合している炭水化物部分の少なくとも１つにカップリングした蛋白を指す。
「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、改変体又は誘導体とは、その天然の環境には無いポリペプチドを意図する。そして、特定の水準の精製を必要としない。例えば、単離されたポリペプチドはそのネイティブ又は天然の環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現された組み換え生産されたポリペプチド及び蛋白は、本発明の目的の為には、何れかの適当な手法で分離、分画又は部分的又は完全に精製されているネイティブ又は組み換えポリペプチドと同様に単離されたと見なされる。
同様に本発明のポリペプチドに包含されるものは、上記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、類縁体、又は改変体、およびこれらの組み合わせである。本発明のＳｐ３５抗体又は抗体ポリペプチドに言及する場合の「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、相当するネイティブの抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持している何れかのポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのフラグメントは、本明細書で別途考察する特定の抗体フラグメントに加えて、蛋白分解フラグメント、並びに欠失フラグメントを包含する。本発明のＳｐ３５抗体及び抗体ポリペプチドの改変体は上記したフラグメント、及び更には、アミノ酸置換、欠失、又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。改変体は天然に生じてもよく、又は非天然に生じてもよい。非天然に生じた改変体は当該分野で知られた突然変異誘発手法を用いて作成してよい。改変体ポリペプチドは保存的、又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は付加を含んでいてよい。本発明のＳｐ３５抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体はネイティブのポリペプチド上では観察されない追加的な特徴を示すように改変されているポリペプチドである。その例には融合蛋白が包含される。改変体ポリペプチドはまた本明細書においては「ポリペプチド類縁体」とも称してよい。本明細書においては、Ｓｐ３５抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」とは官能性の側鎖基の反応により化学的に誘導された残基１つ以上を有する要件ポリペプチドを指す。「誘導体」に同様に包含されるものは、２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体１つ以上を含有するペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換されてよく；５−ヒドロキシリジンはリジンと置換されてよく；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンはセリンと置換されてよく；そしてオルニチンはリジンと置換されてよい。
「ポリヌクレオチド」という用語は単一の核酸、並びに複数の核酸を包含することを意図しており、そして単離された核酸の分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えばアミド結合、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）中に存在するもの）を含んでよい。「核酸」という用語はポリヌクレオチド中に存在する何れか１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドとは、そのネイティブの環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクター中に含有されるＳｐ３５抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドは本発明の目的のためには単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドの別の例は異種宿主細胞中に維持されている組み換えポリヌクレオチド又は溶液中の精製された（部分的又は実質的に）ポリヌクレオチドを包含する。単離されたＲＮＡ分子は本発明のポリヌクレオチドのインビボ及びインビトロのＲＮＡ転写物を包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は更に合成により製造されたそのような分子も包含する。更に又、ポリヌクレオチド又は核酸は調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターであるか、これ等を包含してよい。
本明細書においては、「コーディング領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンよりなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それらはコーディング領域の部分と見なしてよく、しかしながら、何れかのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等はコーディング領域の部分ではない。本発明のコーディング領域２つ以上が単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一のベクター上、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に又、如何なるベクターも単一のコーディング領域を含有してよく、又は２つ以上のコーディング領域を含んでよく、例えば単一のベクターが別個に免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしてよい。更に又、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸はＳｐ３５抗体又はフラグメント、改変体、又は誘導体をコードする核酸に融合した又は融合していないその異種コーディング領域をコードしてよい。異種コーディング領域は限定しないが特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインを包含する。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常は、コーディング領域の１つ以上に作動可能に会合したプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントを包含してよい。作動可能な会合とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドに対するコーディング領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下又は制御下とするような態様において調節配列の１つ以上と会合している場合である。２ＤＮＡフラグメント（例えばポリペプチドコーディング領域及びそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び、２ＤＮＡフラグメントの間の連結部の性質が遺伝子産物の発現を指向する発現調節配列の能力を妨害しないか、又は、ＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害しなければ、「作動可能に会合している」ことになる。即ち、プロモーター領域はプロモーターがそのポリペプチドをコードする核酸の転写を起こすことができた場合に、その核酸に作動可能に会合していることになる。プロモーターは所定の細胞内でＤＮＡのみの実質的転写を指向する細胞特異的なプロモーターであってよい。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終止シグナルは、細胞特異的転写を指向するポリヌクレオチドと作動可能に会合していることができる。適当なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示する通りである。
種々の転写制御領域が当該分野で知られている。これ等には限定しないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定しないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと連携）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントを包含する。他の転写制御領域はアクチン、熱ショック蛋白、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンのような脊椎動物遺伝子から誘導したもの、並びに、真核生物細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列を包含する。他の適当な転写制御領域は組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロン又はインターロイキンにより誘導されるプロモーター）を包含する。
同様に種々の翻訳制御エレメントが当該分野で知られている。これ等は限定しないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及び、ピコナウイルスから誘導されたエレメント（特に内部リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳ、別名ＣＩＴＥ配列）を包含する。
他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌又はシグナルペプチドをコードする別のコーディング領域と会合していてよい。シグナル仮説に基づけば、哺乳類細胞により分泌された蛋白は、粗面小胞体を通過する成長中の蛋白鎖の移出が開始された後に成熟蛋白から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当該分野で知られる通り、脊椎動物細胞により分泌されたポリペプチドは一般的に、完全又は「完全長」のポリペプチドから切断されて分泌された、又は「成熟した」形態のポリペプチドを生成する、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有する。特定の実施形態においては、ネイティブのシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のシグナルペプチド、又は自身と作動可能に会合したポリペプチドの分泌を指向する能力を保持している配列の機能的誘導体を使用する。或いは、異種の哺乳類シグナルペプチド又はその機能的誘導体を使用してよい。例えば、野生型リーダー配列とヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列とを置き換えてもよい。
本発明は特定のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体に関する。天然に存在する抗体のような完全長の抗体に特定的に言及しない限り、「Ｓｐ３５抗体」という用語は完全長の抗体、並びにそのような抗体の抗原結合フラグメント、改変体、類縁体、又は誘導体、例えば天然に存在する抗体又は免疫グロブリン分子又は操作された抗体分子又は抗体分子と同様の態様において抗原に結合するフラグメントを包含する。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は本明細書においては互換的に使用する。抗体又は免疫グロブリンは重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、そして通常は重鎖及び軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は比較的十分に理解されている。例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）を参照できる。
後により詳細に考察する通り、「免疫グロブリン」という用語は生化学的に区別可能なポリペプチドの種々の広範なクラスを含む。当該分野で知られる通り重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）及びそれらのうちの幾つかのサブクラス（例えばγ１〜γ４）として分類される。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥと決定するものはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等もまた十分特性化されており、そして、機能的特殊性を付与するものとして知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾された型は本明細書の開示内容を鑑みれば当業者が容易に判別できるものであり、従って本発明の範囲内である。全ての免疫グロブリンのクラスが本発明の範囲内にあることは明確であり、以下の考察は一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものとなる。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド及び分子量約５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は典型的には「Ｙ字」の配置においてジスルフィド結合により連結され、その場合、「Ｙ字」の開口部を起点として可変領域を通じて継続している重鎖を軽鎖が包囲する。
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）の何れかに分類される。各重鎖クラスはカッパ又はラムダ軽鎖の何れかと結合してよい。一般的に軽鎖及び重鎖は相互に共有結合し、そして２つの重鎖の「テール」部分は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞の何れかにより免疫グロブリンが形成される場合に、共有結合ジスルフィド結合又は非共有結合的連結により相互に結合する。重鎖において、アミノ酸配列はＹ字配置のフォーク型末端におけるＮ末端から、各鎖の底部におけるＣ末端まで伸長している。
軽鎖及び重鎖の両方が構造的及び機能的に相同の領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は機能的に使用される。この点に関し、当然ながら、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）の部分の両方が抗原認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は重要な生物学的特性、例えば分泌、胎盤経由運動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等を付与する。慣例として、定常領域ドメインのナンバリングは、それらが抗原結合部位又は抗体のアミノ末端から遠位となるに従って増大する。Ｎ末端は可変領域であり、そしてＣ末端は定常領域であり；ＣＨ３及びＣＬドメインは実際にはそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上記した通り、可変領域は抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能とする。即ち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）が組み合わさって３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この第４抗体構造はＹの各アーム部の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位はＶＨ及びＶＬ鎖の各々の上の３つのＣＤＲにより定義される。一部の場合、例えばラクダ種から誘導された、又はラクダ免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子においては、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみより成り、軽鎖を有さない場合がある。例えばＨａｍｅｒｓ Ｃａｓｔｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照できる。
天然に存在する抗体においては、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」は水性環境において抗体がその３次元の配置を取る通りに抗原結合ドメインが形成されるように特に位置づけられるアミノ酸の短い非隣接の配列である。「フレームワーク」領域と称される抗原結合ドメインにおけるアミノ酸の残余は、より低い分子間変動性を示す。フレームワーク領域は大半はβシートのコンホーメーションを採用しており、そしてＣＤＲはβシート構造に連結した、そして一部の場合においてはその部分を形成するループを形成する。即ち、フレームワーク領域は鎖間の非共有結合の相互作用により正しい方向にＣＤＲを位置づけることを可能とするスカホールドを形成する作用を有する。位置づけられたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは免疫反応性抗原上のエピトープに相補である表面を定義する。この相補表面は抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが厳密に定義されているため、当業者により何れかの所定の重鎖又は軽鎖の可変領域に対して容易に同定され得る（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ
Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照できる）。
当該分野において使用及び／又は許容されている用語に２つ以上の定義が存在する場合は、本明細書において使用する用語の定義は、あえて反論しない限り、全てのそのような意味を包含することを意図している。特定の例は、重鎖及び軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に観察される非隣接抗原結合化部位を記述するための「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語の使用にある。この特定の領域は参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており、そこでは定義は相互に比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。しかしなお、抗体又はその改変体のＣＤＲに言及するためのいずれかの定義の適用は本明細書において定義して使用する用語の範囲内にあることを意図している。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較のために下記の表Ｉに示す。特定のＣＤＲを包含する厳密な残基の数はＣＤＲの配列及び大きさに応じて変動することになる。どの残基が特定のＣＤＲを含むかについては、抗体の可変領域のアミノ酸配列が有れば、当業者が類型的に決定できる。
Ｋａｂａｔ等は又、何れかの抗体に適用可能な可変ドメイン配列に関するナンバリングシステムを定義している。この「Ｋａｂａｔナンバリング」を、配列自体を超えた何れかの実験データに依存することなく何れかの可変ドメイン配列に明確に割り付けることは当業者であれば可能である。本明細書においては、「Ｋａｂａｔナンバリング」とはＫａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載されているナンバリングシステムとする。特段の記載が無い限り、本発明のＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに言及する場合は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従うものとする。
ラクダ種においては、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は全抗原結合ドメインを形成する。ラクダＶＨＨ可変領域と従来の抗体から誘導されたもの（ＶＨ）との間の主な相違は（ａ）ＶＨＨにおける相当する領域と比較した場合のＶＨの軽鎖接触表面におけるより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、及び（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合の頻繁な発生、を包含する。
本発明の方法において使用するための抗体又はその抗原特異的フラグメント、改変体、又は誘導体は、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化又はキメラの抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリから製造されるフラグメント、及び、抗特発性（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書に開示するＳｐ３５抗体に対する抗Ｉｄ抗体を包含する）を包含する。ＳｃＦｖ分子は当該分野で知られており、そして、例えば米国特許５、８９２，０１９に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体分子は何れかの型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスのものであることができる。
単鎖抗体を包含する抗体フラグメントは、可変領域を単独又は以下のもの、即ちヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体又は一部分との組み合わせにおいて含んでよい。同様に本発明に包含されるものはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとの可変領域の何れかの組み合わせをやはり含んでいる抗原結合フラグメントである。本明細書に開示する診断及び治療の方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントは鳥類及び哺乳類を包含する何れかの動物起源のものであってよい。好ましくは、抗体はヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。別の実施形態においては、可変領域は軟骨様物質起源であってよい（例えばサメ由来）。本明細書においては、「ヒト」抗体とはヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリンライブラリから、又は、ヒト免疫グロブリンの１つ以上に関してトランスジェニックであり内因性免疫グロブリンを発現しない動物から、後述及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等による米国特許５，９３９，５９８に記載の通り単離された抗体を包含する。
本明細書においては、「重鎖部分」という用語は免疫グロブリン重鎖から誘導されたアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含むポリペプチドはＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上部、中央及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン又はその改変体又はフラグメントの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、又はＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでよい。別の実施形態においては、本発明のポリペプチド鎖はＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。更に又、本発明において使用するための結合ポリペプチドはＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインの全て又は１部分）を欠いていてよい。上記した通り、これらのドメイン（例えば重鎖部分）はそれらがアミノ酸配列において天然に存在する免疫グロブリン分子とは異なるように修飾されていてよいことは当業者の知る通りである。
本明細書に開示した特定のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体においては、多量体のポリペプチド鎖１つの重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。或いは、本発明の重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は異なる標的結合部位を含むことにより、例えば２重特異性抗体を形成してよい。
本明細書に開示した診断及び治療の方法において使用するための結合ポリペプチドの重鎖部分は異なる免疫グロブリン分子から誘導してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分はＩｇＧ１分子から誘導したＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子から誘導したヒンジ領域を含んでよい。別の例においては、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から、そして一部はＩｇＧ３分子から誘導したヒンジ領域を含むことができる。別の例においては、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から、そして一部はＩｇＧ４分子から誘導したキメラヒンジを含むことができる。
本明細書においては、「軽鎖部分」という用語は免疫グロブリン軽鎖から誘導したアミノ酸配列を包含する。好ましくは、軽鎖部分はＶＬ又はＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
本明細書に開示したＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、抗原、例えばそれらが認識するか、特異的に結合する標的ポリペプチド（Ｓｐ３５）のエピトープ又は部分に関して記述又は特定してよい。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは単一のエピトープを含んでよいが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、そして抗原の大きさ、コンホーメーション、及び型に応じてエピトープの何れかの数を包含できる。更に又、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は非ポリペプチドエレメントであるか、それを含んでよく、例えばエピトープは炭水化物側鎖を含んでよい。
抗体に対するペプチド又はポリペプチドエピトープの最小の大きさは約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドエピトープは好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０アミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原ペプチド又はポリペプチドをその第３型において認識できるため、エピトープを含むアミノ酸は隣接している必要はなく、そして一部の場合においては、同じペプチド鎖上にすら存在しなくてよい。本発明においては、本発明のＳｐ３５抗体により認識されるペプチド又はポリペプチドエピトープは、Ｓｐ３５の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は約１５〜約３０の隣接又は非隣接アミノ酸の配列を含有する。
「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を必要とすることを一般的には意味している。この定義によれば、抗体がエピトープに「特異的に結合する」と言えるのは、それがそのエピトープに対して、無作為の無関連のエピトープに結合するよりもより容易に、その抗原結合ドメインを介して結合する場合である。「特異的」という用語は本明細書においては特定の抗体が特定のエピトープに結合するための相対的な親和性を適格とみなす場合に使用する。例えば抗体「Ａ」は抗体「Ｂ」よりもあるエピトープに対してより高い特異性を有することが推定され、或いは、抗体「Ａ」はそれが関連するエピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高値の特異性においてエピトープ「Ｃ」に結合するといえる場合がある。
「優先的に結合する」とは、抗体があるエピトープに対して、関連、同様、相同、又は類縁のエピトープに結合するよりも容易に、特異的に結合することを意味する。即ち、所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、その抗体がある関連エピトープに交差反応する場合があるとしても、その関連エピトープに対するよりはそのエピトープに結合しやすいことになる。
限定しない例として、抗体は、第２のエピトープに関する抗体の解離定数（ＫＤ）より低いＫＤで第１のエピトープに結合する場合に、当該第１のエピトープに優先的に結合するとみなしてよい。別の限定しない例においては、抗体は第２のエピトープに関する抗体のＫＤより少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合に、第１の抗原に優先的に結合するとみなしてよい。別の限定しない例においては、抗体は第２のエピトープに関する抗体のＫＤより少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合に、第１のエピトープに優先的に結合するとみなしてよい。
別の限定しない例においては、抗体は、第２のエピトープに関する抗体のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））より低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合に、当該第１のエピトープに優先的に結合するとみなしてよい。別の限定しない例においては、抗体は、第２のエピトープに関する抗体のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））より少なくとも１桁低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合に、当該第１のエピトープに優先的に結合するとみなしてよい。別の限定しない例においては、抗体は、第２のエピトープに関する抗体のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））より少なくとも２桁低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合に、当該第１のエピトープに優先的に結合するとみなしてよい。
本明細書に開示した抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体は５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１又は１０−３秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で本明細書に開示した標的ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合するといえる。より好ましくは、本発明の抗体は５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１又は１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１又は１０−７秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で本明細書に開示した標的ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合するといえる。
本明細書に開示した抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体は１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０−４Ｍ−１秒−１又は５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で本明細書に開示した標的ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合するといえる。より好ましくは、本発明の抗体は１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１又は５×１０６Ｍ−１秒−１又は１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で本明細書に開示した標的ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合するといえる。
抗体が所定のエピトープへのレファレンス抗体の結合を競合的に抑制するといえるのは、それがエピトープへのレファレンス抗体の結合をある程度までブロックする程度にまでそのエピトープに優先的に結合する場合である。競合的な抑制は、当該分野で知られた何れかの方法、例えば競合的ＥＬＩＳＡ試験により測定してよい。抗体は少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％まで所定のエピトープへのレファレンス抗体の結合を競合的に抑制するといってよい。
本明細書においては、「親和性」という用語は免疫グロブリン分子のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強度の尺度を指す。例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版１９８８） ｐ．２７−２８を参照できる。本明細書においては、「アビディティ」という用語は免疫グロブリンの集団と抗原の間の複合体の全体的安定性、即ち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的な複合化の強度を指す。Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照できる。アビディティは特定のエピトープを有する集団における個々の免疫グロブリン分子の親和性、及び免疫グロブリン及び抗原の価数の両方に関連する。例えば２価のモノクローナル抗体と高反復エピトープ構造を有する抗原、例えば重合体、との間の相互作用は高アビディティのものとなる。
本発明のＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体はまたそれらの交差反応性に関して記述又は特定してよい。本明細書においては、「交差反応性」という用語はある抗原に対して特異的な抗体が、第２の抗原と反応する能力：２つの異なる抗原物質の間の関連性の尺度を指す。即ち、抗体はそれがその形成を誘導するものではないエピトープに結合する場合に、交差反応性となる。交差反応性エピトープは一般的に誘導エピトープと同じ相補性の構造の特徴の多くを含有し、そして一部の場合においては実際にはオリジナルよりも良好に適合する場合がある。
例えば、特定の抗体は、関連するが同じではないエピトープ、例えばレファレンスエピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、そして少なくとも５０％の同一性を有するエピトープ（当該分野で知られており、本明細書に記載した方法を用いて計算）にそれらが結合するという点においてある程度の交差反応性を有する。抗体はそれがレファレンスエピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、そして５０％未満の同一性を有するエピトープ（当該分野で知られており、本明細書に記載した方法を用いて計算）には結合しない場合に、交差結合性を殆ど、又はまったく有さないといってよい。抗体は特定のエピトープに対して、それがそのエピトープの如何なる他の類縁体、オーソログ、又は相同体にも結合しない場合に、「高度に特異的」とみなしてよい。
本発明のＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体はまた本発明のポリペプチドへのそれらの結合親和性に関して記述又は特定してよい。好ましい結合親和性は５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数、即ちＫｄを有するものを包含する。
本発明のＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体は「多重特異性」、例えば２重特異性、三重特異性、又はそれより高次の多重特異性であってよく、それが同時に異なる抗原（例えば蛋白）の１つ以上の上に存在する異なるエピトープ２つ以上を認識して結合することを意味する。即ち、Ｓｐ３５抗体が「一重特異性」である又は「多重特異性」、例えば「２重特異性」であるということは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指す。多重特異性抗体は本明細書に記載した標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異性であってよく、或いは、標的ポリペプチドに対して、並びに異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体物質に対して特異的であってよい。
本明細書においては、「価数」という用語はＳｐ３５抗体、結合ポリペプチド又は抗体に存在する潜在的な結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。各結合ドメインは１つのエピトープに特異的に結合する。Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド又は抗体が１つより多い結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、「２価１重特異性」と称される２つの結合ドメインを有する抗体に対しては同じエピトープに、又は、「２価２重特異性」と称される２つの結合ドメインを有する抗体に対しては異なるエピトープに特異的に結合してよい。抗体は又、各特異性に関して２重特異性及び２価であってよい（「２重特異性４価抗体」と称される）。別の実施形態においては、４価のミニボディー又はドメイン欠失抗体を作成できる。
２重特異性２価抗体、及びその作成方法は、例えば参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許５，７３１，１６８；５，８０７，７０６；５，８２１，３３３；及び米国特許出願２００３／０２０７３４及び２００２／０１５５５３７に記載されている。二重特異性４価抗体、及びその作成方法は、例えば両方とも参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０９６９４８及びＷＯ００／４４７８８に記載されている。一般的には ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許４，４７４，８９３；４，７１４，６８１；４，９２５，６４８；５，５７３，９２０；５，６０１，８１９；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照できる。
以前に示した通り、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。本明細書においては、「ＶＨドメイン」という用語は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを包含し、「ＣＨ１ドメイン」という用語は免疫グロブリン重鎖の第１（最アミノ末端）の定常領域ドメインを包含する。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、そして免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
本明細書においては、「ＣＨ２ドメイン」という用語は従来のナンバリングスキームを用いた場合に抗体の例えば概ね残基２４４から残基３６０に伸長する重鎖分子の部分を包含する（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；及び残基２３１〜３４０、ＥＵナンバリングシステム；上記ＫａｂａｔＥＡ等参照）。ＣＨ２ドメインはそれが他のドメインと緊密に対形成しないという点においてユニークである。むしろ、２つのＮ連結分枝炭水化物鎖が未損傷のネイティブのＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挟まれている。ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで伸長し、そして約１０８残基を含むこともよく知られている。
本明細書においては、「ヒンジ領域」という用語はＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を包含する。このヒンジ領域は約２５残基を含み、そして可撓性であるため、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能とする。ヒンジ領域は３つの区別可能なドメイン：上部、中央、及び下部のヒンジドメインに細分することができる（Ｒｏｕｘ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
本明細書においては、「ジスルフィド結合」という用語は２つのイオウ原子の間に形成された共有結合を包含する。アミノ酸システインは第２のチオール基とジスルフィド結合又は架橋を形成できるチオール基を含む。大部分の天然に存在するＩｇＧ分子においては、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合により連結されており、そして２つの重鎖はＫａｂａｔのナンバリングシステムを用いれば２３９及び２４２（２２６又は２２９位、ＥＵナンバリングシステム）に相当する位置において２つのジスルフィド結合により連結されている。
本明細書においては、「キメラ抗体」という用語は免疫反応性の領域又は部位が第１の種から得られ、又は誘導され、そして定常領域（未損傷であるか、本発明に従って部分的又は修飾されていてよい）が第２の種から得られている何れかの抗体を意味するものとする。好ましい実施形態においては、標的結合領域又は部位は非ヒト原料（例えばマウス又は霊長類）に由来し、そして定常領域はヒト型である。
本明細書においては、「操作された抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の何れか又は両方の可変ドメインが特異性既知の抗体由来のＣＤＲ１つ以上の少なくとも部分的な置き換えにより、そして必要に応じて部分的なフレームワーク領域置き換え及び配列変化により改変されている抗体を指す。ＣＤＲはフレームワーク領域の誘導元と同じクラス、更には同じサブクラスの抗体から誘導してよいが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体から、そして好ましくは異なる種の抗体から誘導されることが想定される。特異性既知の非ヒト抗体由来の「ドナー」ＣＤＲ１つ以上がヒト重鎖又は軽鎖フレームワーク領域にグラフトされている操作された抗体は、本明細書においては、「ヒト化抗体」と称する。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移行させるためにはドナーの可変領域由来の完全なＣＤＲでＣＤＲの全てを置き換える必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移行させることのみ必要である。これは例えば米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０に記載されている説明に基づけば、定型的実験を実施することによるか、又は機能的に操作された、又はヒト化された抗体を得るための試行錯誤の試験により、当業者には可能なことである。
本明細書においては、「適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを含む機能的ドメインの全てが区別可能に活性であるポリペプチド（例えばＳｐ３５抗体）を包含する。本明細書においては、「不適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能的ドメインの少なくとも１つが活性でないポリペプチドを包含する。１つの実施形態において、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合により連結されたポリペプチド鎖を含み、逆に不適切に折り畳まれたポリペプチドは少なくとも１つのジスルフィド結合により連結されていないポリペプチド鎖を含む。
本明細書においては、「操作された」という用語は合成手段（例えば組み換え手法、インビトロペプチド合成、酵素的又は化学的なペプチドカップリング、又はこれらの手法の何らかの組み合わせ）による核酸又はポリペプチドの分子の操作を包含する。
本明細書においては、「連結された」、「融合された」又は「融合」という用語は互換的に使用される。これらの用語は化学的コンジュゲーション又は組み換え手段を包含する如何なる手段による場合であっても、さらにもう２つのエレメント又は成分がともに連結されることを指す。「インフレーム融合」とは、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するような態様において連結されることにより、連続するより長いＯＲＦが形成されることを指す。即ち、組み換え融合蛋白は元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当する２つ以上のセグメントを含有する単一の蛋白である（このようなセグメントは通常は天然にはそのように連結されない）。リーディングフレームはこのようにして融合セグメントに渡って連続するように形成されるが、セグメントは例えばインフレームのリンカー配列により物理的又は空間的に分離されていてよい。例えば免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはインフレームに融合してよいが、「融合した」ＣＤＲが連続ポリペプチドの部分として同時翻訳される限りにおいて、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又は追加的なＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離されていてもよい。
ポリペプチドに関する場合、「線状配列」又は「配列」とは配列内で相互に隣りあう残基がポリペプチドの一次構造において隣接しているアミノ末端からカルボキシ末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序である。
「発現」という用語は本明細書においては生化学物質、例えばＲＮＡ又はポリペプチドを遺伝子が生産するプロセスを指す。プロセスは、限定しないが、遺伝子ノックダウン並びに一過性の発現及び安定な発現の両方を包含する、細胞内の遺伝子の機能的存在の何れかの顕在化を包含する。それには、限定しないが、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何れかの他のＲＮＡ産物への転写、及び、そのようなｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳が包含される。最終の所望の生成物が生化学的物質である場合は、発現はその生化学的物質及び何れかの前駆体の形成を包含する。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生産する。本明細書においては、遺伝子産物は核酸、例えば遺伝子の転写により生産されるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載する遺伝子産物は更に、転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、又は翻訳語修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他の蛋白サブユニットとの会合、蛋白分解性の切断等を有するポリペプチドを包含する。
本明細書においては、「治療する」又は「治療」という用語は治療的治療及び予防的又は防止的な処置の両方を指し、ここでその目的とは、望ましくない生理学的変化又は障害、例えば多発性硬化症の進行を防止又は緩徐化（低減）することである。有利又は望ましい臨床結果は限定しないが、検出可能か又は検出不可能かに関わらず、症状の軽減、疾患の範囲の減少、疾患の安定化（即ち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の緩解又は緩和及び沈静化（部分的又は完全）を包含する。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存と比較して延長された生存も意味することができる。治療の必要な者とは、既に状態又は障害を有する者、並びに状態又は障害を有し易いもの、又は状態又は障害を防止すべき者を包含する。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」とは、診断、予後又は治療が望まれる何れかの対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象は、ヒト、家畜動物、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛等を包含する。
本明細書においては、「Ｓｐ３５抗体の投与から利益を被る対象」及び「治療の必要な動物」という表現は、例えばＳｐ３５ポリペプチドの検出のため（例えば診断処置のため）に使用されるＳｐ３５抗体の投与から、及び／又はＳｐ３５抗体を用いたＭＳのような疾患の治療、即ち緩和又は防止から、利益を被る哺乳類対象のような対象を包含する。本明細書においてより詳細に説明する通り、Ｓｐ３５抗体は未コンジュゲート型で使用することができ、又は、例えば薬品、プロドラッグ又は同位体にコンジュゲートすることができる。
ＩＩ．Ｓｐ３５
天然に存在するヒトＳｐ３５（Ｓｐ３５）は３３アミノ酸シグナル配列を包含する６１４アミノ酸（配列番号２）を有すると予測されているグリコシル化中枢神経系特異的蛋白である。Ｓｐ３５は又当該分野ではＬＩＮＧＯ−１、ＬＲＲＮ６、ＬＲＲＮ６Ａ、ＦＬＪ１４５９４、ＬＥＲＮ１、ＭＧＣ１７４２２及びＵＮＱ２０１という名称で知られている。ヒトの完全長の野生型のＳｐ３５ポリペプチドは１４ロイシンリッチリピート（Ｎ及びＣ末端キャップを含む）より成るＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、膜貫通領域、及び細胞質ドメインを含有する。細胞質ドメインはカノニカルなチロシンホスホリル化部位を含有する。更に又、天然に存在するＳｐ３５蛋白はシグナル配列、ＬＲＲＣＴとＩｇドメインの間の短い塩基性の領域、及びＩｇドメインと細胞質ドメインの間の膜貫通領域を含有する。ヒトＳｐ３５遺伝子（配列番号１）は６つの追加的なアミノ酸、即ちＭＱＶＳＫＲ（配列番号３）がＳｐ３５シグナル配列のＮ末端に存在してもしなくてもよいように、代替の翻訳開始コドンを含有する。表２は配列番号２として本明細書に提示したＳｐ３５アミノ酸配列に基づいたアミノ酸残基番号に従ったＳｐ３５ドメイン及び他の領域を示す。Ｓｐ３５ポリペプチドは参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０８５６４８により詳細に特性化されている。
Ｓｐ３５の組織分布及び発生上の発現はヒト及びラットにおいて研究されている。Ｓｐ３５の生物学的特徴は実験動物（ラット）モデルにおいて研究されている。ラットＳｐ３５の発現はノーザンブロット及び免疫組織化学的染色により測定した場合にニューロン及び稀突起神経膠細胞に局在化している。ラットＳｐ３５ｍＲＮＡ発現レベルは発生上で調節され、出生直後、即ち生後第１日に最高値となる。ラット脊髄横断傷害モデルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合、Ｓｐ３５は傷害部位においてアップレギュレートされている。Ｍｉ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）を参照できる。
Ｓｐ３５ポリペプチドの種々の構造的及び機能的ドメインを含むアミノ酸の関連においては、「約」という用語は特記された値及び数個（例えば１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸の分だけより大きいか小さい値を包含する。表１に示したこれらのドメインの位置はコンピューターグラフィックにより予測されているため、ドメインを構成するアミノ酸残基はドメインを定義するために使用される基準に応じて僅かに（例えば約１〜１５残基分）変動してよいことは当業者の知る通りである。
本発明者等は完全長、野生型Ｓｐ３５がＮｇＲ１に結合することを発見した。ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０８５６４８を参照できる。本発明者等は又Ｓｐ３５が稀突起神経膠細胞で発現されること、及びＳｐ３５蛋白が軸索の稀突起神経膠細胞媒介髄鞘形成の調節に関与していることも発見した。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２００６／０００９３８８Ａ１を参照できる。
完全長Ｓｐ３５分子のヌクレオチド配列は以下の通りである。
完全長Ｓｐ３５分子ポリペプチドのポリペプチド配列は以下の通りである。
ＩＩＩ．Ｓｐ３５抗体
１つの実施形態において、本発明はＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に関する。例えば本発明は表３Ａ〜３Ｅに示す特定のモノクローナル抗体、そのフラグメント、改変体、及び誘導体の少なくとも抗原結合ドメインを包含する。
表３Ａは特定の完全長ファージライブラリ誘導抗体により結合されるＳｐ３５ポリペプチドの領域を記載する。これらの抗体は表３Ｂに示す通り、ファージディスプレイライブラリ−１から誘導されるＦａｂフラグメントと同じ可変領域を有する（例えば表３ＡのＤ０５は表３ＢのＬｉ０５と同じ可変領域を有し、表３ＡのＤ０６は表３ＢのＬｉ０６と同じ可変領域を有する等）。抗体は当該分野で良く知られている方法を用いながら表３Ａにおいて定義されるとおりＳｐ３５フラグメントの結合に関して試験した。
表３Ｂ〜３Ｅは命名されたモノクローナル抗体又はＦａｂフラグメントがＳｐ３５を検出する能力を、種々の試験において、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫沈降（ＩＰ）、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）において説明している。これらの試験を実施するための詳細なプロトコルは本明細書に記載する通りであり、或いは当業者に良く知られ、理解されている通りである。表３Ｂ及び３Ｃに記載したハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体は可溶性Ｓｐ３５をマウスに注射し、そして次に当該分野で良く知られている、そして本明細書に記載したハイブリドーマ技術を用いながら単離することにより作成した。表３Ｂに示すモノクローナル抗体及び抗体Ｆａｂフラグメントは当該分野で知られた手法を用いながら２つの異なるファージディスプレイライブラリから単離した。
本明細書においては、「抗原結合ドメイン」という用語は抗原上のエピトープ（例えばＳｐ３５のエピトープ）に特異的に結合する部位を包含する。抗体の抗原結合ドメインは典型的には免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも１部分及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも１部分を包含する。これらの可変領域により形成される結合部位が抗体の特異性を決定する。
本発明はとりわけ、Ｓｐ３５抗体が２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、Ｓｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に関する。
本発明は更に、Ｓｐ３５抗体が２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する、Ｓｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体を記載する。
本発明は又、Ｓｐ３５抗体が２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体の抗原結合領域を少なくとも含む、Ｓｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体を記載する。
２００６年１２月２７日、以下のハイブリドーマ、即ち２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）、７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託した。寄託したハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２は本明細書に記載した抗体３Ｂ５．２を生産し、そして寄託したハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９は本明細書に記載したモノクローナル抗体７Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９を生産する。ハイブリドーマは当該分野で良く知られている、そして本明細書に記載した方法に従って培養できる。
特定の実施形態においては、本発明は特定のＳｐ３５ポリペプチドフラグメント又はドメインに特異的又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体に関する。そのようなＳｐ３５ポリペプチドフラグメントは、限定しないが、アミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７；３４〜４２５；３４〜４９３；６６〜５３２；６６〜４１７；６６〜４２６；６６〜４９３；６６〜５３２；４１７〜５３２；４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）；４１７〜４９３；４１７〜５３２；，４１９〜４９３（Ｓｐ３５Ｉｇ領域）；又は配列番号２の４２５〜５３２を含む、これより本質的になる、又はこれよりなるＳｐ３５ポリペプチド；又は配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７；３４〜４２５；３４〜４９３；６６〜５３２；６６〜４１７；６６〜４２６；６６〜４９３；６６〜５３２；４１７〜５３２；４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）；４１７〜４９３；４１７〜５３２；４１９〜４９３（Ｓｐ３５Ｉｇ領域）；又は４２５〜５３２に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一のＳｐ３５改変体ポリペプチドを包含する
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、Ｓｐ３５のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、例えば、配列番号２のアミノ酸６６〜８９；６６〜１１３；６６〜１３７；９０〜１１３；１１４〜１３７；１３８〜１６１；１６２〜１８５；１８６〜２０９；２１０〜２３３；２３４〜２５７；２５８〜２８１；２８２〜３０５；３０６〜３２９；又は３３０〜３５３を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。配列番号２のアミノ酸６６〜８９；６６〜１１３；９０〜１１３；１１４〜１３７；１３８〜１６１；１６２〜１８５；１８６〜２０９；２１０〜２３３；２３４〜２５７；２５８〜２８１；２８２〜３０５；３０６〜３２９；又は３３０〜３５３に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の改変体Ｓｐ３５ポリペプチドの相当するフラグメントも意図される。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、Ｓｐ３５のＬＲＲにフランキングするシステインリッチ領域１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、例えば、配列番号２のアミノ酸３４〜６４（Ｎ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＮＴ））を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメント、又は配列番号２のアミノ酸のアミノ酸３６３〜４１６（Ｃ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＣＴ））を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。配列番号２のアミノ酸３４〜６４及び３６３〜４１６に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一の改変体Ｓｐ３５ポリペプチドの相当するフラグメントも意図される。
当該分野で知られる通り、２つのポリペプチドの間の「配列同一性」は１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において考察する場合、何れかの特定のポリペプチドが別のポリペプチドに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるかは、当該分野で知られた方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア、例えば限定しないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用Ｖｅｒｓｉｏｎ８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）を用いて決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムを用いることにより２つの配列の間の相同性の最良セグメントを発見している。特定の配列が本発明によるレファレンス配列に例えば９５％同一であるかどうかを調べるためにＢＥＳＴＦＩＴ又は何れかの他の配列アライメントプログラムを使用する場合、当然ながら、同一性のパーセンテージがレファレンスポリペプチド配列の完全長に渡って計算されるように、そして、レファレンス配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが容認されるようにパラメーターを設定する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の４１〜５２５；配列番号２の４０〜５２６；配列番号２の３９〜５２７；配列番号２の３８〜５２８；配列番号２の３７〜５２９；配列番号２の３６〜５３０；配列番号２の３５〜５３１；配列番号２の３４〜５３１；配列番号２の４６〜５２０；配列番号２の４５〜５２１；配列番号２の４４〜５２２；配列番号２の４３〜５２３；及び配列番号２の４２〜５２４のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する更に別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の１〜３３；配列番号２の１〜３５；配列番号２の３４〜６４；配列番号２の３６〜６４；配列番号２の６６〜８９；配列番号２の９０〜１１３；配列番号２の１１４〜１３７；配列番号２の１３８〜１６１；配列番号２の１６２〜１８５；配列番号２の１８６〜２０９；配列番号２の２１０〜２３３；配列番号２の２３４〜２５７；配列番号２の２５８〜２８１；配列番号２の２８２〜３０５；配列番号２の３０６〜３２９；配列番号２の３３０〜３５３；配列番号２の３６３〜４１６；配列番号２の４１７〜４２４；配列番号２の４１９〜４９３；及び配列番号２の４９４〜５５１のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する又更なるＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の１〜３３；配列番号２の１〜３５；配列番号２の１〜６４；配列番号２の１〜８９；配列番号２の１〜１１３；配列番号２の１〜１３７；配列番号２の１〜１６１；配列番号２の１〜１８５；配列番号２の１〜２０９；配列番号２の１〜２３３；配列番号２の１〜２５７；配列番号２の１〜２８１；配列番号２の１〜３０５；配列番号２の１〜３２９；配列番号２の１〜３５３；配列番号２の１〜４１６；配列番号２の１〜４２４；配列番号２の１〜４９３；配列番号２の１〜５５１；配列番号２の１〜５３１及び配列番号２の１〜５３２のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の３４〜６４；配列番号２の３４〜８９；配列番号２の３４〜１１３；配列番号２の３４〜１３７；配列番号２の３４〜１６１；配列番号２の３４〜１８５；配列番号２の３４〜２０９；配列番号２の３４〜２３３；配列番号２の３４〜２５７；配列番号２の３４〜２８１；配列番号２の３４〜３０５；配列番号２の３４〜３２９；配列番号２の３４〜３５３；配列番号２の３４〜４１６；配列番号２の３４〜４２４；配列番号２の３４〜４９３；及び配列番号２の３４〜５５１のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する更に別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の３４〜５３０；配列番号２の３４〜５３１；配列番号２の３４〜５３２；配列番号２の３４〜５３３；配列番号２の３４〜５３４；配列番号２の３４〜５３５；配列番号２の３４〜５３６；配列番号２の３４〜５３７；配列番号２の３４〜５３８；配列番号２の３４〜５３９；配列番号２の３０〜５３２；配列番号２の３１〜５３２；配列番号２の３２〜５３２；配列番号２の３３〜５３２；配列番号２の３４〜５３２；配列番号２の３５〜５３２；配列番号２の３６〜５３２；配列番号２の３０〜５３１；配列番号２の３１〜５３１；配列番号２の３２〜５３１；配列番号２の３３〜５３１；配列番号２の３４〜５３１；及び配列番号２の３５〜５３１；配列番号２の３６〜５３１のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する又更なるＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の３６〜６４；配列番号２の３６〜８９；配列番号２の３６〜１１３；配列番号２の３６〜１３７；配列番号２の３６〜１６１；配列番号２の３６〜１８５；配列番号２の３６〜２０９；配列番号２の３６〜２３３；配列番号２の３６〜２５７；配列番号２の３６〜２８１；配列番号２の３６〜３０５；配列番号２の３６〜３２９；配列番号２の３６〜３５３；配列番号２の３６〜４１６；配列番号２の３６〜４２４；配列番号２の３６〜４９３；及び配列番号２の３６〜５５１のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の３６〜５３０；配列番号２の３６〜５３１；配列番号２の３６〜５３２；配列番号２の３６〜５３３；配列番号２の３６〜５３４；配列番号２の３６〜５３５；配列番号２の３６〜５３６；配列番号２の３６〜５３７；配列番号２の３６〜５３８；及び配列番号２の３６〜５３９のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する更なるＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、配列番号２の４１７〜４９３；配列番号２の４１７〜４９４；配列番号２の４１７〜４９５；配列番号２の４１７〜４９６；配列番号２の４１７〜４９７；配列番号２の４１７〜４９８；配列番号２の４１７〜４９９；配列番号２の４１７〜５００；配列番号２の４１７〜４９２；配列番号２の４１７〜４９１；配列番号２の４１２〜４９３；配列番号２の４１３〜４９３；配列番号２の４１４〜４９３；配列番号２の４１５〜４９３；配列番号２の４１６〜４９３；配列番号２の４１１〜４９３；配列番号２の４１０〜４９３；配列番号２の４１０〜４９４；配列番号２の４１１〜４９４；配列番号２の４１２〜４９４；配列番号２の４１３〜４９４；配列番号２の４１４〜４９４；配列番号２の４１５〜４９４；配列番号２の４１６〜４９４；配列番号２の４１７〜４９４；及び配列番号２の４１８〜４９４のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。
別の実施形態においては、本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合するＳｐ３５ペプチドフラグメントは、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、そのようなポリペプチドのフラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。特記すれば、以下のポリペプチド配列、即ち：ＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２８７）、ＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２８８）、ＶＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２８９）及びＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２９０）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドが挙げられ、ここでＸ１はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、又はアスパラギンであり、Ｘ２はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、又はアスパラギンであり、そしてＸ３はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、又はアスパラギンである。例えば、本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合するＳｐ３５ペプチドフラグメントは、以下のポリペプチド配列：ＳＰＲＫＨ（配列番号２９１）、ＳＰＲＫＫ（配列番号２９２）、ＳＰＲＫＲ（配列番号２９３）、ＳＰＫＫＨ（配列番号２９４）、ＳＰＨＫＨ（配列番号２９５）、ＳＰＲＲＨ（配列番号２９６）、ＳＰＲＨＨ（配列番号２９７）、ＳＰＲＲＲ（配列番号２９８）、ＳＰＨＨＨ（配列番号２９９） ＳＰＫＫＫ（配列番号３００）、ＬＳＰＲＫＨ（配列番号３０１）、ＬＳＰＲＫＫ（配列番号３０２）、ＬＳＰＲＫＲ（配列番号３０３）、ＬＳＰＫＫＨ（配列番号３０４）、ＬＳＰＨＫＨ（配列番号３０５）、ＬＳＰＲＲＨ（配列番号３０６）、ＬＳＰＲＨＨ（配列番号３０７）、ＬＳＰＲＲＲ（配列番号３０８）、ＬＳＰＨＨＨ（配列番号３０９） ＬＳＰＫＫＫ（配列番号３１０）、ＷＬＳＰＲＫＨ（配列番号３１１）、ＷＬＳＰＲＫＫ（配列番号３１２）、ＷＬＳＰＲＫＲ（配列番号３１３）、ＷＬＳＰＫＫＨ（配列番号３１４）、ＷＬＳＰＨＫＨ（配列番号３１５）、ＷＬＳＰＲＲＨ（配列番号３１６）、ＷＬＳＰＲＨＨ（配列番号３１７）、ＷＬＳＰＲＲＲ（配列番号３１８）、ＷＬＳＰＨＨＨ（配列番号３１９） 、及びＷＬＳＰＫＫＫ（配列番号３２０）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。これらのＳｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５のＩｇドメインに塩基性の「ＲＫＨループ」（アルギニン−リジン−ヒスチジンアミノ酸４５６〜４５８）を包含する。塩基性トリペプチドを包含する別のＳｐ３５ペプチドはＩＴＰＫＲＲ（配列番号３２１）、ＡＣＨＨＫ（配列番号３２２）及びＶＣＨＨＫ（配列番号３２３）である。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、そのようなポリペプチドのフラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。特記すれば、以下のポリペプチド配列、即ち：Ｘ４Ｘ５ＲＫＨ（配列番号３２４）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＲ（配列番号３２５）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＫ（配列番号３２６）、Ｘ４Ｘ５ＨＨＨ（配列番号３２７）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＫ（配列番号３２８）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＲ（配列番号３２９）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＨ（配列番号３３０）、Ｘ４Ｘ５ＨＫＨ（配列番号３３１）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＨ（配列番号３３２）及びＸ４Ｘ５ＲＨＨ（配列番号３３３）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるペプチドが挙げられ、ここでＸ４は何れかのアミノ酸であり、そしてＸ５は何れかのアミノ酸である。
別の実施形態においては、本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合するＳｐ３５ペプチドフラグメントは、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、そのようなポリペプチドのフラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。特記すれば、以下のポリペプチド配列、即ち：ＩＴＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号３３４）、ＡＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号３３５、ＶＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号３３６）及びＳＰＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号３３７）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドが挙げられ、ここでＸ６はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、又はアスパラギン、Ｘ７は何れかのアミノ酸であり、そしてＸ８はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、又はアスパラギンである。例えば以下のポリペプチド配列、即ち：ＳＰＲＬＨ（配列番号３３８）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドが挙げられる。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合するＳｐ３５ペプチドフラグメントは、Ｓｐ３５のＩｇドメインにおけるアミノ酸４５２〜４５８を含有するペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、又はその誘導体を包含し、ここでアミノ酸４５２はトリプトファン又はフェニルアラニン残基である。
本発明の特定の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が結合する別のＳｐ３５ペプチドフラグメントは、Ｓｐ３５の塩基性ドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。特記すれば、以下のポリペプチド配列、即ち：ＲＲＡＲＩＲＤＲＫ（配列番号３３９）、ＫＫＶＫＶＫＥＫＲ（配列番号３４０）、ＲＲＬＲＬＲＤＲＫ（配列番号３４１）、ＲＲＧＲＧＲＤＲＫ（配列番号３４２）及びＲＲＩＲＡＲＤＲＫ（配列番号３４３）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるペプチドが挙げられる。
別の例示される可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド及び本発明の抗体又は抗体フラグメントを製造するためのこのような分子を得るための方法及び材料は、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３に記載されている。
抗体を作成する方法は当該分野で良く知られており、そして本明細書に記載する通りである。シグナル配列を有しないＳｐ３５の種々のフラグメントに対する、又は完全長に対する抗体を作成した後、Ｓｐ３５のどのアミノ酸又はエピトープに抗体又は抗原結合フラグメントが結合するかを調べることは、当該分野で良く知られている方法ならびに本明細書に記載するエピトープマッピングプロトコルにより決定することができる（例えば”Ｃｈａｐｔｅｒ１１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、ｖ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）。別のエピトープマッピングプロトコルは両方とも参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載されている。エピトープマッピングは又市販の手段（即ちＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））により実施することもできる。
更に又、次に、Ｓｐ３５の何れかの部分に結合する製造された抗体を、Ｓｐ３５の拮抗剤として機能する、そしてこのため神経突起伸長、ニューロン及び稀突起神経膠細胞の生存、増殖及び分化を促進する、並びに髄鞘形成を促進するそれらの能力に関して、スクリーニングすることができる。抗体は実施例１０及び１１に記載する方法を用いることにより稀突起神経膠細胞／ニューロンの生存に関してスクリーニングできる。更に又、抗体は実施例９の方法を用いることにより髄鞘形成を促進するそれらの能力に関してスクリーニングできる。最後に、抗体は実施例７に記載の方法を用いることにより稀突起神経膠細胞の増殖及び分化、並びに神経突起伸長を促進するそれらの能力に関してスクリーニングできる。本発明の抗体の他の拮抗機能は本明細書の実施例に記載する他の試験法を用いて試験できる。
別の実施形態においては、本発明はＳｐ３５のエピトープの少なくとも１つに特異的又は優先的に結合する抗体、その抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を包含し、ここでエピトープは配列番号２の少なくとも約４〜５アミノ酸、配列番号２の少なくとも７、少なくとも９、又は少なくとも約１５〜約３０アミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。記載する通り配列番号２の所定のエピトープのアミノ酸は隣接又は線状であってよいが、そうである必要はない。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５のエピトープの少なくとも１つは、細胞の表面上に発現された状態の、又は例えばＩｇＧのＦｃ領域に融合した可溶性フラグメントとしての、Ｓｐ３５の細胞外ドメインにより形成される非線状のエピトープを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。即ち、特定の実施形態においては、Ｓｐ３５のエピトープの少なくとも１つは、配列番号２の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００の隣接又は非隣接アミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなり、そしてここで非隣接アミノ酸は蛋白の折り畳みを介してエピトープを形成する。
別の実施形態においては、本発明はＳｐ３５のエピトープの少なくとも１つに特異的又は優先的に結合する抗体、その抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を包含し、ここでエピトープは上記した配列番号２の１、２、３、４、５、６またはそれ以上の隣接又は非隣接のアミノ酸に加えて、蛋白を修飾する追加的部分を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなり、例えば炭水化物部分を包含させることによりＳｐ３５抗体が蛋白の未修飾型に対するよりも修飾された標的蛋白に対してより高い親和性で結合できるようにしてよい。或いは、Ｓｐ３５抗体は標的蛋白の未修飾型には全く結合しない。
特定の特徴において、本発明は該レファレンスモノクローナル抗体に関する解離定数（ＫＤ）よりも低値のＫＤを特徴とする親和性でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体に関する。
特定の実施形態においては、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、上記したＳｐ３５又はフラグメント又は改変体のエピトープの少なくとも１つに特異的に結合し、即ち、未関連又は無作為のエピトープにそれが結合するよりもより容易にそのようなエピトープに結合するか；上記したＳｐ３５又はフラグメント又は改変体のエピトープの少なくとも１つに優先的に結合し、即ち、関連する、同様の、相同な、又は類縁のエピトープにそれが結合するよりもより容易にそのようなエピトープに結合するか；上記したＳｐ３５又はフラグメント又は改変体の特定のエピトープに特異的又は優先的に自身が結合するレファレンス抗体の結合を競合的に抑制するか；又は、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、又は約１０−１５Ｍより低値の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で上記したＳｐ３５又はフラグメント又は改変体のエピトープの少なくとも１つに結合する。特定の特徴において、抗体又はそのフラグメントはネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する。
抗体の結合解離定数の関連において使用する場合、「約」という用語は抗体の親和性を計測するために利用される方法における固有の変動性の程度を容認するものである。例えば、使用する機材の精度のレベル、計測する試料の数に基づいた標準誤差、及び四捨五入誤差に応じて、「約１０−２Ｍ」という用語は例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含する場合がある。
特定の実施形態において、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１又はｌ０−３秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合する。或いは本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×ｌ０−５秒−１又はｌ０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、又は１０−７秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合する。
別の実施形態において、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１又は５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合する。或いは、本発明の抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１又は１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に結合する。
種々の実施形態において、本明細書に記載したＳｐ３５抗体又はその抗原結合フラグメント、改変体又は誘導体はＳｐ３５活性の拮抗剤である。特定の実施形態においては、例えばニューロン上に発現された状態のＳｐ３５への拮抗剤Ｓｐ３５抗体の結合は、ミエリン関連神経突起伸長抑制又はニューロン細胞死をブロックする。別の実施形態においては、稀突起神経膠細胞上に発現された状態のＳｐ３５へのＳｐ３５抗体の結合は稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制をブロックするか、ＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全をブロックする。
特段の記載が無い限り、本明細書においては、抗体に言及する場合の「そのフラグメント」とは抗原結合フラグメント、即ち抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。１つの実施形態において、Ｓｐ３５抗体、例えば本発明の抗体は二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体、例えば二重特異性抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、又は１つより多いエピトープ、例えば１つより多い抗原又は同じ抗原上の１つより多いエピトープに対する結合特異性を有する融合蛋白である。１つの実施形態において、二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体は本明細書に開示した標的ポリペプチド、例えばＳｐ３５の上のエピトープの少なくとも１つに対して特異的な結合ドメインの少なくとも１つを有する。別の実施形態においては、二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体は、標的ポリペプチド上のエピトープに対して特異的な結合ドメインの少なくとも１つ、及び薬品又は毒素に対して特異的な標的結合ドメインの少なくとも１つを有する。更に別の実施形態においては、二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体は、本明細書に開示した標的ポリペプチド上のエピトープに対して特異的な結合ドメインの少なくとも１つ、及びプロドラッグに対して特異的な結合ドメインの少なくとも１つを有する。二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体は、本明細書に開示した標的ポリペプチドのエピトープに対して特異的な標的結合ドメイン２つ及び第２の標的に対して特異的な標的結合ドメイン２つを有する４価の抗体であってよい。即ち、４価の二重特異性Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、又は抗体は、各特異性に関して２価であってよい。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、当業者に知られる通りエフェクター機能の１つ以上を媒介する定常領域を含むことができる。例えば抗体定常領域への補体のＣ１成分の結合は補体系を活性化させる場合がある。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン作用及び溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症応答を刺激し、そして自己免疫性過敏症にも関与している場合がある。更に又、抗体はＦｃ領域を介して種々の細胞の上の受容体に結合し、その場合、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュウ受容体）を含む抗体の異なるクラスに特異的なＦｃ受容体の多くが存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は多くの重要で多様な生物学的応答、例えば抗体コーティング粒子の取り込み及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、即ちＡＤＣＣと称する）、炎症メディエーターの放出、胎盤移行、及び免疫グロブリン生産の制御をトリガーする。
したがって、本発明の特定の実施形態は定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも画分が欠失、又は別様に改変されることにより所望の生化学的特性、例えば、概ね同じ免疫原性を有する全体の未改変の抗体と比較して、低減したエフェクター機能、非共有結合的に２量化する能力、腫瘍部位に局在化する増大した能力、低減した血清中半減期又は増大した血清中半減期が与えられているＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。例えば本明細書に記載した診断および治療の方法において使用するための特定の抗体は免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、重鎖ドメインの１つ以上の少なくとも一部分を欠いているドメイン欠失抗体である。例えば特定の抗体において、修飾された抗体の定常領域の１つの完全なドメインが欠失することになり、例えばＣＨ２ドメインの全て又は部分が欠失することになる。
本明細書に記載した特定のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体においては、Ｆｃ部分は当該分野で知られた手法を用いてエフェクター機能を低下させるように突然変異されてよい。例えば定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点突然変異又は他の手段による）は循環系中の修飾された抗体のＦｃ受容体結合を低減し、これにより腫瘍の局在化を増大させる場合がある。別の場合においては本発明と矛盾しない定常領域修飾は補体結合を和らげ、そしてこれにより血清中半減期およびコンジュゲート細胞毒素の非特異的会合を低減する場合がある。定常領域の更に別の修飾は、増大した抗原特異性又は抗体可撓性による増強された局在化を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を修飾するために使用してよい。結果として生じる生理学的プロファイル、生体利用性、及び修飾の他の生化学的作用、例えば腫瘍局在化、生体分布および血清中半減期は予定外の実験を行うことなくよく知られた免疫学的手法を用いて容易に計測及び定量してよい。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の修飾された形態は当該分野で知られた手法を用いて完全な前駆体又は親抗体から作成できる。例示される手法は本明細書においてより詳細に考察する。
特定の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の可変及び定常領域の両方が完全ヒト型である。完全ヒト型抗体は当該分野で知られた、そして本明細書に記載した手法を用いて作成できる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト型抗体は抗原攻撃に応答してそのような抗体を生産するように変更されているが、その内因性の遺伝子座は無能力化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより製造できる。そのような抗体を作製するために使用数することができる例示される手法は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，１５０，５８４；６，４５８，５９２；６，４２０，１４０に記載されている。他の手法は当技術分野で公知である。完全ヒト型抗体は同様に、種々のディスプレイ技術、例えば本明細書において別途詳述する通り、ファージディスプレイ又は他のウイルスディスプレイ系により製造できる。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は当該分野で知られた手法を用いながら作成又は製造することができる。特定の実施形態においては、抗体分子又はそのフラグメントは「組み換え製造」され、即ち、組み換えＤＮＡ技術を用いて製造される。抗体分子又はそのフラグメントを作成するための例示される手法は本明細書において別途詳述する。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、例えば抗体がその同族エピトープに特異的に結合することを共有結合が防止しないように抗体に分子の何れかの型を共有結合させることにより修飾された誘導体を包含する。例えば、限定しないが、抗体誘導体は例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解的切断、細胞リガンド又は他の蛋白への連結により修飾されている抗体を包含する。任意の多くの化学的修飾が、知られた手法、例えば限定しないが特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により実施されてよい。更に又、誘導体は非古典的アミノ酸の１つ以上を含有してよい。
特定の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は治療すべき動物において、例えばヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しない。１つの実施形態において、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は当該分野で知られた手法を用いてその免疫原性が低減されるように修飾される。例えば、抗体はヒト化、霊長類化、脱免疫化されることができ、又はキメラ抗体を作成できる。これらの型の抗体は親抗体の抗原結合特性を保持又は実質的に保持しているが、ヒトにおいてはより低い免疫原性である、非ヒト抗体、典型的にはネズミ又は霊長類の抗体から誘導する。これは種々の方法、例えば（ａ）完全な非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上にグラフトすることによりキメラ抗体を形成すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上の少なくとも一部分をヒトフレームワーク及び重要なフレームワーク残基を有するか有さない定常領域内にグラフトすること；又は（ｃ）完全な非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基を置き換えることによりヒト様のセクションでそれらを「被覆」すること、により達成してよい。そのような方法は全て参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）及び米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２及び６，１９０，３７０に記載されている。
脱免疫化は又抗体の免疫原性を低下させるために使用できる。本明細書においては、「脱免疫化」という用語はＴ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を包含する（例えばＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照できる）。例えば、原料抗体由来のＶＨ及びＶＬ配列を分析し、そして配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び他の重要な残基との関連においてエピトープの位置を示す各Ｖ領域からヒトＴ細胞エピトープを「マッピング」する。Ｔ細胞エピトープマップ由来の個々のＴ細胞エピトープを分析することにより最終抗体の活性を改変する危険性を低くしながら、代替となるアミノ酸置換を発見する。代替のＶＨ及びＶＬ配列の範囲はアミノ酸の置換の組み合わせを含むように設計され、そしてこれらの配列はその後、本明細書に開示する診断および治療の方法において使用するためにある範囲の結合ポリペプチド、例えばＳｐ３５特異的抗体又はその免疫特異的フラグメント内に組み込まれ、次にこれを機能に関して試験する。典型的には、１２〜２４改変体抗体を形成して試験する。次に修飾されたＶ及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現ベクター内にクローニングし、そしてその後のプラスミドを全体の抗体の製造のために細胞系内に導入する。次に適切な生化学的及び生物学的試験において抗体を比較し、そして最適な改変体を発見する。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は当該分野で知られた何れかの適当な方法により形成してよい。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は当該分野で良く知られている種々の操作法により製造できる。例えば、Ｓｐ３５抗体、例えば結合ポリペプチド、例えばＳｐ３５特異的抗体又はその免疫特異的フラグメントを種々の宿主動物、例えば限定しないがウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバ等に投与することにより抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導することができる。宿主の種に応じて種々のアジュバントを使用することにより免疫学的応答を増大させてよく、そして例えば限定しないが、フロインド（完全及び不完全）、無機質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油脂エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（桿菌カルメット−ゲラン）及びコリネバクテリウム・パルバムを包含する。このようなアジュバントも又当該分野で良く知られている。
モノクローナル抗体は広範な種類の当該分野で知られた手法、例えばハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組み合わせを用いながら製造できる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で知られており、そして例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に記載されているものを包含するハイブリドーマ手法を用いて製造できる（当該参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、ハイブリドーマ技術を介して製造された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語はそれが製造された方法ではなく、単一のクローン、例えば何れかの真核生物、原核生物、又はファージクローンから誘導された抗体を指す。即ち、「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術を介して製造された抗体に限定されない。モノクローナル抗体はエピトープ認識の領域を増大させるためにＳｐ３５ノックアウトマウスを用いて製造できる。モノクローナル抗体は広範な種類の当該分野で知られた手法、例えば本明細書に別途記載する通り、ハイブリドーマ及び組み換え及びファージディスプレイ技術を用いて製造できる。
当該分野で知られたプロトコルを用いながら、１つの例においては、抗体は哺乳類において該当する抗原（例えば精製された腫瘍関連抗原、例えばＳｐ３５又はそのような抗原を含む細胞又は細胞抽出物）及びアジュバントの複数回の皮下又は腹腔内注射により発生させる。この免疫化は典型的には活性化された脾細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体の生産を含む免疫応答を誘発する。結果として生じる抗体を動物の血清から採取してポリクローナル調製品としてよいが、頻繁には脾臓、リンパ節又は末梢血液から個々のリンパ球を単離することによりモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調製品とすることが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得る。
このよく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））においては、抗原を注射したある哺乳類に由来する比較的短命の、又は致死性のリンパ球を不朽化腫瘍細胞系（例えば骨髄腫細胞系）と融合し、これにより雑種細胞、即ち「ハイブリドーマ」を作成し、これは不朽化されており、かつＢ細胞の遺伝子的にコーディングされた抗体を生産することができる。結果として生じた雑種は選択、希釈、及び、各々個々の株が単一の抗体の形成のために特定の遺伝子を含むようにしながら再成長させることにより単一の遺伝子的な株に分離される。それらは所望の抗原に対して均質である抗体を生産し、そしてそれらの純粋な遺伝子的出所に関して、「モノクローナル」と称される。
このように製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を抑制する物質１つ以上を含有する適当な培地中に播種して生育させる。当業者の知る通り、ハイブリドーマの形成、選択及び成長のための試薬、細胞系及び培地は多くの入手元から市販されており、標準化されたプロトコルが十分確立されている。一般的に、ハイブリドーマ細胞を成長させる培地は所望の抗原に対するモノクローナル抗体の製造に関して試験される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性はインビトロの試験法、例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により測定される。所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が発見された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、そして標準的方法により成長させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ ５９−１０３（１９８６））。更に当然ながらサブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、従来の精製操作法、例えばプロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより培地、腹水液、又は血清から分離してよい。
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは知られた手法により形成してよい。例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントはパパイン（Ｆａｂフラグメント製造のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント製造のため）のような酵素を用いながら免疫グロブリン分子の蛋白分解的切断により製造してよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
やはり当業者の知る通り、抗体又は抗体フラグメント（例えば抗原結合部位）をコードするＤＮＡは抗体ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリから誘導してもよい。特にそのようなファージはレパートリー又はコンビナトリアルな抗体ライブラリ（例えばヒト又はネズミ）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために利用できる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識された抗原、又は固体表面又はビーズに結合又はキャプチャーされた抗原を用いながら、抗原により選択又は識別することができる。これらの方法において使用されるファージは典型的にはＦａｂ、ＦｖＯＥＤＡＢ（軽鎖又は重鎖由来の個々のＦｖ領域）又はファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白の何れかに組み換え融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含むフィラメント性のファージである。例示される方法は例えば各々が参照により本明細書に組み込まれるＥＰ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許５，９６９，１０８，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されている。幾つかの公開物（例えばＭａｒｋｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））は鎖シャフリング並びに大型ファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボの組み換えによる高親和性ヒト抗体の製造を記載している。別の実施形態においては、リボソームディスプレイを用いることによりディスプレイプラットホームとしてのバクテリオファージを置き換えることができる（例えばＨａｎｅｓ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１）参照）。更に別の実施形態においては、細胞表面ライブラリを抗体に関してスクリーニングできる（Ｂｏｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。そのような操作法はモノクローナル抗体の単離及びその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ手法の代替を与える。
ファージディスプレイ法においては、機能的抗体ドメインが自身をコードするポリヌクレオチド配列を担持しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。例えばＶＨ及びＶＬ領域をコードしているＤＮＡ配列を動物のｃＤＮＡライブラリ（例えばヒト又はネズミのリンパ様組織のｃＤＮＡライブラリ）又は合成ｃＤＮＡライブラリから増幅させる。特定の実施形態においては、ＶＨ及びＶＬ領域をコードしているＤＮＡをＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーにより連結し、ファージミドベクター内にクローニングする（例えばｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）。ベクターをＥ・コリでエレクトロポレーションに付し、そしてＥ・コリをヘルパーファージにより感染させる。これらの方法において使用されるファージは典型的にはｆｄ及びＭ１３を包含するフィラメント性ファージであり、そしてＶＨ及びＶＬ領域は通常はファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組み換え融合される。目的の抗原（すなわちＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識された抗原、又は固体表面又はビーズに結合又はキャプチャーされた抗原を用いながら、抗原により選択又は識別することができる。
抗体を作成するために使用できるファージディスプレイ法の別の例は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｋｍａｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ等、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３および５，９６９，１０８に開示されているものを包含する。
上記参考文献に記載されているとおり、ファージ選択の後、ファージ由来の抗体コーディング領域を単離してヒト抗体を包含する完全な抗体、又は何れかの他の所望の抗原結合フラグメントを作成するために使用し、そして哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を包含する何れかの所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換え製造するための手法もまたＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉ等、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されているもののような当該分野で知られた方法を用いながら使用することができる（該参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
単鎖Ｆｖ及び抗体を製造するために使用できる手法の例は米国特許４，９４６，７７８および５，２５８，４９８；Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ等、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されているものを包含する。ヒトにおける抗体のインビボの使用及びインビトロの検出試験を包含する一部の使用のためには、キメラ、ヒト化、又はヒト型の抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は抗体の異なる部分が異なる動物種から誘導された分子であり、例えばネズミモノクローナル抗体から誘導された可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体があげられる。キメラ抗体を製造するための方法は当該分野で知られている。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；及び４，８１６３９７を参照できる。ヒト化抗体は非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種の抗体から誘導された抗体分子である。頻繁にはヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は抗原結合を改変、好ましくは向上させるためにＣＤＲドナー抗体に由来する相当する残基で置換されることになる。これらのフレームワーク置換は当該分野で良く知られている方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を発見するためにＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定の位置における通常ではないフレームワーク残基を発見するための配列比較により、発見される。（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎ等、米国特許５，５８５，０８９；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）を参照できる）。抗体は当該分野で知られた種々の手法、例えばＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；及び５，５８５，０８９）、ベニヤリング又はリサーフィシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ等、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、及び鎖シャフリング（米国特許５，５６５，３３２，参照により全体が本明細書に組み込まれる）を用いながらヒト化できる。
完全ヒト型の抗体はヒト患者の治療的治療のために特に望ましい。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列から誘導した抗体ライブラリを用いながら本明細書に記載したファージディスプレイ法を包含する種々の当該分野で知られた方法により作成できる。更に又、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許４，４４４，８８７及び４，７１６，１１１；及びＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５，ＷＯ９８／５０４３３，ＷＯ９８／２４８９３，ＷＯ９８／１６６５４，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１も参照できる。
ヒト抗体は又、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて製造できる。例えばヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子の複合体を無作為に、又は相同組み換えにより、マウス胚性幹細胞に導入してよい。或いはヒト可変領域、定常領域、及び多様性の領域をヒト重鎖及び軽鎖遺伝子の外にマウス胚性幹細胞内に導入してよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は相同組み換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個又は同時に非機能性としてよい。特にＪＨ領域のホモ接合の欠失は内因性抗体生産を防止する。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクションすることによりキメラマウスを作成する。次にキメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合の子孫を得る。トランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全体又は一部分で通常の態様において免疫化する。抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技術を用いながら免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスにより保有されているヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞の分化の間に再配列し、そしてその後クラス切り替え及び体細胞突然変異を起こす。即ち、そのような手法を用いながら治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の概要に関してはＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照できる。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術の詳細な考察、及びそのような抗体を製造するためのプロトコルに関しては、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許５，４１３，９２３；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，５６９，８２５；５，６６１，０１６；５，５４５，８０６；５，８１４，３１８；及び５，９３９，５９８を参照できる。更に又、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．） 及びＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）のような企業が上記したものと同様の技術を用いながら選択された抗原に対して指向されたヒト抗体を提供することに従事することができる。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト型の抗体は「ガイデッド選択」と称される手法を用いて形成できる。この方策においては、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いることにより同じエピトープを認識する完全ヒト型の抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８）。同様に米国特許５，５６５，３３２も参照でき、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
更に又、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体は、同様に、当該分野で良く知られている手法を用いながら標的ポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプの抗体を形成するために利用できる。（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９） ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）参照）。例えば結合してポリペプチドの多量体化及び／又は本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に抑制する抗体は、ポリペプチドの多量体化及び／又は結合ドメインを「模倣し」、そしてその結果、ポリペプチド及び／又はそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプを形成するために使用することができる。そのような中和抗イディオタイプ又はそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントはペプチドリガンドを中和するために治療計画において使用できる。例えばそのような抗イディオタイプ抗体は所望の標的ポリペプチドに結合、及び／又は、そのリガンド／受容体に結合し、これによりその生物学的活性をブロックするために使用できる。
別の実施形態においては、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離して配列決定してよい。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として使用できる。単離された後、ＤＮＡを発現ベクター内に入れ、次にこれを原核生物又は真核生物の宿主細胞、例えばＥ・コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は別様に免疫グロブリンを生産しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトする。とりわけ、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載した通り合成であってよい）は、参照により本明細書に組み込まれる１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎ等の米国特許５，６５８，５７０に記載の通り製品抗体に関して定常及び可変領域の配列をクローニングするために使用してよい。本質的には、これには選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及びＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅をおこなう。この目的のための適当なプライマーは又、米国特許５，６５８，５７０に記載されている。後述においてより詳細に考察するとおり、所望の抗体を発現する形質転換された細胞を比較的大量に成長させることにより免疫グロブリンの臨床用及び商業用の供給量としてよい。
１つの実施形態において、本明細書のＳｐ３５抗体は抗体分子の少なくとも１つ重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含む。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも２つを含む。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも３つを含む。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも４つを含む。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも５つを含む。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも６つを含む。主題のＳｐ３５抗体に包含されることができるＣＤＲ少なくとも１つを含む例示される抗体分子は本明細書に記載する通りである。
特定の実施形態においては、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は当該分野で良く知られている方法により、例えば超可変領域の配列を決定するために他の重鎖及び軽鎖の可変領域の既知アミノ酸配列への比較により、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を発見するために検査してよい。定型的な組み換えＤＮＡ手法を用いながら、ＣＤＲ１つ以上をフレームワーク領域内に、例えばヒトフレームワーク領域内に挿入することにより、非ヒト抗体をヒト化してよい。フレームワーク領域は天然に存在する、又はコンセンサスのフレームワーク領域、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であってよい（例えばヒトフレームワーク領域のリストはＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照できる）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせにより形成されたポリヌクレオチドは所望のポリペプチド、例えばＳｐ３５のエピトープの少なくとも１つに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、アミノ酸置換１つ以上をフレームワーク領域内で起こしてよく、そして好ましくはアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を向上させる。更に又、そのような方法は鎖内ジスルフィド結合１つ以上を欠いた抗体分子を形成するために鎖内ジスルフィド結合に参加している１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を起こすために使用してよい。ポリヌクレオチドへの他の改変は本発明に包含され、そして当該分野の範囲内である。
更に又、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子とスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の製造のために開発された手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））も使用できる。本明細書においては、キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種から誘導されている分子、例えばネズミモノクローナル抗体から誘導された可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
或いは、単鎖抗体の製造に関して記載されている手法（米国特許４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；及びＷａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５５４（１９８９））を採用することにより単鎖抗体を製造できる。単鎖抗体はアミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖のフラグメントを連結して単鎖抗体とすることにより形成される。Ｅ・コリ内の機能的Ｆｖフラグメントの組み立てのための手法もまた使用してよい（Ｓｋｅｒｒａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
本発明の更に別の実施形態は内因性免疫グロブリン生産が不可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるヒト型又は実質的にヒト型の抗体の形成を含む（各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，０７５，１８１，５，９３９，５９８，５，５９１，６６９及び５，５８９，３６９参照）。例えばキメラ及び生殖細胞系の突然改変体マウスにおける抗体重鎖連結領域のホモ接合欠失は内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが報告されている。そのような生殖細胞系突然改変体マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は抗原攻撃時のヒト抗体の生産をもたらすことになる。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を形成する別の好ましい手段は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，８１１，５２４に開示されている。当然ながら、これらのヒト抗体に関連する遺伝子物質も又、本明細書に記載する通り単離し、調整してよい。
組み換え抗体を形成するための更に別の高度に効率的な手段はＮｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。特に、この手法はサル可変ドメイン及びヒト定常配列を含有する霊長類化された抗体の形成をもたらす。この参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に又、この手法は共通譲渡された米国特許５，６５８，５７０，５，６９３，７８０及び５，７５６，０９６にも記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態においては、リンパ球はマイクロマニピュレーションにより選択し、そして可変遺伝子を単離することができる。例えば末梢血液単核細胞を免疫化された哺乳類から単離し、そして約７日間インビトロで培養することができる。培養物をスクリーニング基準に合致する特異的ＩｇＧに関してスクリーニングできる。陽性ウェル由来の細胞を単離できる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳにより、又は、それらを補体媒介溶血プラーク試験において識別することにより、単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を試験管内にマイクロマニピュレーションすることができ、そして例えばＲＴ−ＰＣＲを用いながらＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅できる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は抗体発現ベクター内にクローニングでき、そして発現のために細胞（例えば真核生物又は原核生物の細胞）内にトランスフェクトする。
或いは、当業者に良く知られている手法を用いながら抗体産生細胞系を選択して培養してよい。そのような手法は種々の実験マニュアル及び主要な出版物に記載されている。この点に関し、後述する通り本発明における使用に適する手法は、補遺も含めて参照により全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ等、Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
本明細書に開示する診断及び治療の方法において使用するための抗体は、抗体の合成に関する当該分野で知られた何れかの方法により、特に、化学合成により、又は好ましくは本明細書に記載した組み換え発現手法により製造できる。
１つの実施形態において、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はドメインの１つ以上が部分的又は完全に欠失している合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態においては、適合する修飾された抗体はＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失コンストラクト又は改変体を含む（ΔＣＨ２コンストラクト）。他の実施形態においては、短い連結ペプチドが欠失ドメインを置換することにより可変領域に対する可撓性及び移動自由度を与えてよい。当業者により知られる通り、そのようなコンストラクトは抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために特に好ましい。ドメイン欠失コンストラクトはＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えばＢｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄより入手）を用いて誘導できる（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０６０９５５Ａ２及び ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照できる）。この例示されるベクターはＣＨ２ドメインを欠失し、そしてドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを与えるように操作された。
特定の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はミニボディーである。ミニボディーは当該分野で知られた方法を用いて作成できる（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，８３７，８２１ 又はＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照できる）。
１つの実施形態において、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、それが単量体サブユニットの間の会合を可能にする限り、数個又は単一のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えばＣＨ２ドメインの選択された区域の単一のアミノ酸の突然変異はＦｃ結合を実質的に低減し、そしてこれにより腫瘍局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、モジュレートすべきエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する定常領域ドメインの１つ以上のその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的な欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能は未損傷のまま残存させつつ、抗体の選択された特性（血清中半減期）を向上させる場合がある。更に又、上記した通り、開示した抗体の定常領域は結果として生じるコンストラクトのプロファイルを増強するアミノ酸の１つ以上の突然変異又は置換を介して合成してよい。この点に関し、修飾された抗体の配置及び免疫原性のプロファイルを実質的に維持しつつ、保存された結合部位（例えばＦｃ結合）により与えられる活性を途絶することが可能である場合がある。更に別の実施形態はエフェクター機能のような所望の特性を増強するか、より多くの細胞毒素又は炭水化物の結合を可能にするための定常領域へのアミノ酸の１つ以上の付加を含む。そのような実施形態において選択された定常領域ドメインから誘導された特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
本発明は又、本明細書に記載した抗体分子（例えばＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の改変体（誘導体を包含する）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体を提供し、この場合その抗体又はそのフラグメントはＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は改変体に免疫特異的に結合する。当業者に知られた標準的な手法を用いてＳｐ３５抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入でき、例えば限定しないがアミノ酸置換をもたらす部位指向性突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発が挙げられる。好ましくは、改変体（誘導体を包含する）はレファレンスのＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、又はＶＬＣＤＲ３と相対比較して、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、又は２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的なアミノ酸置換」はアミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基でおきかえられるものである。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で知られている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性の側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。或いは突然変異は例えば飽和突然変異誘発によりコーディング配列の全て又は部分に沿ってランダムに導入することができ、そして得られた突然改変体を生物学的活性に関してスクリーニングすることにより活性（例えばＳｐ３５ポリペプチドに結合する能力）を保持している突然改変体を発見することができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域においてのみ、又はＣＤＲ領域においてのみ、突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異はサイレント又はニュートラルのミスセンス突然変異であってよく、即ち、抗原に結合する抗体の能力に対する作用を全く、又はほとんど有さなくてよい。このような型の突然変異はコドンの使用を最適化するため、又はハイブリドーマの抗体生産を向上させるために有用である場合がある。或いは、非ニュートラルのミスセンス突然変異が抗原に結合する抗体の能力を改変する場合がある。最もサイレント及びニュートラルなミスセンス突然変異の位置はフレームワーク領域内にある可能性が高いのに対し、最も非ニュートラルなミスセンス突然変異の位置はＣＤＲ内にある可能性が高いが、これが絶対的要件ではない。当業者であれば、抗原結合活性の改変又は結合活性の改変が無いことのような、所望の特性を有する突然改変体分子を設計して試験することができる（例えば抗原結合活性の向上、又は抗体特異性の変化）。突然変異誘発の後、コードされた蛋白を定型的に発現させてよく、そして、コードされた蛋白の機能的及び／又は生物学的活性（例えばＳｐ３５ポリペプチドのエピトープの少なくとも１つに免疫特異的に結合する能力）を本明細書に記載した手法を用いて、又は当該分野で公知の定型的に変更されている手法により、測定することができる。
ＩＶ．Ｓｐ３５抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は又、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードする核酸分子を提供する。
１つの実施形態において、本発明は免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。或いは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。即ち、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表４に示すポリペプチド配列に関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
特定の実施形態においてはポリヌクレオチドによりコードされているＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表４に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群に同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
本発明の別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域がハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴において、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表４に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
本発明の別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明は、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つが本明細書に開示するモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。或いは、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は本明細書に開示するモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一である。即ち、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は表５に示すポリペプチド配列に関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
特定の実施形態においてはポリヌクレオチドによりコードされているＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
本発明の別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域がハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドのＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドのＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態においては、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群に同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の特徴において、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列に同一であるヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
本発明の別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド、又はハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明は表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６よりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の特徴において、本発明は表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明は配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６よりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の特徴において、本発明は配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４及び４１６よりなる群から選択される本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
本発明の別の実施形態においては、本発明は、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、およびハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖ポリペプチドよりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、（２０１’）３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及び３Ｂ５．２よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明は、以下に示す配列番号４２０のポリヌクレオチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である重鎖をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる免疫グロブリン重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされる重鎖を含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５又はモノクローナル抗体３Ｂ５．２と同じエピトープに特異的又は優先的に結合する。
ヒトネズミキメラモノクローナル抗体３Ｂ５.２に関する免疫グロブリン重鎖ポリヌク
レオチド配列：
別の実施形態においては、本発明は重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここでポリヌクレオチドは表７に示す配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８、３８２及び４２２よりなる群から選択されるＶＨ核酸配列を含む。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明は表７の配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８、３８２及び４２２よりなる群から選択されるレファレンス核酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＨコード核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合するＶＨポリペプチドをコードする。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、（２０１’）３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＨを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチド、およびハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドよりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。
その他の実施形態において、本発明は表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３，３７７、３８１、３８５及び４１７よりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の特徴において、本発明は表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３，３７７、３８１、３８５及び４１７よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明は表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３，３７７、３８１、３８５及び４１７よりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の特徴において、本発明は配列番号２７３〜２８６、３７３，３７７、３８１、３８５及び４１７よりなる群から選択される、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明は、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、およびハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドよりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、、本発明は免疫グロブリン軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここでポリヌクレオチドは、以下に示す配列番号４２１のポリヌクレオチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である軽鎖をコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖を含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５および又はモノクローナル抗体３Ｂ５．２と同じエピトープに特異的又は優先的に結合する。
ネズミ及びヒトキメラ抗体３Ｂ５.２に関する免疫グロブリン軽鎖ポリヌクレオチド配
列：
別の実施形態においては、本発明は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここでポリヌクレオチドは表９の配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９、３８３及び４２３よりなる群から選択されるＶＬ核酸配列を含む。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明は表９の配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９、３８３及び４２３よりなる群から選択されるＶＬポリヌクレオチドに少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合するＶＬポリペプチドをコードする。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したポリヌクレオチドの１つ以上によりコードされるＶＬを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチド、およびハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチドよりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。
上記したポリヌクレオチドの何れかは更に、例えばコードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナルペプチド、本明細書に記載した抗体定常領域、又は本明細書に記載した他の異種ポリペプチドをコードする追加的な核酸を包含してよい。
更に又、本明細書に別途詳述する通り、本発明は上記したポリヌクレオチド１つ以上を含むポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。１つの実施形態において、本発明は第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む組成物を包含し、ここで該第１のポリヌクレオチドは本明細書に記載したＶＨポリペプチドをコードし、そしてここで該第２のポリヌクレオチドは本明細書に記載したＶＬポリペプチドをコードする。特記すれば、表７に示すＶＨポリヌクレオチド、及び表９に示すＶＬポリヌクレオチドを含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる組成物が挙げられ、ここで、該ＶＨポリヌクレオチド及び該ＶＬポリヌクレオチドは下記：
ｉ）配列番号１７３及び配列番号１８５；
ｉｉ）配列番号１７４及び配列番号１８６；
ｉｉｉ）配列番号１７５及び配列番号１８７；
ｉｖ）配列番号１７６及び配列番号１８８；
ｖ）配列番号１７８及び配列番号１８９；
ｖｉ）配列番号１７９及び配列番号１９０；
ｖｉｉ）配列番号１８０及び配列番号１９１；
ｖｉｉｉ）配列番号１８１及び配列番号１９２；
ｉｘ）配列番号１８２及び配列番号１９３；
ｘ）配列番号１８３及び配列番号１９４；
ｘｉ）配列番号３７０及び配列番号３７１；
ｘｉｉ）配列番号３７４及び配列番号３７５；
ｘｉｉｉ）配列番号３７８及び配列番号３７９；
ｘｉｖ）配列番号３８２及び配列番号３８５；
ｘｖ）配列番号４２２及び配列番号４２３；
ｘｖｉ）配列番号４４８及び配列番号４４９；及び
ｘｖｉｉ）配列番号４５０及び配列番号４４９；
よりなる群から選択される。
本発明は又、本明細書に別途記載する本発明のポリヌクレオチドのフラグメントを包含する。本明細書に記載した融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、及び他の誘導体をコードする別のポリヌクレオチドも本発明は意図している。
ポリヌクレオチドは当該分野で知られた何れかの方法により製造又は製作してよい。例えば抗体のヌクレオチド配列が既知である場合は、抗体をコードするポリヌクレオチドは化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立ててよく（例えばＫｕｔｍｅｉｅｒ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２（１９９４）に記載の通り）、これにおいては、慨すれば、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップしたオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、及び、次いでＰＣＲによるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅が含まれる。
或いは、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは適当な原料に由来する核酸から形成してよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合は、抗体をコードする核酸は化学合成するか、又は適当な原料（例えば抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は抗体又は他のｓＰ３５抗体を発現している何れかの組織又は細胞、例えば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から形成したｃＤＮＡライブラリ、又はそれから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、又は、例えば抗体又は他のＳｐ３５抗体をコードするｃＤＮＡライブラリに由来するｃＤＮＡを発見するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより、得てよい。ＰＣＲにより形成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で良く知られている方法の何れかを用いながら複製可能なクローニングベクター内にクローニングしてよい。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体のヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸配列が測定されたのち、そのヌクレオチド配列はヌクレオチド配列の調整のための当該分野で良く知られている方法、例えば組み換えＤＮＡ手法、部位指向性突然変異誘発、ＰＣＲ等を用いて調整（例えば共に参照により全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ等編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載されている方法を参照）することにより、異なるアミノ酸配列を有する抗体を形成、例えばアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせてよい。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは何れかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドからなることができ、これは未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。例えばＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、及び１本鎖及び２本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖、又はより典型的には２本鎖又は１本鎖及び２本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含む雑種分子よりなることができる。更に又、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む３本鎖領域よりなることができる。Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは又、１つ以上の修飾された塩基、又は安定性のため、又は他の理由のやめに修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡの骨格を含んでよい。「修飾された」塩基とは、例えばトリチル化された塩基及び通常ではない塩基、例えばイノシンを包含する。種々の修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができ；即ち、「ポリヌクレオチド」とは化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を包含する。
免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖部分又は軽鎖部分）の非天然の改変体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされた蛋白内にアミノ酸置換、付加又は欠失１つ以上が導入されるように免疫グロブリンのヌクレオチド配列内にヌクレオチド置換、付加又は欠失１つ以上を導入することにより生じさせることができる。突然変異は標準的な手法、例えば部位指向性突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入してよい。好ましくは、保存的アミノ酸置換を非必須アミノ酸残基１つ以上において行う。
Ｖ．Ｓｐ３５抗体ポリペプチド
本発明は更にＳｐ３５抗体、その抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を構成する単離されたポリペプチドに関する。本発明のＳｐ３５抗体は免疫グロブリン分子から誘導されたＳｐ３５特異的抗原結合領域をコードするポリペプチド、例えばアミノ酸配列を含む。指定の蛋白「から誘導された」ポリペプチド又はアミノ酸配列はポリペプチドの起源に関係する。特定の場合において、特定の原料ポリペプチド又はアミノ酸配列から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸配列は、原料配列のものと本質的に同一のアミノ酸配列又はその一部分を有し、この場合、その一部分は少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸、又は、別様に原料配列にその起源を有するものとして当業者が識別可能なものよりなる。
１つの実施形態において、本発明は免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。或いは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。即ち、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、上記表４に示す群に関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。特定の実施形態においては、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表４に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態においては、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、及びハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列よりなる群から選択されるレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
その他の実施形態において、本発明は表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４、４１６及び４３３及び配列番号４３５よりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の特徴において、本発明は表６に示す配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、３８４、４１６及び４３３及び配列番号４３５よりなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン重鎖、及びハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン重鎖よりなる群から選択されるレファレンスＶＨポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。
特定の実施形態においては、上記したＶＨポリペプチド１つ以上を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したＶＨポリペプチド１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態において、本発明は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。或いは、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は本明細書に開示したモノクローナルＳｐ３５抗体に由来するレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。即ち、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、上記表５に示すポリペプチドに関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。特定の実施形態においては、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の実施形態においては、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域が表５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態においては、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、及びハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列よりなる群から選択されるレファレンス軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
その他の実施形態において、本発明は表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１、３８５、４１７及び４３４よりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＶＬポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
別の特徴において、本発明は表８に示す配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１、３８５、４１７及び４３４よりなる群から選択されるＶＬポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合フラグメントはＳｐ３５に特異的又は優先的に結合する。
その他の実施形態において、本発明はハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬ、及びハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産される免疫グロブリン軽鎖のＶＬよりなる群から選択されるレファレンスＶＬポリペプチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＬポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる単離されたポリペプチドを包含する。
特定の実施形態においては、上記したＶＬポリペプチド１つ以上を含むか、本質的にこれよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、１Ａ７、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、３Ｂ５．２及びＬｉ８１よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的又は優先的に結合するか、又はそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合することを競合的に抑制する。
特定の実施形態においては、上記したＶＬポリペプチド１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる抗体又はその抗原結合フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的又は優先的に結合する。
他の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは下記：
ｉ）配列番号１７０及び配列番号２８３；
ｉｉ）配列番号１７１及び配列番号２８４；
ｉｉｉ）配列番号１７２及び配列番号２８５；
ｉｖ）配列番号１７２及び配列番号２８６；
ｖ）配列番号１５８及び配列番号２７３；
ｖｉ）配列番号１５９及び配列番号２７４；
ｖｉｉ）配列番号１６０及び配列番号２７５；
ｖｉｉｉ）配列番号１６１及び配列番号２７６；
ｉｘ）配列番号１６３及び配列番号２７７；
ｘ）配列番号１６４及び配列番号２７８；
ｘｉ）配列番号１６５及び配列番号２７９；
ｘｉｉ）配列番号１６６及び配列番号２８０；
ｘｉｉｉ）配列番号１６７及び配列番号２８１；
ｘｉｖ）配列番号１６８及び配列番号２８２；
ｘｖ）配列番号３７２及び配列番号３７３；
ｘｖｉ）配列番号３７６及び配列番号３７７；
ｘｖｉｉ）配列番号３８０及び配列番号３８１；
ｘｖｉｉｉ）配列番号３８４及び配列番号３８５；
ｘｉｘ）配列番号４１６及び配列番号４１７；
ｘｘ）配列番号４３３及び配列番号４３４；
ｘｘｉ）配列番号４３５及び配列番号４３４；
よりなる群から選択される、表６に示すＶＨポリペプチド、及び表８に示すＶＬポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。
他の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０６）により生産されるＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチド、及びハイブリドーマ７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９（ＡＴＣＣ寄託標記ＰＴＡ−８１０７）により生産されるＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドよりなる群から選択されるＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。
上記したポリペプチドの何れかは更に、追加的なポリペプチド、例えばコードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナルペプチド、本明細書に記載した抗体定常領域、又は本明細書に記載した他の異種ポリペプチドを包含してよい。更に又、本発明のポリペプチドは本明細書に別途記載するポリペプチドフラグメントを包含する。本発明の追加的なポリペプチドは融合ポリペプチド、Ｆａｂフラグメント、及び本明細書に記載する他の誘導体を包含する。
更に又、本明細書に別途より詳細に記載する通り、本発明は上記したポリペプチドを含む組成物を包含する。
当業者の理解する通り、本明細書に開示したＳｐ３５抗体ポリペプチドはそれらの誘導元である天然に存在する結合ポリペプチドからアミノ酸配列において変動するほうに修飾してよい。例えば指定された蛋白から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸の配列は、原料配列に対して、同様であってよく、例えば特定のパーセントの同一性を有してよく、例えばそれは原料配列に６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であってよい。
更に又、保存的置換又は「非必須」アミノ酸領域における変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行ってよい。例えば指定の蛋白から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸の配列は１つ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又はそれより多い個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除き、原料配列と同一であってよい。特定の実施形態においては、指定の蛋白から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸の配列は原料配列と相対比較して１〜５、１〜１０、１〜１５、又は１〜２０の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する。
本発明の特定のＳｐ３５抗体ポリペプチドはヒトアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。しかしながら、特定のＳｐ３５抗体ポリペプチドは別の哺乳類種から誘導した隣接アミノ酸の１つ以上を含む。例えば、本発明のＳｐ３５抗体は霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、又は抗原結合領域を包含してよい。別の例においては、ネズミ由来アミノ酸の１つ以上が非ネズミ抗体ポリペプチド内に、例えばＳｐ３５抗体の抗原結合部位内に存在してよい。特定の治療用途においては、Ｓｐ３５特異的抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は類縁体は抗体を投与する相手である動物において免疫原性とならないように設計される。
特定の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体ポリペプチドは抗体には通常関連しないアミノ酸配列又は部分１個以上を含む。例示される修飾は後述においてより詳細に説明する。例えば本発明の単鎖ｆｖ抗体フラグメントは可撓性のリンカー配列を含んでよく、或いは、機能的部分を付加するように修飾してよい（例えばＰＥＧ、薬品、毒素、又は標識）。
本発明のＳｐ３５抗体ポリペプチドは融合蛋白を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなってよい。融合蛋白は、例えば、標的結合部位少なくとも１つ、及び異種部分少なくとも１つ、即ち自然状態では本来連結していない部分、を有する免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は通常は融合ポリペプチド中で共存している別個の蛋白中に存在してよく、或いは、それらは通常は同じ蛋白中に存在してよいが、融合ポリペプチド中においては新しい配置におかれる。融合蛋白は例えば化学合成によるか、又は所望の関係においてペプチド領域がコードされているポリヌクレオチドを作成して翻訳することにより、作成してよい。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用する場合の「異種」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自身が比較されている実体の残余のものからは区別可能な実体から誘導されることを意味する。例えば、本明細書においては、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は類縁体に融合すべき「異種ポリペプチド」は同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、又は異なる種の免疫グロブリン又は非免疫グロブリンポリペプチドから誘導される。
「保存的アミノ酸置換」とはアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基でおきかえられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、例えば塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性の側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。即ち、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は好ましくは同じ側鎖のファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置き換えられる。別の実施形態においては、アミノ酸のストリングを、側鎖のファミリーのメンバーの順序及び／又は組成において異なる構造的に同様のストリングで置き換えることができる。
或いは、別の実施形態においては、突然変異を例えば飽和突然変異誘発により免疫グロブリンコーディング配列の全て又は部分に沿ってランダムに導入することができ、そして得られた突然改変体を本明細書に開示する診断及び治療の方法における使用のためにＳｐ３５抗体に組み込み、そして所望の抗原、例えばＳｐ３５へのそれらの結合能力に関してスクリーニングすることができる。
ＶＩ．融合蛋白及び抗体コンジュゲート
本明細書において別途詳述する通り、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は更にＮ又はＣ末端において異種ポリペプチドに組み換え融合するか、又はポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲート（例えば共有結合及び非共有結合を包含する）してよい。例えばＳｐ３５特異的Ｓｐ３５抗体は検出試験における標識として有用な分子、及び異種ポリペプチド、薬品、放射性核種、又は毒素のようなエフェクター分子に組み換え融合又はコンジュゲートしてよい。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許５，３１４，９９５；及びＥＰ ３９６，３８７を参照できる。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、共有結合が抗体のＳｐ３５への結合を防止しないように抗体に何れかの型の分子を共有結合することにより修飾された誘導体を包含する。例えば、限定しないが、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィル化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解的切断、細胞リガンド又は他の蛋白への連結等により修飾されている抗体を包含する。任意の多くの化学的修飾が、知られた手法、例えば限定しないが特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により実施されてよい。更に又、誘導体は非古典的アミノ酸の１つ以上を含有してよい。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、ペプチド結合、又は修飾されたペプチド結合、即ち、ペプチドアイソスターにより相互に連結されたアミノ酸よりなることができ、そして２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。Ｓｐ３５特異的抗体は天然のプロセス、例えば翻訳後のプロセシングにより、又は当該分野で良く知られている化学的修飾技法により、修飾してよい。そのような修飾は基本的な教則本に、そしてより詳細なモノグラフに、並びに多数の研究論文において、十分記載されている。修飾はＳｐ３５特異的抗体の何れかの位置、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端において、又は炭水化物のような部分上において、生じることができる。当然ながら、修飾の同じ型が所定のＳｐ３５特異的抗体中の数個の部位において同じか様々な程度において存在してよい。更に又、所定のＳｐ３５特異的抗体は多くの型の修飾を含有してよい。Ｓｐ３５特異的抗体は例えばユビキチン化の結果として分枝していてよく、そしてそれらは分枝を伴うか伴わない環状であってよい。環状、分枝、及び分枝環状のＳｐ３５特異的抗体は翻訳後の天然のプロセスから生じてよく、或いは、合成方法により作成してよい。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白分解性プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化を包含する。（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２ｎｄ Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ等、Ａｎｎ
ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
本発明はＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体、及び異種ポリペプチドを含む融合蛋白を可能とする。抗体を融合させる異種ポリペプチドは機能のために有用であってよく、或いは、Ｓｐ３５ポリペプチド発現細胞をターゲティングするために有用である。１つの実施形態において、本発明の融合蛋白は本発明の抗体のＶＨ領域の何れか１つ以上のアミノ酸配列又は本発明の抗体のＶＬ領域の何れか１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのフラグメント又は改変体、及び異種ポリペプチド配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。別の実施形態においては、本明細書に開示した診断及び治療の方法において使用するための融合蛋白は、Ｓｐ３５特異的抗体のＶＨＣＤＲの何れか１、２、３つのアミノ酸配列、又はそのフラグメント、誘導体、又は改変体、又はＳｐ３５特異的抗体のＶＬＣＤＲの何れか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体を有するポリペプチド、及び異種ポリペプチド配列を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。１つの実施形態において、融合蛋白は本発明のＳｐ３５特異的抗体、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び異種ポリペプチド配列を含み、この融合蛋白はＳｐ３５のエピトープの少なくとも１つに特異的に結合する。別の実施形態においては、融合蛋白は、本発明のＳｐ３５特異的抗体のＶＨ領域少なくとも１つのアミノ酸配列、及び本発明のＳｐ３５特異的抗体のＶＬ領域少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのフラグメント、誘導体、又は改変体、及び異種ポリペプチド配列を含む。好ましくは融合蛋白のＶＨ及びＶＬ領域はＳｐ３５のエピトープの少なくとも１つに特異的に結合する単一原料の抗体（又はｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）に相当する。更に別の実施形態においては、本明細書に開示する診断及び治療の方法における使用のための融合蛋白は、Ｓｐ３５特異的抗体のＶＨＣＤＲの何れか１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸配列及びＳｐ３５特異的抗体のＶＬＣＤＲの何れか１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのフラグメント、又は改変体、及び異種ポリペプチド配列を含む。好ましくはＶＨＣＤＲ又はＶＬＣＤＲの２、３、４、５、６、又はそれより多くが本発明の単一原料の抗体（又はｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）に相当する。これらの融合蛋白をコードする核酸分子も又、本発明に包含される。
文献において報告されている例示される融合蛋白はＴ細胞受容体の融合物（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ等、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ９：３４７−３５３（１９９０）；及びＢｙｒｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；及びＷａｔｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ等、Ｃｅｌｌ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等、Ｃｅｌｌ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；及びＰｅｐｐｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；及びＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８（１９９１））を包含する。
特定の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体は更にターゲティング部分を含む。ターゲティング部分は身体の特定の部分、例えば脳又はその中のコンパートメントに局在化を指向する蛋白又はペプチドを含む。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体は脳ターゲティング部分に結合又は融合される。脳ターゲティング部分は共有結合的に結合される（例えば直接、翻訳融合、又は、直接又は場合により切断可能なスペーサー分子を介した化学結合による）か、又は非共有結合的に結合される（例えば可逆的相互作用、例えばアビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧ等を介する）。他の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体はもう１つの脳ターゲティング部分に結合される。別の実施形態においては、脳ターゲティング部分は複数のＳｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体に結合される。
Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体と会合する脳ターゲティング部分はそのようなＳｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体の脳送達を増強する。蛋白又は治療薬と融合された場合に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して蛋白又は治療薬を送達する多くのポリペプチドが報告されている。非限定的な例には単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ等、（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ｍＡＢ８３−１４、ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体ｍＡＢ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等、（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６及びＢ８ペプチド（Ｘｉａ等、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等、（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；及び米国特許６，３０６，３６５の配列番号１〜１８が包含される。上記参考文献の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体または改変体の増強された脳送達は当該分野で十分確立されている多くの手段により測定される。例えば脳ターゲティング部分に連結された放射標識、酵素標識、又は蛍光標識Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体及び改変体の動物への投与；脳局在化の測定；及び脳ターゲティング部分に会合していない等価な放射標識、酵素標識、又は蛍光標識Ｓｐ３５抗体、その抗体フラグメント、誘導体または改変体との局在化の比較が挙げられる。増強されたターゲティングを測定する他の手段は上記参考文献に記載されている。
本明細書に別途記載する通り、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はポリペプチドのインビボの半減期を増大させるため、又は当該分野で知られた方法を用いたイムノアッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合してよい。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを本発明のＳｐ３５抗体にコンジュゲートすることによりそのインビボの半減期を増大させることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；又はＷｅｉｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ３０：５１２（２００２）。
更に又、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はその精製または検出を容易にするためにペプチドのようなマーカー配列に融合できる。好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えば、特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）中で提供されるタグであり、これらの多くは市販されている。例えばＧｅｎｔｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるようにヘキサヒスチジンは融合蛋白の好都合な精製を可能にする。精製のために有用な他のペプチドタグは、限定しないが、インフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））及び「ｆｌａｇ」タグを包含する。
融合蛋白は当該分野で良く知られている方法を用いて製造できる（例えば米国特許５，１１６，９６４及び５，２２５，５３８参照）。融合を行う厳密な部位は融合蛋白の分泌又は結合特性を最適にするために実験的に選択してよい。次に融合蛋白をコードするＤＮＡを発現のための宿主細胞内にトランスフェクトする。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は非コンジュゲート型で使用してよく、又は、例えば分子の治療特性を向上させるため、標的検出を容易にするため、又は患者の画像化又は治療のために、種々の分子の少なくとも１つにコンジュゲートしてよい。本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、精製を実施する場合には精製の前又は後のいずれかに標識又はコンジュゲートできる。
特に、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は治療薬、プロドラッグ、ペプチド、蛋白、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬品、又はＰＥＧにコンジュゲートしてよい。
当業者の知る通り、コンジュゲートは又、コンジュゲートすべき選択された剤に応じて種々の手法を用いながら組み立ててよい。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、例えばビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化エステルに結合ポリペプチドを反応させることにより製造する。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは例えば本明細書に記載するようなカップリング剤の存在下、又は、イソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により製造してよい。本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体のコンジュゲートは同様の態様において製造される。
本発明は更に診断薬又は治療薬にコンジュゲートした本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を包含する。Ｓｐ３５抗体は例えば所定の治療及び／又は予防の投薬法の薬効を測定するための臨床試験操作法の部分として神経学的な疾患の発症又は進行を例えばモニタリングするために診断上使用できる。検出はＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を検出可能な物質にカップリングすることにより容易にすることができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子射出断層撮影を用いた陽電子射出金属、及び非放射性の常磁性金属イオンを包含する。本発明により診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートできる金属イオンに関しては、例えば米国特許４，７４１，９００を参照できる。適当な酵素の例は、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを包含し；発光物質の例はルミノールを包含し；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを包含し；そして適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃを包含する。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はまたそれを化学発光化合物にカップリングさせることにより検出可能に標識できる。次に化学発光タグ付きＳｐ３５抗体の存在を化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することにより検出する。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルである。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体が検出可能に標識できる方法の１つは、これを酵素に連結し、そして連結産物を酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，”Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｒｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．等（編），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。Ｓｐ３５抗体に結合している酵素は、例えば分光分析、蛍光分析によるか、又は目視による手段により検出することができる化学部分を生成するような態様において、適切な基質、好ましくは発色性の基質と反応することになる。抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素は、限定しないが、マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを包含する。更に又、検出は酵素に対する発色性の基質を使用する比色法により行うことができる。検出は同様に調製した標準物質との比較において基質の酵素反応の程度を目視比較することにより行ってもよい。
検出は又、種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて行ってよい。例えばＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を介して抗体を検出できる（例えば参照により本明細書に組み込まれるＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）を参照できる）。放射性同位体は限定しないがガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーを包含する手段により検出できる。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はまた蛍光発射金属、例えば１５２Ｅｕ、又は他のランタニド系列を用いながら検出可能に標識できる。これらの金属はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート形成基を用いながら抗体に結合できる。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体に種々の部分をコンジュゲートするための手法は、よく知られており、例えばＡｒｎｏｎ等、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ等（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ等（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ等（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３−１６（１９８５），およびＴｈｏｒｐｅ等、”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照できる。
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
良く知られている通り、ＲＮＡは元のハイブリドーマ細胞から、又は他の形質転換された細胞から、標準的な手法により、例えばグアニジウムイソチオシアネート抽出及び沈降とその後の遠心分離又はクロマトグラフィーにより、単離してよい。所望に応じて、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーのような標準的な手法により全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離してよい。適切な手法は当該分野でよく知られている。
１つの実施形態において、よく知られた方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いながら、同時又は別個に、抗体の軽鎖及び重鎖をコードしているｃＤＮＡを作成してよい。ＰＣＲはコンセンサス定常領域プライマーにより、又は公開されている重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びアミノ酸の配列に基づいたより特異的なプライマーにより、開始してよい。上記において考察したとおり、ＰＣＲを用いることにより抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してよい。この場合、ライブラリはコンセンサスプライマー、又はより大型の相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブによりスクリーニングしてよい。
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを当該分野で知られた手法を用いて細胞から単離し、制限酵素地図を作成し、そして、例えば組み換えＤＮＡ手法に関する上記参考文献に詳述されている標準的なよく知られた手法に従って配列決定してよい。当然ながら、ＤＮＡは単離過程又はその後の分析の間の何れかの時点において本発明による合成性のものであってよい。
単離された遺伝子物質を調整して本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体とした後、Ｓｐ３５抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的にはＳｐ３５抗体の所望の量を生成するために使用してよい宿主細胞内への導入のための発現ベクターに挿入される。
抗体、又はそのフラグメント、誘導体、又は類縁体、例えば本明細書に記載した標的分子、例えばＳｐ３５に結合する抗体の重鎖又は軽鎖の組み換え発現は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖又は軽鎖、又はその部分（好ましくは重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含有）をコードするポリヌクレオチドが得られた後、抗体分子の製造のためのベクターを当該分野で良く知られている手法を用いながら組み換えＤＮＡ技術により製造してよい。即ち抗体コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することにより蛋白を製造するための方法を本明細書に記載する。当業者に良く知られている方法を用いて抗体コーディング配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えばインビトロ組み換えＤＮＡ手法、合成手法、及びインビボ遺伝子組み換えを包含する。即ち本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体分子、又はその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖可変ドメイン、をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えばＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許５，１２２，４６４参照）を包含してよく、そして抗体の可変ドメインは全重鎖又は軽鎖の発現のためのそのようなベクター内にクローニングしてよい。
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクター、即ち重鎖誘導ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖誘導ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトしてよい。２つのベクターは重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有してよい。或いは、重鎖と軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してよい。そのような状況においては過剰な毒性の遊離重鎖を回避するために重鎖よりも前に軽鎖を置くことが好都合である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１９７（１９８０））。重鎖及び軽鎖のコーディング配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでよい。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は本明細書においては、宿主細胞に所望の遺伝子を導入し、そして発現させるためのベヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に知られる通り、そのようなベクターはプラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスよりなる群から容易に選択してよい。一般的に、本発明に適合するベクターは選択可能なマーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、及び真核生物又は原核生物の細胞内に侵入及び／又はそこで複製する能力を含むことになる。
本発明の目的のためには、多くの発現ベクター系を使用してよい。例えばベクターの１つのクラスはウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから誘導されるＤＮＡエレメントを利用する。他の場合は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックな系を使用する。更に又、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするマーカー１つ以上を導入することにより自身の染色体内にＤＮＡを組み込んでいる細胞を選択してよい。マーカーは栄養要求性の宿主への原栄養性、生物致死物質耐性（例えば抗生物質）又は銅のような重金属に対する耐性を与えてよい。選択可能なマーカー遺伝子は発現すべきＤＮＡ配列に直接連結するか、又は同時形質転換により同じ細胞内に導入することができる。追加的なエレメントも又、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル並びに転写プロモーター、エンハンサー及び終止シグナルを包含してよい。
特に好ましい実施形態においては、クローニングされた可変領域遺伝子は上記において考察したとおり合成性の重鎖及び軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と共に発現ベクター内に挿入される。１つの実施形態において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡと称されるＢｉｏｇｅｎＩＤＥＣ Ｉｎｃ．の専売の発現ベクター（米国特許６，１５９，７３０）を使用して達成される。このベクターはサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１及びエクソン２、ジヒドロホレート還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有している。このベクターは、可変及び定常領域の遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地中での選択及びメトトレキセート増幅により、極めて高いレベルの抗体発現をもたらすことがわかっている。当然ながら、真核生物細胞において発現を誘発することができる如何なる発現ベクターも本発明において使用してよい。適当なベクターの例は限定しないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ及びｐＺｅｏＳＶ２（入手元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びプラスミドｐＣＩ（入手元Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を包含する。一般的に、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の適度な高レベルを発現するものを求めて形質転換された細胞の多数をスクリーニングすることは、例えばロボットシステムにより実施できる定型的な実験である。ベクター系はまた各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，７３６，１３７及び５，６５８，５７０に記載されている。この系は高い発現レベル、例えば＞３０ｐｇ／細胞／日をもたらす。他の例示されるベクター系は米国特許６，４１３，７７７に記載されている。
他の好ましい実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は２００２年１１月１８日に出願され、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２００３−０１５７６４１Ａ１に開示されているもののようなポリシストロン性のコンストラクトを用いながら発現してよい。これらの新しい発現系においては、抗体の重鎖及び軽鎖のような目的の遺伝子産物多数を単一のポリシストロン性コンストラクトから製造してよい。これらの系は好都合には、真核生物宿主細胞中、Ｓｐ３５抗体、例えば結合ポリペプチド、例えばＳｐ３５特異的抗体、又はその免疫特異性フラグメントの比較的高いレベルをもたらすために内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。適合するＩＲＥＳ配列はやはり本明細書に組み込まれる米国特許６，１９３，９８０に開示されている。当業者に知られる通り、このような発現系は本出願に開示するＳｐ３５抗体の全範囲を効果的に生産するために使用してよい。
より一般的には、Ｓｐ３５抗体の単量体性のサブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列を製造した後、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入してよい。宿主細胞へのプラスミドの導入は当業者に良く知られている種々の手法により行うことができる。これらには、限定しないがトランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを包含）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、及び未損傷ウイルス感染が包含される。例えばＲｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．”Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ” Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照できる。典型的には宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションを介して行う。発現コンストラクトを保有している宿主細胞を軽鎖及び重鎖の生産に適切である条件下に生育させ、そして重鎖及び／又は軽鎖蛋白の合成に関して試験する。例示される試験法は、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化細胞ソーティング分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等を包含する。
発現ベクターは従来の手法により宿主細胞内に転移させ、そして次にトランスフェクトされた細胞を従来の手法で培養することにより本明細書に記載した方法において使用するための抗体を製造する。即ち、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体、又はその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。２本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態においては、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳述する通り、全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞内で同時発現させてよい。
本明細書においては、「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ手法を用いて構築され、そして異種遺伝子の少なくとも１つをコードしているベクターを有する細胞を指す。組み換え宿主に由来する抗体の単離のためのプロセスの記述において、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、特段の記載が無い限り抗体の原料を互換的に指すために使用する。換言すれば「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈された全細胞から、又は培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの、何れかを意味してよい。
種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載した方法における使用のための抗体分子を発現してよい。そのような宿主発現系は目的のコーディング配列が生産され、その後精製されるベヒクルとなるが、また、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又はトランスフェクトされた場合にインサイチュで本明細書の抗体分子を発現することができる細胞ともなる。これらには限定されないが、微生物、例えば抗体コーディング配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コーディング配列を含有する組み換えコウボ発現ベクターで形質転換されたコウボ（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コーディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コーディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、又は同様の組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した、植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウイルスからのもの（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現コンストラクトを保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が包含される。好ましくは、細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、そしてより好ましくは、特に全組み換え抗体分子の発現のための真核生物の細胞を組み換え抗体分子の発現のために使用する。例えば、哺乳類細胞、例えばヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２（１９９０））。
蛋白発現のために使用される宿主細胞系は頻繁には哺乳類起源のものであり；当業者であれば内部で発現させるべき所望の遺伝子に対して最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定する能力を有するはずである。例示される宿主細胞系は限定しないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原によるＣＶＩ誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎）を包含する。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は典型的には市販元、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は出版物から得られる。
更に又、挿入された配列の発現をモジュレートする、又は所望の特定の態様において遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞系を選択してよい。蛋白産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は蛋白の機能のために重要である場合がある。種々の異なる宿主細胞が蛋白及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的で特異的な機序を有している。適切な細胞系又は宿主系を選択することにより発現された外来性蛋白の正しい修飾及びプロセシングを確保することができる。この目的の為には、主要転写物の適切なプロセシング、グリコシル化及び遺伝子産物のホスホリル化のための細胞機序を有する真核生物宿主細胞を使用してよい。
組み換え蛋白の長期の高収率の生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば抗体分子を安定に発現する細胞系を操作してよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりはむしろ、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されたＤＮＡ及び選択可能なマーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後、操作された細胞をリッチ化培地中で１〜２日間生育させてよく、次に選択培地に切り替える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーが選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定してプラスミドをその染色体内に組み込んで生育することにより細胞増殖巣ができるようにし、次にこれをクローニングして増殖させ、細胞系とする。この方法は抗体分子を安定に発現する細胞系を操作するために好都合に使用してよい。
多くの選択系を使用してよく、例えば限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｃｅｌｌ１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２（１９９２））及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ等、Ｃｅｌｌ２２：８１７ １９８０）の遺伝子をｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用できる。更に又、抗代謝産物耐性を以下の遺伝子、即ち、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７（１９８１））；マイコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ１２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月））；及びハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等、Ｇｅｎｅ３０：１４７（１９８４））に関する選択の基準として使用できる。使用できる組み換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に知られた方法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ等（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）：及びＤｒａｃｏｐｏｌｉ等（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）のＣｈａｐｔｅｒｓ １２及び１３；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
抗体分子の発現レベルはベクター増幅により上昇させることができる（検討のためにはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参考にできる）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する抑制剤のレベルの上昇はマーカー遺伝子のコピー数を増大させることになる。増幅された領域は抗体遺伝子に関連しているため、抗体の生産もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
インビトロの製造は所望のポリペプチド大量をもたらすスケールアップを可能にする。組織培養条件化の哺乳類細胞培養の手法は当該分野で知られており、そして例えばエアリフト反応器中、又は連続攪拌反応器中の均質懸濁培養、又は例えば中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、又はセラミックカートリッジによる固定化又は捕獲された細胞の培養を包含する。必要及び／又は所望により、ポリペプチドの溶液を、慣用的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上のクロマトグラフィー、又は（イムノ）アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後、又は本明細書に記載したＨＩＣクロマトグラフィー工程の前後に、精製することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をコードする遺伝子もまた細菌又はコウボ又は植物細胞のような非哺乳類細胞で発現できる。核酸を容易に取り込む細菌は腸内細菌科のメンバー、例えばエシェリシア・コリ、又はサルモネラの菌株；バチルス科、例えばバチルス・サブチルス；肺炎球菌；連鎖球菌、及びヘモフィルス・インフルエンザを包含する。更に当然ながら、細菌において発現する場合は、異種ポリペプチドは典型的には封入体の部分となる。異種ポリペプチドは単離し、精製し、そして機能的分子に組み立てなければならない。抗体の４価の形態が望まれる場合は、次にサブユニットを自己組立させて４価の抗体とする（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）．
細菌系においては、発現するべき抗体分子について意図される用途に応じて多くの発現ベクターを好都合に選択してよい。例えば、抗体分子の医薬組成物の作成のためにそのような蛋白を大量に製造すべきである場合は、容易に精製される融合蛋白産物の高レベルの発現を指向するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターは限定されないが、融合蛋白が生産されるように抗体コーディング配列がｌａｃＺコーディング領域にインフレームとなるようにベクター内に個々にライゲーションしてよいＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ等、ＥＭＢＯＪ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；等を包含する。ｐＧＥＸベクターもまたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白としての外来性ポリペプチドを発現するために使用してよい。一般的に、そのような融合蛋白は可溶性であり、そして、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着及び結合とその後の遊離グルタチオン存在下の溶離により、溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターはクローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
原核生物に加えて、真核生物の微生物もまた使用してよい。サッカロマイセス・セレビシアエ、即ち一般的なパン酵母が真核生物の微生物中で最も一般的に使用されているが、多くの他の菌株、例えばピチア・パストリスも市販されている。
サッカロマイセスにおける発現のためには例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等、Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））が一般的に使用されている。このプラスミドは既にトリプトファン中で生育する能力を欠いているコウボの突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））に対する選択マーカーを与えるＴＲＰ１遺伝子を含有している。コウボ宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１欠陥の存在が次にトリプトファン非存在下の成長による形質転換の検出のための有効な環境を与える。
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来性遺伝子を発現するためのベクターとして典型的に使用される。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において生育させる。抗体コーディング配列はウイルスの非必須領域（例えば多核体遺伝子）内に個々にクローニングし、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多核体プロモーター）の制御下においてよい。
本発明の抗体分子が組み換え発現された後、それを免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で知られた何れかの方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティーによるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度によるか、又は、蛋白精製のための何れかの他の標準的な手法により精製してよい。或いは、本発明の抗体の親和性を上昇させるための好ましい方法は米国特許公開２００２０１２３０５７Ａ１に開示されている。
ＶＩＩＩ．治療用Ｓｐ３５抗体を用いた治療方法
本明細書に記載した通り、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はＣＮＳニューロンにおいて通常は起こる軸索伸長のＮｇＲ１媒介抑制を軽減できる。これは軸索伸長又はニューライトの新芽形成が脳又は脊髄において必要である状況において有益である。脊髄傷害、例えば部分的又は完全なクラッシュ又は切断は、軸索伸長が望まれるが、Ｎｏｇｏ経路の作動を介して通常は抑制される状況を例示するものである。脳における軸索伸長及び／又はニューライトの新芽形成が有益である疾患又は障害の例は、卒中、多発性硬化症、及び他の神経変性疾患又は障害、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）及びウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、神経障害、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツバイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニヤーミ症候群、異染性白質委縮症、三叉神経痛、ベル麻痺、脊髄傷害及びニューロン細胞死に関連するすべての神経学的疾患を包含する。
本発明者等は更にＳｐ３５が稀突起神経膠細胞において発現され、そして稀突起神経膠細胞の生物学的側面に寄与することを発見した。Ｓｐ３５の可溶性誘導体、特定のポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ）、並びにＳｐ３５に特異的に結合する特定の抗体は、本明細書に記載するとおり、稀突起神経膠細胞においてＳｐ３５機能に対する拮抗剤として作用し、稀突起神経膠細胞の増殖、分化及び生存を促進し、そしてインビトロ及びインビボのニューロンの髄鞘形成を促進する。これは脱髄及び髄鞘発育不全の関与する疾患、障害又は状態において有益である。稀突起神経膠細胞の増殖、分化及び生存、及び／又は髄鞘形成又は再髄鞘形成が有益である疾患又は障害の例は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、及びペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツバイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニヤーミ症候群、異染性白質委縮症、三叉神経痛、及びベル麻痺を包含する。
従って本発明の１つの実施形態は、脊髄の傷害、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する疾患又は障害、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害、及びＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全の関与する疾患を、そのような傷害又は疾患に罹患した又はそのような疾患にかかる素因がある動物において治療するための方法を提供し、方法はＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の有効量を動物に投与することを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。本発明の抗体は本明細書に記載する通りであり、そして表３Ａ及び表３Ｂに列挙したモノクローナル抗体、表３Ａ及び表３Ｂに列挙したモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体、Ｓｐ３５への表３Ａ及び表３Ｂに列挙したモノクローナル抗体の結合を競合的に抑制する抗体、及び表３Ａ及び表３Ｂに列挙したモノクローナル抗体から誘導されるポリペプチドを含む抗体を包含する。
本明細書に開示した治療方法において使用されるべき治療用Ｓｐ３５抗体は、ＣＮＳ神経突起伸長、ニューロン生存、軸索ガイダンスおよび軸索再生を促進し、稀突起神経膠細胞の生存、成長、及び／又は分化を促進し、そしてＣＮＳニューロンの髄鞘形成又は再髄鞘形成を促進する治療薬として製造し、使用することができる。適当な治療用Ｓｐ３５抗体の特性は、Ｓｐ３５活性のブロッキングをもたらすＳｐ３５エピトープへの結合、治療作用を誘発するために十分な親和性によるＳｐ３５への結合、及び例えばＮｏｇｏ受容体のような通常の結合相手に優先してＳｐ３５に結合すること、を包含する。
治療用Ｓｐ３５抗体はモノクローナル、キメラ又はヒト化抗体、又はＳｐ３５に特異的に結合する抗体のフラグメントであってよい。抗体は１価、２価、多価、又は２官能性の抗体であってよい。抗体フラグメントは限定しないがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントを包含する。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は未標識又は未コンジュゲートの形態で使用することができ、或いは、薬品、標識又は追加的な治療効果を呈しても呈さなくてもよい安定化剤にカップリング又は連結することができる。
何れかの特定の患者に対する特定の用量及び治療投薬法は、種々の要因、例えば使用される特定のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体、患者の年齢、体重、全身状態、性別、及び食餌、及び投与の時間、排出速度、薬品の組み合わせ、及び治療すべき特定の疾患の重症度に応じたものとなる。看護師によるそのような要因の判断は当業者の知る通りである。量もまた治療すべき個々の患者、投与経路、製剤の型、使用する化合物の特性、疾患の重症度、及び所望の作用に応じたものとなる。使用量は当該分野で良く知られている薬理学的および薬物動態の原理により求めることができる。
本発明の方法においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は直接神経系に、脳室内に、又は髄腔内に、例えばＭＳの慢性病巣内に、後述においてより詳細に考察する通り投与してよい。
種々の実施形態において上記Ｓｐ３５抗体はＳｐ３５活性の拮抗剤である。特定の実施形態においては、例えばニューロン上に発現された状態のＳｐ３５に拮抗剤Ｓｐ３５抗体を結合させることは、ミエリン関連の神経突起伸長の抑制又はニューロン細胞死をブロックする。別の実施形態においては稀突起神経膠細胞上に発現された状態のＳｐ３５にＳｐ３５抗体を結合させることは、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制をブロックするか、又はＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全をブロックする。
本発明の方法において、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体、特に本明細書に記載したＳｐ３５抗体は、予備形成されたポリペプチドとして直接、又は核酸ベクターを介して間接的に投与することができ、これにより有益な軸索の伸長を可能とし、稀突起神経膠細胞の増殖、分化、及び生存を促進し、及び／又は髄鞘形成又は再髄鞘形成を促進できる。
特定の実施形態においては、対象は例えばベクター中のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は類縁体をコードする核酸分子で治療してよい。ポリペプチドをコードする核酸の用量は患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、又は３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの場合の用量は用量当たり１０〜１００ビリオン以上である。
本発明の一部の実施形態においては、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は（１）Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を発現する核酸、例えばベクターで移植可能な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳類内に、疾患、障害又は傷害の部位において移植すること、を包含する治療方法において投与される。例えば形質転換された宿主細胞は脊髄傷害の部位において、又は髄鞘発育不全の部位において移植できる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞はＳｐ３５抗体をコードする単離された核酸を用いて一時的に培養された、形質転換された、又はトランスフェクトされた哺乳類から回収され、そしてその回収元の同じ哺乳類内に移植し戻される。細胞は、必須ではないが、それを移植する部位と同じ部位から回収できる。エクスビボ遺伝子療法として知られる場合があるそのような実施形態は、限定された期間、作用部位の部位に限局したＳｐ３５ポリペプチドの連続的供給をもたらすことができる。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の投与を含む、脊髄傷害、ＣＮＳにおけるニューロン成長の抑制に関連する疾患又は障害、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害、及びＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全の関与する疾患を治療するための方法は典型的には、インビトロで、そして次に所望の治療又は予防活性に関して許容される動物モデルにおいてインビボで試験され、その後ヒトにおいて使用される。適当な動物モデル、例えばトランスジェニック動物は当業者に良く知られている。例えば、本明細書に記載したＳｐ３５抗体の治療上の利用性を明らかにするためのインビトロ試験は細胞系又は患者組織試料に対するＳｐ３５抗体の作用を包含する。細胞系及び／又は組織試料に対するＳｐ３５抗体の作用は当業者に知られている手法、例えば本明細書に別途記載する試験法を利用しながら測定できる。本発明によれば、特異的Ｓｐ３５抗体の投与の適応症であるかどうかを調べるために使用できるインビトロの試験はインビトロの細胞培養試験を包含し、それにおいては、患者組織試料を培養物として成長させ、そして化合物に曝露するか、別様に投与し、そしてそのような化合物の組織試料に対する作用を観察する。
補助的な活性化合物もまた本発明の組成物中に配合できる。例えば本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は追加的治療薬１つ以上と同時製剤及び／又は同時投与してよい。
本発明は選択された標的組織に対する本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体のための何れかの適当な送達方法を包含し、それには水溶液の瞬時注射又は制御放出系の移植が包含される。制御放出インプラントの使用は反復注射の必要性を低減する。
ＩＸ．医薬組成物及び投与方法
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の製造及びそれを必要とする対象への投与の方法は当業者に良く知られているか、容易に決定できる。Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の投与経路は、例えば経口、非経口、吸入又は局所投与によるものであってよい。非経口という用語は本明細書においては、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣内投与を包含する。投与の全てのこのような形態は本発明の範囲内にあることは明確に意図されているが、投与のための形態は特に静脈内又は動脈内の注射又は点滴のための注射溶液となる。通常は注射のための適当な医薬組成物は緩衝液（例えば酢酸塩、リン酸塩、又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合により安定化剤（例えばヒトアルブミン）等を含んでよい。しかしながら、本明細書の記載に適合する他の方法においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は、治療薬への疾患組織の曝露を増大させるために、有害な細胞の集団の部位に直接送達することができる。
前述したとおり、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は哺乳類の脊髄傷害、ＣＮＳにおけるニューロン成長の抑制に関連する疾患又は障害、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害、及びＣＮＳの脱髄又は髄鞘発育不全の関与する疾患のインビボの治療のために薬学的に有効な量において投与してよい。この点に関し、当然ながら開示した抗体は投与を容易にし、そして活性剤の安定性を促進するように製剤されることになる。好ましくは、本発明による医薬組成物は製薬上許容しうる非毒性の滅菌担体、例えば生理食塩水、非毒性の緩衝液、保存料等を含む。本出願の目的のためにはコンジュゲート又は未コンジュゲートのＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の薬学的有効量は、標的への有効な結合を達成するため、及び利益を達成するため、例えば疾患又は障害の症状を緩解するため、又は物質又は細胞を検出するために十分な量を意味するものとする。
本明細書において使用される医薬組成物は製薬上許容しうる担体、例えばイオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えばプロタミンスルフェート、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛の塩、コロイド状シリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む。
非経口投与のための調製品は滅菌された水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳液を包含する。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用の有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性の担体は水、アルコール性／水性の溶液、乳液又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体を包含する。主題の発明においては、製薬上許容しうる担体は限定しないが０．０１〜０．１Ｍ、そして好ましくは０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液、又は０．８％食塩水を包含する。他の一般的な非経口用のベヒクルはリン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液、又は固定油を包含する。静脈内ベヒクルは水分及び栄養補充物、電解質補充物、例えばＲｉｎｇｅｒデキストロース系のもの等を包含する。保存料及び他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート形成剤、及び不活性ガス等も存在してよい。
より詳細には、注射用途のために適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を包含する。そのような場合、組成物は滅菌されなければならず、そして容易にシリンジ使用ができる程度の流体性を有さなければならない。製造及び保存の条件下で安定であることが必要であり、そして好ましくは細菌及びカビのような微生物の汚染作用に対抗して保存される。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適当な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適当な流体性は例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散体の場合は必要な粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により、維持することができる。本明細書に開示する治療方法における使用のための適当な製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，第１６版（１９８０）に記載されている。
微生物の作用の防止は種々の抗細菌及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等により達成できる。多くの場合において等張性付与剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含有することが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含有させることにより実現できる。
いずれかの場合において、滅菌注射溶液は、必要に応じて本明細書に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の単独又は他の活性剤との組み合わせ）を配合すること、次いで濾過滅菌することにより製造できる。一般的に分散液は基本的な分散媒体及び上記列挙したものから選択される必要な他の成分を含有する滅菌ベヒクル内に活性化合物を配合することにより製造する。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合は、製造の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは活性成分と以前に濾過滅菌された自身の溶液の何れかの追加的な所望の成分の粉末をもたらす。注射用の調製品を処理し、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ又はバイアルのような容器に充填し、そして当該分野で知られる方法に従って無菌条件下に密封する。更に又、調製品は、参照により全体が本明細書に組み込まれる同時係争中の米国特許出願０９／２５９，３３７（ＵＳ−２００２−０１０２２０８Ａ１）に記載の通り、パッケージングしてキットの形態で販売してよい。そのような製造物品は好ましくは関連する組成物が自己免疫性又は新生物性の障害に罹患しているか、その素因のある対象を治療する場合に有用であることを示すラベル又は添付文書を有することになる。
非経口製剤は単一の瞬時用量、注入、又は負荷瞬時用量とその後の維持用量であってよい。これらの組成物は特定の固定された、又は可変の時間間隔で、例えば１日１回、又は「必要時」を基準として投与してよい。
本発明において使用する特定の医薬組成物は許容される剤型、例えばカプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液において経口投与してよい。特定の医薬組成物は又、鼻用エアロゾル又は吸入剤として投与してもよい。そのような組成物はベンジルアルコール又は他の適当な保存料、生体利用性を増強するための吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を用いながら、食塩水中の溶液として製造してよい。
単回剤型を製造するために担体物質と組み合わせてよいＳｐ３５抗体、又はそのフラグメント、改変体、又は誘導体の量は治療される宿主及び特定の投与様式に応じて変動することになる。組成物は単回用量として、多数回用量として、又は輸液の所定期間に渡って、投与してよい。投薬法は又、最適な所望の応答（例えば治療又は予防応答）を得るために調節してよい。
本発明の開示の範囲内を維持しつつ、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は治療効果をもたらすために十分な量において上記した治療方法に従ってヒト又は他の動物に投与してよい。本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は知られた手法に従って従来の製薬上許容しうる担体又は希釈剤に本発明の抗体を組み合わせることにより製造された従来の剤形においてそのようなヒト又は他の動物に投与できる。当業者の知る通り、製薬上許容しうる担体又は希釈剤の形態及び特徴はそれが組み合わせられる活性成分の量、投与経路及び他のよく知られた変数により決定される。更に当業者の知る通り、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の１つ以上の物質種を含むカクテルも特に有効であることが判明し得る。
脊髄傷害、ＣＮＳにおけるニューロン成長の抑制に関連する疾患又は障害、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害、及びＣＮＳの脱髄又は髄鞘発育不全の関与する疾患の治療のための本発明の組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例えば投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他剤、及び治療が予防的か治療的かに応じて変動する。通常は患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を包含する非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療用量は安全性及び薬効を最適にするために当業者に知られた定型的方法を用いて用量設定してよい。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を用いた脊髄傷害、ＣＮＳにおけるニューロン成長の抑制に関連する疾患又は障害、稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害、及びＣＮＳの脱髄又は髄鞘発育不全の関与する疾患の治療のためには、用量は例えば、宿主体重あたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）となる。例えば用量は１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであることができる。上記範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内に意図される。対象はそのような用量を毎日、又は隔日、毎週、又は実験的分析により決定された何れかの他の日程に従って、投与されることができる。例示される治療は例えば少なくとも６か月の延長された期間にわたる多用量における投与を包含する。別の例示される投薬法は２週毎に一回、又は月一回、又は３〜６か月ごとに一回の投与を包含する。例示される投薬日程は１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇを連続日、３０ｍｇ／ｋｇを隔日、又は毎週６０ｍｇ／ｋｇを包含する。一部の方法においては、異なる結合特性のモノクローナル抗体２つ以上を同時に投与し、その場合、投与される各抗体の用量は記載した範囲に包含される。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は多数の機会において投与できる。単回用量の間の間隔は、毎日、毎週、毎月、又は毎年とすることができる。間隔は又、患者における標的ポリペプチド又は標的分子の血中濃度を計測することにより示される通り、不規則であることもできる。一部の方法においては、用量は血漿中ポリペプチド濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌを達成するように調節される。或いは、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は除放性製剤として投与することができ、その場合は必要な投与の頻度はより低下する。用量及び頻度は患者における抗体の半減期に応じて変動する。Ｓｐ３５抗体の半減期は又安定なポリペプチド又は部分、例えばアルブミン又はＰＥＧへの融合を介して延長できる。一般的に、ヒト化抗体が最も長い半減期を示し、次いでキメラ抗体、そして非ヒト抗体となる。１つの実施形態において、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は未コンジュゲート型で投与できる。別の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体はコンジュゲート型において多数回投与できる。又別の実施形態において、、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は未コンジュゲート型で投与し、次にコンジュゲート型、あるいはその逆で投与することができる。
本発明の組成物は何れかの適当な方法、例えば非経口、心室内、経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、口腔内、膣内、又は移植されたリザーバより投与してよい。「非経口」という用語は本明細書においては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、患部内、及び頭蓋内の注射又は注入の手法を包含する。以前に記載した通り、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は神経系において作用することにより、稀突起神経膠細胞の生存、増殖及び分化及びニューロンの髄鞘形成及びニューロン生存、軸索再生及び軸索ガイダンスを促進する。従って、本発明の方法においては、Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体をそれらが血液脳関門を通過するような態様において投与する。この通過はＳｐ３５抗体分子そのものに固有の物理化学的特性から、医薬品製剤中の他の成分から、又は血液脳関門を突破するための針、カニューレ、又は外科機器のような機械的装置の使用から生じるものであることができる。Ｓｐ３５抗体が本来血液脳関門を通過しない分子、例えば通過を促進する分子への融合物である場合、適当な投与経路は、例えば髄腔内、または頭蓋内、例えばＭＳの慢性患部に直接となる。Ｓｐ３５抗体が本来血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は後述する種々の経路の１つ以上であってよい。一部の方法においては、抗体を除放性組成物、又はＭｅｄｉｐａｄ（商標）装置のような装置として投与する。血液脳関門を通過する送達は担持分子、例えば抗Ｆｃ受容体、トランスフェリン、抗インスリン受容体、又は毒素コンジュゲート又は貫通増強剤により増強できる。
本発明の方法において使用されるＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は脳に直接注入してよい。化合物の直接脳注入のための種々のインプラントが知られており、そして神経障害に罹患したヒト患者への治療化合物の送達において有効である。これらにはポンプ、定位移植一時性間質性カテーテル、永久頭蓋内カテーテルインプラント、及び手術により移植した生体分解性のインプラントを用いた脳への長期注入が包含される。例えばＧｉｌｌ等、“Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）；Ｓｃｈａｒｆｅｎ等、“Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ等、“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ ６６，ｐａｇｅｓ ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａ等、“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ等、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；及びＢｒｅｍ等、“Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：１１１−２３（１９９５）を参照できる。
組成物は又、化合物のための適当な送達又は支持の系として機能する生体適合性の担体物質中に分散されたＳｐ３５抗体を含んでよい。除放性担体の適当な例は座薬又はカプセルのような形状付与された物品の形態の半透過性の重合体マトリックスを包含する。移植可能な、又はマイクロカプセルの除放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許３，７７３，３１９；ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチルＬ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））又はポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を包含する。
本発明の一部の実施形態においては、本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は脳の適切な領域への直接の注入により患者に投与される。例えば、上記Ｇｉｌｌ等を参照できる。代替の手法が使用可能であり、本発明のＳｐ３５抗体を投与するために適用してよい。例えば、カテーテル又はインプラントの定位静置はＲｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒユニット及びＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的限局ユニットを用いながら行うことができる。オムニパーク１２０ｍｌ、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入し、２ｍｍスライス厚みとした造影剤増強コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンは３次元の多平面治療計画を可能にする（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機材は明確な標的の確認のためにＣＴおよびＭＲＩの標的情報を融合させた磁気共鳴画像化試験に基づいた計画を可能とする。
ＧＥのＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と共に使用するように改良されたＬｅｋｓｅｌｌの定位システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）並びにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）の定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的のために使用できる。即ち、移植当日朝、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭部に結合させる。ベースプレートにクランプされたグラファイトロッドローカライザーフレームを用いて（標的組織）領域に渡って３ｍｍ間隔で連続ＣＴ断面を得ることができる。ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間でマッピングするためのグラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いながらＶＡＸ１１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上でコンピューター化された治療計画プログラムを実行できる。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は場合により治療（例えば予防又は治療）の必要な障害又は状態を治療する場合に有効である他剤と組み合わせて投与できる。
Ｘ．診断
本発明は更に、個体に由来する組織又は他の細胞又は体液中のＳｐ３５蛋白又は転写物の発現レベルを計測すること、及び、計測された発現レベルを正常な組織又は体液中の標準的なＳｐ３５発現レベルと比較することを包含するニューロン障害又は傷害の診断の間に有用な診断方法を提供し、これによれば、標準と比較した発現レベルの増大が障害を示す。
Ｓｐ３５特異的抗体は当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法を用いながら生物学的試料中の蛋白レベルを試験するために使用できる（例えばＪａｌｋａｎｅｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）参照）。蛋白発現を検出するために有用な他の抗体系方法はイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、又はウエスタンブロッティングを包含する。適当な試験は本明細書に別途詳述する通りである。
「Ｓｐ３５ポリペプチドの発現レベルを試験する」とは、第１の生物学的試料中のＳｐ３５ポリペプチドのレベルを、直接（例えば絶対的な蛋白レベルを測定するまたは見積もることにより）、又は相対的に（例えば第２の生物学的試料中の癌関連ポリペプチドと比較することにより）定性的又は定量的に計測又は推定することを意図する。好ましくは第１の生物学的試料中のＳｐ３５ポリペプチド発現レベルを計測又は推定し、標準Ｓｐ３５ポリペプチドレベルと比較するが、ここで標準は障害を有さない個体から得られた第２の生物学的試料から得られたものであるか、又は障害を有さない個体の集団に由来するレベルを平均することにより求められる。当該分野で知られる通り、「標準」Ｓｐ３５ポリペプチドレベルが判明すれば、それは比較のための標準として反復して使用できる。
「生物学的試料」とは潜在的にＳｐ３５を発現する個体、細胞系、組織培養物、又は他の細胞原料から得られた何れかの生物学的試料を意図している。組織生検物及び体液を哺乳類から得るための不法は当該分野で良く知られている。
上記した診断方法における使用のためのＳｐ３５抗体は本明細書に別途記載する通りＳｐ３５遺伝子産物に特異的に結合する何れかのＳｐ３５抗体を包含する。
ＸＩ．イムノアッセイ
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は当該分野で知られた何れかの方法により免疫特異的結合に関して試験してよい。使用できるイムノアッセイは限定しないが、少し例を挙げればウエスタンブロットのような手法を用いた競合的及び非競合的な試験系、ラジオ免疫学的検定試験、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降試験、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散試験、凝集試験、補体固定試験、免疫放射線試験、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイを包含する。そのような試験は定型的であり当該分野で良く知られている（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ等、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４））を参照できる。例示されるイムノアッセイを以下に概説する（限定する意図はない）。
免疫沈降プロトコルは一般的に蛋白ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％
Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解すること、目的の抗体を細胞溶解物に添加すること、４℃において所定時間（例えば１〜４時間）インキュベートすること、プロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加すること、４℃で約１時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液でビーズを洗浄すること、及びＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁することを含む。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は例えばウエスタンブロット分析により試験できる。抗体の抗原への結合を増大させ、バックグラウンドを低下させるために変更できるパラメーターに関しては当業者の知る通りである（例えば細胞溶解物をセファロースビーズで予備清浄化すること）。免疫沈降プロトコルに関するこれ以上の考察は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）、１０．１６．１を参照できる。
ウエスタンブロット分析は一般的に蛋白試料を製造すること、ポリアクリルアミドゲル（例えば８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗原の分子量による）中の蛋白試料の電気泳動、蛋白試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロンのような膜に移すこと、ブロッキング溶液（例えばＰＢＳ＋３％ＢＳＡ又はノンファットミルク）中で膜をブロッキングすること、洗浄緩衝液（例えばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（目的の抗体）で膜をブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液で洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した酵素基質（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（例えば３２Ｐ又は１２５Ｉ）にコンジュゲートした二次抗体（一時抗体を認識する、例えば抗人抗体）で膜をブロッキングすること、洗浄緩衝液で膜を洗浄すること、及び抗原の存在を検出すること、を含む。検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを低減するために変更できるパラメーターに関しては当業者の知る通りである。ウエスタンブロットプロトコルに関するこれ以上の考察は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｖｏｌ．１（１９９４）、１０．８．１を参照できる。
ＥＬＩＳＡは抗原を製造すること、抗原で９６穴マイクロタイタープレートのウェルをコーティングすること、ウェルに酵素基質（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物にコンジュゲートした目的の抗体を添加すること及び所定時間インキュベートすること、そして抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいては目的の抗体は検出可能な化合物にコンジュゲートする必要はなく；むしろ、検出可能な化合物にコンジュゲートした第２の抗体（目的の抗体を認識する）をウェルに添加してよい。更に又、抗原でウェルをコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてよい。この場合、検出可能な化合物にコンジュゲートした第２の抗体は目的の抗原の添加の後にコーティングされたウェルに添加してよい。検出されるシグナルを増大させるために変更できるパラメーター、並びに当該分野で知られたＥＬＩＳＡの他の変形例は当業者の知る通りである。ＥＬＩＳＡに関するこれ以上の考察は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）、１１．２．１を参照できる。
抗原に対する抗体の結合親和性及び抗体−抗原相互作用のオフレートは競合的結合試験により測定できる。競合的結合試験の１つの例は漸増量の未標識抗原の存在下に目的の抗体と共に標識された抗原（例えば３Ｈ又は１２５Ｉ）をインキュベートすること、及び標識された抗原に結合した抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性及び結合オフレートはスカッチャードプロット分析によりデータから求めることができる。第２の抗体との競合もまたラジオイムノアッセイを用いて測定できる。この場合、漸増量の未標識の第２の抗体の存在下に標識された化合物（例えば３Ｈ又は１２５Ｉ）にコンジュゲートした目的の抗体と共に抗原をインキュベートする。
本発明のＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体は更に、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡又は非免疫学的試験の場合のように、癌抗原遺伝子産物又はその保存された改変体又はペプチドフラグメントのインサイチュの検出のために、組織学的に使用される。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出すこと、そしてそれに好ましくは生物学的試料上に標識された抗体（又はフラグメント）を積層することにより適用された、標識されたＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体を適用することにより行ってよい。そのような操作法を使用することにより、Ｓｐ３５蛋白、又は保存された改変体又はペプチドフラグメントの存在のみならず、検査組織中のその分布も測定することが可能となる。本発明を用いることにより、広範な種類の組織学的方法（例えば染色操作法）の何れもそのようなインサイチュ検出を達成するために変更できることを当業者は容易に察知することになる。
Ｓｐ３５遺伝子産物又はその保存された改変体又はペプチドフラグメントに関するイムノアッセイ又は非イムノアッセイは典型的には、試料、例えば生物学的流体、組織抽出物、新しく採取した細胞、又は細胞培養物中でインキュベートされている細胞の溶解物を、Ｓｐ３５遺伝子産物又はその保存された改変体又はペプチドフラグメントに結合することができる検出可能に標識された抗体の存在下にインキュベートすること、及び、当該分野で良く知られている多くの手法の何れかにより結合抗体を検出することを含む。
生物学的試料は固相支持体又は担体、例えばニトロセルロース、又は細胞、細胞粒子、又は可溶性蛋白を固定化することができる他の固体支持体と接触させ、その上に固定化してよい。次に支持体を適当な緩衝液で洗浄し、次に検出可能に標識されたＳｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体で処理する。次に固相支持体を再度緩衝液で洗浄し、未結合の抗体を除去してよい。場合により抗体をその後標識する。次に固体支持体上の結合標識の量を従来の手段により検出してよい。
「固相支持体または担体」とは抗原又は抗体に結合することができる何れかの支持体を意図している。よく知られた支持体又は担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然又は修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩、及び磁鉄鉱を包含する。担体の性質は本発明の目的のためにはある程度まで可溶性又は不溶性の何れかであることができる。支持体物質はカップリングされた分子が抗原又は抗体に結合可能である限り、実質的に如何なる可能な構造配置を有することもできる。即ち、支持体配置はビーズの場合のように球状であるか、又は試験管内部表面又はロッドの外部表面の場合のように円筒状であってよい。或いは、表面はシート、試験ストリップ等のように平板であってよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズを包含する。当業者であれば抗体又は抗原に結合するための多くの他の適当な担体を知っており、或いは定型的な実験を使用することによりこれらを確認することができる。
Ｓｐ３５抗体、又はその抗原結合フラグメント、改変体、又は誘導体の所定のロットの結合活性は良く知られた方法に従って測定してよい。当業者であれば定型的な実験により各測定のための作動可能で最適な試験条件を調べることができる。
抗体−抗原相互作用の親和性を計測するために使用できる種々の方法があるが、速度定数を求めるためのものは比較的少ない。方法の大部分は抗体又は抗原の何れかの標識に依存しているが、これは最終的には定型的な計測を複雑化し、そして計測された量に不確実性を導入する。
ＢＩＡｃｏｒｅ上で実施される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は抗体−抗原相互作用の親和性を計測する従来の方法を超えた多くの利点を与え、即ち、（ｉ）抗体又は抗原の何れも標識する必要がなく；（ｉｉ）抗体を事前に精製する必要はなく、細胞培養物の上澄みを直接使用でき；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体の相互作用の迅速な半定量的比較を可能とするリアルタイムの計測が可能となり、そして多くの評価目的のために十分であり；（ｉｖ）一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できるような生物特異的表面を再生することができ；（ｖ）分析の操作法が完全に自動化され、広範なシリーズの計測をユーザーの介入なく実施できる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、バージョン ＡＢ（１９９８年増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、バージョン ＡＢ（１９９８年増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８４。
ＳＰＲ系の結合試験は結合対の１メンバーがセンサー表面に固定化されることを必要とする。固定化された結合相手をリガンドと称する。溶液中の結合相手は分析対象と称する。一部の場合においては、リガンドはキャプチャー分子と称される別の固定化分子への結合を介して表面に間接的に結合する。ＳＰＲ応答は分析対象の結合又は解離に応じた検出器表面における質量濃度の変化を反映している。
ＳＰＲに基づけば、リアルタイムＢＩＡｃｏｒｅ計測は相互作用を直接、その発生時にモニタリングする。その手法は速度論的パラメーターの測定に極めて適している。比較親和性順位づけは実施が非常に簡素であり、そして速度論的および親和性の定数の両方がセンサーグラムデータから誘導できる。
分析対象をリガンド表面を通過する個別のパルスにおいて注入すると、得られるセンサーグラムは３つの本質的な相、即ち（ｉ）試料注射間のリガンドとの分析対象の会合；（ｉｉ）分析対象結合の速度が複合体からの解離により均衡される試料注射の間の平衡又は定常状態；（ｉｉｉ）緩衝液流動の間の表面からの分析対象の解離、に分割できる。
会合及び解離の相は分析対象−リガンド相互作用の速度論的特徴に関する情報を与える（ｋａ及びｋｄ、複合体の形成及び解離の速度、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡相は分析対象−リガンド相互作用の親和性に関する情報を与える（ＫＤ）。
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアは数的積分及びグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を用いる曲線フィッティングのための包括的な方策を与える。データの適当な分析があれば、相互作用に関する分離速度及び親和性定数が簡素なＢＩＡｃｏｒｅ検査により得られる。この手法により計測できる親和性の範囲はｍＭからｐＭまで極めて広範囲である。
エピトープ特異性はモノクローナル抗体の重要な特性である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いたエピトープのマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ又は他の表面吸着法とは対照的に、標識又は精製された抗体を必要とせず、そして、数種のモノクローナル抗体の配列を用いた多重部位特異性試験を可能にする。更に又、多数の分析を自動で処理できる。
ペアワイズな結合実験は同じ抗原に同時に結合する２つのＭＡｂの能力を試験する。別個のエピトープに対して指向されたＭＡｂは独立して結合するのに対し、同一又は緊密に関連したエピトープに対して指向されたＭＡｂはお互いに他方の結合を妨害する。ＢＩＡｃｏｒｅによるこれらの結合試験は解り易く実施される。
例えば、第１のＭＡｂに結合するためにキャプチャー分子を使用でき、その後抗原及び第２のＭＡｂを逐次的に付加させることができる。センサーグラムは、１．抗原のどのような量が第１のＭＡｂに結合したか、２．第２のＭＡｂのどの程度が表面結合抗原に結合したか、３．第２のＭＡｂが結合しない場合、ペアワイズ試験の順序を逆にすることで結果が変わるかどうか、を明らかにする。
ペプチド抑制はエピトープマッピングのために使用されるもう１つの手法である。この方法はペアワイズ抗体結合試験を補充することができ、そして抗原の一次配列が既知である場合に機能的エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。ペプチド又は抗原フラグメントは固定化された抗原への種々のＭＡｂの結合の抑制に関して試験される。所定のＭＡｂの結合を妨害するペプチドはそのＭＡｂにより定義されるエピトープに構造的に関連していると推定される。
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当該分野の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の手法を採用する。そのような手法は文献において十分に説明されている。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ
Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ 編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編、（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照できる。
抗体操作の一般的原理はＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。タンパク質操作の一般原理は、 Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．等、Ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理はＮｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；及びＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に記載されている。更に又、当該分野で知られており、特に説明しなかった免疫学における標準的な方法を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ） ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ −Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）およびＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載される通り、一般的には追従した。
免疫学の一般的原理を記載した標準的な参考文献はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．等編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．等編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｄｔ ａｎｄ Ｂａｒｂａｒａ Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６ｔｈ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００３）を包含する。
上記において引用される参考文献全て、並びに本明細書において引用した参考文献全ては、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
（実施例１）Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞の生物学的特徴に関与する。
稀突起神経膠細胞はＡ２Ｂ５先祖細胞（Ａ２Ｂ５を発現する）から分化して前髄鞘形成の稀突起神経膠細胞（Ｏ１及びＯ４を発現する）となり、そして最終的に成熟した髄鞘形成の稀突起神経膠細胞（Ｏ１、Ｏ４及びＭＢＰを発現する）に至る、数個の発生段階を経て成熟する。即ち、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４及びＭＢＰマーカーの有無をモニタリングすることにより、所定の細胞の発生段階を決定すること、及び、稀突起神経膠細胞の生物学的特徴におけるＳｐ３５−Ｆｃの役割を評価することが可能になる。稀突起神経膠細胞の生物学的特徴に関する一般的検討は例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）を参照できる。
Ｏ４、ＭＢＰ及びＣＮＰａｓｅに対するモノクローナル抗体はＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓから入手し；ＡＰＣに対するモノクローナル抗体（クローンＣＣ−１；参照番号２９）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。他の抗体はβＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ｓｐ３５（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、Ｆｙｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びホスホ−Ｆｙｎ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に対するものであった。Ａ２Ｂ５に対するモノクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎより入手できる。Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞において発現される。
精製ラットＰ１３ＣＧニューロン、Ｐ２稀突起神経膠細胞、及びＰ４星状細胞の培養物中のＳｐ３５の発現を逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．より入手したキットを用いながら製造元の説明書に従ってラット脳からｍＲＮＡを抽出した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲはフォワードプライマー５’ＡＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡ３’（配列番号３４４）及びリバースプライマー５’ＡＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴ３’（配列番号３４５）を用いて実施し、ニューロンにおける高発現、稀突起神経膠細胞におけるより低値の発現、そして星状細胞における無発現が示された。
稀突起神経膠細胞におけるＳｐ３５の発現は成熟ラット視神経から誘導した切片におけるインサイチュのハイブリダイゼーションにより確認した。ラット視神経切片はＭｉ等、“Ｓｐ３５ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｇｏ−６６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｐ７５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）に記載の通り作成して処理し、そしてＳｐ３５コーディング配列の最初の５００ヌクレオチドを用いながらジゴキシゲニン標識Ｓｐ３５アンチセンス又はセンスＲＮＡでプローブした。切片はチラミドシグナル増幅キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び蛍光抗ジゴキシゲニンコンジュゲート抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いながら製造元の説明書に従って染色した。複合したインサイチュ及び免疫蛍光の分析を組み合せるためには、切片をまずジゴキシゲニン標識ＲＮＡで、次いで抗体、例えばＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；成熟稀突起神経膠細胞のマーカー）又は抗Ｓｐ３５抗体でプローブした。本発明者等はアンチセンスＳｐ３５プローブにハイブリダイズする稀突起神経膠細胞はＣＣ１に対する抗体でも同時染色されることを観察している（データ示さず）。センスＳｐ３５プローブを用いた場合には特異的標識は観察されなかった。稀突起神経膠細胞におけるＳｐ３５の発現はまた、Ｐ７ラット皮質の側脳室領域から得た組織切片の免疫組織化学的試験でも確認された。ＣＣ１抗体で標識された皮質細胞の大部分は抗Ｓｐ３５抗体によっても標識された。データ示さず。相互作用の特異性はＳｐ３５−Ｆｃ（実施例２参照）を用いた抗Ｓｐ３５抗体の予備吸着により確認し、これによりシグナルは消失した。
Ｓｐ３５発現のＳｐ３５特異的ＲＮＡｉノックダウンは稀突起神経膠細胞の成長及び分化を促進する。
Ｓｐ３５特異的ＲＮＡｉを用いて稀突起神経膠細胞前駆細胞におけるＳｐ３５発現を排除することによりＳｐ３５がどのように稀突起神経膠細胞の成長及び分化に寄与するかを調べた。５０，０００個のＡ２Ｂ５稀突起神経膠細胞前駆細胞を以下の通り製造したＳｐ３５特異的ＲＮＡｉ配列又は対照ＲＮＡｉ配列を担持するレンチウイルスに感染させた。
候補の小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のために使用する相同領域を発見するためにネズミ及びラットのＳｐ３５ＤＮＡ配列を比較した。Ｓｐ３５ＲＮＡｉのレンチウイルス発現のためのＣＨ３２４は、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５及びＬＶ１−０３６をアニーリングし、そしてＨｐａＩ及びＸｈｏＩ消化ｐＬＬ３．７にライゲーションすることにより構築した。ｐＬＬ３．７ベクター、追加的な方法、及びウイルスの製造はＲｕｂｉｎｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−０６（２００３）に記載されている。Ｓｐ３５ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはＭＷＧから購入し、そして以下の配列、即ちＬＶ１−０３５（センスオリゴ）５’-ＴＧＡ ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｃ-３’（配列番号３４６）及びＬＶ１−０３６（アンチセンスオリゴ）５’-ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＴ ＣＡ-３’（配列番号３４７）を有する。
対照ＲＮＡｉは小文字で示すヌクレオチドの変化以外は同じオリゴヌクレオチド配列を有するように設計、即ち：５’−ＴＧＡ ＴＣｃ ＴＣＡ ＴｃＣ ｔｔＣ Ｔａｔ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴｇＴ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡｃＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡ−３’（配列番号３４８）及び５’−ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＴａ ＴＡＧ ａＡＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＴ ＣＡ−３’（配列番号３４９）とした。
レンチウイルス製造の前に、ｐＬＬ３．７由来のＤＮＡ又はｐＬＬ３．７中の候補ｓｈＲＮＡを６ウェルフォーマットにおいてＣＨＯ細胞内に５対１の比においてネズミＳｐ３５−ＨＡタグプラスミドで同時トランスフェクトした。ノックダウンはトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の溶解物に由来するＳｐ３５−ＨＡタグのウエスタンブロット検出により、並びに、２連のウェルから調製した全ＲＮＡのノーザンブロットにより分析した。ブロットをＳｐ３５ｃＤＮＡのフラグメントでプローブした。試験はトランスフェクション後４８時間に実施した。予測された通り、対照処理細胞と相対比較してＣＨ３２４ＲＮＡｉ処理ＣＨＯ細胞においてはＳｐ３５ｍＲＮＡの１０倍低減が観察された。データは示していない。緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）担持ＲＮＡｉレンチウイルスはＲｕｂｉｎｓｏｎ等の記載の通りに形成した。対照又はＳｐ３５ＲＮＡｉの何れかで処理した培養物において、稀突起神経膠細胞の約８０％がＧＦＰ陽性であった。総細胞数はＲＮＡｉ処理により変化しなかった。分化に対するＲＮＡｉの作用を定量するために、ＧＦＰ発現稀突起神経膠細胞のみを計数した。
稀突起神経膠細胞のリッチ化された集団を以下の通り変更を加えたＣｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９０）の記載に従って雌性Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓＰ２ラットから生育させた。慨すれば、前脳を切開し、Ｈａｎｋ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。組織を１ｍｍの断片に切り出し、そして０．０１％トリプシン及び１０μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ中で１５分間３７℃でインキュベートした。解離した細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングＴ７５組織培養フラスコ上にプレーティングし、そして２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ培地中１０日間３７℃で生育させた。稀突起神経膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）は３７℃で２００ｒｐｍにおいて一夜フラスコを振とうすることにより採集し、９５％純度の集団を得た。培養物は１週間ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した高グルコースダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦを除去することによりＡ２Ｂ５＋細胞は３〜７日後にＯ４＋前髄鞘形成稀突起神経膠細胞に、そして７〜１０日後にＯ４＋及びＭＢＰ＋成熟稀突起神経膠細胞に分化した。これらの分化状態は形態の変化から容易に明確化され、即ちＡ２Ｂ５＋細胞は二極性の形状であり、Ｏ４＋前髄鞘形成稀突起神経膠細胞はより長くより多く分枝した突起を有し、そしてＭＢＰ＋成熟稀突起神経膠細胞は突起の間にミエリンシート構造を含有している。
Ａ２Ｂ５稀突起神経膠細胞前駆体細胞にＣＨ３２４ＲＮＡｉ含有レンチウイルスを感染させた。得られた細胞を３日間培養し、Ｏ４−陽性（稀突起神経膠細胞分化のマーカー）稀突起神経膠細胞の数を計数した。内因性Ｓｐ３５発現はＳｐ３５ＲＮＡｉレンチウイルス感染により低減し、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された。Ｓｐ３５の低減は、細胞突起の長さの増大により、そして豊富なミエリンシート構造の存在により明らかな通り、対照感染細胞と比較してより高度に分化した成熟稀突起神経膠細胞をもたらした（データ示さず）。Ｓｐ３５ＲＮＡｉを発現した細胞においては、対照培養物よりも３倍多い成熟（Ｏ４−陽性）稀突起神経膠細胞が存在していた。これらのデータはＳｐ３５が稀突起神経膠細胞の分化を負の方向に調節していることを示している。
優性阻害Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞の成長及び分化を促進する。
Ｓｐ３５の野生型及び優性阻害型を発現するレンチウイルスベクターを構築した。マウス完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜６１４）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより、プライマー５’-ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＧ-３’（配列番号３５０）及び５’-ＧＧＧ ＧＣＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧ−３’（配列番号３５１）を用いながら増幅し、そしてＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ部位においてＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターに挿入した。同様に、優性阻害Ｓｐ３５（ＤＮ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５８１）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＴによりプライマー５’-ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＧ-３’（配列番号３５２）及び５’-ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＣＣＣ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ −３’（配列番号３５３）を用いながら増幅した。Ｒｕｂｉｎｓｏｎ等、“Ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−０６（２００３）に記載の通りＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトすることによりレンチウイルスを作成した。稀突起神経膠細胞は細胞当たり２ＭＯＩでレンチウイルスに感染させ、そしてウエスタンブロットによりＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５の発現を確認した。
ＤＮ−Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞の分化を促進し、成熟稀突起神経膠細胞の数の増大をもたらした。これとは対照的に、完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５）の過剰発現は反対の作用を有し、そして対照と比較した場合の成熟稀突起神経膠細胞の数の低減により明らかな通り、分化を抑制した（データは示していない）。
（実施例２）
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白の構築及び精製
Ｓｐ３５の生物学的機能を試験するためにヒトＳｐ３５の細胞外部分（残基１〜５３２）をヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ領域に融合させたコンストラクトを作成した。ヒトＳｐ３５の部分的コーディング配列はＰＣＲによりクローン２２７．２からフォワードプライマー５’-ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＣＧ Ｔ-３’（配列番号３５４）及びリバースプライマー５’-ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＧＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＧＡ ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧ-３
’（配列番号３５５）を用いながら得た。
平滑末端ＰＣＲ産物をＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆＩ部位にサブクローニングし、ＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５を作成した。ＳａｌＩフラグメントをＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５から単離し、ＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰの誘導体）内にサブクローニングした。ＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクターにおいて、ヒンジ及びＦｃガンマ配列をＳａｌＩ（５’）〜ＮｏｔＩ（３’）フラグメントとしてサブクローニングされる。ＳａｌＩＳｐ３５フラグメントをＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクターのＳａｌＩ部位にサブクローニングすることによりＳｐ３５シグナル配列及び細胞外ドメイン（コドン１〜５３２）をヒトＩｇ１のヒンジ及びＦｃ領域をコードする配列とインフレームに融合した。正しい単離株を同定し、そしてＳｐ３５Ｆｃフラグメントを包含するＮｏｔＩフラグメントをＣＨＯ発現ベクター、ＰＶ９０（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）の単一のＮｏｔＩクローニング部位にサブクローニングした。得られたプラスミドはＤＮＡ配列決定により確認し、そしてＧＴ１２３と標記した。
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白を発現する安定な細胞系を、プラスミドＧＴ１２３を用いながらＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４のエレクトロポレーションにより作成した。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１０％透析血清及び４ｍＭグルタミンの存在下アルファマイナスＭＥＭ中で培養することによりヌクレオシド非依存性生育に関して選択した。トランスフェクション後１４日、細胞に新しい培地を与えた。Ｓｐ３５−Ｆｃを発現する細胞をスクリーニングするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリスリン（ＰＥ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）で標識し、そしてＦＡＣＳＭｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）における高速フローサイトメトリーソーティングに付した。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現した細胞を選択した。これらの細胞を７日間培養物中で増殖させ、次に再標識し、再ソーティングした。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現している細胞を９６穴プレート中の個々のクローンとして単離した。これらのクローンを２週間生育させ、そして次に新鮮培地を１日与えた後にＦＡＣＳ分析に付すことにより発現レベルを確認した。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現したクローンを増殖させ、凍結細胞バンクを樹立した。細胞系を血清非含有培地ＢＣＭ１６中の懸濁培養における生育に適合させた。これらのクローンにより生産されたＳｐ３５−Ｆｃの力価は、細胞系を３７℃で４〜５継代生育させ、次に細胞を５０％最大細胞密度まで生育させ、そしてそれらを１０〜１５日間２８℃において生存細胞密度が７５％に低下するまで培養することにより、測定した。この時点において、培地を採取し、細胞及び破砕片を遠心分離により除去し、そして培養上澄みのＳｐ３５−Ｆｃレベルに関して、プローブとして抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を用いながらウエスタンブロット分析により力価測定した。
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白は以下の通り清澄化された培地から精製した。即ち、９ｍｌの１ＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５をコンディショニングされた培地９００ｍｌに添加した。培地を３時間４℃でプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３ｍｌ上にバッチ負荷した。樹脂を１．５ｃｍ（ＩＤ）カラム内に収集し、そしてＰＢＳ３ｍｌで４回、そして８００ｍＭＮａＣｌ含有ＰＢＳ４ｍｌで２回、次いで再度ＰＢＳ３ｍｌで洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃは１．５ｍｌ画分において２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８及び１００ｍＭＮａＣｌでカラムから溶離させ、そして０．５ＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を７５μｌ添加することにより中和した。ピーク蛋白含有画分を２８０ｎｍの吸光度により識別し、プールし、そして１ｍＬプロテインＡカラム上の追加的精製に付した。負荷の前に、ＮａＣｌを６００ｍＭまで、そしてＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５を５０ｍＭまで添加した。カラムを６００μｌの１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５及び１ＭＮａＣｌで２回洗浄し、次に１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃは２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８及び１００ｍＭＮａＣｌでカラムから溶離させ、０．５ｍｌ画分を収集し、そして０．５ＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を２５μｌ添加することにより中和した。ピーク蛋白含有画分を２８０ｎｍの吸光度により識別し、プールした。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｓｐ３５−Ｆｃ蛋白は見かけの質量９０ｋＤａの単一のバンド（＞９５％純度）として移動した。非還元条件下においては、蛋白は１８０ｋＤａの概ねの質量を有する２量体として泳動した。精製されたＳｐ３５−Ｆｃ蛋白を小分量ずつに分け、−７０℃で保存した。
（実施例３）
Ｓｐ３５特異的モノクローナル抗体の製造
本発明のＳｐ３５ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｓｐ３５抗体を以下の方法及び操作法を用いて作成した。
Ａ．抗体スクリーニング試験
１．ＥＬＩＳＡ試験
Ｓｐ３５−Ｆｃ（５０μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０中０．５μｇ）を９６穴のＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ（商標））の各ウェルに添加した。次にプレートを３７℃で１時間、又は４℃で１６時間インキュベートした。プレート上の非特異的結合部位は、０．１％ＢＳＡ、０．１％卵白アルブミン、０．１％（１５０ｍＭＮＡＣＥ中５％（ｗ／ｖ）非ファットドライミルク）および０．００１％アジドを含有する２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４を用いてブロッキングした。血清又はハイブリドーマ上澄みの希釈（例えば連続３倍希釈）物をプレートの各列に渡って添加し、そして２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）の１：１０，０００希釈物５０μｌを各ウェルに添加し、そして更に１時間インキュベートした。３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、２Ｍ硫酸で停止させた。色の強度を４５０ｎｍにおいて分光光度計でモニタリングした。
２．ＦＡＣＳ試験
ＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ細胞を０．１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で供給元の記載に従って標識した。等しい容量のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）標識対照細胞を洗浄したＳｐ３５−ＣＯＳ−７細胞又はＳｐ３５−ＣＨＯ細胞（Ｓｐ３５発現ベクターの一過性トランスフェクションにより作成）と混合した後に、抗Ｓｐ３５被験血清又はハイブリドーマ上澄みと共にインキュベートした。細胞混合物５０マイクロリットルを９６穴Ｖ底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８７７、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに分注し、そして１００μｌのマウス血清、ハイブリドーマ上澄み、又は対照抗Ｓｐ３５抗体を添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中のフィコエリスリンコンジュゲートアフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧＦｃガンマ特異的二次抗体（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）５０μｌと共にインキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳ２００μｌ中に懸濁し、そしてＦＡＣＳ分析に付した。或いは、Ｓｐ３５−ＣＯＳ−７細胞又はＳｐ３５−ＣＨＯ−細胞をマウス血清又はハイブリドーマ上澄みと混合し、そして次にＲ−フィコエリスリンコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体で処理し、そして標準的なＦＡＣＳ分析に直接付した。
Ｂ．ネズミモノクローナル抗Ｓｐ３５抗体のハイブリドーマ製造
８週齢の雌性ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、２週毎に１回、実施例２に記載の通り製造したＳｐ３５−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ領域に融合した配列番号２のアミノ酸３４〜５３２）５０μｇを含有する乳液で腹腔内免疫化するか、又は、ヒトＳｐ３５−Ｆｃ５０μｇ及び完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０μｌを含有する乳液で腹腔内免疫化した。免疫化したマウスの血清を初回免疫化前、及び第２及び第３の免疫化の１週間後に収集し、そして抗Ｓｐ３５抗体の抗体価を上記した通りＳｐ３５発現ＣＯＳ−７細胞上のＦＡＣＳ試験により計測した。ブースター最終用量を第３免疫化後及びハイブリドーマ融合開始の３日前に与えた。
種々のＳｐ３５ペプチドで免疫化したマウスに由来する血清を上記した通りＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。Ｓｐ３５発現ＣＯＳ−７細胞に特異的に結合する抗体に対して陽性であるマウスは、上記した通りフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で識別し、そして屠殺した。脾細胞をマウスから単離し、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、編Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．，ＭｃＫｅａｒｎ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ，Ｋ．Ｂ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）に記載の通りＦＬ６５３骨髄腫（Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫のＡＰＲＴ−誘導体、１０％ＦＢＳ、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、４ｍＭＬ−グルタミン、及び２０ｍｇ／ｍｌ８−アザグアニンを含有するＤＭＥＭ中に維持））に融合した。融合細胞は２４又は４８穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）にプレーティングし、そしてアデニン、アミノプテリン及びチミジン（ＡＡＴ、入手元Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有培地を供給した。ＡＡＴ耐性培養物をＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーにより上記した通りＳｐ３５−ＣＯＳ−７細胞又はＳｐ３５−Ｆｃの何れかへの結合に関してスクリーニングした。陽性のハイブリドーマを更に限界希釈によりサブクローニングした。
Ｓｐ３５−Ｆｃで免疫化したマウスから生産されたモノクローナル抗体を生産する１７ハイブリドーマ細胞系を単離した。ハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体の特性を表３Ａ及び３Ｂに示す。
モノクローナル抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３及び３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲで単離し、クローニングし、そして以下の方法による配列分析に付した。全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いながらハイブリドーマ細胞から抽出し、そしてｃＤＮＡを、標準的条件を用いながらＲＴＰＣＲにより単離されたＲＮＡから形成した。プライマーのカクテルをＲＴ−ＰＣＲ用に使用した。プライマーの好ましいセットはシグナル配列にハイブリダイズするプライマーの５’及びＦＲ４／定常ドメイン接合部の定常ドメイン３’にハイブリダイズするプライマーの３’末端を有するプライマーを包含するものとした。これによりモノクローナル抗体のＮ末端及びＶ／Ｃ接合部に関して曖昧さを有さない未損傷の可変ドメインの増幅が可能となる。当業者に知られる通り、プライマーセットは異なる鋳型の増幅のため、及び異なるＰＣＲ条件に対して、変更が必要となる。場合によっては、高度に豊富な非生産的メッセージ（例えば融合相手からのＣＤＲ３−ＦＲ４フレームシフト非生産的軽鎖）又は非特異的な生産的メッセージの存在が発生し、そして可変鎖のクローニングを複雑化する場合がある。１つの解決策は真正な精製された抗体に由来するＮ末端配列データを使用することにより縮重したプライマーを設計し、クローニングを可能にすることである。或いは、可変ドメインのＮ及びＣ末端を「固定」する（即ちＦＲ１のＮ末端及びＦＲ４のＣ末端がプライマー決定性である）、Ｏｒｌａｎｄｉ等、ＰＮＡＳ８６：３８３３（１９８９）に記載のもののような「ユニバーサルフレームワーク」を使用することもできる。
更に又、より効果的なプライマーを設計するための配列データは、ゲル精製され、次に配列決定されている大量ＲＴ−ＰＣＲ産物から得ることができる。ＰＣＲ産物は又例えばＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながらサブクローニングし、次に配列決定することもできる。次にコンセンサス配列を確実に樹立するために、配列データを多数の独立したサブクローン又はゲル精製フラグメントから得る。
Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７の軽鎖の配列は５’ネズミカッパ軽鎖シグナル配列プライマー：（ｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ３’（配列番号３５６）、（ｉｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＲＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＫＡＣ ＹＣＡ ＧＧＴ ＣＴＴ ＹＲＴ Ａ３’（配列番号３５７）、（ｉｉｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＧＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｇ３’（配列番号３５８）、及び（ｉｖ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＫＣ ＣＣＣ ＷＧＣ ＴＣＡ ＧＹＴ ＹＣＴ ＫＧＧ Ａ３’（配列番号３５９）、及び単一の３’ネズミカッパ定常ドメインプライマー：５’ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＡ３’（配列番号４）のカクテルを用いて測定し、ここでＫ＝Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ及びＹ＝Ｃ／Ｔである。得られたＰＣＲ産物をサブクローニングし、そして多数の独立したサブクローンを配列決定した。推定されたコンセンサス配列はＥｄｍａｎ分解による配列決定データと合致していた。配列決定は縮重シグナル配列５’プライマー５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＲＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＫＡＣ ＹＣＡ ＧＧＴ ＣＴＴ ＹＲＴ Ａ３’（配列番号３５７）が増幅の間に３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７軽鎖可変ドメインをもたらしたものであったことを示していた。
３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７重鎖配列はネズミ重鎖シグナル配列５’ＰＣＲプライマー（ｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＲ ＡＴＧ ＳＡＧ ＣＴＧ ＫＧＴ ＭＡＴ ＳＣＴ ＣＴＴ３’，（配列番号３６０）（ｉｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＲＡ ＣＴＴ ＣＧＧ ＧＹＴ ＧＡＧ ＣＴＫ ＧＧＴ ＴＴＴ３’（配列番号３６１）及び（ｉｉｉ）５’ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＴ３’（配列番号３６２）、及び縮重ネズミＩｇＧＣＨ１定常ドメイン３’プライマー５’ＡＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＹＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＲＲＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ３’（配列番号３６３）のカクテルを用いて測定し、ここでＫ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝ Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＹ＝Ｃ／Ｔである。種々の異なるサイクリング条件でこのプライマーカクテルを用いたＰＣＲは、推定されたＮ末端が精製された３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７抗体のＥｄｍａｎ分解配列により求められたものと合致する重鎖可変ドメイン配列を与えることができなかった。従って本発明者等は重鎖ユニバーサルプライマーＦＲ１ ５’ＡＧＧ ＴＳＭ ＡＲＣ ＴＧＣ ＡＧＳ ＡＧＴ ＣＷＧ Ｇ３’（配列番号３６４）及びＦＲ４ ５’ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ Ｇ３’（配列番号３６５）を使用し、ここでＭ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、及びＷ＝Ａ／Ｔである。このセットは推定配列が実験的な３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７のデータと合致するネズミ重鎖可変ドメインを与えた。
重鎖可変ドメインＮ及びＣ末端が真正であり、プライマー決定性でないことを確認するために、別のＰＣＲ反応を縮重シグナル配列プライマー５’ ＡＴＧ ＧＡＲ ＴＧＹ ＡＡＹ ＴＧＧ ＡＴＨ ＣＴＮ ＣＣＮ ＴＴＹ Ａ３’（配列番号３６６）及び上記定常ドメイン３’プライマー５’ＡＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＹＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＲＲＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ３’（配列番号３６７）を用いて実施し、ここでＨ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＹ＝Ｃ／Ｔである。縮重シグナル配列プライマーの設計は上記「ユニバーサルプライマー」によるＰＣＲ反応から得られた３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７のコンセンサス推定ＦＲ１配列に関してクエリされたＧｅｎｂａｎｋげっ歯類配列データベースのＴＦＡＳＴＡ検索から誘導された最良ヒットのシグナル配列に基づいた。このＰＣＲは完全なネズミ重鎖可変ドメインを有する産物を与えた。
ヒトＩｇＧ１及びカッパ定常ドメインｃＤＮＡと結合して完全な３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７ネズミ可変ドメインを使用（制限部位を導入するために必要に応じてサイレントな突然変異誘発を伴う）することによりそれぞれキメラ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを構築した。完全長の免疫グロブリンｃＤＮＡを市販のＥＢＶ哺乳類細胞エピソーム発現ベクターｐＣＥＰ４の誘導体であるｐＮＥ００１と称される発現ベクター内にサブクローニングした。重鎖及び軽鎖の発現ベクター（それぞれｐＸＷ３７２及びｐＸＷ３６３と称する）を２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞のコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析（ヒトＩｇＧ特異的試薬でプローブ）によれば、キメラ３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７−ｈｕＩｇＧ１、カッパｍＡｂの発現が確認された。得られた３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７のＶＨ及びＶＬポリペプチド配列は表６及び８に示す通りであり、そしてそれぞれ配列番号１７３及び２０９である。１Ａ７、２Ｆ３、及び３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３モノクローナル抗体に関する重鎖及び軽鎖の配列は同様の方法で決定した。
Ｃ．ファージディスプレイによる抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体の同定
抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントは、参照により全体が本明細書に組み込まれるＨｏｅｔ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：３４４−３４８（２００５）；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９４−２０５（２００３）；及びＫｎａｐｐｉｋ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）に記載の通りファージディスプレイライブラリから同定して単離した。
ヒト化合成抗体可変領域を含むＭｏｒｐｈｏＳｙｓＦａｂ−ファージディスプレイライブラリＨｕＣＡＬ（登録商標） ＧＯＬＤ（”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ−２”、表３Ｂ）を標準的なＥＬＩＳＡ及びＩＨＣスクリーニング法により組み換えヒト可溶性Ｓｐ３５−Ｆｃ蛋白に対してスクリーニングした。例えばＯｓｔｅｎｄｏｒｐ，Ｒ．，Ｆｒｉｓｃｈ，Ｃ．ａｎｄ Ｕｒｂａｎ Ｍ，”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＨｕＣＡＬ（登録商標）．” Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２ Ｎｏｖｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ １３−５２（２００４）を参照できる。Ｓｐ３５に特異的に結合するＦａｂ−ファージを精製し、そして特性化した。これらのファージディスプレイ誘導モノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの特性を「ファージディスプレイライブラリ−２−誘導モノクローナルＦａｂフラグメント」として表３Ｂに示す。単離されたＦａｂ−ファージ１９６８をその後の分析のために選択した。
（実施例４）
抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体によるＳｐ３５の免疫沈降
免疫沈降を実施するために、Ｎ末端においてヘマグルチニン（ＨＡ）タグに融合しているＳｐ３５を発現するＣＯＳ−１細胞を、ＨＡタグを有する完全長Ｓｐ３５蛋白を発現するＤＮＡコンストラクトでＣＯＳ−１細胞を一過性にトランスフェクトすることにより作成した。細胞はトランスフェクションの４８時間後に採取し、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０％グリセロール）中で３０分間４℃で溶解した。１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、上澄みを１時間４℃でプロテインＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共にインキュベートし、そして次に１Ａ７又は２Ｆ３抗Ｓｐ３５ネズミモノクローナル抗体の何れかと共に１時間４℃でインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で煮沸し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そしてＨＡタグを認識する抗体を用いながらウエスタンブロットで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に示される通り、モノクローナル抗体１Ａ７及び２Ｆ３はヒト及びネズミの両方のＳｐ３５（図１）を強力に免疫沈降させた。図１に示すように、モノクローナル抗体２Ｆ３はヒト及びネズミの両方のＳｐ３５を強力に免疫沈降させたが、ヒトＳｐ３５を強力に免疫沈降させたモノクローナル抗体１Ａ７は、ネズミＳｐ３５蛋白を弱く認識したのみであった。同様にモノクローナル抗体１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｆ３、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、Ｌｉ０１、Ｌｉ０３、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０７、Ｌｉ０８、Ｌｉ１１、Ｌｉ１２、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及び３Ｂ５．２はヒト及びマウス又はヒト及びマウスのＳｐ３５を免疫沈降する（表３Ｂ及び３Ｃ参照）。更に又、Ｌｉ０８はＡＰ−Ｓｐ３５を免疫沈降し、そしてモノクローナル抗体１Ｂ６．４及び３Ｅ３．１は内因性Ｓｐ３５を免疫沈降させている（表３Ｂ参照）。
（実施例５）
ＥＬＩＳＡにより測定したＳｐ３５に特異的に結合する抗Ｓｐ３５抗体
Ｓｐ３５ポリペプチドのどの領域が実施例２で製造された種々のハイブリドーマ及びファージディスプレイ誘導モノクローナル抗体により結合されるのかを調べるために、実施例１に記載の方法によりＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ領域に各々融合されたトランケーションされたＳｐ３５ポリペプチドのパネルを用いてＥＬＩＳＡ試験を実施した。パネルは以下のＳｐ３５フラグメント、即ち：配列番号２のアミノ酸３４〜４２５、配列番号２のアミノ酸４１７〜５３２、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３、及び配列番号２のアミノ酸３４〜５３２よりなるものとした。卵白アルブミン及びＢＳＡを対照として使用した。表３Ｂに示す通り、ハイブリドーマ誘導ｍＡｂｓ２Ｆ３、２Ｂ１０、３Ａ３、３Ｐ４ｃ２．２ｄ２，及び３Ｐ４ｃ８．２ｇ９、及びＦａｂ−ファージ誘導ｍＡｂｓ３３８３、３５６３、３５６４、３５６５、３５６８、３５６９、３５７０，及び３５８２は全て特異的に１−４１７及び１−５３４Ｓｐ３５フラグメントに結合し、これらの抗体がＳｐ３５のＬＲＲ領域におけるエピトープに結合することを示唆していた。ハイブリドーマ誘導Ｍａｂｓ１Ａ７、３Ｐ１Ｂ１１Ｆ９、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６３Ｇ１０．２Ｈ７、２Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６１Ｄ９，及び３９４Ｃ５１Ｄ８、及びＦａｂ−ファージ誘導Ｍａｂｓ３４９５、３５６６、３５６７，及び１９６８は３４−５３２Ｓｐ３５フラグメントに特異的に結合し、そして４１７−５３２Ｓｐ３５には弱く結合し、これらの抗体がＬＲＲ領域のＳｐ３５Ｃ末端の部分を少なくとも包含するエピトープに結合する可能性があることを示唆していた。同様の実験においてこれらの後者の抗体は又ヒトＳｐ３５のアミノ酸３４〜５３４よりなるＳｐ３５ポリペプチドに特異的に結合し、そしてマウス及びラットＳｐ３５に対しては低親和性であった。マウス及びラットＳｐ３５に対するこれらの後者の抗体の親和性は、マウス又はラットのＳｐ３５のアミノ酸４１９をヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）に変更した場合にはヒトＳｐ３５を用いた場合に観察されたレベルに回復した。アルギニンはヒトＳｐ３５の４１９位におけるアミノ酸である。モノクローナル抗体１Ａ７に関するＫＤはヒトＳｐ３５結合に関しては１０ｎＭ（１×１０−９Ｍ）、ネズミＳｐ３５結合に関しては２０μＭ（２×１０−５Ｍ）であることが求められた。４１７〜５３２領域に結合する抗体を検出するためのＡｐ−Ｓｐ３５ＥＬＩＳＡに関しては、ＥＬＩＳＡは以下のとおり実施した。ＭａｂをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次に一夜４℃においてＳｐ３５−ＡＰ融合蛋白、次いで１時間室温でＡＰ−連結抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（１：５，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にか、或いは、一夜４℃でＡＰ−融合蛋白と共にかの何れかによりインキュベートした。次にＡＰ基質を０．１Ｍグリシン、１ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＺｎＣｌ２、ｐＨ１０．５中１０ｍｇ／ｍｌの４ＮＰＰにより発色させ、そしてＯＤ４０５において読み取った。
同様の実験において、モノクローナル抗体３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、並びに７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９抗体のＦａｂフラグメントをＥＬＩＳＡ試験において、ヒトＳｐ３５、Ｓｐ３５の全ＬＲＲ領域、Ｓｐ３５のＩｇ領域、及びネズミＳｐ３５に結合するそれらの能力に関して試験した。表３Ｃに示す通り、３Ｂ５．２、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９及び７Ｐ１Ｄ５．１ＧＦａｂフラグメントはヒト及びネズミのＳｐ３５に結合した。３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９モノクローナル抗体は又Ｓｐ３５のＬＲＲ領域にも結合した。表３Ｃ参照。
組織培養ウェルの底部に固定した３Ｂ５．５モノクローナル抗体を用いたＳｐ３５結合試験において、以下の抗体、即ちＬｉ０３、Ｌｉ０５、Ｌｉ０８、Ｌｉ０１１及びＬｉ０１３のＦａｂフラグメントはＳｐ３５の３Ｂ５．２結合をブロックしなかった。
（実施例６）
ＦＡＣＳにより測定したＳｐ３５に特異的に結合する抗Ｓｐ３５抗体
実施例３に記載の通り作成したハイブリドーマ誘導抗Ｓｐ３５ｍＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３の結合特性を更に特性化するために、マウス又はヒトＳｐ３５を発現している固定されかつ生存しているＣＯＳ−７細胞又は２９３細胞への結合を比較した。Ｓｐ３５トランスフェクト又は非トランスフェクト細胞を固定し、ＦＡＣＳ分析に付した。（ＦＡＣＳ：ヒト又はマウスのＳｐ３５又はベクター対照によりトランスフェクトされた細胞を培養プレートから解離させ、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、１時間氷上で１μｇ／ｍｌにおいて一次抗体と共にインキュベートした。細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、次に３０分間氷上でＰＥ標識二次抗体（１：１００、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を２％ＰＦＡ中に固定し、そしてＰＥによるＦＡＣＳ分析に付した。）ＦＡＣＳの結果は、ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３はＳｐ３５を発現しているＣＯＳ−７又は２９３細胞に結合したが、Ｓｐ３５を発現していない対照細胞には結合しなかったことを示していた（図２）。
同様の実験において、Ｓｐ３５により安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ分析において使用することにより３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９の結合特性を更に特性化した。図１１に示す通り３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９はトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上のＳｐ３５に結合した。特に、３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９抗体はヒト又はネズミのＳｐ３５でトランスフェクトされこれを発現しているＣＨＯ細胞に結合するそれらの能力について試験した。図１１に示す通り、平均蛍光（ＭＣＦ）で計測した場合の３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９抗体が結合した細胞の数は使用した抗体の濃度と共に増大した。更に又、３Ｂ５．２抗体は７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９よりも平均蛍光（ＭＣＦ）で測定した場合により多くの細胞に結合していた。
（実施例７）
神経突起伸長試験
ニューロンに対する例えばＯＭｇｐのようなＣＮＳミエリン抑制剤の抑制作用を逆行させる上記製造したハイブリドーマ誘導及びＦａｂ−ファージ誘導モノクローナル抗体の能力を試験するために、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウェル）を０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））でコーティングした。Ａｐ−ＯＭｇｐ（１μｇ／スポット）又はＰＢＳを３μｌの液滴としてスポットした。次にＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドを洗浄し、そして１０μｇ／ｍｌラミニン（Ｇｉｂｃｏ（商標））でコーティングした。Ｐ６〜７のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット新生仔の脊髄神経節（ＤＲＧ）を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ１型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて解離させ、火炎研磨パスツールピペットで磨砕し、ニューロン細胞をリッチ化するために予備プレーティングし、そして最後に予備コーティングされたＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド上で１００００個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１Ａ７又は２Ｆ３をＤＲＧのプレーティング直後に添加した。培地は５％熱不活性化ドナーウマ血清、５％熱不活性化ウシ胎児血清、及び５０ｎｇ／ｍＬマウス神経成長因子（ｍＮＧＦ）を含有するＦ１２（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）とし、そして６時間３７℃及び５％ＣＯ２においてインキュベートした。インキュベーションの後、スライドを４％パラホルムアルデヒド／２０％スクロース中に固定化し、そして１６時間後に抗βＩＩＩチューブリンＴＵＪ１抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）で染色した。
二次抗体として、１：３００希釈した抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をスライドに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。スライドをＧｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（商標）（Ｂｉｏｍｅｄａ（商標））でカバースリップした。５×のデジタル画像をＯｐｅｎＬａｂ（商標）ソフトウエア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で獲得し、そしてＯＰＥＮＬＡＢ（商標）ソフトウエアを用いながら神経突起伸長の定量のために画像を分析し、これら全てに関し、製造元が特定したパラメーターに従った。
ＭＡｂ１Ａ７及び２Ｆ３の両方とも、神経突起伸長のＯＭｇｐ媒介抑制からＤＲＧニューロンを保護した（図３）。３Ｂ５．２も又神経突起伸長のＯＭｇｐ媒介抑制からＤＲＧニューロンを保護した（データ示さず）。
（実施例８）
モノクローナル抗体１Ａ７はラット脊髄傷害モデルにおいて機能回復を促進する。
脊髄損傷（ＳＣＩ）は以前に報告されている方法（Ｌｉ，Ｓ．等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，１０５１１−１０５２０（２００４））から変更した以下に示す背部上半切開により誘導した。麻酔した雌性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラット（７週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に術前鎮痛剤（ブプレノルフィン／ブプレネックス、０．０５ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）を与え、そして安定剤（ミダゾラム、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）投与し、そして主背内側及び側背の皮質脊髄路（ＣＳＴ）を完全に遮断するように胸椎６／７において背部上半切開を実施した。皮質脊髄路（ＣＳＴ）の背部及び背側部の成分を完全に遮断し、そしてＣＳＴの腹側部分は未損傷のままとした。半切開後に残存している腹側組織架橋（ｖｅｎｔｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｒｉｄｇｅ）は両投与群において索の約２０％を構成していた（データ示さず）。
後肢の機能はＢａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）オープンフィールド採点法（Ｅｂｙ，Ｍ．Ｔ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５３３６−１５３４２（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）を用いて定量し、そして全ての動物はＳＣＩの後には顕著な機能不全を保持しており、手術翌日はほぼ完全な後肢麻痺を有していた。ＣＳＴ離断の直後、Ｔ７においてくも膜下腔内に髄腔内カテーテルを挿入し、皮下腔内に挿入されたプライミングされた小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ２００４型、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ）に連結した。小型浸透圧ポンプはヒトＩｇＧアイソタイプ対照蛋白（５ｍｇ／ｍｌ）又はモノクローナル抗体１Ａ７（４．８ｍｇ／ｍｌ）を５週間に渡り０．２５μｌ／ｈの速度で連続的に送達した。対照（ヒトＩｇＧ処置）動物は実験の５週間の期間に渡りかなりの機能を回復したが、３〜４週間で平衡に達し、最終的には平均ＢＢＢ評点は９±０．４５であった（図７）。これとは対照的に、脊髄離断後５週間１Ａ７の連続髄腔内注入は５週間までに対照動物を超えた顕著に改善されたＢＢＢ評点をもたらし、２〜５週間の時間枠内で連続した機能改善が観察され、平均のＢＢＢ評点は１１．１±０．７に達した（図４）。これらの結果は抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７の処置はＢＢＢ評点の増大により示されるとおり脊髄傷害後の機能の回復を促進し、軸索の再生及び低値の軸索退縮が軸索の免疫組織化学的染色により観察された。抗体３Ｂ５．２も又、脊髄傷害後の回復を促進した（データ示さず）。
（実施例９）
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、Ｌｉ３３、Ｄ０５、Ｄ０８及び３Ｂ５．２はインビトロの髄鞘形成を促進する。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７及び２Ｆ３を脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロン及び稀突起神経膠細胞の同時培養物を処理し、そして免疫組織学的分析及びウエスタンブロッティングにより髄鞘形成に関して試験することにより、髄鞘形成における抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７及び２Ｆ３の役割をインビトロで調べた。これらの試験のためには、まずＤＲＧニューロン及び稀突起神経膠細胞の一次培養物を形成することが必要であった。
雌性Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓラットＥ１４〜Ｅ１７の胚性脊髄神経節をＰｌａｎｔ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）に記載の通り培養した。切除したＤＲＧを２週間ポリ−Ｌ−リジンコーティングカバーガラス上にプレーティングした（１００μｇ／ｍｌ）。細胞を第２〜６日の間フルオロデオキシウリジンの存在下、そして第８〜１１日の間は１×Ｂ２７，１００ｎｇ／ｍＬＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中でインキュベートした。
雌性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ生後第２日（Ｐ２）ラットの稀突起神経膠細胞を以下の通り変更を加えたＣｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９０）記載の通り培養した。慨すれば前脳をＰ２ラットから摘出し、冷ＨＢＳＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に入れた。組織断片を１ｍｍの小片に切断し、０．０１％トリプシン及び１０μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ中で１５分間３７℃でインキュベートした。解離した細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングＴ７５組織培養フラスコ上に入れ、そして１０日間３７℃において２０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で生育させた。Ａ２Ｂ５陽性稀突起神経膠細胞は３７℃で２００ｒｐｍにおいて一夜フラスコを振とうすることにより収集した。Ａ２Ｂ５稀突起神経膠細胞は７日間、２５ｍＭＤ−グルコース、４ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌヒトアポトランスフェリン、５μｇ／ｍｌウシ膵臓インスリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム、１０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｎＭＤ−ビオチン、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ及びＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。次に細胞をトリプシン処理により採集した。次に細胞を２％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中において、１、３、１０又は３０μｇ／ｍｌの抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７又は２Ｆ３、又は陰性対照抗体の存在下又は非存在下においてＤＲＧニューロンと共に同時培養した。このような試験において投与すべき有効な抗体の用量は抗体に応じて０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲であることが分かっている。当業者であれば本明細書に記載した試験を用いて有効用量を決定できる。
培地を変えて、種々のモノクローナル抗体に３日ごとに栄養補給した。３７℃３０日の後、軸索を同定するための抗βＩＩＩチューブリン抗体、又は稀突起神経膠細胞を同定するための抗ＭＢＰ抗体を用いて神経フィラメントに関する免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）により同時培養細胞を染色した（図４Ａ〜Ｅ）。同時培養細胞は更に溶解し、ウエスタンブロット分析に付すことによりＭＢＰを定量した（図４Ｇ）。ＩＨＣ及びウエスタンブロット分析に基づけば、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７及び２Ｆ３で処理した同時培養細胞は稀突起神経膠細胞及びニューロンの増大した生存性、束化軸索の増大した数、及びＭＢＰ陽性細胞の増大した数を示し（図４Ｆ）、ＭＢＰ陽性細胞は対照抗体処理同時培養物と比較して１０倍多かった。
同様の実験において、稀突起神経膠細胞及びＤＲＧ同時培養物を抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５及びＬｉ０６、又は陰性対照抗体の存在下又は非存在下にインキュベートした。同時培養細胞を溶解し、ウエスタンブロット分析に付すことによりＭＢＰを定量した（図８）。ウエスタンブロット分析に基づけば、抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５及びＬｉ０６で処理した同時培養細胞は、Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）３、１０及び３０μｇで処理した同時培養細胞と同様のＭＢＰ陽性細胞の増大した数を示した。
同様の実験において、稀突起神経膠細胞及びＤＲＧ同時培養物を抗Ｓｐ３５抗体３Ｂ５．２、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、及びＬｉ３３の存在下又は非存在下にインキュベートし、そして同様に髄鞘形成が促進された。同様に、完全長抗体Ｄ０５及びＤ０８も又、髄鞘形成を促進した。ＤＲＧ同時培養実験において髄鞘形成を促進するために必要な３Ｂ５．２及び７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９抗体の最低有効用量は０．１μｇ／ｍｌであった。
更に又、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９のＦａｂフラグメントを同様のインビトロ髄鞘形成試験において試験した。７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９のＦａｂフラグメントは１．０μｇ／ｍｌの濃度において髄鞘形成を促進した。
これらの結果は抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、Ｌｉ３３、Ｄ０５、Ｄ０８及び３Ｂ５．２のＤＲＧ−稀突起神経膠細胞同時培養物への処理は、対照抗体処理同時培養物と比較して、成熟稀突起神経膠細胞軸索相互作用及び髄鞘形成を促進することを示した。
（実施例１０）
抗Ｓｐ３５抗体及びＦａｂフラグメントはインビボで稀突起神経膠細胞生存及び髄鞘形成を促進する。
Ｍｏｒｅｌｌ Ｐ等、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２２０−７（１９９８）に記載の方法に従って成熟野生型Ｃ５７Ｂｌ／６雄性マウスに６週間キュプリゾン（粉砕マウス飼料と０．２重量％混練）を与えることにより脳梁内部に脱髄を誘発した。慨すれば、抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７を後述する方法によりキュプリゾン給餌の第２、２．５及び３週において脱髄している脳梁内に定位注射した。対照マウスには同じ時間間隔で対照抗体含有滅菌培地を定位注射した。キュプリゾン給餌６週の後、マウスを２、４及び６週間正常給餌（粉砕マウス飼料のみ）に戻し、再髄鞘形成させた。
１Ａ７及び対照モノクローナル抗体は以下の通り送達した。キュプリゾン処置マウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、定位手術のために設計された固定化装置上に位置づけた（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。頭皮を開け、１．７ｍｍの深度においてブレグマの０．７ｍｍ後方及び０．３ｍｍ側方の定位座標を用いながら１０μｌのハミルトンシリンジを用いながら、野生型のレシピエントマウスの急性脱髄脳梁内に片側性に滅菌化合物（１ｍｌＨＢＳＳ中１μＭ）を注射した（Ｍｅｓｓｉｅｒ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３： ３１３−１８（１９９９））。追加的な対照レシピエントマウスには化合物を含有しないＨＢＳＳを定位注射した。頭蓋の開口部をＧｅｌｆｏａｍで充填し、その領域にペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を塗布し、そして創傷を縫合した。マウスは注射後実験の各週において屠殺し、その脳を摘出し、分子、生化学及び組織学的分析用に処理した。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７を投与された動物は、増大した成熟稀突起神経膠細胞生存性（ＣＣ１抗体染色に基づく、図５Ａ）及び抗ＭＢＰ蛋白抗体又はルクソールファーストブルーを用いたＩＨＣによる軸索髄鞘形成（図５Ｂ）を示していた。ＣＣ１抗体陽性稀突起神経膠細胞を４週目及び６週目に定量した（図５Ｃ）。これらの結果は、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処置は対照抗体処置マウスと比較して成熟稀突起神経膠細胞生存性及び軸索髄鞘形成を促進したことを示している。同様に、脱髄のリソレシチンモデルにおいても１Ａ７抗体又は１μｇ／ｍｌの７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９Ｆａｂフラグメントを投与された動物でも対照動物と比較して軸索髄鞘形成が促進された。
（実施例１１）
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７は視神経離断モデルにおいて網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存を促進する。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７をニューロン機能に影響する要因を調べる視神経離断モデルにおいて試験した。幼若成熟雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをこの試験において使用した。各動物の右視神経を視神経円板から１．５ｍｍで眼窩内に離断した。６％Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ＦＧ）を浸積したゲルフォーム片を視神経円板直後の新しく離断した部位に適用することにより生存網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に標識した。動物は硝子体内注射により抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７、対照抗体、又はＰＢＳのみの何れかを投与した３群（各群ｎ＝６）に分割した。各硝子体内注射の容量は４μｌとし、各注射の用量は２μｇとした。硝子体内注射は視神経離断直後に実施した。
全動物を１週間生存させた。動物を屠殺する２日前、各動物の左視神経を離断し、そして６％ＦＧを上記した通り投与することにより生存ＲＧＣを標識し、内部対照として使用した。動物はネンブタールの過剰投与により屠殺し、網膜を４％パラホルムアルデヒド中で切開した。４か所の放射状切開部を形成することにより網膜を４つの四分円に分割した（上側、下側、鼻側、及び側頭側）。次に網膜を１時間同じ固定液中に後固定し、その後それらを封入剤（Ｄａｋｏ）を用いて平板封入した。スライドは紫外線フィルターを用いながら蛍光顕微鏡下に観察した（励起波長＝３３０〜３８０ｎｍ）。２００×２００μｍ２のアイピースグリッド下に５００μｍの間隔で、視神経円板から開始して網膜の周辺境界部まで、各四分円の正中線に沿って標識されたＲＧＣを計数した。各処置から生じた生存ＲＧＣのパーセントは傷害眼の生存ＲＧＣの数をその対側眼と比較することにより表示した。全てのデータは平均±ＳＥＭで表示した。統計学的有意性は一元ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック試験により評価した。ｐ＜０．０５で差を有意とみなした。抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処置動物は約５０％のニューロン生存を示したのみであった対照抗体又はＰＢＳ処置動物と比較して高値のニューロン生存（８０％）を示した（図６）。
（実施例１２）
視神経クラッシュモデルにおける再髄鞘形成に関する抗Ｓｐ３５抗体の試験
右視神経に対し、眼窩内で眼球の約１．５ｍｍ後方で１０秒間＃５鉗子により完全クラッシュをもたらし、その直後に硝子体内注射により２ｍｌ中モノクローナル抗体１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５及びＬｉ０６を２μｌ投与する。
動物には手術後１週間に同じ処置を二回目の硝子体内注射として与える。手術後２週間、動物にＥＭ固定液を灌注し、後固定し、そして半薄及び超薄の切片に加工する。長手方向の視神経の切片を染色し、ミエリン観察のために調製する。クラッシュした視神経の近位及び遠位の部分の髄鞘形成を異なる処置群の間で比較する。Ｓｐ３５−Ｆｃ及び１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５及びＬｉ０６処置動物、並びに適切な対照を、対照と比較した視神経の遠位部分における再髄鞘形成に関して分析する。
（実施例１３）
視神経クラッシュモデルにおける軸索再生に関する抗Ｓｐ３５抗体の試験
右視神経に対し、眼窩内で眼球の約１．５〜２ｍｍ後方で１０秒間＃５鉗子によりクラッシュをもたらし、その直後に硝子体内注射によりＰＢＳ中モノクローナル抗体１Ａ７を２μｇ投与した。１Ａ７抗体で４ラットを試験し、そして８ラットは対照動物として使用した。動物には手術後１週間に同じ処置を二回目の硝子体内注射として与えた。被験動物屠殺の３日前（実験の第１１日）、ＣＴＢ−ＦＩＴＣ２ｍｌを硝子体内注射することにより、再生視神経軸索を順行性に標識した。手術後第１４日において、動物を灌注し、後固定した。クラッシュした視神経を凍結長手方向切片が得られるように加工した。クラッシュ部位を超えた種々の距離において、患部を横断しているＣＴＢ−ＦＩＴＣ標識軸索を再生線維として計数した。１Ａ７を眼に注射した場合、軸索の再生はクラッシュ部位を超えて２５０μｍまで観察された。図１０参照。
（実施例１４）
抗Ｓｐ３５抗体はＭＯＧ誘導ＥＡＥラットモデルを用いた場合視神経の再髄鞘形成及び修復を促進する。
これらの実験のためにミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルを用いた。これはヒト多発性硬化症に関わる動物モデルである。２００ｎｇ完全フロイントアジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ．）５０μｌ＋食塩水中の５０μｇＭＯＧ５０μｌを乳化（１：１）し、そして各動物の尾部基部に皮内注射するまで氷上に維持した。雌性茶色Ｎｏｒｗａｙラット、８〜１０週齢を全実験に使用した。当該分野の一般的観察によれば、ＥＡＥモデルはＭＯＧ注射の約１５日後に誘導される。ラットのＥＡＥ臨床兆候について採点する。兆候は以下の通り採点する。即ち、０．５等級、尾部の遠位の不全麻痺；１等級、完全尾部麻痺；１．５等級、尾部の不全麻痺及び軽度の後脚の不全麻痺；２．０等級、片側性の重度の後脚の不全麻痺；２．５等級、両側性の重度の後脚の不全麻痺；３．０等級、完全な両側性の重度の後脚の麻痺；３．５等級、完全な両側性の重度の後脚の麻痺及び１前足の不全麻痺；等級完全麻痺（四肢麻痺）、瀕死状態、又は死亡。動物はＥＡＥモデルが誘導されたのちに処置を受けた。
抗Ｓｐ３５抗体（１Ａ７）２μｇ／μｌをＭＯＧ−ＥＡＥ誘導第１５日に硝子体内に注射した。第２２及び２８日に追加２回の抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７の２μｇ／μｌを注射した。実験終了時に動物に４％ＰＦＡを灌注した。視神経を１％ＯｓＯ４中に後固定し、脱水し、そしてＥｐｏｎに包埋した。半薄切片（１μＭ）を切り出し、髄鞘形成の評価のためにトルイジンブルーで染色した。視神経の軸索再生及び再髄鞘形成に関して処置動物の視神経を未処置動物と比較した。全ての操作は研究所の動物取扱使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））により認可されたプロトコルに従って実施した。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７で処置された動物は正常視神経又はＭＯＧ誘導ＥＡＥに付されたが処置を受けなかった動物と比較して視神経の再髄鞘形成及び修復を示していた（図９）。図９Ｃにおいて、矢印は髄鞘形成した軸索を指している。Ｓｐ３５に特異的ではない連鎖球菌（ＭＯＰＣ２１）に由来するプロテインＧのドメインＩＩＩを認識する抗体を投与した動物は正常視神経又は未処置動物の視神経と比較して視神経の再髄鞘形成又は修復の兆候を示さなかった（データ示さず）。Ｓｐ３５拮抗剤抗体１Ａ７はラットＭＯＧ誘導ＥＡＥ視神経炎モデルにおいて視神経の再髄鞘形成及び修復を促進した（図９）。
（実施例１５）
ＭＯＧ誘導ＥＡＥマウスモデルを用いたＣＮＳ再髄鞘形成の促進に関する抗Ｓｐ３５抗体の試験
マウスの１２９Ｂ６混合系統において、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した１００μｇのＭＯＧ１−１２５蛋白による皮内免疫化（第０日）によりＥＡＥを誘導する。注射容量はマウス当たり１００μｌであり、そして３部位に渡って分布させる（耳介、背部及び皮膚）。乳液は１：１容量比に基づいて調製し、そして１ｍｇ／ｍｌのＭＯＧ１−１２５及び２ｍｇ／ｍｌのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（菌株Ｈ３７Ｒａ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を含有する。百日咳毒素（２００ｎｇ／マウス）を免疫化の時点、及びその２日後に腹腔内投与する。体重及び臨床ＥＡＥ評点（０＝臨床兆候無し；１＝跛行尾部；２＝後肢の虚弱化、障害のある立ち直り反射又は動揺歩行；３＝完全後肢麻痺又は立ち直り反射の非存在；４＝完全後肢麻痺及びある程度の前肢の罹患；５＝完全に麻痺した動物；６＝瀕死又は死亡）を毎日記録する。全ての操作は本発明者等の研究所の動物取扱使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により認可されたプロトコルに従って実施する。動物には１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５及びＬｉ０６モノクローナル抗体又は対照抗体を試験の第０日に投与する。血液試料は眼窩後方出血手法により実験期間中を通じて種々の時点において採取する。遠心分離によりＰＢＭＣから血漿を分離し、細胞の表現型決定をＦＡＣＳ染色により実施する。体液性抗ＭＯＧ抗体応答のプロファイリングはサブクラス／アイソタイプ特異的ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いながらＥＬＩＳＡにより実施する。各実験の終了時において、脳、脊髄、視神経及び坐骨神経を灌注後に採取する。
これと同じプロトコルを用いてＳｐ３５ノックアウトマウス及び同腹仔においてＥＡＥを誘導する。Ｓｐ３５ノックアウトマウスは典型的には低値のＥＡＥ評点（１．５）を示し、そして対照と比較して回帰を示さず（４５日の期間に渡る）、次いで野生型同腹仔となる（ＥＡＥ評点３．５）。
Ｓｐ３５Ｆｃおよび１Ａ７、２Ｆ３処置動物の対照と比較した再髄鞘形成に関して分析する。
Ｈｉｓタグ付ＭＯＧ１−１２５蛋白をドキシサイクリン誘導性ＴｅｔＯ−ＡＯＸ１プロモーターを用いてピチア・パストリス中で発現させた（Ｍ．Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，Ｄ．Ｋｒｕｓｈｉｎｓｋｉｅ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｕｃｈ，執筆中）。ラットＭＯＧの細胞外コーディング配列（シグナル配列の除去後の成熟蛋白のＧｌｙ１〜Ｇｌｙ１２５）を以下のプライマー：５’ＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＡＧＧＧ３’（配列番号３６８）及び５’ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＧＧ３’（配列番号３６９）を用いてＰＣＲ増幅した。
（実施例１６）
３Ｂ５．２改変体の構築
以下に示すものは３Ｂ５．２抗体の可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤＲは下線を付してあり、そしてＮ連結グリコシル化部位は太字で示し二重下線を付した。
３Ｂ５．２抗体の発現及び／又はＳｐ３５への抗体の結合がグリコシル化部位の除去により影響されるかどうか調べるために、３Ｂ５．２改変体を構築した。特に、ＦＲ３のＫａｂａｔ位置６３〜６８を突然変異させてヒト及びネズミカッパ軽鎖配列SGSGSG（配列番号418）とした。得られた突然改変体３Ｂ５.２可変軽鎖は以下の通りであり、突然変異したアミノ酸は太字で示し二重下線を付した。
３Ｂ５．２抗体及び改変体３Ｂ５．２抗体の両方がＳｐ３５蛋白に結合する能力は試験した場合に同様であった。更に又、電気泳動の泳動度のデータに基づけば、３Ｂ５．２可変軽鎖はグリコシル化されるが、改変体の軽鎖はされないと考えられる。最後に、トランスフェクトされた細胞における両方の抗体の発現レベルは同様であった。
（実施例１７）
ヒト化１Ａ７抗体の構築
１Ａ７軽鎖及び重鎖の配列
ネズミ可変領域の分析
相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原に結合する可能性が最も高い残基を含有し、そして、再形状化された抗体において保持されていなければならない。ＣＤＲは参照により全体が本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ等、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｔ．Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅに従った配列により定義される。ＣＤＲはカノニカルなクラスに属し（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．，Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ａｉｒ，Ｇ．，Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．，Ｔｕｌｉｐ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．，Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、その場合重要な残基がかなりの範囲までＣＤＲループの構造コンホーメーションを決定する。これらの残基はほぼ常時、再形状化された抗体内に保持されている。重鎖及び軽鎖のＣＤＲは以下の通りカノニカルなクラスに分類されている。
軽鎖： 重鎖：
Ｌ１：１０残基 クラス１ Ｈ１：５残基 クラス１
Ｌ２：７残基 クラス１ Ｈ２：１７残基 クラス２
Ｌ３：９残基 クラス１ Ｈ３：７残基 カノニカルなクラス無し。
これらのＣＤＲクラスのために重要なカノニカルな残基を表１０に示す。
可変軽鎖及び重鎖はコンセンサス（Ｋａｂａｔ等、１９９１）及び生殖細胞系配列（（Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ Ｊ，Ｚｏｃｈｅｒ Ｉ，Ｔｈｉｅｂｅ Ｒ，Ｚａｃｈａｕ ＨＧ．（１９９７）．Ｇｅｎｅ．１９１（２）：１７３−８１ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ Ｆ，Ｉｓｈｉｉ Ｋ，Ｂｏｕｒｖａｇｎｅｔ Ｐ，Ｋｕｍａ Ｋ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｈ，Ｍｉｙａｔａ Ｔ，Ｈｏｎｊｏ Ｔ．（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８（１１）：２１５１−６２、参照により全体が本明細書に組み込まれる）と、ネズミ及びヒトのサブグループに関して、ＢＬＡＳＴプログラム及び内部で編集されたコンセンサス及び生殖細胞系のｂｌａｓｔ蛋白配列データベースを用いながら、比較した。
可変軽鎖はネズミサブグループカッパ６のメンバーであり、１０９アミノ酸オーバーラップにおいて９４％同一性を有し、そしてネズミｋｋ４生殖細胞系を起源としている（１００％ＩＤ）（下記参照）。
可変重鎖はネズミサブグループＨＶＭＳのメンバーであり、１３２アミノ酸オーバーラップにおいて５５％同一性を有し、そしてネズミＶＧＫ６生殖細胞系を起源としている（９２％ＩＤ）（下記参照）。
可変軽鎖はヒトサブグループカッパ３に相当し、１０９アミノ酸オーバーラップにおいて６７％同一性を有し、そしてヒトＬ６生殖細胞系に最も近い（６４％ＩＤ）（下記参照）。
可変重鎖はヒトサブグループＭＨＶ１に相当し、１２９アミノ酸オーバーラップにおいて５９％同一性を有し、そしてヒトｈｕＶＨ７−８１生殖細胞系に最も近い（７０％ＩＤ）（下記参照）。
可変領域の構造のモデリング
このヒト化のために本発明者等はＯＫＴ３（ＰＤＢＩＤ１ＳＹ６、軽鎖モデリングのために使用）及びＴＥ３３（ＰＤＢＩＤ１ＴＥＴ、重鎖モデリングのために使用）抗体の結晶構造に基づいてＰ１Ａ７の可変領域のモデルを構築した。
再形状化された可変領域の分析
本発明者等は位置において復帰突然変異する必要のない最も同様のヒト発現抗体配列を発見（Ｌ４、３８、４３、４４、５８、６２、６５−６９、７３、８５、９８及びＨ２、４、３６、３９、４３、４５、６９、７０、７４、９２）（例えば参照により全体が組み込まれる米国特許６、４０７、２１３参照）し、そしてそれらを抗体フレームワークとして使用することを試みた。本発明者等は内部支配された抗体配列のデータベース及びクエリツールを使用することによりカノニカル、界面及びベニヤゾーンの残基におけるネズミＰ１Ａ７配列に最も高い同様性を有する適当な鋳型を同定することにより復帰突然変異の数を最小限にした。ＦＲ４領域におけるコンセンサス残基で充填された生殖細胞系の配列を別個に考慮した。多数のフレームワークを考慮した後、生殖細胞系配列ｈｕＬ６及びＶＨ７−８１をそれぞれ重鎖及び軽鎖用のアクセプターフレームワークとして選択した。
可変軽鎖再形状化鎖の３バージョン及び可変重鎖再形状化鎖の３バージョンが設計されている。最初のバージョンは最も少ない復帰突然変異を含有し、そして第３のバージョンが最も多く含む（即ち最小の「ヒト化」）。
再形状化ＶＬにおける復帰突然変異
ｈｕＬ６
Ｅ１Ｑ 抗原に向かうＱ１点及び電荷の変化は結合を改変する場合がある。バージョン２及び３に存在。
Ｌ４６Ｒ Ｒ４６はＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｈ３を支持するＶＨ／ＶＬ界面上にある非通常の残基である。全バージョンに存在。
Ｌ４７Ｗ−Ｗ４７はＣＤＲ−Ｌ２の下部のクラスター中に位置する。 バージョン３のみに存在。
Ｉ５８Ｖ−Ｖ５８はＣＤＲ−Ｌ２の下部のクラスター中に位置する。 バージョン３のみに存在。
Ｆ７１Ｙ−Ｙ７１はＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３の支持のために重要なカノニカルな残基である。全バージョンに存在。
再形状化ＶＨにおける復帰突然変異
ｈｕＶＨ７−８１Ｐ３８Ｋ Ｋ３８はＣＤＲ−Ｈ２を支持する。バージョン２及び３に存在。
Ｅ４６Ｋ Ｋ４６はＣＤＲ−Ｈ２を支持する。バージョン２及び３に存在。
Ｍ７１Ｌ Ｌ７１はＣＤＲ−Ｈ１を支持するカノニカルな残基である。全バージョンに存在。
Ａ７８Ｖ Ｖ７８は生殖細胞系Ａから過剰突然変異され、ＣＤＲ−Ｈ１を支持する。
Ｉ８２Ｆ Ｆ８２はコアパッキング残基である。バージョン３のみに存在。
Ｙ９１Ｆ Ｆ９１はＶＨ／ＶＬ界面上の残基である。バージョン３のみに存在。
Ｐ１Ａ７のためのヒト化設計
フレームワークは以下の配列からとった。
軽鎖：ｈｕＬ６
重鎖：ｈｕＶＨ７−８１
復帰突然変異は小文字太字で示す。
ＣＤＲは下線を付した。
重鎖改変体２に関する完全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド重鎖配列
ｈｕＰ１Ａ７−ＩｇＧ１Ｈ２重鎖のＤＮＡ配列（ｐＸＷ４６５）
ｈｕＰ１Ａ７Ｈ２重鎖の推定される蛋白配列（シグナル配列は下線を付す）
軽鎖改変体１に関する完全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド重鎖配列
ｈｕＰ１Ａ７Ｌ１カッパ軽鎖のＤＮＡ配列（ｐＸＷ４８０）
ｈｕＰ１Ａ７ Ｌ１軽鎖の予測される蛋白配列（シグナル配列は下線を付す）
軽鎖改変体２に関する完全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド重鎖配列
ｈｕＰ１Ａ７ Ｌ２カッパ軽鎖のＤＮＡ配列（ｐＸＷ４７６）
ｈｕＰ１Ａ７Ｌ２軽鎖の予測される蛋白配列（シグナル配列には下線を付す）
ネズミ及びヒトのキメラ１Ａ７抗体に由来する重鎖及び軽鎖のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を以下に示す。
ｃｈＰ１Ａ７カッパ軽鎖のＤＮＡ配列（ｐＥＡＧ２１１０）
ｃｈＰ１Ａ７軽鎖の予測される蛋白配列（シグナル配列には下線を付す）
ｃｈＰ１Ａ７ｈｕＩｇＧ１重鎖のＤＮＡ配列（ｐＥＡＧ２１１２）
ｃｈＰ１Ａ７重鎖の予測される蛋白配列（シグナル配列には下線を付す）
（実施例１８）
エフェクター機能、グリケーション及び凝集を低減するためのＬｉ３３Ｉｇ２の再操作
エフェクター機能、グリケーション及び凝集を潜在的に低減するためにＬｉ３３において種々の突然変異を作成した。稀突起神経膠細胞−ＤＲＧ同時培養試験における蛋白の発現、溶解性、抗体活性、及びグリケーションまたはＣＤ３２結合に対するこれら各々の突然変異の作用を調べた。結果を表１１に総括する。
（実施例１９）
Ｌｉ８１改変体の構築
抗体Ｌｉ８１は抗体Ｌｉ１３の親和性成熟バージョンである。Ｌｉ８１抗体のアグリコシル化バージョンをＬｉ８１重鎖配列における単一のアミノ酸を変えることにより作成した。以下に示すものはアグリコシル化改変体の可変重鎖（ＶＨ）に関するアミノ酸配列である。
成熟蛋白には存在しないことになるリーダー配列（最初の１９アミノ酸）は太字で示し、そしてＣＤＲＳには下線を付した。Ｌｉ８１可変重鎖配列（配列番号４３３）と比較した場合の単一のアミノ酸変化は太字で示し、二重下線を付している。以下に示すものはアグリコシル化改変体の可変重鎖（ＶＨ）に関するヌクレオチド配列である。
本発明は本発明の個々の特徴の単一の説明を意図している記載した特定の実施形態によりその範囲において限定されることはなく、そして機能的に等価であるいかなる組成物又は方法も本発明の範囲内に包含される。実際、提示した、そして本明細書に記載した物に加えて本発明の種々の変形は上記した説明及び添付の図面から当業者には自明である。そのような変形は添付請求項の範囲に包含されることを意図している。
本明細書において言及した全ての公開物及び特許出願は各々個々の公開物又は特許出願が特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれることを示される場合と同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (25)

  1. Ｓｐ３５に特異的に結合する単離された抗体であって、該抗体は、配列番号４３５に示される重鎖アミノ酸配列、および配列番号４３４に示される軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
  2. 自身に融合した異種ポリペプチドを更に含む請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が治療薬、プロドラッグ、ペプチド、蛋白、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬品、およびＰＥＧよりなる群から選択される剤にコンジュゲートされた請求項１〜２のいずれか１項に記載の抗体。
  4. 前記抗体が脳ターゲティング部分に融合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 前記脳ターゲティング部分が、ＦＣ５、ｍＡＢ ８３−１４、Ｂ２ポリペプチド、Ｂ６ポリペプチド、Ｂ８ポリペプチド、抗Ｆｃ受容体、トランスフェリンおよび抗インスリン受容体からなる群より選択される、請求項４に記載の抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に受容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
  7. 非経口投与のために製剤化される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. ヒト被験体におけるＣＮＳ傷害を処置するための医薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体の使用。
  9. ヒト被験体においてＣＮＳにおけるニューロンの成長の抑制に関連した疾患または障害を処置するための医薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体の使用。
  10. ヒト被験体における稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害を処置するための医薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体の使用。
  11. ヒト被験体におけるＣＮＳのニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全に関連する疾患又は障害を処置するための医薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体の使用。
  12. 前記疾患又は障害が、多発性硬化症、視神経炎、急性虚血性視神経障害、卒中、横断脊髄炎、外傷性脳傷害、脊髄傷害、アルツハイマー病、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質委縮症およびクラッベ病からなる群より選択される、請求項１１に記載の使用。
  13. 前記疾患又は障害が、多発性硬化症である、請求項１２に記載の使用。
  14. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体を含む、ヒト被験体におけるＣＮＳ傷害を処置するための組成物。
  15. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体を含む、ヒト被験体においてＣＮＳにおけるニューロンの成長の抑制に関連した疾患または障害を処置するための組成物。
  16. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体を含む、ヒト被験体における稀突起神経膠細胞の成長又は分化の抑制に関連する疾患又は障害を処置するための組成物。
  17. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体を含む、ヒト被験体におけるＣＮＳのニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全に関連する疾患又は障害を処置するための組成物。
  18. 前記疾患又は障害が多発性硬化症、視神経炎、急性虚血性視神経障害、卒中、横断脊髄炎、外傷性脳傷害、脊髄傷害、アルツハイマー病、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質委縮症およびクラッベ病からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記疾患又は障害が多発性硬化症である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体に中枢神経系（ＣＮＳ)ニューロンを接触させることを含む、該ニューロンの軸索成長の抑制を低下させるインビトロの方法。
  21. 有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗Ｓｐ３５抗体にＣＮＳニューロンを接触させることを含む、該ニューロンの成長錐体虚脱を抑制するインビトロの方法。
  22. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｓｐ３５抗体をコードする単離された核酸配列を含む組成物。
  23. 宿主細胞であって、該宿主細胞は、
    （ａ）２つの発現ベクターであって、第１の発現ベクターは請求項１に記載の抗Ｓｐ３５抗体の重鎖をコードし、第２の発現ベクターは請求項１に記載の抗Ｓｐ３５抗体の軽鎖をコードする、２つの発現ベクター；あるいは
    （ｂ）単一の発現ベクターであって、該単一の発現ベクターは、請求項１に記載の抗Ｓｐ３５抗体の重鎖および請求項１に記載の抗Ｓｐ３５抗体の軽鎖の両方をコードする、単一の発現ベクター；
    を含む、宿主細胞。
  24. 抗Ｓｐ３５抗体を産生するインビトロの方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を培養する工程及び該抗体またはそのフラグメントを該培養物から回収する工程を含む、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法により産生された抗Ｓｐ３５抗体。
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