ES2673153T3 - Anticuerpos Sp35 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos Sp35 y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2673153T3
ES2673153T3 ES14154372.8T ES14154372T ES2673153T3 ES 2673153 T3 ES2673153 T3 ES 2673153T3 ES 14154372 T ES14154372 T ES 14154372T ES 2673153 T3 ES2673153 T3 ES 2673153T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
antibody
human
polypeptide
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14154372.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Sha Mi
R. Blake Pepinsky
Zhaohui Shao
Ellen A. Garber Stark
Steven D. Miklasz
Christilyn Graff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen MA Inc filed Critical Biogen MA Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2673153T3 publication Critical patent/ES2673153T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo comprende: una región VH que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH indicadas en SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 438, respectivamente; y una región VL que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL indicadas en SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 y SEQ ID NO: 444, respectivamente, donde el anticuerpo se une al polipéptido Sp35 con una afinidad caracterizada por una constante de disociación no mayor que 5 x 10-10 M medido mediante FACS en células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 humano, y donde el anticuerpo es IgG1/kappa.

Description

Anticuerpos SP35 y usos de los mismos
5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
La presente invención hace referencia a neurología, neurobiología y biología molecular. Más en particular, la
10 presente invención hace referencia a anticuerpos Sp35, así como a dichos anticuerpos para su uso en el tratamiento de enfermedades, trastornos y lesiones neurológicos tales como una lesión de la médula espinal.
Antecedentes de la invención
15 Los axones y las dendritas se extienden desde las neuronas. El extremo distal de un axón en extensión incluye una región especializada, conocida como cono de crecimiento. Los conos de crecimiento detectan el entorno local y guían el crecimiento axonal hacia la célula diana de una neurona. Los conos de crecimiento responden a las claves ambientales, por ejemplo, la adhesividad superficial, los factores de crecimiento, los neurotransmisores y los campos eléctricos. Los conos de crecimiento avanzan en general a un ritmo de uno o dos milímetros al día. El cono de
20 crecimiento explora el área que tiene por delante y a los lados, por medio de elongaciones clasificadas como lamelipodios y filopodios. Cuando una elongación entra en contacto con una superficie desfavorable, se retira. Si una elongación entra en contacto con una superficie de crecimiento favorable, continúa extendiéndose y guía el cono de crecimiento en esa dirección. Cuando el cono de crecimiento alcanza una célula diana apropiada se crea una conexión sináptica.
25 En la función de las células nerviosas influye el contacto entre neuronas y otras células en su entorno inmediato (Rutishauser, et al., 1988, Physiol. Rev. 68:819). Estas células incluyen células gliales especializadas, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC) y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP), que envuelven el axón neuronal con mielina (Lemke, 1992, en An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall,
30 Ed., pág. 281, Sinauer).
Las neuronas del SNC tienen el potencial intrínseco de regenerarse después de una lesión, pero se inhiben de hacerlo ante la acción de proteínas inhibidoras presentes en la mielina (Brittis et al., 2001, Neuron 30:11-14; Jones et al., 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe et al., 2002, J. Neurosci. 22:3144-3160).
35 Varias proteínas inhibidoras de mielina presentes en los oligodendrocitos han sido caracterizadas. Entre los ejemplos conocidos de proteínas inhibidoras de mielina se incluyen NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), glucoproteína asociada a mielina (MAG) (McKerracher et al., 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay et al., 1994, Neuron 13:757-767) y glucoproteína de oligodendrocitos (OM-gp),
40 Mikol et al., 1988, J. Cell. Biol. 106:1273-1279). Para cada una de estas proteínas se ha demostrado por separado que es un ligando para el receptor neuronal Nogo-1 (NgR1 (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., Neuron 2002, publicado online el 28 de junio de 2002).
45 El receptor Nogo-1 (NgR1) es una proteína de membrana fijada a GPI que contiene 8 repeticiones ricas en leucina (Fournier et al., 2001, Nature 409:341-346). Tras la interacción con proteínas inhibidoras (por ejemplo, NogoA, MAG y OM-gp), el complejo NgR1 transduce señales que llevan al cono de crecimiento a colapsarse y a la inhibición del crecimiento de neuritas.
50 Existe la necesidad no satisfecha de moléculas y procedimientos para inhibir el colapso del cono de crecimiento mediado por NgR1 y la inhibición resultante del crecimiento de neuritas. Además, existe la necesidad de moléculas que aumenten la supervivencia neuronal y la regeneración de los axones. En particular para el tratamiento de enfermedades, trastornos o lesiones que impliquen una lesión axonal, muerte de células neuronales u oligodendrocitos, desmielinización o dismielinización o se refieran en general al sistema nervioso.
55 Dichas enfermedades, trastornos o lesiones incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple (EM), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), encefalomielitis (EPL), mielinólisis pontina central (MPC), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células globoides (enfermedad de Krabbe) y degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, esclerosis
60 lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de
la médula espinal, lesión por traumatismo craneoencefálico, lesión post-radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, accidente cerebrovascular, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia de vitamina E aislado, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino y parálisis de Bell. Entre estas enfermedades, EM es la más
5 extendida, que afecta aproximadamente a 2,5 millones de personas en todo el mundo.
La EM comienza generalmente con un patrón de recidiva-remisión de afectación neurológica que después avanza a una fase crónica con aumento del daño neurológico. La EM se asocia con la destrucción de mielina, oligodendrocitos y axones localizada en lesiones crónicas. La desmielinización observada en la EM no es siempre permanente y se
10 ha documentado remielinización en las fases tempranas de la enfermedad. Para la remielinización de las neuronas se necesitan oligodendrocitos.
Existen varios tratamientos modificadores de la enfermedad para la EM, entre ellos el uso de corticoesteroides e inmunomoduladores tales como interferón beta y Tysabri®. Además, debido al papel fundamental de los 15 oligodendrocitos y la mielinización en la EM, se han hecho esfuerzos para desarrollar terapias que aumenten el número de oligodendrocitos o potencien la mielinización. Véase, por ejemplo, Cohen et al., patente de EE. UU. nº 5.574.009; Chang et al., N. Engl. J. Med. 346: 165-73 (2002). El documento WO-2007/008547 describe anticuerpos específicos para Sp35, y procedimientos de uso de dichos anticuerpos como antagonistas de la función de Sp35 endógena. Sin embargo, persiste una necesidad urgente de idear terapias adicionales para la EM y otros trastornos
20 de la desmielinización y dismielinización.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente descripción se basa en el descubrimiento de que Sp35 (Sp35 también se designa en la bibliografía
25 como LINGO-1 y LRRN6) se expresa en oligodendrocitos y células neuronales y regula negativamente la diferenciación oligodendrocito/neuronal, la supervivencia y la mielinización de los axones. Además, algunos antagonistas de Sp35 promueven la supervivencia, proliferación y diferenciación de oligodendrocitos y células neuronales, así como la mielinización de las neuronas. Basándose en estos descubrimientos, la descripción, que incluye la presente invención, se refiere en general a anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos o derivados de
30 los mismos que pueden usarse como antagonistas de Sp35. Más en particular, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo comprende:
una región VH que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH indicadas en SEQ ID NO: 436, SEQ ID 35 NO: 437 y SEQ ID NO: 438, respectivamente; y
una región VL que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL indicadas en SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 y SEQ ID NO: 444, respectivamente,
40 donde el anticuerpo se une al polipéptido Sp35 con una afinidad caracterizada por una constante de disociación no mayor que 5 x 10-10 M medido mediante FACS en células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 humano, y donde el anticuerpo es IgG1/kappa.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a
45 antígeno del mismo que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la región VL de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la región VH de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 433.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente
50 al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 435.
En un aspecto adicional todavía, la presente invención proporciona un anticuerpo monocatenario que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo monocatenario comprende:
55 una región VH que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH indicadas en SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 438, respectivamente; y
una región VL que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL indicadas en SEQ ID NO: 442, SEQ ID 60 NO: 443 y SEQ ID NO: 444, respectivamente,
donde el anticuerpo se une al polipéptido Sp35 con una afinidad caracterizada por una constante de disociación no mayor que 5 x 10-10 M medido mediante FACS en células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 humano, y donde el anticuerpo es IgG1/kappa.
5 En un aspecto adicional todavía, la presente invención proporciona un anticuerpo monocatenario que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo monocatenario comprende la región VL de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la región VH de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 433.
10 En las reivindicaciones adjuntas se describen aspectos y realizaciones adicionales de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS
15 FIG. 1: Gel de SDS-PAGE que muestra la inmunoprecipitación de Sp35 por los anticuerpos monoclonales 1A7 y 2F3.
FIG. 2: Resultado de FACS que muestra que los AMc 1A7 y 2F3 se unieron a las células COS-7 o 293 que expresan Sp35, pero no células control sin expresión Sp35.
20 FIG. 3: los AMc 1A7 y 2F3 protegieron las neuronas GRD de la inhibición mediada por mielina del crecimiento de neuritas.
FIG. 4A-G: Tinción inmunohistoquímica ("IHC") de cocultivos de neuronas GRD y oligodendrocitos tratados con los
25 anticuerpos monoclonales 1A7 y 2F3, o anticuerpo de control. Los paneles D y E son ampliaciones de los paneles B y C, respectivamente. Tinción con anticuerpo anti-βIII-tubulina para identificar axones, o anticuerpo anti-MBP para identificar los oligodendrocitos. F: Cuantificación de células mielinizantes MBP+ tras tratamiento de cocultivos con 1A7 o 2F3. G: Análisis Western blot para cuantificar los MBP producidos a partir de cocultivos de neuronas GRD y oligodendrocitos tratados con los anticuerpos monoclonales 1A7 y 2F3.
30 FIG. 5A-C: A: Tinción de anticuerpos CC1 de oligodendrocitos de ratón en modelo de cuprizona. B. Tinción de anticuerpos de proteína anti-MBP o azul de luxol rápido de neuronas de ratón en modelo de cuprizona. C: Cuantificación de oligodendrocitos positivos frente a anticuerpo CC1 a las cuatro semanas y 6 semanas.
35 FIG. 6: CGR supervivientes. Tratamiento con anticuerpo monoclonal 1A7. Los animales tratados con el anticuerpo anti-Sp35 1A7 mostraron una supervivencia neuronal importante (80 %) cuando se compararon con los animales tratados con el anticuerpo de control o con PBS, que mostraron cada uno solo aproximadamente el 50 % de supervivencia neuronal.
40 FIG. 7. Puntuaciones BBB de ratones que recibieron anticuerpo anti-Sp35 1A7 después de una lesión de la médula espinal tal como se describe en el Ejemplo 8.
FIG. 8. La técnica de Western blot de oligodendrocitos y GRD cocultivados después de la incubación con anticuerpos anti-Sp35 Li05, Li06 y 3, 10 y 30 mg de Sp35-Fc (LINGO-1-Ig) tal como se describe en el Ejemplo 9.
45 FIG. 9. Fotografías de los nervios ópticos de A) ratas normales; B) ratas con encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) inducida por Glucoproteína Mielínica de Oligodendrocitos (MOG); y C) ratas con encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) inducida por la Glucoproteína Mielínica de Oligodendrocitos (MOG) tratadas con el anticuerpo Sp35 1A7. Debajo de cada fotografía del nervio óptico se muestran micrografías electrónicas de cada
50 nervio óptico.
FIG. 10. Gráfica del número de fibras neuronales regenerativas por sección contada en animales que reciben una inyección intravítrea del anticuerpo Sp35 1A7 después de aplastamiento del nervio óptico.
55 FIG. 11. Resultado FACS que muestra que los AMc 3B5.2 (3B5) y 7P1D5.1G9 (1D5) se unieron a células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 (LINGO-1).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
60 I. DEFINICIONES
Debe observarse que el término "una" entidad hace referencia a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un anticuerpo Sp35”, representa a uno o más anticuerpos Sp35. De este modo, las expresiones "un" (o "una"), "uno o más” y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.
5 Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende comprender un solo "polipéptido" así como varios "polipéptidos”, y hace referencia a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" hace referencia a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no hace referencia a una longitud específica
10 del producto. Así, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína”, "cadena de aminoácidos”, o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, están incluidos dentro de la definición de "polipéptido”, y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones post-expresión del polipéptido, lo que incluye sin limitación glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por
15 grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no presentes en la naturaleza. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o producirse mediante una tecnología recombinante, pro no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Puede generarse de cualquier manera, lo que incluye síntesis química.
20 Un polipéptido de la descripción puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1.000 o más, o 2.000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se refieren como plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones
25 diferentes, se refieren como desplegados. Tal como se usa en el presente documento, el término glucoproteína hace referencia a una proteína acoplada con al menos una fracción de hidrato de carbono que está unida a la proteína por medio de una cadena lateral que contiene oxígeno o que contiene nitrógeno de un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de serina o un residuo de asparagina.
30 Por polipéptido o fragmento “aislado”, variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere un nivel determinado de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede extraerse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante y expresados en células hospedadoras se consideran aislados para los fines de la descripción, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados o purificados parcial o sustancialmente
35 por cualquier técnica adecuada.
Como polipéptidos de la presente descripción se incluyen también fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento”, "variante”, "derivado" y "análogo" cuando hacen referencia a anticuerpos Sp35 o polipéptidos de anticuerpos incluyen cualquier polipéptido 40 que conserve al menos algunas de las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo o polipéptido nativo correspondiente. Los fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpos específicos descritos en otro lugar en el presente documento. Las variantes de anticuerpos Sp35 y los polipéptidos de anticuerpos incluyen fragmentos tal como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones de 45 aminoácidos, deleciones o inserciones. Las variantes pueden estar presentes en la naturaleza o no estar presentes en la naturaleza. Las variantes no presentes en la naturaleza pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados de anticuerpos Sp35 y polipéptidos de anticuerpos son polipéptidos que han sido alterados de manera que muestren características adicionales no presentes en el 50 polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Las variantes de polipéptidos también pueden referirse en el presente documento como "análogos de polipéptidos”. Tal como se usa en el presente documento un "derivado" de un anticuerpo Sp35 o polipéptido de anticuerpo hace referencia a un polipéptido objeto que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos presentes en la naturaleza de los
55 veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede sustituirse por lisina.
El término "polinucleótido" pretende comprender un único ácido nucleico, así como varios ácidos nucleicos, y hace 60 referencia a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN de
plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como el presente en ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). La expresión "ácido nucleico" hace referencia a uno cualquiera o más segmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido “aislado” se entiende 5 una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido extraída de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un anticuerpo Sp35 contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente descripción. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de
10 polinucleótidos. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de unión a ribosomas o un terminador de transcripción.
Tal como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una parte de ácido nucleico que consiste en
15 codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA, o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia de flanqueo, por ejemplo, los promotores, los sitios de unión a ribosomas, los terminadores transcripcionales, los intrones, y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente descripción pueden estar presentes en una única construcción de polinucleótidos, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de
20 polinucleótidos separados, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la descripción puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un ácido nucleico que codifica un
25 anticuerpo Sp35 o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.
En algunos casos, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende
30 un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa se produce cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la secuencia(s)reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos
35 y un promotor asociado con la misma) están "asociados operativamente" si la inducción de la función de promotor produce la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión de dirigir la expresión del producto génico o interferir con la capacidad de la plantilla de ADN de ser transcrita. Así, una región de promotor estaría asociada operativamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fue capaz
40 de llevar a cabo la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de la célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en las células predeterminadas. Otros elementos de control de transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de las células. En el presente documento se describen los promotores adecuados y otras regiones de control de
45 transcripción.
Los expertos en la materia conocen diversas regiones de control de transcripción. Entre ellas se incluyen, sin limitación, regiones de control de transcripción que actúan en las células de los vertebrados, tales como, pero sin limitarse a ellos, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, en 50 conjunción con intrón A), virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y β-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejidos, así como promotores inducibles por
55 linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).
De forma similar, los expertos en la materia conocen diversos elementos de control de traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y terminación de traducción y elementos derivados de picornavirus (en particular un sitio de entrada a ribosomas interno, o IRES, también referido como
60 secuencia CITE).
En otros casos, un polinucleótido de la presente descripción es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm).
5 Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente descripción pueden asociarse con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente descripción. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamíferos tienen una secuencia delantera secretora o de péptido señal que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteínas en crecimiento a
10 lo largo del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la materia saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrados tienen en general un péptido señal fusionado en el terminal N del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En algunos casos, se usa el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional del cual la secuencia conserva la capacidad de dirigir la secreción del
15 polipéptido que está asociado operativamente con él. Alternativamente, puede usarse un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia delantera de tipo natural puede sustituirse por la secuencia delantera del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o β-glucuronidasa de ratón.
La presente descripción se dirige a ciertos anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o
20 derivados de los mismos. Salvo que se haga referencia específicamente a los anticuerpos de tamaño completo tales como anticuerpos presentes en la naturaleza, la expresión "anticuerpos Sp35" comprende anticuerpos de tamaño completo así como fragmentos de unión a antígenos, variantes, análogos o derivados de dichos anticuerpos, por ejemplo, moléculas de anticuerpos o inmunoglobulinas presentes en la naturaleza o moléculas o fragmentos de anticuerpos diseñados que se unen a antígeno de una forma similar a moléculas de anticuerpo.
25 Los términos "anticuerpo" y "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulinas básicas en sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A
30 Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988).
Tal como se expondrá con más detalle más adelante, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases extensas de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la materia observarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (γ, µ, α, δ, ε) con algunas subclases entre 35 ellas (por ejemplo, γ1-γ4). La naturaleza de esta cadena es la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos) por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la materia a la vista de la presente descripción y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente descripción. Todas las 40 clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente descripción, y la exposición mostrada a continuación se dirigirá en general a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. En lo que respecta a IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas normalmente por enlaces disulfuro en una configuración en "S"
45 donde las cadenas ligeras enmarcan las cadenas pesadas que empiezan en la parte abierta de la "S" y continúan a través de la región variable.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (κ, λ). Cada clase de cadenas pesadas puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas de forma covalente
50 entre sí, y las partes de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras diseñadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos discurren desde un terminal N en los extremos bifurcados de la configuración en S al extremo C en la parte inferior de cada cadena.
55 Las cadenas ligeras y pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. A este respecto, se observará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de los antígenos. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren importantes propiedades biológicas tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión a receptores Fc, unión de
60 complemento y similares. Por convención la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que
se hacen más distales desde el sitio de unión a antígeno o extremo amino del anticuerpo. La parte en el extremo N es una región variable y la parte en el extremo C es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
5 Tal como se indica anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH, o subconjunto de las regiones de determinación de complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpos cuaternaria forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la S. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está
10 definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos, por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina obtenidas de especies de camélidos o diseñadas con base en inmunoglobulinas de camélido, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir solo en cadenas pesadas, sin cadenas ligeras. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).
15 En anticuerpos presentes en la naturaleza, las seis "regiones de determinación de complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno son secuencias de aminoácidos cortas no contiguas que están colocadas específicamente para formar el dominio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antígeno, referidos como regiones "marco", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida
20 una conformación en lámina β y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. Así, las regiones marco actúan para formar un andamiaje que facilita la colocación de las CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR colocadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo equivalente. Los
25 aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, pueden ser identificadas fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera por un experto en la materia, dado que han sido definidas con precisión (véase, "Sequences of Proteins of Inmunological Interest”, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
30 En el caso en que existan dos o más definiciones de un término que se usan y/o aceptan en la técnica, la definición del término tal como se usa en el presente documento pretende incluir todos estos significados salvo que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo concreto es el uso de la expresión "región de determinación de complementariedad" ("CDR") para describir el antígeno no contiguo que combina sitios presentes dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región concreta ha sido descrita por Kabat et al., U.S.
35 Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al.,
J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen superposiciones o subconjuntos de residuos de aminoácidos comparados entre sí. No obstante, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo pretende situarse dentro del alcance del término tal como se define y se usa en el presente documento. En la tabla I se recogen de forma comparada los residuos de aminoácidos apropiados que
40 comprenden las CDR tal como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente. Los números de residuos exactos que comprenden una CDR en particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar de forma rutinaria los residuos que comprenden una CDR en particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del anticuerpo.
45 TABLA 1. Definiciones CDR1
Kabat
Chothia
CDR1 VH
31-35 26-32
CDR2 VH
50-65 52-58
CDR3 VH
95-102 95-102
CDR1 VL
24-34 26-32
CDR2 VL
50-56 50-52
CDR3 VL
89-97 91-96
1 La numeración de todas las definiciones de CDR de la tabla 1 es conforme con las convenciones de numeración
indicadas por Kabat et al. (véase más adelante).
50 Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar sin ambigüedades este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia en sí. Tal como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" hace referencia al sistema de
numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de los residuos de aminoácidos en un anticuerpo Sp35 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
5 En especies de camélidos, la región variable de cadena pesada, referida como VHH, forma el dominio de unión a antígeno completo. Las principales diferencias entre las regiones variables VHH de camélidos y las derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) más aminoácidos hidrófobos en la cadena ligera entran en contacto con la superficie de VH que con la región correspondiente en VHH, (b) una CDR3 más larga en VHH, y (c) la frecuente
10 aparición de un enlace disulfuro entre CDR1 y CDR3 en VHH.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados
o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión a epítopos, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv,
15 Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos a disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos Sp35 descritos en el presente documento). Las moléculas ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU.
5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos de la descripción pueden ser de cualquier tipo (por
20 ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Los fragmentos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos monocatenarios, pueden comprender la región(es)variable(s) en solitario o en combinación con una parte o la totalidad de lo siguiente: región bisagra, 25 dominios CH1, CH2 y CH3. Además, se incluyen en la descripción los fragmentos de unión a antígenos que comprenden también cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para el uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento pueden ser de cualquier origen animal lo que incluye aves y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, 30 cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otro caso, la región variable puede tener un origen de condrictios (por ejemplo, de tiburones). Tal como se usa en el presente documento, los anticuerpos “humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe más adelante y, por ejemplo, en la patente de
35 EE. UU. nº 5.939.598 para Kucherlapati et al.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de entre: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra 40 superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido de unión puede comprender una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena de 45 polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otro caso, un polipéptido de la descripción comprende una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para el uso en la descripción puede carecer de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, parte o la totalidad de un dominio CH2). Tal como se expone anteriormente, un experto en la materia entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) pueden
50 modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina presente en la naturaleza.
En ciertos anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptidos de un multímero son
55 idénticas a las de una segunda cadena de polipéptidos del multímero. Alternativamente, los monómeros que contienen la porción de cadena pesada de la descripción no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión diana diferente, para formar, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico.
Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para el uso en los procedimientos diagnósticos y 60 terapéuticos descritos en el presente documento pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por
ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica
5 derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferentemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de entre un dominio VL o CL.
10 Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento pueden describirse o especificarse desde el punto de vista del/ de los epítopo(s)y de la(s) parte(s) de un antígeno, por ejemplo, un polipéptido diana (Sp35) que reconocen o al que se unen específicamente. La parte de un polipéptido diana que interacciona específicamente con el dominio de unión a antígeno de un
15 anticuerpo es un "epítopo”, o un "determinante antigénico”. Un polipéptido diana puede comprender un único epítopo, aunque normalmente comprende al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno. Además, debe observarse que un "epítopo" en un polipéptido diana puede ser o incluir elementos no polipeptídicos, por ejemplo, un "epítopo puede incluir una cadena lateral de hidratos de carbono.
20 Se piensa que el tamaño mínimo de un epítopo de péptidos o polipéptidos para un anticuerpo es de aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptidos o polipéptidos contienen preferentemente al menos siete, más preferentemente al menos nueve y con la máxima preferencia entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en
25 su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no deben ser contiguos, y en algunos casos, pueden incluso no estar en la misma cadena de péptidos. En la presente descripción, el epítopo de péptidos o polipéptidos reconocido por los anticuerpos Sp35 de la presente descripción contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos de Sp35 contiguos o no contiguos.
30 Por "se une específicamente”, se entiende en general que un anticuerpo se une a un epítopo por medio de su dominio de unión a antígeno, y que la unión comprende cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, por medio de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que lo
35 haría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se usa en el presente documento para denotar la afinidad relativa según la cual un cierto anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad mayor para un epítopo dado que el anticuerpo "B”, o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad mayor de la que tiene para el epítopo "D” relacionado.
40 Por "se une preferentemente”, se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que haría con un epítopo relacionado similar, homólogo o análogo. Así, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado tendría más probabilidad de unirse a ese epítopo que a un epítopo relacionado, aun cuando dicho anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.
45 A modo de ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une a dicho primer epítopo con una constante de disociación (KD) que es menos la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se
50 une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo.
En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante cinética de disociación (k(off)) que es inferior que la k(off) del anticuerpo
55 para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.
Puede decirse que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo con una constante cinética de disociación (k(off)) menor o igual que 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 x 10-3 s-1 o 10-3 s-1. Más preferentemente, puede decirse que un anticuerpo de la descripción se une a un polipéptido diana descrito en el
5 presente documento o un fragmento o variante del mismo con una constante cinética de disociación (k(off)) menor o igual que 5 x 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5 s-1 5 x 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 x 10-7 s-1 o 10-7 s-1.
Puede decirse que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo
10 con una constante cinética de asociación (k(on)) mayor o igual que 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 o 5 x 104 M1 s-1. Más preferentemente, puede decirse que un anticuerpo de la descripción se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo con una constante cinética de asociación (k(on)) mayor o igual que 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, o 5 x 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1.
15 Se dice que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo hasta el punto de que bloquea, en cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia con el epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de competición ELISA. Puede decirse que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos el 90 %, con al menos el 80
20 %, al menos el 70 %, al menos el 60 % o al menos el 50 %.
Tal como se usa en el presente documento, el término "afinidad" hace referencia a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988) en las páginas 27-28. Tal 25 como se usa en el presente documento, el término "avidez" hace referencia a la estabilidad global del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada con la afinidad de moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, y también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal
30 bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo con alta repetición, tal como un polímero, tendría una alta avidez.
Los anticuerpos Sp35 o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos también pueden describirse o especificarse desde el punto de vista de su reactividad cruzada. Tal como se usa en el presente 35 documento, la expresión "reactividad cruzada" hace referencia a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de la relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Así, un anticuerpo tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo distinto de aquel que indujo su formación. El epítopo con reactividad cruzada contiene generalmente muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo inductor, y en algunos casos, en realidad puede ajustarse mejor que el
40 original.
Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, dado que se unen a epítopos relacionados pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos el 95 %, al menos el 90 %, al menos el 85 %, con al menos el 80 %, al menos el 75 %, al menos el 70 %, al menos el 65 %, al menos el 60 %, al menos el 55 %, y 45 al menos el 50 % de identidad (calculado usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene una reactividad cruzada baja o nula si no se une a epítopos con menos del 95 %, menos del 90 %, menos del 85 %, menos del 80 %, menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 65 %, menos del 60 %, menos del 55 % y menos del 50 % de identidad (calculado usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia.
50 Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para un cierto epítopo si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.
Los anticuerpos Sp35 o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden describirse o especificarse también desde el punto de vista de su afinidad de unión a un polipéptido. Las afinidades de unión 55 preferentes incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15
M.
60 Los anticuerpos Sp35 o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden ser
"multiespecíficos”, por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad, lo que significa que reconoce y se une a dos o más epítopos diferentes presentes en uno o más antígenos diferentes (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo. Así, si un anticuerpo Sp35 es "monoespecífico" o "multiespecífico”, por ejemplo, "biespecífico”, hace referencia al número de diferentes epítopos con los que reacciona un polipéptido de unión. Los
5 anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana descritos en el presente documento o pueden ser específicos para un polipéptido diana, así como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido.
Tal como se usa en el presente documento el término "valencia" hace referencia al número de dominios de unión
10 potenciales, por ejemplo, dominios de unión a antígeno, presentes en un anticuerpo Sp35, polipéptido de unión o anticuerpo. Cada dominio de unión se une específicamente a un epítopo. Cuando un anticuerpo Sp35, polipéptido de unión o anticuerpo comprende más de un dominio de unión, cada dominio de unión puede unirse específicamente al mismo epítopo, para un anticuerpo con dos dominios de unión, denominado "monoespecífico bivalente”, o a diferentes epítopos, para un anticuerpo con dos dominios de unión, denominado "biespecífico
15 bivalente”. Un anticuerpo puede ser también biespecífico y bivalente para cada especificidad (denominados "anticuerpos biespecíficos tetravalentes"). En otro caso, pueden prepararse minicuerpos tetravalentes o anticuerpos con supresión de dominios.
Los anticuerpos biespecíficos bivalentes, y los procedimientos para prepararlos, se describen, por ejemplo, en las
20 patentes de EE. UU. nº 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; y las publicaciones de solicitudes de EE. UU. nº 2003/020.734 y 2002/0155.537. Los anticuerpos biespecíficos tetravalentes, y los procedimientos para prepararlos se describen, por ejemplo, en los documentos WO-02/096948 y WO-00/44788. Véanse en general las publicaciones PCT WO-93/17715; WO-92/08802; WO-91/00360; WO-92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); las patentes de EE. UU. nº 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol.
25 148:1547-1553 (1992).
Tal como se indica anteriormente, las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "dominio VH" incluye el dominio variable en el extremo amino de una cadena pesada de
30 inmunoglobulina y la expresión "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (el situado más en el extremo amino) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y está en el extremo amino en la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.
Tal como se usa en el presente documento la expresión "dominio CH2" incluye la parte de una molécula de cadena
35 pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración EU; véase Kabat EA et al. op. cit. El dominio CH2 es único en el sentido de que no está emparejado estrechamente con otro dominio. Al contrario, cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas en N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien
40 documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 al extremo C de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25
45 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno en el extremo N se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios de bisagra superior, medio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre
50 dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG presentes en la naturaleza, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU).
55 Tal como se usa en el presente documento, se entenderá que la expresión "anticuerpo quimérico" significa cualquier anticuerpo donde la región o sitio inmunorreactivo se obtiene o se deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, ser parcial o estar modificada de acuerdo con la presente descripción) se obtiene de una segunda especie. En casos preferentes la región o sitio de unión diana procederá de una fuente no
60 humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante es humana.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo diseñado" hace referencia a un anticuerpo en el que el dominio variable en la cadena pesada y ligera o las dos está alterado al menos por la sustitución parcial de una o más CDR con respecto a un anticuerpo de especificidad conocida y, si fuera necesario, por una sustitución 5 parcial de la región marco y un cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del cual se derivan las regiones marco, se contempla que las CDR se derivarán de un anticuerpo de diferente clase y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo diseñado en el que se injertan una o más CDR "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida en una región marco de cadena pesada o ligera humana se refiere en el presente documento como un 10 "anticuerpo humanizado”. Puede no ser necesario sustituir todas las CDR con las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión a antígeno de un dominio variable a otro. Al contrario, puede ser necesario solo transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión diana. Dadas las explicaciones expuestas, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. nº 5.585.089, 5.693.761,
5.693.762 y 6.180.370, se estará claramente dentro de la competencia de los expertos en la materia, ya sea al
15 efectuar experimentación de rutina o aplicando prueba y error para obtener un anticuerpo humanizado o diseñado funcional.
Tal como se usa en el presente documento la expresión "polipéptido plegado adecuadamente" incluye polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos Sp35) en los que todos los dominios funcionales que comprenden el polipéptido están
20 activos de forma distintiva. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido plegado inadecuadamente" incluye polipéptidos en los que al menos uno de los dominios funcionales del polipéptido no está activo. En un caso, un polipéptido plegado adecuadamente comprende cadenas de polipéptidos unidas por al menos un enlace disulfuro y, por el contrario, un polipéptido plegado inadecuadamente comprende cadenas de polipéptidos no unidas por al menos un enlace disulfuro.
25 Tal como se usa en el presente documento el término "diseñado" incluye la manipulación de moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos por medios sintéticos (por ejemplo, por técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas).
30 Tal como se usa en el presente documento, los términos "unido”, "fusionado" o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos más elementos o componentes, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" hace referencia a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) de polinucleótidos para formar un ORF más largo continuo, de una manera que mantiene el marco de lectura traduccional correcto de los ORF originales. Así, una proteína de fusión recombinante
35 es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están así unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace así continuo en todos los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados de forma física o espacial, por ejemplo, por una secuencia conectora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden estar fusionadas, en marco, pero separadas por un polinucleótido que
40 codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, en la medida en que las CDR "fusionadas" están cotraducidas como parte de un polipéptido continuo.
En el contexto de polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección del extremo amino a carboxilo en el que los residuos que son adyacentes entre sí en la
45 secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.
El término "expresión" tal como se usa en el presente documento hace referencia a un procedimiento por el que un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El procedimiento incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, sin limitación, inactivación génica, 50 así como expresión transitoria y expresión estable. Incluye sin limitación la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN en horquilla pequeño (shRNA), ARN de interferencia pequeño (siRNA)
o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s). Si el producto deseado final es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico”. Tal como se usa en el presente documento, un producto génico
55 puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que es traducido a partir de una transcripción. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas, escisión proteolítica, y similares.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto es prevenir o ralentizar (aminorar) un trastorno o cambio fisiológico no deseado, tal como la progresión de esclerosis múltiple. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, 5 estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado patológico y remisión (parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" puede significar también la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Las personas que necesitan el tratamiento incluyen aquellas que ya tienen la afección o trastorno, así como las propensas a tener la afección o trastorno o aquellas en las que la afección o
10 trastorno debe prevenirse.
Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero”, se entiende cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el cual se desea el diagnóstico, el pronóstico o la terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja y animales de zoológicos, de deportes o de compañía tales
15 como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, y así sucesivamente.
Tal como se usa en el presente documento, frases tales como "un sujeto que se beneficiaría de la administración de un anticuerpo Sp35" y "un animal que necesita el tratamiento" incluye sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de un anticuerpo Sp35 usado, por ejemplo, para la detección de un polipéptido
20 Sp35 (por ejemplo, para un procedimiento diagnóstico) y/o del tratamiento, es decir, la paliación o prevención de una enfermedad tal como EM, con un anticuerpo Sp35. Tal como se describe en mayor detalle en el presente documento, el anticuerpo Sp35 puede usarse en forma no conjugada o puede conjugarse, por ejemplo, con un fármaco, profármaco o un isótopo.
25 II. Sp35
El Sp35 humano presente en la naturaleza (Sp35) es una proteína glucosilada específica del sistema nervioso central que según la predicción tiene 614 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), lo que incluye una secuencia señal de 33 aminoácidos. Sp35 es conocido también en la técnica con los nombres de LINGO-1, LRRN6, LRRN6A, FLJ14594, 30 LERN1, MGC17422 y UNQ201. El polipéptido Sp35 humano de longitud completa de tipo natural contiene un dominio LRR que consiste en 14 repeticiones ricas en leucina (que incluye caperuzas en los extremos N y C), un dominio Ig, una región de transmembrana y un dominio citoplásmico. El dominio citoplásmico contiene un sitio de fosforilación de tirosina canónico. Además, la proteína Sp35 presente en la naturaleza contiene una secuencia señal, una región básica corta entre el dominio LRRCT e Ig, y una región de transmembrana entre el dominio Ig y el 35 dominio citoplásmico. El gen Sp35 humano (SEQ ID NO: 1) contiene codones de inicio de traducción alternativos, de manera que seis aminoácidos adicionales, es decir, MQVSKR (SEQ ID NO: 3) pueden estar o no presentes en el extremo N de la secuencia señal Sp35. La tabla 2 recibe los dominios Sp35 y otras regiones, de acuerdo con el número de residuo de aminoácido, basándose en la secuencia de aminoácidos Sp35 presentada en el presente documento como SEQ ID NO: 2. El polipéptido Sp35 se caracteriza en mayor detalle en la publicación PCT nº WO
40 2004/085648.
TABLA 2. Dominios Sp35
Dominio o región
Residuo de inicio Residuo de fin
Secuencia señal
1 33 o 35
LRRNT
34 o 36 64
LRR
66 89
LRR
90 113
LRR
114 137
LRR
138 161
LRR
162 185
LRR
186 209
LRR
210 233
LRR
234 257
LRR
258 281
LRR
282 305
LRR
306 329
LRR
330 353
LRRCT
363 414 o 416
Básico
415 o 417 424
Ig
419 493
Secuencia de conexión
494 551
Transmembrana
552 576
Citoplásmico
577 614
La distribución de tejidos y la expresión de desarrollo de Sp35 se ha estudiado en seres humanos y ratas. La biología de Sp35 se ha estudiado en un modelo de animal experimental (rata). La expresión de Sp35 de rata está localizada en las neuronas y los oligodendrocitos, según se determina por Northern blot y tinción
5 inmunohistoquímica. El nivel de expresión de ARNm Sp35 de rata está regulado en forma de desarrollo, y alcanza un máximo inmediatamente después del nacimiento, es decir, aproximadamente un día posnatal. En un modelo de transección de médula espinal de rata, Sp35 se regula por aumento en el sitio de la lesión, según se determina por RT-PCR. Véase Mi et al. Nature Neurosci. 7:221-228 (2004).
10 En el contexto de los aminoácidos que comprenden los diversos dominios estructurales y funcionales de un polipéptido Sp35, el término "aproximadamente" incluye el valor indicado en particular y valores mayores o menores en varios aminoácidos (por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1). Dado que la posición de estos dominios recogidos en la tabla 1 ha sido predicha por gráficos informáticos, un experto en la materia comprendería que los residuos de aminoácidos que constituyen los dominios pueden variar ligeramente (por ejemplo, en aproximadamente 1 a 15
15 residuos) dependiendo de los criterios usados para definir el dominio.
Los autores de la invención han descubierto que el Sp35 de longitud completa de tipo natural se une a NgR1. Véase la publicación PCT nº WO-2004/085648. Los autores de la invención han descubierto también que Sp35 se expresa en oligodendrocitos y que la proteína Sp35 interviene en la regulación de mielinización de axones mediada por
20 oligodendrocitos. Véase la publicación de patente de EE. UU. nº 2006/0009388 A1.
La secuencia de nucleótidos para la molécula Sp35 de longitud completa es la siguiente:
La secuencia polipeptídica para el polipéptido Sp35 de longitud completa es la siguiente:
III. ANTICUERPOS Sp35
En un caso, la presente descripción se dirige a anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos. Por ejemplo, la presente descripción incluye al menos los dominios de unión a antígeno de
10 ciertos anticuerpos monoclonales, y fragmentos, variantes, y derivados de los mismos mostrados en las tablas 3A a 3E.
La tabla 3A describe las regiones del polipéptido Sp35 que están unidas por ciertos anticuerpos derivados de bibliotecas de fagos de longitud completa. Estos anticuerpos tienen las mismas regiones variables que los
15 fragmentos Fab derivados de la Biblioteca de Presentación de Fagos-1, tal como se indica en la tabla 3B (por ejemplo, D05 en la tabla 3A tiene la misma región variable que Li05 en la tabla 3B, D06 en la tabla 3A tiene la misma región variable que Li06 en la tabla 3B, etc.). Los anticuerpos se sometieron a ensayo para determinar la unión a fragmentos de Sp35 tal como se define en la tabla 3A, usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
20 Las tablas 3B-3E describen la capacidad de los anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab denominados para detectar Sp35 en diversos ensayos tales como: clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), Inmunoprecipitación (IP), análisis por la técnica Western blot, Inmunohistoquímica (IHC) y ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Los protocolos detallados para realizar estos ensayos se describen en el presente documento o son bien conocidos y entendidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos
25 monoclonales derivados de hibridomas recogidos en las tablas 3B y 3C fueron producidos por inyección de Sp35 soluble en ratones y después aislados usando tecnología de hibridomas que es bien conocida en la técnica y se describe en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales y los fragmentos Fab de anticuerpos recogidos en la tabla 3B fueron aislados a partir de dos bibliotecas de presentación de fagos diferentes usando técnicas conocidas en la técnica.
30 TABLA 3A
Fragmento Sp35
D03 (región variable Li03) D05 (región variable Li05) D06 (región variable Li06) D08 (región variable Li08) D11 (región variable Li03) D13 (región variable Li13) D33 (región variable Li33)
Fc rata 1-432
+ + + - + - +
Fc rata 417-093
- +/ +/ - - - -
AP-Sp35 (1-419)
N/D + -/+ -/+ N/D N/D N/D
AP-Sp35 (418-498)
N/D - - - N/D N/D N/D
Fc humano 417-498
- - - - - - -
Fc humano 417-503
- - - - - - -
Fc humano 363-498
- - - - - - -
Fc humano 244-498
- - - - - -
TABLA 3B - SP35 ANTICUERPOS MONOCLONALES
ANTICUERPOS MONOCLONALES DERIVADOS DE HIBRIDOMA
FACs
Inmunoprecipitación Western
huSp35
mSp35 sp35Fc huSp35 mSp35 huSp35 ratón/rata sp35
201'
sí sí No (ratón y rata)
3A3
- - + - - no No (ratón y rata)
3A6
++ +/ ++ +++ -/+ no No (ratón y rata)
1A7
++ - ++ +++ -/+ no No (ratón y rata)
1G7
++ +/ ++ +++ + no No (ratón y rata)
2B10
++ +/ + +++ -/+ no No (ratón y rata)
2C11
- - - - - no No (ratón y rata)
2F3
+/- +/- +++ +++ sí sí con mSp35 sobreexpresado
3P1B1.1F9
+++ -
3P1D10.2C3
+++ -
3P1E11.3B7
+++ -
3P2C6. 3G10.2H7
+++ -
3P2C9.2G4
+++ -
3P4A6.1D9
+++ -
3P4A1.2B9
+++ -
3P4C2.2D2
+++ +++
3P4C5.1D8
+++ -
3P4C8.2G9
+++ +++ sí Sí (ratón)
7P1D5.1G9 (ATCC: PTA-8107)
+ + +++ +++ no No (ratón)
1B6.4
+++ +++ +++ (banda superior) +++ (banda inferior) no No (ratón)
2C7.2
+++ +++ +++ (banda superior) +++ (banda inferior) no No (ratón)
2D6.1
++ (se une a células 293) ++ (se une a células 293) - - no No (ratón)
2F7.3
++ ++ +++ (banda inferior) +++ (banda inferior) sí Sí (ratón)
2H3.2
++ ++ +++ (banda inferior) +++ (banda inferior) sí Sí (ratón)
3C11.1
++ ++ +++ (banda inferior) +++ (banda inferior) sí Sí (ratón)
3E3.1
+++ +++ +++ (banda superior) +++ (banda inferior) no No (ratón)
3H11.2
++ ++ +++ (banda inferior) +++ (banda inferior) sí Sí (ratón)
3G8.1
+ + +++ (banda superior) +++ no No (ratón)
2B8.1
++ ++ +++ (banda superior) + (banda inferior) no No (ratón)
3B5.2 (ATCC: PTA-8106)
+++ +++ +++ (banda superior) +++ no No (ratón)
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
IHC en células transfectadas
IHC en tejidos ELISA
huSp35
mSp35 WT (parafina) KO (parafina) 34417 417493 419-495 1532 34532
201'
N/A N/A sí sí
3A3
no no sí sí
3A6
sí con fondo no
1A7
sí con fondo no +/- sí sí
1G7
sí con fondo no
2B10
sí con fondo no sí sí
2C11
no no
2F3
sí sí sí sí sí sí
3P1B1.1F9
3P1D10.2C3
+/- sí sí
3P1E11.3B7
+/ sí sí
3P2C6. 3G10.2H7
+/ sí sí
3P2C9.2G4
+/- sí sí
3P4A6.1D9
+/- sí sí
3P4A1.2B9
3P4C2.2D2
sí sí
3P4C5.1D8
+/- sí sí
3P4C8.2G9
sí sí
7P1D5.1G9
(ATCC: PTA-8107)
1B6.4
2C7.2
2D6.1
2F7.3
2H3.2
3C11.1
3E3.1
3H11.2
3G8.1
2B8.1
3B5.2 (ATCC: PTA-8106)
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
FRAGMENTOS Fab MONOCLONALES DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-1
FACs
Inmunoprecipitación Western
huSp35
mSp35 sp35Fc huSp35 mSp35 huSp35 Ratón/rata sp35
30-C12 (Li01)
++ ++
38-D01 (Li02)
-/+ -/+
35-E04 (Li03)
++ +++
36-C09 (Li04)
-/+ -/+
30-A11 (Li05)
+ ++ ++ ++
34-F02 (Li06)
++ ++
29-E07 (Li07)
++ ++
34-G04 (Li08)
+/- + ++ ++
36-A12 (Li09)
- -
28-D02 (Li10)
-/+ +/-
30-B01 (Li11)
++ ++ ++
34-B03 (Li12)
+ +
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
FRAGMENTOS Fab MONOCLONALES DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-1
IHC en células transfectadas
IHC en tejidos ELISA
huSp35
mSp35 WT (parafina) KO (parafina) 34-417 417-493 419-495 1532 34532
30-C12 (Li01)
38-D01 (Li02)
35-E04 (Li03)
36-C09 (Li04)
30-A11 (Li05)
34-F02 (Li06)
29-E07 (Li07)
34-G04 (Li08)
36-A12 (Li09)
28-D02 (Li10)
30-B01(Li11)
34-B03 (Li12)
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
FRAGMENTOS Fab MONOCLONALES DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-2
FACs
Inmunoprecipitación Western
huSp35
mSp35 sp35Fc huSp35 mSp35 huSp35 Ratón/rata sp35
3383 (1)
+ -
3495(2)
+ - sí no
3563 (3)
+
3564 (4)
+
3565 (5)
+
3566 (6)
+
3567 (7)
+
3568 (8)
+
3569 (9)
+
3570 (10)
+
3571 (11)
+
3582 (12)
+
1968 (13)
+/- - ++ débil no
3011
- +/
3012
- -
3013
adherente +
3418
adherente
3422
-
3562
adherente
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
FRAGMENTOS Fab MONOCLONALES DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-2
IHC en células transfectadas
IHC en tejidos ELISA
huSp35
mSp35 WT (parafina) KO (parafina) 34-417 417493 419-495 1532 34532
3383 (1)
N/A N/A sí sí sí sí
3495 (2)
débil N/A sí sí +/ sí sí
3563 (3)
no no sí sí
3564 (4)
no no sí sí
3565 (5)
no no sí sí
3566 (6)
sí muy débil sí sí +/ sí sí
3567 (7)
sí no sí sí +/ sí sí
3568 (8)
no no sí sí
3569 (9)
no no sí sí
3570 (10)
no no sí sí
3571 (11)
no no
3582 (12)
no no sí sí
1968 (13)
muy débil sí con fondo sí sí +/- sí sí
3011
solo tinción de muy pocas células débil
3012
no no
3013
sí con fondo alto sí
3418
sí con fondo alto sí
3422
muy débil sí con fondo alto
3562
no no
TABLA 3B - Sp35 ANTICUERPOS MONOCLONALES (continuación)
ANTICUERPOS MONOCLONALES COMPLETOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-1
FACs
Inmunoprecipitación Western
huSp35
mSp35 sp35Fc huSp35 mSp35 huSp35 Ratón/rata sp35
D05
++
D07
+++
D08
++
D10
+++
D11
+++
ANTICUERPOS MONOCLONALES COMPLETOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA DE PRESENTACIÓN DE FAGOS-1
IHC en células transfectadas
IHC en tejidos ELISA
huSp35
mSp35 WT (parafina) KO (parafina) 34-417 417-493 419-495 1-532 34-532
D05
D07
D08
D10
D11
Leyenda: huSp35 = proteína Sp35 humana mSp35 = proteína Sp35 murina WT = tipo natural KO = inactivado IHC = inmunohistoquímica FACS = clasificación de células activada por fluorescencia
TABLA 3D
Anticuerpo
Especie Subtipo ELISA
hLINGO-1
LRR Ig mLINGO1 hLINGO-2
1A7
murina IgG1/kappa Fab + +/-
AMc
+++ - - +/ -
2F3
murina IgG2a Fab
AMc
++ ++ - ++ +/
3P1D10.2C3
murina IgG1 AMc +++ - - -
3P1E11.3B7
murina IgG1 AMc +++ - - -
6P4F4.1D3
murina IgG1/kappa AMc +++ +++ - +++ -
6P4F4.1F9
murina IgG1/kappa AMc +++ +++ - +++ -
7P1D5.1G9 (ATCC PTA8107
murina IgG1/kappa Fab + +
AMc
++ + - +++ -
1B6.4
murina IgG1/kappa AMc +++ ++ - +++ -
2C7.2
murina IgG1/kappa AMc +++ ++ - +++ +
2D6.1
murina IgG1/kappa AMc - - - - -
2F7.3
murina IgG1/kappa AMc +++ - - +++ -
2H3.2
murina IgG1/kappa AMc +++ - - +++ -
3C11.1
murina IgG1/kappa AMc +++ - - +++ -
3E3.1
murina IgG1/kappa AMc +++ ++ - +++ -
3H11.2
murina IgG1/kappa AMc +++ - - +++ -
3G8.1
murina AMc +++ ++ - +++ -
2B8.1
murina AMc +++ ++ - +++ -
3B5.2 (ATCC: PTA8106)
murina IgG1/kappa AMc +++ + - +++ -
3P3C10.2
murina AMc +++ + - +++ -
3P4F4.6
murina AMc +++ + - +++ -
TABLA 3D (continuación)
Anticuerpo
Especie Subtipo FACS en células 293 FACS en CHO estables
1A7
murina IgG1/kappa Fab 1 nM -
AMc
+++ - 0,7 nM -
2F3
murina IgG2a Fab
AMc
+/ +/
3P1D10.2C3
murina IgG1 AMc
3P1E11.3B7
murina IgG1 AMc
6P4F4.1D3
murina IgG1/kappa AMc
6P4F4.1F9
murina IgG1/kappa AMc
7P1D5.1G9 (ATCC PTA8107
murina IgG1/kappa Fab + (10,4) nM 3,7 nM
AMc
+++ 2,7 nM 1 nM
1B6.4
murina IgG1/kappa AMc +++ +++
2C7.2
murina IgG1/kappa AMc +++ +++
2D6.1
murina IgG1/kappa AMc ++(*) ++(*) - -
2F7.3
murina IgG1/kappa AMc ++ ++
2H3.2
murina IgG1/kappa AMc ++ ++
3C11.1
murina IgG1/kappa AMc ++ ++
3E3.1
murina IgG1/kappa AMc +++ +++
3H11.2
murina IgG1/kappa AMc ++ ++
3G8.1
murina AMc + +
2B8.1
murina AMc ++ ++ 5,4 nM
3B5.2 (ATCC: PTA-8106)
murina IgG1/kappa AMc +++ +++ < 0,4 nM 0,4 nM
3P3C10.2
murina AMc 5,1 nM 4,4 nM
3P4F4.6
murina AMc 4,6 nM 6 nM
TABLA 3D (CONTINUACIÓN)
Anticuerpo
Especie Subtipo ELISA
hLINGO-1
LRR Ig mLINGO1
30-C12 (DIi01)
humana kappa Fab ++ + -
38-D01 (DIi02)
humana lambda Fab + - -
35-E04 (DiI03)
humana kappa Fab +++ + - +++
Ac
36-C09 (DIi04)
humana Fab + - -
30-A11 (DIi05)
humana lambda Fab +++ - (CG), ++ (ZS) - +++
Ac
34-F02 (DIi06)
humana kappa Fab ++ - (CG), +/- (ZS) - ++
Ac
29-E07 (DIi07)
humana lambda Fab ++ + +/-
34-G04 (DIi08)
humana kappa Fab - (CG), ++ (ZS) - (CG), +/- (ZS) - +
Ac
36-A12 (DIi09)
humana kappa Fab - - -
28-D02 (DIi10)
humana kappa Fab ++ - -
Ac
30-B01 (DIi11)
humana kappa Fab +++ + -
Ac
34-B03 (DIi12)
humana Fab ++ +/- -
72-D03 (DIi13)
humana Fab ++++ - - ++++
Ac
73-C08 (DIi17)
humana Fab +++ - - +++
74-E08 (DIi21)
humana Fab +++ + - +++
75-H04 (DIi24)
humana Fab ++++ - - ++++
76-F10 (DIi28)
humana Fab ++++ + - ++++
79-G02 (DIi32)
humana Fab ++++ + - ++++
80-A08 (DIi33)
humana Fab ++++ ++ - ++++
Ac
80-D02 (DIi34)
humana Fab ++++ ++ - +++++
Ac
81-C01 (DIi35)
humana Fab ++++ ++ - ++++
74-D05 (DIi36)
humana Fab ++++ ++++
74-F02 (DIi40)
humana Fab ++++ ++++
75-B09 (DIi42)
humana Fab ++++ ++++
94-E07 (DIi54)
humana Fab ++++ ++++
98-B10 (DIi55)
humana Fab ++++ +++
544L-M0054-E03 (DIi62)
humana Fab ++++
IgG1Agly
Ac
544-L-M0059-G09 (DIi63)
humana Fab ++++
544-L-M0063-G06 (DIi64)
humana Fab ++++
544-L-M0069-D12 (DIi65)
humana Fab ++++
544-L-M0070- H12 (DIi67)
humana Fab ++++
544-L-M0090-E09 (Di73)
humana Fab ++++
IgG1Agly
Ac
544-L-M0090-E12 (DIi74)
humana Fab ++++
544-L-M0090-F08 (DIi75)
humana Fab ++++
544-L-M0104-B01 (DIi77)
humana Fab ++++
544-L-M0120-E08 (DIi81)
humana Fab ++++
IgG1Agly
Ac 0.25nM 0.27nM
TABLA 3D (CONTINUACIÓN)
Anticuerpo
Especie Subtipo FACS en células 293 FACS en CHO estable
hLINGO-1
mLINGO-1 hLINGO1 mLINGO1
30-C12 (DIi01)
humana kappa Fab
38-D01 (DIi02)
humana lambda Fab
35-E04 (DiI03)
humana kappa Fab
Ac
36-C09 (DIi04)
humana Fab
30-A11 (DIi05)
humana lambda Fab + 22,8 nM -
Ac
++ sin ajuste 5,5 nM
34-F02 (DIi06)
humana kappa Fab 21 nM >200 nM
Ac
2,32 nM 26,6 nM
29-E07 (DIi07)
humana lambda Fab
34-G04 (DIi08)
humana kappa Fab +/- 206 nM 190 nM
Ac
++ 3,3 nM 18,6 nM
36-A12 (DIi09)
humana kappa Fab
28-D02 (DIi10)
humana kappa Fab
Ac
+++ 0,49 nM >400 nM
30-B01 (DIi11)
humana kappa Fab +++
Ac
+++
34-B03 (DIi12)
humana Fab
72-D03 (DIi13)
humana Fab 0,74 nM, 3,2 (CG) 24,7 nM
Ac
73-C08 (DIi17)
humana Fab
74-E08 (DIi21)
humana Fab
75-H04 (DIi24)
humana Fab
76-F10 (DIi28)
humana Fab
79-G02 (DIi32)
humana Fab
80-A08 (DIi33)
humana Fab 1,39 nM, 4 (CG) sin ajuste
Ac
0,208 nM para IgG2
80-D02 (DIi34)
humana Fab
Ac
81-C01 (DIi36)
humana Fab
74-D05 (DIi39)
humana Fab 7,6 nM (CG)
74-F02 (DIi40)
humana Fab 11 nM (CG)
75-B09 (DIi42)
humana Fab 28 nM (CG)
94-E07 (DIi54)
humana Fab 33 nM (CG)
98-B10 (DIi55)
humana Fab 50 nM (CG)
544L-M0054-E03 (DIi62)
humana Fab
IgG1Agly
Ac 0,261 nM
544-L-M0059-G09 (DIi63)
humana Fab
544-L-M0063-G06 (DIi64)
humana Fab
544-L-M0069-D12 (DIi65)
humana Fab
544-L-M0070-H12 (DIi67)
humana Fab
544-L-M0090
humana Fab
E09 (DIi73)
IgG1Agly
Ac 0,12 nM
544-L-M0090-E12 (DIi74)
humana Fab
544-L-M0090-F08 (DIi75)
humana Fab
544-L-M0104-B01 (DIi77)
humana Fab
544-L-M0120-E08 (DIi81)
humana Fab
IgG1Agly
Ac 0,156 nM
TABLA 3E
Anticuerpo
Especie Subtipo IP IHC
hLINGO -1
mLINGO -1 roedor endógen o bloque o congelad o parafin a
1A7
murina IgG1/kappa Fab +++ (U) +/-
AM c
+++ (U) +/ sí
2F3
murina IgG2a Fab
AM c
+++ (L) +++ (L) no no sí (débil) +++
3P1D10.2C 3
murina IgG1 AM c
3P1E11.3B7
murina IgG1 AM c
6P4F4.1D3
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++
6P4F4.1F9
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++
7P1D5.1G9 (ATCC PTA8107
murina IgG1/kappa Fab +++ (U) +++
AM c
+++ (U) +++ (L) sí sí
1B6.4
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++ (L) sí
2C7.2
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++ (L) sí
2D6.1
murina IgG2a/kapp a AM c - - no
2F7.3
murina IgG1/kappa AM c +++ (L) +++ (L) no
2H3.2
murina IgG1/kappa AM c +++ (L) +++ (L) no no
3C11.1
murina IgG1/kappa AM c +++ (L) +++ (L) sí (débil) no
3E3.1
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++ (L) sí sí no
3H11.2
murina IgG1/kappa AM c +++ (L) +++ (L)
3G8.1
murina AM c +++ (U) +++ sí
2B8.1
murina AM c +++ (U) + (L) sí
3B5.2 (ATCC:
murina IgG1/kappa AM c +++ (U) +++ sí sí
PTA-8106)
3P3C10.2
murina AM c
3P4F4.6
murina AM c
30-C12 (DIi01)
human a kappa Fab ++ ++
38-D01 (DIi02)
human a lambda Fab -/+ -/+
35-E04 (DiI03)
human a kappa Fab ++ +++ no no
Ac
36-C09 (DIi04)
human a Fab -/+ -/+
30-A11 (DIi05)
human a lambda Fab ++ ++
Ac
++ (U) ++ (L) sí
34-F02 (DIi06)
human a kappa Fab ++ ++
Ac
29-E07 (DIi07)
human a lambda Fab ++ ++
34-G04 (DIi08)
human a kappa Fab ++ ++
Ac
++ (U) ++ (L)
36-A12 (DIi09)
human a kappa Fab - -
28-D02 (DIi10)
human a kappa Fab -/+ +/-
Ac
30-B01 (DIi11)
human a kappa Fab ++ (U) ++ (L)
Ac
sí no +
34-B03 (DIi12)
human a Fab + +
72-D03 (DIi13)
human a Fab ++ (U) ++ (L) no
Ac
++
73-C08 (DIi17)
human a Fab
74-E08 (DIi21)
human a Fab
75-H04 (DIi24)
human a Fab
76-F10 (DIi28)
human a Fab
79-G02 (DIi32)
human a Fab
80-A08 (DIi33)
human a Fab ++ (banda superior) ++ (L) sí (débil)
Ac
+++ +
80-D02 (DIi34)
human a Fab ++ (U) ++ (L)
Ac
+++ +++
81-C01 (DIi36)
human a Fab
74-D05
human Fab
(DIi39)
a
74-F02 (DIi40)
human a Fab
75-B09 (DIi42)
human a Fab
94-E07 (DIi54)
human a Fab
98-B10 (DIi55)
human a Fab
544LM0054-E03 (DIi62)
human a Fab
IgG1Agly
Ac
544-LM0059-G09 (DIi63)
human a Fab
544-LM0063-G06 (DIi64)
human a Fab
544-LM0069-D12 (DIi65)
human a Fab
544-LM0070-H12 (DIi67)
human a Fab
544-LM0090-E09 (DIi73)
human a Fab
IgG1Agly
Ac
544-LM0090-E12 (DIi74)
human a Fab
544-LM0090-F08 (DIi75)
human a Fab
544-LM0104-B01 (DIi77)
human a Fab
544-LM0120-E08 (DIi81)
human a Fab
IgG1Agly
Ac sí sí sí
TABLA 3E (continuación)
Anticuerpo
Especie Subtipo Mielinización en cocultivo Crecimiento de neuritas LME Aplastamiento nervio óptico Cuprizona Lisolecitina
1A7
murina IgG1/kappa Fab
AMc
sí sí sí? sí sí sí
2F3
murina IgG2a Fab
AMc
sí sí no
3P1D10.2C3
murina IgG1 AMc sí/no
3P1E11.3B7
murina IgG1 AMc sí/no
6P4F4.1D3
murina IgG1/kappa AMc sí
6P4F4.1F9
murina IgG1/kappa AMc
7P1D5.1G9 (ATCC PTA8107
murina IgG1/kappa Fab sí sí
AMc
sí no?
1B6.4
murina IgG1/kappa AMc no
2C7.2
murina IgG1/kappa AMc no
2D6.1
murina IgG1/kappa AMc sí
2F7.3
murina IgG1/kappa AMc sí
2H3.2
murina IgG1/kappa AMc no
3C11.1
murina IgG1/kappa AMc sí
3E3.1
murina IgG1/kappa AMc no
3H11.2
murina IgG1/kappa AMc no
3G8.1
murina AMc no
2B8.1
murina AMc sí
3B5.2 (ATCC: PTA/8106)
murina IgG1/kappa AMc sí sí sí
3P3C10.2
murina AMc
3P4F4.6
murina AMc
30-C12 (DIi01)
humana kappa Fab
38-D01 (DIi02)
humana lambda Fab
35-E04 (DiI03)
humana kappa Fab
Ac
36-C09 (DIi04)
humana Fab
30-A11 (DIi05)
humana lambda Fab sí sí
Ac
sí sí
34-F02 (DIi06)
humana kappa Fab sí
Ac
sí
29-E07 (DIi07)
humana lambda Fab
34-G04 (DIi08)
humana kappa Fab sí sí
Ac
sí sí/no
36-A12 (DIi09)
humana kappa Fab
28-D02 (DIi10)
humana kappa Fab
Ac
30-B01 (DIi11)
humana kappa Fab
Ac
no
34-B03 (DIi12)
humana Fab
72-D03 (DIi13)
humana Fab sí sí
Ac
73-C08 (DIi17)
humana Fab
74-E08 (DIi21)
humana Fab
75-H04 (DIi24)
humana Fab no
76-F10 (DIi28)
humana Fab sí
79-G02 (DIi32)
humana Fab
80-A08 (DIi33)
humana Fab sí sí
Ac
sí
80-D02 (DIi34)
humana Fab no
Ac
81-C01 (DIi36)
humana Fab no
74-D05
humana Fab
(DIi39)
74-F02 (DIi40)
humana Fab
75-B09 (DIi42)
humana Fab
94-E07 (DIi54)
humana Fab
98-B10 (DIi55)
humana Fab
544LM0054-E03 (DIi62)
humana Fab sí
IgG1Agly
Ac sí
544-LM0059-G09 (DIi63)
humana Fab no
544-LM0063-G06 (DIi64)
humana Fab no
544-LM0069-D12 (DIi65)
humana Fab sí
544-LM0070-H12 (DIi67)
humana Fab sí
544-LM0090-E09 (DIi73)
humana Fab sí
IgG1Agly
Ac sí
544-LM0090-E12 (DIi74)
humana Fab no
544-LM0090-F08 (DIi75)
humana Fab no
544-LM0104-B01 (DIi77)
humana Fab sí
544-LM0120-E08 (DIi81)
humana Fab sí
IgG1Agly
Ac sí sí
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "dominio de unión a antígeno" incluye un sitio que se une específicamente a un epítopo en un antígeno (por ejemplo, un epítopo de Sp35). El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo incluye normalmente al menos una parte de una región variable de cadena pesada de
5 inmunoglobulina y al menos una parte de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. El sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo.
La presente descripción está dirigida más específicamente a un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, donde el anticuerpo Sp35 se une al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal 10 seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571
15 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81.
La descripción se dirige además a un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, donde el anticuerpo Sp35 inhibe competitivamente un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 20 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565
(L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81 de la unión a Sp35.
La descripción se dirige también a un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del
5 mismo, donde el anticuerpo Sp35 comprende al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563
10 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81.
El 27 de diciembre de 2006, se depositaron los siguientes hibridomas en la American Type Culture Collection (ATCC) en Manassas, VA: 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106), 7.P1D5.1.G9 (Designación de
15 Depósito ATCC PTA-8107). El hibridoma 2.P3B5.2 depositado produce el anticuerpo monoclonal 3B5.2, descrito en el presente documento y el hibridoma 7.P1D5.1.G9 depositado produce el anticuerpo monoclonal 7P1D5.1.G9, descrito en el presente documento. Los hibridomas pueden cultivarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
20 En algunos casos, la presente descripción se dirige a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo que se une de forma específica o preferente a un fragmento o dominio de polipéptido Sp35 en particular. Dichos fragmentos de polipéptidos Sp35 incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido Sp35 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493;66 a 532;417 a 532; 417 a 425 (la región básica de Sp35); 417 a 493; 417 a 532;,
25 419 a 493 (la región Ig de Sp35); o 425 a 532 de SEQ ID NO: 2; o una variante de polipéptido Sp35 con al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con los aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493; 66 a 532; 417 a 532; 417 a 425 (la región básica de Sp35); 417 a 493; 417 a 532; 419 a 493 (la región Ig de Sp35); o 425 a 532 de SEQ ID NO: 2.
30 Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una o más repeticiones ricas en leucina (LRR) de Sp35. Dichos fragmentos incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en
o consisten en los aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 66 a 137; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209;
35 210 a 233;, 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; o 330 a 353 de SEQ ID NO: 2. También se contemplan los fragmentos correspondientes de una variante de polipéptido Sp35 con al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con los aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233; 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; o 330 a 353 de SEQ ID NO: 2.
40 Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una o más regiones ricas en cisteína que flanquean la LRR de Sp35. Dichos fragmentos incluyen, por ejemplo, un fragmento que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los aminoácidos 34 a 64 de SEQ ID NO: 2 (la región de flanqueo LRR en el extremo
45 N(LRRNT)), o un fragmento que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los aminoácidos 363 a 416 de SEQ ID NO: 2 (región de flanqueo LRR en el extremo C (LRRCT)). También se contemplan fragmentos de aminoácidos correspondientes de una variante de polipéptido Sp35 con al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con los aminoácidos 34 a 64 y 363 a 416 de SEQ ID NO: 2.
50 Tal como se conoce en la técnica, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se indica en el presente documento, el hecho de que un polipéptido cualquiera en particular tenga al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con otro polipéptido puede determinarse usando procedimientos y programas/software informáticos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, el programa BESTFIT
55 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, Universiity Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia en particular tiene, por ejemplo, el 95 % de identidad con una secuencia de referencia de acuerdo con la
60 presente descripción, los parámetros se establecen, naturalmente, de manera que el porcentaje de identidad se
calcula en toda la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia y que se permiten diferencia en la homología de hasta el 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a
5 antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 41 a 525 de SEQ ID NO: 2; 40 a 526 de SEQ ID NO: 2; 39 a 527 de SEQ ID NO: 2; 38 a 528 de SEQ ID NO: 2; 37 a 529 de SEQ ID NO: 2; 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 46 a 520 de SEQ ID NO: 2; 45 a 521 de SEQ ID NO: 2; 44 a 522 de SEQ ID NO: 2; 43 a 523 de SEQ ID NO: 2; y 42 a 524 de SEQ ID NO: 2.
10 Otros fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO: 2; 34 a 64 de SEQ ID NO: 2; 36 a 64 de SEQ ID NO: 2; 66 a 89 de SEQ ID NO: 2; 90 a 113
15 de SEQ ID NO: 2; 114 a 137 de SEQ ID NO: 2; 138 a 161 de SEQ ID NO: 2; 162 a 185 de SEQ ID NO: 2; 186 a 209 de SEQ ID NO: 2; 210 a 233 de SEQ ID NO: 2; 234 a 257 de SEQ ID NO: 2; 258 a 281 de SEQ ID NO: 2; 282 a 305 de SEQ ID NO: 2; 306 a 329 de SEQ ID NO: 2; 330 a 353 de SEQ ID NO: 2; 363 a 416 de SEQ ID NO: 2; 417 a 424 de SEQ ID NO: 2; 419 a 493 de SEQ ID NO: 2; y 494 a 551 de SEQ ID NO: 2.
20 Aún más, los fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO: 2; 1 a 64 de SEQ ID NO: 2; 1 a 89 de SEQ ID NO: 2; 1 a 113 de SEQ ID NO: 2; 1 a 137 de SEQ ID NO: 2; 1 a 161 de SEQ ID NO: 2; 1 a 185 de SEQ ID NO: 2; 1 a 209 de SEQ ID NO: 2; 1 a 233 de SEQ ID
25 NO: 2; 1 a 257 de SEQ ID NO: 2; 1 a 281 de SEQ ID NO: 2; 1 a 305 de SEQ ID NO: 2; 1 a 329 de SEQ ID NO: 2; 1 a 353 de SEQ ID NO: 2; 1 a 416 de SEQ ID NO: 2; 1 a 424 de SEQ ID NO: 2; 1 a 493 de SEQ ID NO: 2; 1 a 551 de SEQ ID NO: 2; 1 a 531 de SEQ ID NO: 2 y 1 a 532 de SEQ ID NO: 2.
Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a
30 antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 34 a 64 de SEQ ID NO: 2; 34 a 89 de SEQ ID NO: 2; 34 a 113 de SEQ ID NO: 2; 34 a 137 de SEQ ID NO: 2; 34 a 161 de SEQ ID NO: 2; 34 a 185 de SEQ ID NO: 2; 34 a 209 de SEQ ID NO: 2; 34 a 233 de SEQ ID NO: 2; 34 a 257 de SEQ ID NO: 2; 34 a 281 de SEQ ID NO: 2; 34 a 305 de SEQ ID NO: 2; 34 a 329 de SEQ ID NO: 2; 34 a 353 de SEQ ID NO: 2; 34 a 416 de
35 SEQ ID NO: 2; 34 a 424 de SEQ ID NO: 2; 34 a 493 de SEQ ID NO: 2; y34 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Más fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 34 a 530 de SEQ ID NO: 40 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 533 de SEQ ID NO: 2; 34 a 534 de SEQ ID NO: 2; 34 a 535 de SEQ ID NO: 2; 34 a 536 de SEQ ID NO: 2; 34 a 537 de SEQ ID NO: 2; 34 a 538 de SEQ ID NO: 2; 34 a 539 de SEQ ID NO: 2; 30 a 532 de SEQ ID NO: 2; 31 a 532 de SEQ ID NO: 2; 32 a 532 de SEQ ID NO: 2; 33 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 35 a 532 de SEQ ID NO: 2; 36 a 532 de SEQ ID NO: 2; 30 a 531 de SEQ ID NO: 2; 31 a 531 de SEQ ID NO: 2; 32 a 531 de SEQ ID NO: 2; 33 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ
45 ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; y 36 a 531 de SEQ ID NO: 2.
Aún más, los fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 36 a 64 de SEQ ID NO: 2;
50 36 a 89 de SEQ ID NO: 2; 36 a 113 de SEQ ID NO: 2; 36 a 137 de SEQ ID NO: 2; 36 a161 de SEQ ID NO: 2; 36 a 185 de SEQ ID NO: 2; 36 a 209 de SEQ ID NO: 2; 36 a 233 de SEQ ID NO: 2; 36 a 257 de SEQ ID NO: 2; 36 a 281 de SEQ ID NO: 2; 36 a 305 de SEQ ID NO: 2; 36 a 329 de SEQ ID NO: 2; 36 a 353 de SEQ ID NO: 2; 36 a 416 de SEQ ID NO: 2; 36 a 424 de SEQ ID NO: 2; 36 a 493 de SEQ ID NO: 2; y 36 a 551 de SEQ ID NO: 2.
55 Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 36 a 531 de SEQ ID NO: 2; 36 a 532 de SEQ ID NO: 2; 36 a 533 de SEQ ID NO: 2; 36 a 534 de SEQ ID NO: 2; 36 a 535 de SEQ ID NO: 2; 36 a 536 de SEQ ID NO: 2; 36 a 537 de SEQ ID NO: 2; 36 a 538 de SEQ ID NO: 2; y 36 a
60 539 de SEQ ID NO: 2.
Más fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en los aminoácidos 417 a 493 de SEQ ID NO: 2; 417 a 5 494 de SEQ ID NO: 2; 417 a 495 de SEQ ID NO: 2; 417 a 496 de SEQ ID NO: 2; 417 a 497 de SEQ ID NO: 2; 417 a 498 de SEQ ID NO: 2; 417 a 499 de SEQ ID NO: 2; 417 a 500 de SEQ ID NO: 2; 417 a 492 de SEQ ID NO: 2; 417 a 491 de SEQ ID NO: 2; 412 a 493 de SEQ ID NO: 2; 413 a 493 de SEQ ID NO: 2; 414 a 493 de SEQ ID NO: 2; 415 a 493 de SEQ ID NO: 2; 416 a 493 de SEQ ID NO: 2; 411 a 493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 494 de SEQ ID NO: 2; 411 a 494 de SEQ ID NO: 2; 412 a 494 de SEQ ID NO: 2; 413 a 494 de SEQ ID NO: 2; 414 a
10 494 de SEQ ID NO: 2; 415 a 494 de SEQ ID NO: 2; 416 a 494 de SEQ ID NO: 2; 417 a 494 de SEQ ID NO: 2; y418 a 494 de SEQ ID NO: 2.
En un caso adicional los fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen un polipéptido Sp35 que 15 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en péptidos del dominio Ig de Sp35 o fragmentos, variantes o derivados de dichos polipéptidos. Específicamente, los polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en las siguientes secuencias de polipéptidos: ITX1X2X3 (SEQ ID NO: 287), ACX1X2X3 (SEQ ID NO: 288), VCX1X2X3 (SEQ ID NO: 289) y SPX1X2X3 (SEQ ID NO: 290) donde X1 es lisina, arginina, histidina, glutamina o asparagina, X2 es lisina, arginina, histidina, glutamina, o asparagina y X3 es lisina, arginina, histidina, glutamina o 20 asparagina. Por ejemplo, los fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen aquellos fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las siguientes secuencias de polipéptidos: SPRKH (SEQ ID NO: 291), SPRKK (SEQ ID NO: 292), SPRKR (SEQ ID NO: 293), SPKKH (SEQ ID NO: 294), SPHKH (SEQ ID NO: 295), SPRRH (SEQ ID NO: 296), SPRHH (SEQ ID NO: 297), SPRRR (SEQ ID NO: 298), SPHHH (SEQ ID NO: 299) 25 SPKKK (SEQ ID NO: 300), LSPRKH (SEQ ID NO: 301), LSPRKK (SEQ ID NO: 302), LSPRKR (SEQ ID NO: 303), LSPKKH (SEQ ID NO: 304), LSPHKH (SEQ ID NO: 305), LSPRRH (SEQ ID NO: 306), LSPRHH (SEQ ID NO: 307), LSPRRR (SEQ ID NO: 308), LSPHHH (SEQ ID NO: 309) LSPKKK (SEQ ID NO: 310), WLSPRKH (SEQ ID NO: 311), WLSPRKK (SEQ ID NO: 312), WLSPRKR (SEQ ID NO: 313), WLSPKKH (SEQ ID NO: 314), WLSPHKH (SEQ ID NO: 315), WLSPRRH (SEQ ID NO: 316), WLSPRHH (SEQ ID NO: 317), WLSPRRR (SEQ ID NO: 318), WLSPHHH
30 (SEQ ID NO: 319) y WLSPKKK (SEQ ID NO: 320). Estos polipéptidos Sp35 incluyen el "bucle RKH" básico (aminoácidos Arginina-Lisina-Histidina 456-458) en el dominio Ig de Sp35. Los péptidos Sp35 adicionales que incluyen un tripéptido básico son ITPKRR (SEQ ID NO: 321), ACHHK (SEQ ID NO: 322) y VCHHK (SEQ ID NO: 323).
35 Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen un polipéptido Sp35 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en péptidos del dominio Ig de Sp35 o fragmentos, variantes o derivados de dichos polipéptidos. Específicamente, los péptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las siguientes secuencias de polipéptidos: X4X5RKH (SEQ ID NO: 324), X4X5RRR (SEQ ID NO: 325),
40 X4X5KKK (SEQ ID NO: 326), X4X5HHH (SEQ ID NO: 327), X4X5RKK (SEQ ID NO: 328), X4X5RKR (SEQ ID NO: 329), X4X5KKH (SEQ ID NO: 330), X4X5HKH (SEQ ID NO: 331), X4X5RRH (SEQ ID NO: 332) y X4X5RHH (SEQ ID NO: 333) donde X4 es cualquier aminoácido y X5 es cualquier aminoácido.
En otros casos fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a
45 antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen un polipéptido Sp35 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en péptidos del dominio Ig de Sp35 o fragmentos, variantes o derivados de dichos polipéptidos. Específicamente, los polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en las siguientes secuencias de polipéptidos: ITX6X7X8 (SEQ ID NO: 334), ACX6X7X8 (SEQ ID NO: 335), VCX6X7X8 (SEQ ID NO: 336) y SPX6X7X8 (SEQ ID NO: 337) donde X6 es lisina, arginina, histidina, glutamina, o
50 asparagina, X7 es cualquier aminoácido y X8 es lisina, arginina, histidina, glutamina, o asparagina. Por ejemplo, un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la siguiente secuencia polipeptídica: SPRLH (SEQ ID NO: 338).
Los fragmentos de péptidos Sp35 a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos,
55 variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen un polipéptido Sp35 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en péptidos que contienen aminoácidos 452-458 en el dominio Ig de Sp35, o derivados de los mismos, donde aminoácido 452 es un residuo de triptófano o fenilalanina.
Los fragmentos de péptidos Sp35 adicionales a los que se unen ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a 60 antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción incluyen un polipéptido Sp35 que
comprende, consiste esencialmente en, o consiste en péptidos del dominio básico de Sp35. Específicamente, los péptidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en las siguientes secuencias de polipéptidos: RRARIRDRK (SEQ ID NO: 339), KKVKVKEKR (SEQ ID NO: 340), RRLRLRDRK (SEQ ID NO: 341), RRGRGRDRK (SEQ ID NO: 342) y RRIRARDRK (SEQ ID NO: 343).
5 Los polipéptidos Sp35 solubles de ejemplo adicionales y los procedimientos y materiales para obtener estas moléculas para producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente descripción pueden encontrarse, por ejemplo, en la publicación PCT WO-2004/085.648.
10 Los procedimientos para preparar anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Una vez que se han producido los anticuerpos para diversos fragmentos de, o para el Sp35 de longitud completa sin la secuencia señal, la determinación de que los aminoácidos, o epítopos, de Sp35 a los que se une el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno puede determinarse por protocolos de correspondencia de epítopos tal como se describe en el presente documento así como procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo,
15 ELISA en sándwich de anticuerpos doble tal como se describe en "Chapter 11 - Immunology”, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Pueden encontrarse protocolos de correspondencia de epítopos adicionales en Morris, G. Epitope Mapping Protocols, Nueva Jersey: Humana Press (1996). La correspondencia de epítopos puede realizarse también por medios disponibles comercialmente (por ejemplo, ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)).
20 Además, los anticuerpos producidos que se unen a cualquier parte de Sp35 puede cribarse a continuación según su capacidad para actuar como antagonistas de Sp35 y promover así el crecimiento de neuritas, la supervivencia neuronal y de oligodendrocitos, la proliferación y la diferenciación, así como promover la mielinización. Puede realizarse un cribado de anticuerpos según la supervivencia de oligodendrocitos/neuronal usando el procedimiento
25 tal como se describe en los Ejemplos 10 y 11. Además, puede realizarse un cribado de anticuerpos según su capacidad para promover la mielinización usando el procedimiento del Ejemplo 9. Finalmente, puede realizarse un cribado de los anticuerpos según su capacidad para promover la proliferación y diferenciación de oligodendrocitos, así como el crecimiento de neuritas usando el procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 7. Otras funciones antagonistas de los anticuerpos de la presente descripción pueden analizarse usando otros ensayos tal como se
30 describe en los Ejemplos en el presente documento.
En otros casos, la presente descripción incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo que se une de forma específica o preferente a al menos un epítopo de Sp35, donde el epítopo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en al menos aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos de
35 SEQ ID NO: 2, al menos siete, al menos nueve, o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos de un epítopo dado de SEQ ID NO: 2 tal como se describe pueden ser, aunque no necesariamente, contiguos o lineales. En algunos casos, el al menos un epítopo de Sp35 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un epítopo no lineal formado por el dominio de Sp35 extracelular tal como se expresa en la superficie de una célula o como un fragmento soluble, por ejemplo, fusionado
40 con una región Fc de IgG. Así, en algunos casos el al menos un epítopo de Sp35 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30, o al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID NO: 2, donde los aminoácidos no contiguos forman un epítopo a través de plegamiento de proteínas.
45 En otros casos, la presente descripción incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo que se unen de forma específica o preferente a al menos un epítopo de Sp35, donde el epítopo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, además de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID NO: 2 tal como se describe anteriormente, y puede incluirse una
50 fracción adicional que modifica la proteína, por ejemplo, una fracción de hidratos de carbono de manera que el anticuerpo Sp35 se une con mayor afinidad a la proteína objeto modificada de lo que lo haría con una versión no modificada de la proteína. Alternativamente, el anticuerpo Sp35 no se une en ningún modo con la versión no modificada de la proteína objeto.
55 En algunos casos, la presente descripción se dirige a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo que se une específicamente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) que es inferior que la KD para dicho anticuerpo monoclonal de referencia.
60 En algunos casos, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción
se une específicamente a al menos un epítopo de Sp35 o fragmento o variante descritos anteriormente, es decir, se une a dicho epítopo más fácilmente de lo que lo haría con un epítopo aleatorio o no relacionado; se une preferentemente a al menos un epítopo de Sp35 o fragmento o variante descritos anteriormente, es decir, se une a dicho epítopo más fácilmente de lo que lo haría con un epítopo homólogo, análogo, similar o relacionado; inhibe 5 competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia que en sí se une de forma específica o preferente a un cierto epítopo de Sp35 o fragmento o variante descritos anteriormente; o se une a al menos un epítopo de Sp35 o fragmento o variante descritos anteriormente con una afinidad caracterizada por una constante de disociación KD de menos de aproximadamente 5 x 10-2 M, aproximadamente 10-2 M, aproximadamente 5 x 10-3 M, aproximadamente 10-3 M, aproximadamente 5 x 10-4 M, aproximadamente 10-4 M, aproximadamente 5 x 10-5 M, aproximadamente 10-5 10 M, aproximadamente 5 x 10-6 M, aproximadamente 10-6 M, aproximadamente 5 x 10-7 M, aproximadamente 10-7 M, aproximadamente 5 x 10-8 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 5 x 10-9 M, aproximadamente 10-9 M, aproximadamente 5 x 10-10 M, aproximadamente 10-10 M, aproximadamente 5 x 10-11 M, aproximadamente 10-11 M, aproximadamente 5 x 10-12 M, aproximadamente 10-12 M, aproximadamente 5 x 10-13 M, aproximadamente 10-13 M, aproximadamente 5 x 10-14 M, aproximadamente 10-14 M, aproximadamente 5 x 10-15 M, o aproximadamente 10-15 M.
15 En un caso en particular, el anticuerpo o fragmento del mismo se une preferentemente a un polipéptido Sp35 humano o fragmento del mismo, con respecto a un polipéptido Sp35 murino o fragmento del mismo.
Tal como se usa en el contexto de constantes de disociación de unión a anticuerpos, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los procedimientos usados para medir la afinidad de anticuerpos. Por
20 ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de la instrumentación usada, el error estándar basado en el número de muestras medidas y el error de redondeo, la expresión "aproximadamente 10-2 M" podría incluir, por ejemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
En casos concretos, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la
25 descripción se une a polipéptidos Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos con una constante cinética de disociación (k(off)) menor o igual que 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 x 10-3 s-1 o 10-3 s-1. Alternativamente, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción se une a polipéptidos Sp35 o
-
fragmentos o variantes de los mismos con una constante cinética de disociación (k(off)) menor o igual que 5 x 10-4 s
1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5 s-1 5 x 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 x 10-7 s-1 o 10-7 s-1.
30 En otros casos, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción se une a polipéptidos Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos con una constante cinética de asociación (k(on)) mayor o igual que 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 o 5 x 104 M-1 s-1. Alternativamente, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción se une a polipéptidos Sp35 o
35 fragmentos o variantes de los mismos con una constante cinética de asociación (k(on)) mayor o igual que 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, o 5 x 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1.
En varios casos, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo tal como se describe en el presente documento es un antagonista de actividad Sp35. En algunos casos, por ejemplo, la unión de
40 un anticuerpo Sp35 antagonista a Sp35, expresada en neuronas, bloquea el crecimiento asociado a mielina de la inhibición de neuritas o la muerte de células neuronales. En otros casos, la unión del anticuerpo Sp35 a Sp35, expresada en oligodendrocitos, bloquea la inhibición del crecimiento o diferenciación de oligodendrocitos, o bloquea la desmielinización o dismielinización de neuronas del SNC.
45 Salvo que se indique específicamente, tal como se usa en el presente documento un "fragmento del mismo" en referencia a un anticuerpo hace referencia a un fragmento de unión a antígeno, es decir, una parte del anticuerpo que se une específicamente al antígeno. En un caso, un anticuerpo Sp35, por ejemplo, un anticuerpo de la descripción es un anticuerpo Sp35 biespecífico, polipéptido de unión o anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, minicuerpo, anticuerpo de supresión de dominio o proteína de fusión que tiene especificidad de unión
50 por más de un epítopo, por ejemplo, más de un antígeno o más de un epítopo en el mismo antígeno. En un caso, un anticuerpo Sp35 biespecífico, polipéptido de unión o anticuerpo tiene al menos un dominio de unión específico para al menos un epítopo en un polipéptido diana descrito en el presente documento, por ejemplo, Sp35. En otro caso, un anticuerpo Sp35 biespecífico, polipéptido de unión o anticuerpo tiene al menos un dominio de unión específico para un epítopo en un polipéptido diana y al menos un dominio de unión diana específico para un fármaco o toxina. En
55 otro caso más, un anticuerpo Sp35 biespecífico, polipéptido de unión o anticuerpo tiene al menos un dominio de unión específico para un epítopo en un polipéptido diana descrito en el presente documento, y al menos un dominio de unión específico para un profármaco. Un anticuerpo Sp35 biespecífico, polipéptido de unión o anticuerpo puede ser un anticuerpo tetravalente que tiene dos dominios de unión diana específicos para un epítopo de un polipéptido diana descrito en el presente documento y dos dominios de unión diana específicos para una segunda diana. Así, un
60 anticuerpo Sp35 biespecífico tetravalente, polipéptido de unión o anticuerpo puede ser bivalente para cada
especificidad.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción, tal como se conoce por los expertos en la materia, pueden comprender una región constante que media en una o más 5 funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 de complemento a una región constante de anticuerpo puede activar el sistema de complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de patógenos celulares. La activación del complemento estimula también la respuesta inflamatoria y también puede implicarse en hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a los receptores en diversas células por medio de la región Fc, con un sitio de unión a receptor Fc en la región Fc de 10 anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Existe una serie de receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión de anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen fagocitación y destrucción de las partículas recubiertas de anticuerpos, aclaramiento de los complejos inmunitarios, lisis de células diana
15 recubiertas con anticuerpos por células citolíticas (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de producción de inmunoglobulinas.
Por consiguiente, algunos casos de la descripción incluyen un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno,
20 variante o derivado del mismo, en que al menos se ha suprimido o alterado por otros medios una fracción de uno o más de los dominios de región constante de manera que se proporcionan características bioquímicas deseadas tales como la reducción de las funciones efectoras, la capacidad de dimerización no covalente, el aumento de la capacidad de localización en el sitio de un tumor, la reducción de la semivida en suero o el aumento de la semivida en suero cuando se compara con un anticuerpo completo no alterado de aproximadamente la misma
25 inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para el uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento son anticuerpos con supresión de dominio que comprenden una cadena de polipéptidos similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una parte de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, se suprimirá un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se suprimirá parte o la totalidad del dominio CH2.
30 En ciertos anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, la parte Fc puede estar mutada para reducir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante aumentando
35 así la localización del tumor. En otros casos puede suceder que las modificaciones de la región constante compatibles con la presente descripción moderen la unión al complemento y reduzcan así la semivida en suero y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Otras modificaciones más de la región constante pueden usarse para modificar los enlaces disulfuro o las fracciones de oligosacáridos que permiten una mejora de la localización debido a la mayor especificidad de antígenos o viabilidad de anticuerpos. El perfil fisiológico resultante,
40 la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como localización del tumor, biodistribución y semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin una experimentación indebida.
Pueden prepararse formas modificadas de anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o
45 derivados de los mismos de la descripción a partir de anticuerpos precursores o progenitores enteros usando técnicas conocidas en la técnica. En el presente documento se exponen en mayor detalle técnicas de ejemplo.
En algunos casos las regiones variables y constantes de los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos son totalmente humanas. Los anticuerpos humanos pueden prepararse usando 50 técnicas que son conocidas en la técnica y tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos totalmente humanos contra un antígeno específico pueden prepararse administrando el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a una provocación de antígenos, pero estos loci endógenos han sido desactivados. Las técnicas de ejemplo que pueden usarse para preparar dichos anticuerpos se describen en las patentes de EE. UU.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. En la
55 técnica se conocen otras técnicas. Los anticuerpos totalmente humanos pueden producirse de forma semejante mediante diversas tecnologías de presentación, por ejemplo, presentación de fagos u otros sistemas de presentación de virus, tal como se describe en mayor detalle en otra parte en el presente documento.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción 60 pueden prepararse o fabricarse usando técnicas que son conocidas en la técnica. En algunos casos, las moléculas
de anticuerpos o fragmentos de los mismos son "producidas de forma recombinante”, es decir, son producidas usando tecnología de ADN recombinante. Las técnicas de ejemplo para preparar moléculas de anticuerpos o fragmentos de los mismos se exponen en mayor detalle en otra parte en el presente documento.
5 Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción también incluyen derivados que son modificados, por ejemplo, por la fijación covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la fijación covalente no impide que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo semejante. Por ejemplo, pero no de forma limitativa, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por
10 grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Pueden realizarse numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
15 En algunos casos, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción no provocarán una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal que será tratado, por ejemplo, en un ser humano. En un caso, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción son modificados para reducir su inmunogenicidad usando técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser humanizados, primatizados, desinmunizados, o pueden prepararse
20 anticuerpos quiméricos. Estos tipos de anticuerpos proceden de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo murino o de primate, que conserva o conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo progenitor, pero que es menos inmunógeno en seres humanos. Esto puede conseguirse por diversos procedimientos, que incluyen (a) injerto de los dominios variables no humanos enteros en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injerto de al menos una parte de una o más de las regiones de
25 determinación de complementariedad (CDR) no humanas en regiones marco y constante humanas con o sin retención de residuos marco críticos; o (c) trasplante de los dominios variables no humanos completos, pero "ocultándolos" con una sección de tipo humano por sustitución de residuos superficiales. Dichos procedimientos se describen en Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec.
30 Immun. 31:169-217 (1994), y patentes de EE. UU. nº 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.190.370.
La desinmunización puede usarse también para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Tal como se usa en el presente documento, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de linfocitos T (véanse, por ejemplo, los documentos WO-98/52976 A1, WO-00/34317 A2). Por ejemplo, se analizan 35 las secuencias VH y VL del anticuerpo de inicio y un epítopo de linfocitos T humanos establece una "correspondencia" entre cada región V que muestra la posición de los epítopos en relación con las regiones de determinación de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de linfocitos T individuales del mapa de epítopos de linfocitos T son analizados para identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se designa un intervalo de secuencias VH y 40 VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y posteriormente estas secuencias se incorporan en un intervalo de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de Sp35 o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para su uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento, cuya función se comprueba a continuación. Normalmente, se generan y se prueban entre 12 y 24 variantes de anticuerpos. A continuación, se clonan los genes de cadena pesada y ligera completos que
45 comprenden regiones V y C humanas modificadas en vectores de expresión y los plásmidos subsiguientes introducidos en líneas celulares para la producción de un anticuerpo completo. A continuación, se comparan los anticuerpos en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados, y se identifica la variante óptima.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción
50 pueden generarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales para un antígeno de interés pueden producirse por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo Sp35, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico de Sp35 o un fragmento inmunoespecífico del mismo puede administrarse a varios animales hospedadores que incluyen, pero no se limitan a, conejos, ratones, ratas, pollos, hámsteres, cabras, burros, etc., para inducir la producción de sueros
55 que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen pero no se limitan a, Freund (completo y incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guérin) y
60 Corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes son también bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluido el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes y de presentación de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridomas que incluyen 5 los conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.S., 563-681 (1981). La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento no se limita a los anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal" hace referencia a un anticuerpo que se obtiene de un único clon, lo que incluye cualquier clon eucariota, procariota o 10 de fago, y no el procedimiento por el cual se produce. Así, la expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridomas. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando ratones inactivados Sp35 para aumentar el reconocimiento de las regiones de epítopos. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnología de hibridomas y recombinante y de presentación de fagos tal como se describe en otra parte en el
15 presente documento.
Usando protocolos reconocidos en la técnica, en un ejemplo, los anticuerpos se desarrollan en mamíferos mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno de interés (por ejemplo, antígenos asociados a tumores purificados tales como Sp35 o células o extractos celulares que comprenden dichos antígenos) y un 20 adyuvante. Esta inmunización desencadena normalmente una respuesta inmunitaria que comprende la producción de anticuerpos reactivos a antígenos a partir de esplenocitos o linfocitos activados. Si bien los anticuerpos resultantes pueden recogerse del suero del animal para proporcionar preparaciones policlonales, a menudo es deseable aislar linfocitos individuales del bazo, los ganglios linfáticos o la sangre periférica para proporcionar preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales (AMc). Preferentemente, los linfocitos se obtienen del
25 bazo.
En este procedimiento bien conocido (Kohler et al., Nature 256:495 (1975)) los linfocitos de vida relativamente corta,
o mortales, obtenidos de un mamífero al que se ha inyectado un antígeno están fusionados con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una mieloma línea celular), produciendo así células híbridas o "hibridomas" que son a
30 la vez inmortales y capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente del linfocito B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas individuales mediante selección, dilución y nuevo crecimiento con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo individual. Producen anticuerpos que son homogéneos frente a un antígeno deseado y, en referencia a su ascendencia genética pura, se denominan "monoclonales”.
35 Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Los expertos en la materia observarán que los reactivos, las líneas celulares y los medios para la formación, selección y crecimiento de hibridomas están disponibles comercialmente en diversas fuentes y
40 que existen protocolos bien establecidos. En general, el medio de cultivo en el que se desarrollan las células de hibridoma se somete a ensayo en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales frente al antígeno deseado. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Después de identificar las células de hibridoma que producen
45 anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y usando procedimientos estándar de crecimiento (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986)). Se observará además que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, el líquido de ascitis o el suero por procedimientos de purificación convencionales tales como, por ejemplo, proteína-A, cromatografía de
50 hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).
55 Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Los expertos en la materia también observarán que el ADN que codifica anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, sitios de unión a antígenos) también puede obtenerse de bibliotecas de anticuerpos, tales como 60 bibliotecas de presentación de fagos. En particular, dicho fago puede usarse para presentar dominios de unión a
antígenos expresados a partir de un repertorio o una biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés puede seleccionarse
o identificarse con el antígeno, por ejemplo, usando un antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o perla. Los fagos usados en estos procedimientos son normalmente fagos filamentosos que 5 incluyen dominios de unión M13 y fd expresados a partir del fago con Fab, Fv OE DAB (región Fv individual de cadenas ligeras o pesadas) o Fv dominios de anticuerpos Fv estabilizados con disulfuro fusionados de forma recombinante con el gen de gen III de fago o la proteína del gen VIII. Se exponen procedimientos ilustrativos, por ejemplo, en el documento EP-368.684-B1; la patente de EE. UU. 5.969.108, Hoogenboom, H.R. y Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al. Nat. Med. 8:801 (2002); Huie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682 10 (2001); Lui et al., J. Mol. Biol. 315:1063 (2002). Varias publicaciones (por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) han descrito la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad por redistribución de cadenas, así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir grandes bibliotecas de fagos. En otro caso, puede usarse presentación ribosómica para sustituir los bacteriófagos en la plataforma de presentación (véase, por ejemplo, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson et al., Proc.
15 Natl. Acad. Sci. USA 98:3750 (2001); o Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). En otro caso más, puede realizarse una detección selectiva de bibliotecas de superficies celulares en busca de anticuerpos (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Estos procedimientos proporcionan alternativas a las técnicas de hibridoma tradicionales para el aislamiento y la posterior clonación de anticuerpos monoclonales.
20 En procedimientos de presentación de fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se presentan en la superficie de partículas de fagos que transportan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las regiones VH y VL son amplificadas a partir de bibliotecas de ADNc de animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humanas o murinas de tejidos linfoides) o bibliotecas de ADNc sintéticas. En
25 algunos casos, los ADN que codifica las regiones VH y VL están unidos entre sí por un enlazador de scFv mediante PCR y se clonan en un vector fagémido (por ejemplo, p CANTAB 6 o pComb 3 HSS). El vector se somete a electroporación en E. coli y la E. coli está infectada con un fago auxiliar. Los fagos usados en estos procedimientos suelen ser fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y las regiones VH o VL normalmente se fusionan de forma recombinante con cualquiera de los genes III o VIII de fagos. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno
30 que se une a un antígeno de interés (es decir, un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo) puede seleccionarse
o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o perla.
Entre los ejemplos adicionales de procedimientos de presentación de fagos que pueden usarse para preparar los
35 anticuerpos se incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); las publicaciones PCT WO1992/001047, WO-90/02809; WO-91/10737; WO-92/01047; WO-92/18619; WO-93/11236; WO-95/15982; WO95/20401; y las patentes de EE. UU. nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753;
40 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluidos anticuerpos humanos,
o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, lo que
45 incluye células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO-92/22.324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:10411043 (1988).
50 Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv y anticuerpos de cadena única incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. nº 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluido el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos
55 quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo se obtienen de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable obtenida de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202
60 (1989); las patentes de EE. UU. nº 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397. Los anticuerpos humanizados son moléculas
de anticuerpos obtenidas de un anticuerpo de especie no humana que se unen al antígeno deseado que tiene una o más regiones de determinación de complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos marco en las regiones marco humanas estarán sustituidos por el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la 5 unión a antígeno. Estas sustituciones marco se identifican por procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelización de las interacciones de la CDR y los residuos marco para identificar residuos marco importantes para unión a antígeno y comparación de secuencias con el fin de identificar residuos marco no habituales en posiciones determinadas. (Véase, por ejemplo, Queen et al., patente de EE. UU. nº 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).) Los anticuerpos pueden humanizarse usando diversas técnicas
10 conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP-239.400; publicación PCT WO91/09.967; patentes de EE. UU. nº 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), recubrimiento o recomposición (documentos EP-592.106; EP-519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) e intercambio de cadenas (patente de EE. UU. nº 5.565.332).
15 Los anticuerpos completamente humanos son deseables en particular para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica que incluyen los procedimientos de presentación de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos obtenidas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse también las patentes de EE. UU. nº 4.444.887 y
20 4.716.111; y las publicaciones PCT WO-98/46645, WO-98/50433, WO-98/24893, WO-98/16654, WO-96/34096, WO96/33735 y WO-91/10741.
Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por 25 ejemplo, pueden introducirse complejos génicos de inmunoglobulinas humanas de cadena pesada y ligera aleatoriamente o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci 30 de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, se crían los ratones quiméricos para producir descendencia homocigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados de la forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, parte o la totalidad de un polipéptido diana deseado. 35 Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse de ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana alojados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B, y posteriormente se someten a cambio de clase y mutación somática. Así, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos véase 40 Lonberg y Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para una exposición detallada de esta tecnología para producir humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO-98/24893; WO-96/34096; WO-96/33735; las patentes de EE. UU. nº 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; y 5.939.598. Además, empresas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) y GenPharm (San Jose, Calif.) pueden comprometerse para proporcionar
45 anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica referida como "selección guiada”. En este enfoque se usa un anticuerpo monoclonal no humano
50 seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988). Véase también la patente de EE. UU. nº 5.565.332.)
Además, los anticuerpos para polipéptidos diana de la descripción pueden usarse, a su vez, para generar
55 anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" los polipéptidos diana usando técnicas bien conocidas para los expertos en la materia. (Véase, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444 (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen a e inhiben competitivamente la multimerización de polipéptidos y/o la unión de un polipéptido de la descripción con un ligando para generar antiidiotipos que "imitan" la multimerización de polipéptidos y/o un dominio de unión y, como consecuencia, se unen a y
60 neutralizan un polipéptido y/o su ligando. Dichos anti-idiotipos de neutralización o fragmentos Fab de dichos anti
idiotipos pueden usarse en pautas terapéuticas para neutralizar un ligando de polipéptido. Por ejemplo, dichos anticuerpos anti-idiotípicos pueden usarse para unirse a un polipéptido diana deseado y/o para unirse a sus ligandos/receptores, y bloquear así su actividad biológica.
5 El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales deseados puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas sirven de fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que, a continuación, son transfectados en células hospedadoras procariotas o
10 eucariotas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen inmunoglobulinas. Más en particular, el ADN aislado (que puede ser sintético tal como se describe en el presente documento) puede usarse para clonar secuencias de regiones variables y constantes para la fabricación de anticuerpos tal como se describe en Newman et al., patente de EE. UU. nº 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995. Esencialmente, esto comprende la extracción de ARN de las células
15 seleccionadas, la conversión a ADNc y la amplificación por PCR usando cebadores de Ig específicos. Los cebadores adecuados para este fin se describen también en la patente de EE. UU. nº 5.658.570. Tal como se expondrá con más detalle más adelante, las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden cultivarse en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la inmunoglobulina.
20 En un caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al menos una CDR de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otro caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otro caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otro caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otro caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al
25 menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otro caso, un anticuerpo Sp35 de la descripción comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo de ejemplo que comprenden al menos una CDR que pueden incluirse en los anticuerpos Sp35 objeto se describen en el presente documento.
30 En un caso concreto, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera pueden ser inspeccionados para identificar las secuencias de las regiones de determinación de complementariedad (CDR) por procedimientos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar la hipervariabilidad de las regiones de secuencia. Usando técnicas rutinarias de ADN recombinante, pueden insertarse una o más de las
35 CDR dentro de las regiones marco, por ejemplo, en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano. Las regiones marco pueden aparecer naturalmente o ser regiones marco de consenso, y preferentemente regiones marco humanas (véase, por ejemplo, en Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) un listado de las regiones marco humanas). Preferentemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones marco y las CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de un polipéptido deseado, por
40 ejemplo, Sp35. Preferentemente, pueden prepararse una o más sustituciones de aminoácidos en las regiones marco, y, preferentemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo con su antígeno. Además, dichos procedimientos pueden usarse para hacer sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de región variable que participan en enlace disulfuro intracadena para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracadena. Otras alteraciones en el polinucleótido están
45 comprendidas por la presente descripción y se sitúan dentro de las competencias de la técnica.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) por splicing de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno
50 adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes se obtienen de diferentes especies animales, por ejemplo, las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
55 Alternativamente, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE. UU. nº 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios están formados por la unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, para dar lugar a un anticuerpo monocatenario. También pueden usarse
60 técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).
Otros casos más de la presente descripción comprenden la generación de anticuerpos humanos o sustancialmente humanos en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son incapaces de una producción endógena de inmunoglobulinas (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. nº 6.075.181. 5.939.598, 5.591.669 y 5.589.369). 5 Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de unión a la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos produce la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de una matriz de genes de inmunoglobulina humana a dichos ratones mutantes de línea germinal llevará a la producción de anticuerpos humanos tras la provocación con antígeno. Otro medio preferente de generación de anticuerpos humanos usando ratones SCID se describe en la patente de EE. UU. nº
10 5.811.524. Se observará que el material genético asociado con estos anticuerpos humanos también puede aislarse y manipularse tal como se describe en el presente documento.
Otro medio altamente eficiente más para generar anticuerpos recombinantes es el descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Específicamente, esta técnica produce la generación de anticuerpos
15 primatizados que contienen dominios variables y secuencias constantes humanas. Por otra parte, esta técnica se describe también en las patentes de EE. UU. cedidas comúnmente nº 5.658.570, 5.693.780 y 5.756.096.
En otro caso, los linfocitos pueden seleccionarse por micromanipulación y aislarse los genes variables. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica pueden aislarse a partir de un mamífero inmunizado y cultivarse 20 durante aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos pueden cribarse de acuerdo con IgG específicas que cumplan los criterios de cribado. Pueden aislarse las células de los pocillos positivos. Los linfocitos B de producción de Ig pueden aislarse por FACS o identificándolos en un ensayo de placa hemolítica mediada por complemento. Los linfocitos B que producen Ig pueden micromanipularse en un tubo y los genes VH y VL pueden amplificarse usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes VH y VL pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpos y transfectarse
25 en células (por ejemplo, células eucariotas o procariotas) para su expresión.
Alternativamente, las líneas celulares de producción de anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse usando técnicas bien conocidas para el experto en la materia. Dichas técnicas se describen en diversos manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las técnicas adecuadas para su uso en la descripción tal
30 como se describe más adelante se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991).
Los anticuerpos para el uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular,
35 por síntesis química o preferentemente, por técnicas de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento.
En un caso, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción comprende una región constante sintética donde uno o más dominios están total o parcialmente suprimidos 40 ("anticuerpos con supresión de dominios"). En algunos casos los anticuerpos modificados compatibles comprenderán construcciones con supresión de dominios o variantes donde todo el dominio CH2 haya sido eliminado (construcciones ∆CH2). En otros casos puede sustituirse un péptido de conexión corto mediante el dominio suprimido para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento para la región variable. Los expertos en la materia observarán que dichas construcciones son preferentes especialmente debido a las propiedades reguladoras del
45 dominio CH2 en la velocidad catabólica del anticuerpo. Las construcciones con supresión de dominios pueden obtenerse usando un vector (por ejemplo, de Biogen IDEC Incorporated) que codifica un dominio constante de IgG1 humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO-02/060.955-A2 y WO02/096.948-A2). Este vector de ejemplo fue diseñado para suprimir el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que exprese una región constante de IgG1 con supresión de dominios.
50 En algunos casos, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción son minicuerpos. Los minicuerpos pueden prepararse usando procedimientos descritos en la técnica (véase, por ejemplo, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5.837.821 o el documento WO-94/09817 A1).
55 En un caso, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene una deleción o sustitución de algunos o incluso de un solo aminoácido siempre que permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión a Fc y con ello aumentar la localización del tumor. De forma similar, puede ser deseable simplemente suprimir
60 esa parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, unión de
complemento) que se modulará. Dichas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las
características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) mientras se dejan intactas otras funciones
deseables asociadas con el dominio de región constante objeto. Por otra parte, tal como se alude anteriormente, las
regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas a través de la mutación o sustitución de uno
5 o más aminoácidos que potencia el perfil de la construcción resultante. A este respecto puede ser posible
desorganizar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión a Fc) mientras se
mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Otros casos más
comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables
tales como la función efectora o proporcionar más fijación a citotoxinas o hidratos de carbono. En estos casos puede 10 ser deseable introducir o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.
La presente descripción también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten
en, variantes (incluidos derivados) de moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones VH y/o regiones VL)
descritas en el presente documento, donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen 15 inmunoespecíficamente a un polipéptido Sp35 o fragmento o variante del mismo. Pueden usarse técnicas estándar
conocidas por los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un
anticuerpo Sp35, lo que incluye, pero no se limita a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR
que da lugar a sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (incluidos los derivados) codifican
menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones 20 de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de
15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de
aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2
sustituciones de aminoácidos con respecto a la región de referencia VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, la región VL,
VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de 25 aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las
familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica.
Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas
laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo,
glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, 30 alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas
(por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina,
triptófano, histidina). Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de parte o la
totalidad de la secuencia codificante, tales como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden
cribarse en cuanto a su actividad biológica para identificar mutantes que conservan la actividad (por ejemplo, la 35 capacidad de unirse a un polipéptido Sp35).
Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en las regiones marco o solo en las regiones CDR de una
molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones de sentido erróneo silenciosas o
neutras, es decir, que tienen un efecto reducido o nulo en la capacidad de un anticuerpo de unirse a antígeno. Estos 40 tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o mejorar la producción de anticuerpos de
hibridomas. Alternativamente, las mutaciones de sentido erróneo no neutras pueden alterar la capacidad de un
anticuerpo de unirse a antígeno. La posición de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo silenciosas o
neutras será probablemente en las regiones marco, mientras que la posición de la mayoría de las mutaciones de
sentido erróneo no neutras será probablemente en una CDR, aun cuando este no es un requisito absoluto. Un 45 experto en la materia sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como no
alteración en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la
actividad de unión a antígeno o cambio en la especificidad de un anticuerpo). Después de la mutagénesis, la
proteína codificada puede expresarse de forma rutinaria y puede determinarse la actividad funcional y/o biológica de
la proteína codificada (por ejemplo, capacidad de unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítopo de un 50 polipéptido Sp35) usando técnicas descritas en el presente documento o mediante técnicas de modificación
rutinarias conocidas en la técnica.
IV. POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN ANTICUERPOS Sp35
55 La presente descripción también proporciona para moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción.
En un caso, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente
en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), 60 donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las CDR de la región
variable de cadena pesada tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de referencia CDR1, CDR2 o CDR3 a partir de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Alternativamente, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de referencia
5 CDR1, CDR2 y CDR3 a partir de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Así, de acuerdo con este aspecto una región variable de cadena pesada de la descripción tiene secuencias de polipéptidos de CDR1, CDR2, o CDR3 relacionadas con las secuencias de polipéptidos mostradas en la tabla 4:
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente
5 en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla 4. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
10 En un caso adicional de la descripción, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH del polipéptido de la cadena pesada de inmunoglobulina producido por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación
15 de Depósito ATCC PTA-8106) o las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH del polipéptido de la cadena pesada de inmunoglobulina producido por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En un caso adicional, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de
20 inmunoglobulina (VH) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos que son idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla 4. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
25 En un caso adicional de la descripción, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con el polinucleótido que codifica las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma
30 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) o el polinucleótido que codifica las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste
35 esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en: 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li022), 35-E04 (Li033), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30
40 B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste
45 esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10
50 15 M, o 10-15 M.
En otro caso, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las CDR de la región 55 variable de cadena ligera tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Alternativamente, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Así, de acuerdo con 60 este aspecto una región variable de cadena ligera de la descripción tiene secuencias de polipéptidos de CDR1,
CDR2, o CDR3 relacionadas con las secuencias de polipéptidos mostradas en la tabla 5: TABLA 5: Secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL de referencia*
Nombre de anticuerpo
VL-CDR1 VL-CDR2 VL-CDR3
Li10
P=RASQGIGNWLA (SEQ ID NO: 87) P=AASSLES (SEQ ID NO: 89) P=QQAQTFPLT (SEQ ID NO: 91)
Li07
P=SGDQLGDKHVA (SEQ ID NO: 93) P=LDIKRPA (SEQ ID NO: 95) P=QAWDIKTV (SEQ ID NO: 97)
Li05
P=GGDNIGSKSVH (SEQ ID NO: 99) P=DDYDRPS (SEQ ID NO: 101) P=QVRDSRTEERV (SEQ ID NO: 103)
Li11
P=RASQEIANYLA (SEQ ID NO: 105) P=DTYTLQT (SEQ ID NO: 107) P=QQADIFPLS (SEQ ID NO: 109)
Li01
P=QASQDISNYLN (SEQ ID NO: 111) P=DASNLET (SEQ ID NO: 113) P=QQADRFPAVT (SEQ ID NO: 115)
Li06
P=RASQSISSWLA (SEQ ID NO: 117) P=AASSLRT (SEQ ID NO: 119) P=LQDISYPLT (SEQ ID NO: 121)
Li08
P=QASQDISYYLN (SEQ ID NO: 123) P=DVSNLQT (SEQ ID NO: 125) P=QQSDNLPLT (SEQ ID NO: 127)
Li03
P=RASQSISSYLN (SEQ ID NO: P=AASSLQS (SEQ ID NO: P=QQSYSTPWT (SEQ ID NO:
129)
131) 133)
Li09
P=RASQSIDTYLN (SEQ ID NO: 135) P=AASKLED (SEQ ID NO: 137) P=QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 139)
Li02
P=SGDKLGDKFAS (SEQ ID NO: 141) P=QDRKRLS (SEQ ID NO: 143) P=QAWDTNTVV (SEQ ID NO: 145)
Li13
P=RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 386) P=DASNRAT (SEQ ID NO: 387) P=QQRSNWPMYT (SEQ ID NO: 388)
Li32
P=QASQDISYYLN (SEQ ID NO: 392) P=DAFELEG (SEQ ID NO: 393) P=QQSDQLPVT (SEQ ID NO: 394)
Li33
P=RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 398) P=DASNRAT (SEQ ID NO: 399) P=QQYDKWPLT (SEQ ID NO: 400)
Li34
P=HASQDISNYLS (SEQ ID NO: 404) P=DAFNLET (SEQ ID NO: 405) P=QHYDNLPFT (SEQ ID NO: 406)
1A7
P=SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 146) P=DTSKLAS (SEQ ID NO: 147) P=QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 148)
2F3
P=RASGNIYNYLA (SEQ ID NO: 149) P=NAKTLPD (SEQ ID NO: 150) P=QHFWAIPYT (SEQ ID NO: 151)
3P1D10.2 0
P=KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 152) P=WASTRES (SEQ ID NO: 153) P=QNDISYPLFT (SEQ ID NO: 154)
3P1E11.3 E
P=KSSQSLLNSGNQKSYLT (SEQ ID NO: 155) P=WASTRES (SEQ ID NO: 156) P=QNDISYPLFT (SEQ ID NO: 157)
L1a.01
P=SGDSLPSKFVH (SEQ ID NO: 234) P=RDNNRPS (SEQ ID NO: 235) P=SSYDALTD (SEQ ID NO: 236)
L1a.02
P=RASQSITNSYLG (SEQ ID NO: 237) P=DASSRAT (SEQ ID NO: 238) P=QQASDAPE (SEQ ID NO: 239)
L1a.03
P=RASQGINFWLN (SEQ ID NO: 240) P=AGSNLQS (SEQ ID NO: 241) P=MQDSDFPF (SEQ ID NO: 242)
L1a.04
P=TGSSSNIGAGYDVS (SEQ ID NO: 243) P=RNNNRPS (SEQ ID NO: 244) P=QTYDNSTD (SEQ ID NO: 245)
L1a.05
P=SGDNIRSYYVH (SEQ ID NO: 246) P=EDSNRPS (SEQ ID NO: 247) P=QSYDSAILLH (SEQ ID NO: 248)
L1a.06
P=RSSQSLVLRTGYTYLN (SEQ ID NO: 249) P=LVSNRAS (SEQ ID NO: 250) P=QQYYGMPL (SEQ ID NO: 251)
L1a.07
P=RASQSVSYQYLA (SEQ ID NO: 252) P=GASSRAT (SEQ ID NO: 253) P=QQYGSVPR (SEQ ID NO: 254)
L1a.08
P=SGDSLGSYYVH (SEQ ID NO: 255) P=DDNDRPS (SEQ ID NO: 256) P=SAYDISART (SEQ ID NO: 257)
L1a.09
P=SGDNLGSKYVS (SEQ ID NO: 258) P=DDDDRPS (SEQ ID NO: 259) P=SSYDFLNIGL (SEQ ID NO: 260)
L1a.10
P=SGDSLGKKSVH (SEQ ID NO: P=EDSERPS (SEQ ID NO: P=SSYTNSVD (SEQ ID NO: 263)
261)
262)
L1a.11
P=SGDNLGKKYVG (SEQ ID NO: 264) P=DDDNRPS (SEQ ID NO: 265) P=QSYDDTSI (SEQ ID NO: 266)
L1a.12
P=SGDSLGNKYVH (SEQ ID NO: 267) P=DDSDRPS (SEQ ID NO: 268) P=QTWDYVGY (SEQ ID NO: 269)
L1a.13
P=TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 270) P=DVSNRPS (SEQ ID NO: 271) P=QSYDRYRLKN (SEQ ID NO: 272)
3B5.2
P=SASSRVSYVH (SEQ ID NO: 413) P=DTSNLAS (SEQ ID NO: 414) P=QQWSTNPPT (SEQ ID NO: 415)
P= RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 442)
P= DASNRAT (SEQ ID NO: 443) P= QQRSNWPMYT (SEQ ID NO: 444)
Li81
*Determinado por el sistema de Kabat (ver más arriba). N = secuencia de nucleótidos, P = secuencia polipeptídica.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
5 En un caso adicional de la descripción, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de VL del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina producido por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de
10 Depósito ATCC PTA-8106) o las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de VL del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina producido por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En otro caso, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) en el
15 que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla 5. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso adicional, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste
20 esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos que son idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla 5. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
25 En un caso adicional de la descripción, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 son codificadas por secuencias de nucleótidos con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con el polinucleótido que codifica las
30 regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) o el polinucleótido que codifica las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
35 En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste
esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04
5 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10) 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
10 En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M,
15 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de
20 identidad con una secuencia VH de polipéptidos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 y 416 mostradas en la tabla 6. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
25 En otro caso, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VH que tiene una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 y 416 mostradas en la tabla 6. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
30 TABLA 6 - Secuencias de polipéptidos VH
VH
Secuencia SEQ ID NO:
Li02
158
Li09
159
Li06
160
Li05
161
Li04
162
Li08
163
Li11
164
Li10
165
Li01
166
Li07
167
Li03
168
Li12
169
1A7
170
2F3
171
3P1 D10.2C3 y 3P1 E11.3B7
172
Li1 3
372
Li3 2
376
Li3 3
380
Li3 4
384
3B 5.2
416
P1 A7 var. 2
432
Li8 1
433
Li8 1 (aglicosilado)
435
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con una secuencia VH de polipéptidos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las
5 SEQ ID NO: 158-172, 372, 376, 380, 384 y 416. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VH de la descripción, seleccionada de entre el
10 grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158-172, 372, 376, 380, 384 y 416. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste 15 esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o
100 % de identidad con una secuencia VH de polipéptidos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina producido por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina producido por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
5 En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en (201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7,
10 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13, 7P1D5.1G9 y 3B5.2, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
15 En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3
20 M, 10-3 M, 5 x 10-4M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
En casos adicionales, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de
25 inmunoglobulina, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una cadena pesada con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con el polinucleótido de SEQ ID NO: 420 tal como se muestra más adelante. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la cadena pesada codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35 y o al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 3B5.2.
30 Secuencia de polinucleótidos de cadena pesada de inmunoglobulina para anticuerpo monoclonal quimérico humano murino 3B5.2:
5 En casos adicionales, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que codifica una región variable de cadena pesada (VH), donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácidos nucleicos VH seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO 173 a 184, 370, 374, 378, 382 y 422, tal como se muestra en la tabla
7. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
Li02
173
Li09
174
Li06
175
Li05
176
Li04
177
Li08
178
Li11
179
Li10
180
Li01
181
Li07
182
Li03
183
Li12
184
Li13
370
Li32
374
Li33
378
Li34
382
3B5. 2
422
Li81
448
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las
5 SEQ ID NO: 173-184, 370, 374, 378. 382 y 422 de la tabla 7. En algunos casos, el polinucleótido codifica un polipéptido VH que se une de forma específica o preferente a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se 10 une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en (201’) 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565
15 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 3B5.2 y Li81 o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se 20 une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido
Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-10 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
5 En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con una secuencia de polinucleótidos VH de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en el polinucleótido que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma
10 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y el polinucleótido que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de
15 identidad con una secuencia polipeptídica VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 y 417 mostradas en la tabla 8. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
20 En otro caso, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VL que tiene una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381 385 y 417, mostradas en la tabla 8. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
25 TABLA 8 - Secuencias de polipéptidos VL
VL
Secuencia SEQ ID NO:
Li02
273
Li09
274
Li06
275
Li05
276
Li08
277
Li11
278
Li10
279
Li01
280
Li07
281
Li03
282
1A7
283
2F3
284
3P1D 10.2C 3
285
3P1E 11.3B 7
286
Li13
373
Li32
377
Li33
381
Li34
385
3B5. 2
417
P1A 7 var. 1
430
P1A 7 var. 2
431
Li81
434
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con una secuencia polipeptídica VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ
5 ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381 385 y 417, tal como se muestra en la tabla 8. En algunos casos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o
10 consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una VL de la descripción, seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 y 417. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con una secuencia polipeptídica VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina producido por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina producido por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
En casos adicionales, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, donde el polinucleótido es un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una cadena ligera con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con el polinucleótido de SEQ ID NO: 421 tal como se muestra más adelante. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la cadena ligera codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35 y o el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 3B5.2.
Secuencia de polinucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina para el anticuerpo quimérico murino y humano 3B5.2:
En casos adicionales, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que codifica una región variable de cadena ligera (VL), donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácidos nucleicos VL seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO 185 a 194, 371, 375, 379, 383 y 423 tal como se muestra en la tabla 9. En
5 algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de forma específica o preferente a Sp35.
TABLA 9 - Secuencias de polinucleótidos VL
VL
Secuencia SEQ ID NO:
Li02
185
Li09
186
Li06
187
Li05
188
Li08
189
Li11
190
Li10
191
Li01
192
Li07
193
Li03
194
Li1 3
371
Li3 2
375
Li3 3
379
Li3 4
383
3B 5.2
423
Li8 1
449
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con un polinucleótido VL seleccionado de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 185-194, 371, 375, 379, 383 y 423 de la tabla 9. En algunos casos, el polinucleótido codifica un polipéptido VL que se une de forma específica o preferente a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con una secuencia de polinucleótidos VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en el polinucleótido que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y el polinucleótido que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
Cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente puede incluir además ácidos nucleicos adicionales, que codifican, por ejemplo, un péptido señal para dirigir la secreción del polipéptido codificado, regiones constantes de anticuerpos tal como se describe en el presente documento u otros polipéptidos heterólogos tal como se describe en el presente documento.
También, tal como se describe en mayor detalle en otra parte en el presente documento, la presente descripción incluye composiciones que comprenden los polinucleótidos que comprenden uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente. En un caso, la descripción incluye composiciones que comprenden un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido donde dicho primer polinucleótido codifica un polipéptido VH tal como se describe en el presente documento y donde dicho segundo polinucleótido codifica un polipéptido VL tal como se describe en el presente documento. Específicamente una composición que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido VH, tal como se muestra en la tabla 7, y un polinucleótido VL, tal como se muestra en la tabla 9, donde dicho polinucleótido VH y dicho polinucleótido VL se seleccionan de entre el grupo que consiste en:
i) SEQ ID NO: 173 y SEQ ID NO: 185; ii) SEQ ID NO: 174 y SEQ ID NO: 186; iii) SEQ ID NO: 175 y SEQ ID NO: 187; iv) SEQ ID NO: 176 y SEQ ID NO: 188; v) SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 189; vi) SEQ ID NO: 179 y SEQ ID NO: 190; vii) SEQ ID NO: 180 y SEQ ID NO: 191; viii) SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 192; ix) SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 193; x) SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 194; xi) SEQ ID NO: 370 y SEQ ID NO: 371; xii) SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375; xiii) SEQ ID NO: 378 y SEQ ID NO: 379; xiv) SEQ ID NO: 382 y SEQ ID NO: 385; xv) SEQ ID NO: 422 y SEQ ID NO: 423; xvi) SEQ ID NO: 448 y SEQ ID NO: 449; y xvii) SEQ ID NO: 450 y SEQ ID NO: 449.
La presente descripción también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la descripción, tal como se describe en otra parte. Adicionalmente en la descripción también se contemplan polinucleótidos que codifican polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, tal como se describe en el presente documento.
Los polinucleótidos pueden ser producidos o fabricados por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, tal como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), lo que, sucintamente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen partes de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligamiento de dichos oligonucleótidos, y a continuación amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifica un anticuerpo determinado, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico que codifica el anticuerpo u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir del ácido nucleico, preferentemente poli A+ARN, aislado de cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo u otro anticuerpo Sp35, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación de PCR usando cebadores sintéticos hibridables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia génica en particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo u otro anticuerpo Sp35. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse a continuación en vectores de clonación replicables usando cualquier procedimiento bien conocido en la técnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos puede manipularse usando procedimientos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.S. (1990) y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.
Un polinucleótido que codifica un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por ADN monocatenario o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más normalmente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o bien ARN y ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede contener también una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas por estabilidad o por otros motivos. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no habituales como inosina. Pueden realizarse diversas modificaciones en el ADN y el ARN; así, "polinucleótido" comprende formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente.
Puede crearse un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o una porción de cadena ligera de inmunoglobulina) introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, se realizan sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.
V. POLIPÉPTIDOS DE ANTICUERPOS SP35
La presente descripción se dirige además a polipéptidos aislados que conforman anticuerpos Sp35, fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos. Los anticuerpos Sp35 de la presente descripción comprenden polipéptidos, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que codifican regiones de unión a antígenos específicas de Sp35 derivadas de moléculas de inmunoglobulina. Una secuencia de polipéptidos o aminoácidos "derivado de" una proteína designada hace referencia al origen del polipéptido. En algunos casos, la secuencia de polipéptidos o aminoácidos que se deriva de una secuencia de polipéptidos o aminoácidos de inicio en particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de inicio, o una parte de la misma, donde la parte consiste en al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, al menos 30-50 aminoácidos, o que es identificable por otros medios para un experto en la materia ya que tiene su origen en la secuencia de inicio.
En un caso, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las CDR de la región variable de cadena pesada tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Alternativamente, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Así, de acuerdo con este aspecto una región variable de cadena pesada de la descripción tiene secuencias de polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 relacionadas con los grupos mostrados en la tabla 4, más arriba. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VH se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla
4. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VH se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las CDR de la región variable de cadena pesada tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de referencia seleccionadas de entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 % 95 % o 100 % de identidad con una secuencia VH de polipéptidos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158 a 172, 372, 376, 380, 384, 416 y 433, tal como se muestra en la tabla 6 y la SEQ ID NO: 435. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VH se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VH seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 158 a 172, 372, 376, 380, 384, 416 y 433, tal como se muestra en la tabla 6 y SEQ ID NO: 435. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VH se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VH con al menos el 80 %, 85 %, 90 % 95 % o 100 % de identidad con una secuencia VH de polipéptidos de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y la cadena pesada de inmunoglobulina producidas por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o más de los polipéptidos VH descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un VH encriptado por uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M o 10-15 M.
En otro caso, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las CDR de la región variable de cadena ligera tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Alternativamente, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos monoclonales Sp35 descritos en el presente documento. Así, de acuerdo con este caso, una región variable de cadena ligera de la descripción tiene secuencias de polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 relacionadas con los polipéptidos mostrados en la tabla 5, más arriba. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VL se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) en la que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos CDR1, CDR2 y CDR3 mostrados en la tabla
5. En algunos casos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VL se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las CDR de la región variable de cadena ligera tienen al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad con secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de referencia seleccionadas de entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA-8107).
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con una secuencia polipeptídica VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381, 385, 417 y 434, mostradas en la tabla 8. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VL se une de forma específica o preferente a Sp35.
En otro caso, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VL seleccionado de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 273 a 286, 373, 377, 381, 385, 417 y 434, mostradas en la tabla 8. En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que comprende el polipéptido VL se une de forma específica o preferente a Sp35.
En un caso adicional, la presente descripción incluye un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VL con al menos el 80 %, 85 %, 90 % 95 % o 100 % de identidad con una secuencia polipeptídica VL de referencia seleccionada de entre el grupo que consiste en la VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y la VL de la cadena ligera de inmunoglobulina producida por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA8107).
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en,, uno o más de los polipéptidos VL descritos anteriormente se une de forma específica o preferente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 y Li81, o inhibirá competitivamente dicho anticuerpo monoclonal de la unión a Sp35.
En algunos casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o más de los polipéptidos VL descritos anteriormente se une de forma específica o preferente a un polipéptido Sp35 o un fragmento del mismo, o una variante de polipéptido Sp35, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15
M.
En otros casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VH, tal como se muestra en la tabla 6, y un polipéptido VL, tal como se muestra en la tabla 8, seleccionados de entre el grupo que consiste en:
i) SEQ ID NO: 170 y SEQ ID NO: 283; ii) SEQ ID NO: 171 y SEQ ID NO: 284; iii) SEQ ID NO: 172 y SEQ ID NO: 285; iv) SEQ ID NO: 172 y SEQ ID NO: 286; v) SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 273; vi) SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 274; vii) SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 275; viii) SEQ ID NO: 161 y SEQ ID NO: 276; ix) SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 277; x) SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 278; xi) SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 279; xii) SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 280; xiii) SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 281; xiv) SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 282; xv) SEQ ID NO: 372 y SEQ ID NO: 373; xvi) SEQ ID NO: 376 y SEQ ID NO: 377; xvii) SEQ ID NO: 380 y SEQ ID NO: 381; xviii) SEQ ID NO: 384 y SEQ ID NO: 385; xix) SEQ ID NO: 416 y SEQ ID NO: 417; xx) SEQ ID NO: 433 y SEQ ID NO: 434; xxi) SEQ ID NO: 435 y SEQ ID NO: 434.
En otros casos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido VH y un polipéptido VL seleccionado de entre el grupo que consiste en el polipéptido VH y el polipéptido VL producido por el hibridoma 2.P3B5.2 (Designación de Depósito ATCC PTA-8106) y el polipéptido VH y el polipéptido VL producido por el hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designación de Depósito ATCC PTA8107).
Cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente puede incluir además polipéptidos adicionales, por ejemplo, un péptido señal para dirigir la secreción del polipéptido codificado, regiones constantes de anticuerpos tal como se describe en el presente documento u otros polipéptidos heterólogos tal como se describe en el presente documento. Además, los polipéptidos de la descripción incluyen fragmentos de polipéptidos tal como se describe en otra parte. Adicionalmente los polipéptidos de la descripción incluyen polipéptido de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, tal como se describe en el presente documento.
Además, tal como se describe en mayor detalle en otra parte en el presente documento, la presente descripción incluye composiciones que comprenden los polipéptidos descritos anteriormente.
Un experto en la materia comprenderá también que los polipéptidos de anticuerpos Sp35 tal como se describe en el presente documento pueden modificarse de manera que varían en la secuencia de aminoácidos con respecto al polipéptido de unión presente en la naturaleza del que se obtuvieron. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser similar, por ejemplo, tener un cierto porcentaje de identidad con la secuencia de inicio, por ejemplo, puede tener el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con la secuencia de inicio.
Además, pueden realizarse sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos o aminoácidos que conducen a sustituciones o cambios conservadores en regiones de aminoácidos "no esenciales". Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser idéntica a la secuencia de inicio excepto por una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos individuales, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos individuales. En algunos casos, una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de una proteína designada tiene de una a cinco, de una a diez, de una a quince o de una a veinte sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos individuales con respecto a la secuencia de inicio.
Algunos polipéptidos de anticuerpos Sp35 de la presente descripción comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos humana. Sin embargo, algunos polipéptidos de anticuerpos Sp35 comprenden uno o más aminoácidos contiguos derivados de otra especie de mamífero. Por ejemplo, un anticuerpo Sp35 de la presente descripción puede incluir una porción de cadena pesada de primate, una porción bisagra o una región de unión a antígeno. En otro ejemplo, uno o más aminoácidos derivados de ratón pueden estar presentes en un polipéptido de anticuerpos no murinos, por ejemplo, en un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo Sp35. En algunas aplicaciones terapéuticas, se diseñan anticuerpos específicos de Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o análogos de los mismos de manera que no sean inmunógenos en el animal al que se administra el anticuerpo.
En algunos casos, un polipéptido de anticuerpo Sp35 comprende una secuencia de aminoácidos o una o más fracciones no asociadas normalmente con un anticuerpo. Más adelante se describen en mayor detalle modificaciones de ejemplo. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv monocatenario puede comprender una secuencia enlazadora flexible, o puede modificarse para añadir una fracción funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina o una etiqueta).
Un polipéptido de anticuerpo Sp35 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión diana, y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la que no está unido naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se unen entre sí en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero están colocadas en una nueva ordenación en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, por síntesis química, o creando y traduciendo polinucleótido en el que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada.
El término "heterólogo" según se aplica a un polinucleótido o un polipéptido significa que el polinucleótido o polipéptido se obtiene de una entidad distinta al resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, tal como se usa en el presente documento, un "polipéptido heterólogo" que se fusionará con un anticuerpo Sp35, o un fragmento de unión a antígeno, variante o análogo del mismo se obtiene de un polipéptido no de inmunoglobulina de la misma especie, o un polipéptido de inmunoglobulina o no inmunoglobulinas de una especie diferente.
Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina está sustituido preferentemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otro caso, una cadena de aminoácidos puede estar sustituida por una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.
Alternativamente, en otro caso, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de parte o la totalidad de la secuencia codificante de inmunoglobulina, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden incorporarse en anticuerpos Sp35 para su uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento y someterse a cribado según su capacidad de unirse al antígeno deseado, por ejemplo, Sp35.
VI. PROTEÍNAS DE FUSIÓN Y CONJUGADOS DE ANTICUERPOS
Tal como se expone en mayor detalle en otra parte en el presente documento, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden fusionarse adicionalmente de forma recombinante con un polipéptido heterólogo en el extremo N o C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos Sp35 específicos de Sp35 pueden fusionarse de forma recombinante o conjugarse con moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas. Véanse, por ejemplo, publicaciones PCT WO-92/08495; WO-91/14438; WO-89/12624; patente de EE. UU. nº 5.314.995; y documento EP 396.387.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción incluyen derivados que son modificados, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula con el anticuerpo de manera que la unión covalente no impide que el anticuerpo se una a Sp35. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Puede realizarse cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los anticuerpos específicos Sp35 pueden modificarse por procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier lugar del anticuerpo específico Sp35, incluyendo la estructura principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en fracciones tales como hidratos de carbono. Se observará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios lugares en un anticuerpo específico Sp35 dado. Además, un anticuerpo específico Sp35 dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos específicos Sp35 puede ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubicuitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos específicos Sp35 cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden obtenerse de procesos naturales de postraducción o pueden prepararse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o un derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas como arginilación y ubicuitinación. (Véase, por ejemplo, Proteins – Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman y Company, Nueva York 2ª ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pág. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
La presente descripción también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, y un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo puede ser útil para función o es útil para dirigirse a células que expresan el polipéptido Sp35. En un caso, una proteína de fusión de la descripción comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones VH de un anticuerpo de la descripción o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones VL de un anticuerpo de la descripción o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En otro caso, una proteína de fusión para el uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento comprende, consiste esencialmente en,, o consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres de las CDR de VH de un anticuerpo específico Sp35, o fragmentos, variantes o derivados del mismo, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres de las CDR de VL de un anticuerpo específico Sp35, o fragmentos, variantes o derivados del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En un caso, la proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de VH de un anticuerpo específico Sp35 de la presente descripción, o fragmento, derivado o variante del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga, donde esta proteína de fusión se une específicamente a al menos un epítopo de Sp35. En otro caso, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región VH de un anticuerpo específico Sp35 de la descripción y la secuencia de aminoácidos de al menos una región VL de un anticuerpo específico Sp35 de la descripción o fragmentos, derivados o variantes del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, las regiones VH y VL de la proteína de fusión corresponden a un único anticuerpo fuente (o un fragmento scFv o Fab) que se une específicamente al menos a un epítopo de Sp35. En otro caso más, una proteína de fusión para el uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en el presente documento comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las CDR de VH de un anticuerpo específico Sp35 y la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las CDR de VL de un anticuerpo específico Sp35, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más de la CDR o las CDR de VH o la CDR o las CDR de VL corresponden a un único anticuerpo fuente (o un fragmento scFv o Fab) de la descripción. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican estas proteínas de fusión están comprendidas también por la descripción.
Las proteínas de fusión de ejemplo a las que se hace referencia en la bibliografía incluyen fusiones del receptor de linfocitos T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); y Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990)); L-selectina (receptor de inicio) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); y Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); receptor TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1053510539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); y Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); y receptor IgE a (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)).
En algunos casos, los anticuerpos Sp35, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos comprenden además una fracción de direccionamiento. Las fracciones de direccionamiento incluyen una proteína o un péptido que dirige la localización a una cierta parte del cuerpo, por ejemplo, al encéfalo o a compartimentos del mismo. En algunos casos, los anticuerpos Sp35, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos se unen o se fusionan con una fracción de direccionamiento encefálico. Las fracciones de direccionamiento encefálico están unidas de forma covalente (por ejemplo, directa, fusión traduccional o por enlace químico directamente o a través de una molécula separadora, que puede ser opcionalmente escindible) o unidas de forma no covalente (por ejemplo, a través de interacciones reversibles tales como avidina, biotina, proteína A, IgG, etc.). En otros casos, los anticuerpos Sp35, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos están unidos a una o más fracciones de direccionamiento encefálico. En casos adicionales, la fracción de direccionamiento encefálico está unida a una pluralidad de anticuerpos Sp35, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos.
Una fracción de direccionamiento encefálico asociada con un anticuerpo Sp35, fragmento de anticuerpo, derivado o variante del mismo potencia el suministro encefálico de dichos anticuerpos Sp35, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos. Se ha descrito una serie de polipéptidos que, cuando se fusionan con una proteína o agente terapéutico, suministran la proteína o el agente terapéutico a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Los ejemplos no limitativos incluyen el anticuerpo de dominio único FC5 (Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); AMc 83-14, un anticuerpo monoclonal para el receptor de insulina humana (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); los péptidos B2, B6 y B8 que se unen al receptor de transferrina humana (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Virol. 74, 11359-11366); el anticuerpo monoclonal OX26 con el receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); y las SEQ ID NO: 1-18 de la patente de EE. UU. nº 6.306.365.
El suministro encefálico mejorado de un anticuerpo Sp35, fragmento de anticuerpo, derivado o variante del mismo se determina por una serie de medios bien establecidos en la técnica. Por ejemplo, la administración a un animal de un anticuerpo Sp35 marcado por medios radiactivos, enzimáticos o por fluorescencia, fragmento de anticuerpo, derivado y variante del mismo unido a una fracción de direccionamiento encefálico; la determinación de una localización en el encéfalo; y la comparación de la localización con un anticuerpo Sp35 marcado por medios radiactivos, enzimáticos o por fluorescencia, derivado o variante del mismo que no está asociado con una fracción de direccionamiento encefálico. En las referencias anteriores se describen otros medios para determinar el direccionamiento mejorado.
Tal como se expone en otra parte en el presente documento, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden fusionarse con polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos o para el uso en inmunoensayos que usan procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un caso, PEG puede conjugarse con los anticuerpos Sp35 de la descripción para aumentar su semivida in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002).
Por otra parte, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación o detección. En casos preferentes, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchas de las cuales están disponibles comercialmente. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación cómoda de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para purificación incluyen, pero no se limitan a, la marca "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la marca "flag".
Las proteínas de fusión pueden prepararse usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. nº 5.116.964 y 5.225.538). El sitio exacto en el que se realiza la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de secreción o unión de la proteína de fusión. A continuación, el ADN que codifica la proteína de fusión es transfectado en una célula hospedadora para su expresión.
Los anticuerpos Sp35 o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la presente descripción pueden usarse en forma no conjugada o pueden ser conjugados con al menos una de una diversidad de moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de diana o para estudios de imagen o terapia del paciente. Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden marcarse o conjugarse antes o después de la purificación, cuando se realiza purificación.
En particular, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden conjugarse con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.
Los expertos en la materia observarán que los conjugados pueden ensamblarse también usando diversas técnicas dependiendo del agente seleccionado para conjugación. Por ejemplo, los conjugados con biotina se preparan por ejemplo mediante la reacción de un polipéptido de unión con un éster activado de biotina tal como el éster de Nhidroxisuccinimida de biotina. De forma similar, los conjugados con un marcador fluorescente pueden prepararse en presencia de un agente de copulación, por ejemplo, los enumerados en el presente documento, o por reacción con un isotiocianato, preferentemente isotiocianato de fluoresceína. Los conjugados de los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción se preparan de una forma análoga.
La presente descripción comprende además anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos Sp35 pueden usarse de forma diagnóstica, por ejemplo, para vigilar el desarrollo o progresión de una enfermedad neurológica como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento y/o prevención dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo a una sustancia detectable. Entre los ejemplos de sustancias detectables se incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales de emisión de positrones usando varias tomografías por emisión de positrones y iones de metales paramagnéticos no radiactivos. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para el uso como agentes de diagnóstico de acuerdo con la presente descripción. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados se incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; entre los ejemplos de materiales bioluminiscentes se incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y entre los ejemplos de material radiactivo adecuado se incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.
Un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede marcarse de forma detectable por acoplamiento con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo Sp35 marcado por quimioluminiscencia se determina a continuación mediante la detección de la presencia de luminiscencia que aparece durante el curso de una reacción química. Entre los ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente particularmente útiles se incluyen luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.
Una de las formas en que un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede marcarse de forma detectable es mediante la unión del mismo a una enzima y usando el producto enlazado con un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Inmunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Asociates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981). La enzima, que está unida al anticuerpo Sp35 reaccionará con un sustrato apropiado, preferentemente un sustrato cromógeno, de manera que produzca una fracción química que puede ser detectada, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar de forma detectable el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, isomerasa delta-5-esteroidea, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, fosfato de triosa isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Además, la detección puede realizarse por procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección puede realizarse también por comparación visual de la magnitud de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de forma similar.
La detección puede realizarse también usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcado radiactivo del anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (marzo, 1986)). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios que incluyen, pero no se limitan a, un contador gamma, un contador de centelleo o una autorradiografía.
Un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede marcarse también de forma detectable usando metales de emisión de fluorescencia tales como 152Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo usando grupos quelantes metálicos como ácido dietilentriaminpentacético (DTPA) o ácido etilendiamintetraacético (EDTA).
Las técnicas para conjugación de diversas fracciones a un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Inmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pág. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Vehicles Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pág. 303-16 (1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
VII. EXPRESIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE ANTICUERPOS
Como es bien conocido, el ARN puede aislarse de las células originales de hibridoma o de otras células trasformadas por técnicas estándar, tales como extracción de isotiocianato de guanidinio y precipitación seguido por centrifugación o cromatografía. Cuando resulta deseable, el ARNm puede aislarse a partir del ARN total por técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en la técnica.
En un caso, los ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden prepararse, simultáneamente o por separado, usando transcriptasa inversa y ADN polimerasa de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Puede iniciarse una PCR con cebadores de región constante de consenso o mediante cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN y aminoácidos de cadena pesada y ligera. Tal como se expone anteriormente, la PCR puede usarse también para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo. En este caso pueden cribarse las bibliotecas mediante cebadores de consenso o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de región constante de ratón.
El ADN, normalmente ADN de plásmico, puede aislarse a partir de las células usando técnicas conocidas en la técnica, restricción cartografiada y secuenciada de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas expuestas en detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores en relación con técnicas de ADN recombinante. Naturalmente, el ADN puede ser sintético en cualquier punto durante el procedimiento de aislamiento o el análisis posterior.
Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos Sp35 se insertan normalmente en un vector de expresión para su introducción en células hospedadoras que pueden usarse para producir la cantidad deseada de anticuerpo Sp35.
La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo de los mismos, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana descrita en el presente documento, por ejemplo, Sp35, requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (preferentemente que contiene el dominio variable de la cadena pesada o ligera), de la descripción, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Así, en el presente documento se describen los procedimientos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene un anticuerpo que codifica secuencias de nucleótidos. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional adecuadas. Entre estos procedimientos se incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La descripción proporciona así vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la descripción, o una cadena pesada o ligera de los mismos, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, unidos operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO-86/05807; la publicación PCT WO-89/01036; y la patente de EE. UU. nº 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa.
La célula hospedadora puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión de la descripción, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifica los polipéptidos de la cadena pesada y de la cadena ligera. En estas situaciones, la cadena ligera se coloca ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.
El término "vector" o la expresión "vector de expresión" se usan en el presente documento para referirse a vectores usados de acuerdo con la presente descripción como un vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula hospedadora. Tal como conocen los expertos en la materia, dichos vectores pueden seleccionarse fácilmente de entre el grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente descripción comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.
Para los fines de la presente descripción, pueden emplearse numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector usa elementos de ADN que se obtienen de virus de animales tales como virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Además, pueden seleccionarse células que han integrado el ADN en sus cromosomas introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedadoras transfectadas. El marcador puede proporcionar para prototrofia a un hospedador auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre. El gen marcador seleccionable puede estar ligado directamente a las secuencias de ADN para su expresión o introducirse en la misma célula por cotransformación. También pueden necesitarse elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias señal, señales de splice, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación.
En casos particularmente preferentes los genes clonados de región variable se insertan en un vector de expresión junto con los genes de región constante de cadena pesada y ligera (preferentemente humanos) sintéticos tal como se expone anteriormente. En un caso, esto se realiza usando un vector de expresión de propiedad exclusiva de Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (patente de EE. UU. 6.159.730). Este vector contiene el promotor/potenciador de citomegalovirus, el promotor principal de globina beta de ratón, el origen de replicación SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, el exón 1 y el exón 2 de neomicina fosfotransferasa, el gen de dihidrofolato reductasa y una secuencia delantera. Se ha encontrado que este vector produce una expresión de anticuerpos de muy alto nivel tras la incorporación de genes de regiones variables y constantes, transfección en células CHO, seguido por selección en G418 que contiene medio y amplificación de metotrexato. Naturalmente, en la presente invención puede usarse cualquier vector de expresión que sea capaz de provocar la expresión en células eucariotas. Entre los ejemplos de vectores adecuados se incluyen, pero no se limitan a plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Ze02, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 y pZeoSV2 (disponibles en Invitrogen, San Diego, CA), y plásmido pCI (disponible en Promega, Madison, WI). En general, el cribado de grandes cantidades de células transformadas para las cuales se expresan niveles adecuadamente elevados de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina es una experimentación de rutina que puede ser realizada, por ejemplo, por sistemas robóticos. También se enseñan sistemas de vectores en las patentes de EE. UU. nº 5.736.137 y 5.658.570. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Otros sistemas de vectores de ejemplo se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 6.413.777.
En otros casos preferentes los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden expresarse usando construcciones policistrónicas tales como las descritas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos nº 2003-0157641 A1, presentada el 8 de noviembre de 2002. En estos nuevos sistemas de expresión, pueden producirse múltiples productos génicos de interés tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de una única construcción policistrónico. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio de entrada de ribosomas interno (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos Sp35, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos Sp35 o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos en células hospedadoras eucariotas. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente de EE. UU. nº 6.193.980. Los expertos en la materia observarán que dichos vectores de expresión pueden usarse para producir de manera efectiva el conjunto completo de anticuerpos Sp35 descritos en la presente solicitud.
Más en general, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo Sp35, el vector de expresión puede introducirse en una célula hospedadora apropiada. La introducción del plásmido en la célula hospedadora puede realizarse mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Entre estas se incluyen, pero no se limitan a, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación de fosfato de calcio, fusión celular con ADN de envoltura, microinyección e infección con virus intacto. Véase, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez y Denhardt, eds., Butterworths, Boston, Mass., capítulo 24.2, pág. 470-472 (1988). Normalmente, la introducción de plásmicos en el hospedador se realiza por electroporación. Las células hospedadoras que alojan la construcción de expresión se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, y se someten a ensayo para la síntesis de proteínas de cadena pesada y/o ligera. Entre las técnicas de ensayo de ejemplo se incluyen ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.
El vector de expresión es transferido a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan a continuación por técnicas convencionales para producir un anticuerpo para el uso en los procedimientos descritos en el presente documento. Así, la descripción incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la descripción, o una cadena pesada o ligera del mismo, ligado operativamente a un promotor heterólogo. En casos preferentes para la expresión de anticuerpos bicatenarios, los vectores que codifican las cadenas pesadas y las cadenas ligeras pueden coexpresarse en la célula hospedadora para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla más adelante.
Tal como se usa en el presente documento, "células hospedadoras" hace referencia a células que alojan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procedimientos para el aislamiento de anticuerpos a partir de hospedadores recombinantes, las expresiones "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para denotar la fuente de anticuerpo salvo que se especifique claramente lo contrario. Dicho de otro modo, la recuperación de polipéptidos de las "células" puede proceder del centrifugado de células enteras o del cultivo de células que contiene el medio y las células en suspensión.
Puede usarse una variedad de sistemas de vectores de expresión de hospedador para expresar moléculas de anticuerpo para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento. Dichos sistemas de expresión de hospedador representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y purificarse posteriormente, pero también representan células que, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo de la descripción in situ. Entre ellas se incluyen pero no se limitan a microorganismos como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que alojan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores obtenidos del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus vaccinia 7.5K). Preferentemente, se usan células bacterianas como Escherichia coli, y más preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunción con un vector tal como el elemento principal de gen temprano intermedio del citomegalovirus humano constituyen un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
La línea celular del hospedador usada para expresión de proteínas tiene a menudo un origen de mamífero; los expertos en la materia tienen la capacidad de determinar preferentemente líneas celulares de hospedador particulares que son las mejor adaptadas para la expresión en las mismas del producto génico deseado. Entre las líneas celulares de hospedador de ejemplo, se incluyen, pero no se limitan a, CHO (ovario de hámster chino), DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos), HELA (carcinoma de cuello uterino humano), CVI (línea renal de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T SV40), VERY, BHK (riñón de cría de hámster), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea renal de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Se prefieren particularmente las células CHO. Las líneas celulares de hospedador están disponibles normalmente en los servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o la bibliografía publicada.
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares
o sistemas hospedadores adecuados para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado de la transcripción primaria, la glucosilación y la fosforilación del producto génico.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, pueden transformarse las células hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, puede permitirse el desarrollo de células diseñadas durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambia a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y se desarrollen para formar focos que a su vez pueden ser clonados y expandirse en líneas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo.
Puede usarse una serie de sistemas de selección, que incluyen, pero no se limitan al virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), pueden emplearse genes de timidina cinasa hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 1980) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos como base de la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993), TIB TECH 11(5):155-215 (mayo de 1993); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Los procedimientos conocidos comúnmente en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981).
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden incrementarse mediante amplificación de vectores (véase una revisión en Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gen amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in ADN cloning, Academic Press, Nueva York, Vol. 3. (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de células hospedadoras incrementará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
La producción in vitro permite el aumento de escala para producir grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamíferos en condiciones de cultivo tisular son conocidas en la técnica e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de levantamiento de aire o en un reactor con agitador continuo, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si es necesario y/o se desea, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse por procedimientos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración de gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno-)afinidad, por ejemplo, después de biosíntesis preferente de un polipéptido sintético de región bisagra o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en el presente documento.
Los genes que codifican anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden expresar también células no de mamífero como células de bacterias o levaduras o plantas. Entre las bacterias que captan fácilmente ácidos nucleicos se incluyen miembros de las enterobacteriáceas, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Se observará además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos normalmente se hacen parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben ser aislados, purificados y después ensamblados en moléculas funcionales. Cuando se desean formas tetravalentes de anticuerpos, las subunidades se ensamblarán después en anticuerpos tetravalentes (documento WO02/096948A2).
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresión seleccionados dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que son purificados fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el que la secuencia codificante de anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en el marco con la región codificante lacZ de manera que se produce una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX pueden usarse también para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a perlas de glutatiónagarosa de matriz seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan de manera que incluyan sitios de escisión de trombina o factor Xa proteasa de modo que el producto génico diana clonado pueda ser liberado en la fracción GST.
Además de procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas. Entre los microorganismos eucariotas el más utilizado es Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, aunque comúnmente se dispone de otras cepas diversas como, por ejemplo, Pichia pastoris.
Para la expresión en Saccharomyces se usa comúnmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb et al., Nature
282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de desarrollarse en triptófano, por ejemplo, nº ATCC 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trpl as una característica del genoma de célula hospedadora de levadura que proporciona un entorno efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.
En un sistema de insectos se usa normalmente el virus de poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la poliedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).
Una vez que se ha expresado de forma recombinante una molécula de anticuerpo de la descripción, puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de Proteína A y cromatografía de dimensionamiento de columna), centrifugado, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Alternativamente, se describe un procedimiento preferente para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la descripción en el documento US 2002 0123057 A1.
VIII. PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO QUE USAN ANTICUERPOS Sp35 TERAPÉUTICOS
Tal como se describe en el presente documento, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes
o derivados de los mismos de la descripción pueden aliviar la inhibición mediada por NgR1 de la extensión axonal que tiene lugar normalmente en las neuronas del SNC. Esto es beneficioso en situaciones en las que la extensión axonal o el brote de neuritas son necesarios en el encéfalo o la médula espinal. La lesión de la médula espinal, que incluye aplastamiento o rotura parcial o completa ilustra una situación en la que se necesita extensión axonal, pero normalmente está inhibida a través del funcionamiento de la vía Nogo. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos en los que extensión axonal y/o el brote de neuritas en el encéfalo serían beneficiosos se incluyen accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple y otras enfermedades o trastornos neurodegenerativos tales como esclerosis múltiple (EM), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), encefalomielitis (EPL), mielinólisis pontina central (MPC), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células globoides (enfermedad de Krabbe) y degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, lesión por traumatismo craneoencefálico, lesión post-radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, accidente cerebrovascular, neuropatía, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia de vitamina E aislado, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino, parálisis de Bell, lesión de la médula espinal y todas las enfermedades neurológicas relacionadas con la muerte de células neuronales.
Los autores de la invención han descubierto además que Sp35 se expresa en oligodendrocitos, y contribuye a la biología de los oligodendrocitos. Los derivados solubles de Sp35, ciertos polinucleótidos (por ejemplo, ARNi), así como ciertos anticuerpos que se unen específicamente a Sp35, tal como se describe en el presente documento actúan como antagonistas de la función de Sp35 en los oligodendrocitos, promoviendo la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de oligodendrocitos y promoviendo la mielinización de neuronas in vitro e in vivo. Esto resulta beneficioso en enfermedades, trastornos o afecciones que implican desmielinización y dismielinización. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos en los que la proliferación, diferenciación y supervivencia de oligodendrocitos, y/o la mielinización o remielinización serían beneficiosas se incluyen esclerosis múltiple (EM), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), encefalomielitis (EPL), mielinólisis pontina central (MPC), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células globoides (enfermedad de Krabbe), degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, lesión por traumatismo craneoencefálico, lesión post-radiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, accidente cerebrovascular, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia de vitamina E aislado, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino y parálisis de Bell.
Por consiguiente, un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para tratar lesiones de la médula espinal, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento neuronal en el SNC, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento o diferenciación de oligodendrocitos y enfermedades que implican desmielinización o dismielinización de neuronas del SNC en un animal que sufre dicha lesión o enfermedad o está predispuesto a contraer dicha enfermedad, comprendiendo el procedimiento, consistiendo esencialmente en o consistiendo en la administración al animal de una cantidad efectiva de un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo. En el presente documento se describen anticuerpos de la descripción, e incluyen los anticuerpos monoclonales enumerados en la tabla 3A y 3B, los anticuerpos que se unen específicamente al mismo epítopo que los anticuerpos monoclonales enumerados en la tabla 3A y 3B, los anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de los anticuerpos monoclonales enumerados en la tabla 3A y 3B a Sp35 y los anticuerpos que comprenden polipéptidos derivados de los anticuerpos monoclonales enumerados en la tabla 3A y 3B.
Un anticuerpo Sp35 terapéutico que se usará en los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento puede prepararse y usarse como un agente terapéutico que promueve el crecimiento de neuritas en el SNC, la supervivencia neuronal, la orientación axonal y la regeneración axonal, que promueve la supervivencia, crecimiento y/o diferenciación de oligodendrocitos y que promueve la mielinización o remielinización de neuronas del SNC. Entre las características de anticuerpos Sp35 terapéuticos adecuados se incluyen: unión a epítopos Sp35 que producen el bloqueo de la actividad de Sp35, unión a Sp35 con suficiente afinidad para provocar un efecto terapéutico y unión a Sp35 preferentemente para parejas de unión normales como, por ejemplo, receptor Nogo.
Los anticuerpos Sp35 terapéuticos pueden ser anticuerpos monoclonales, quiméricos o humanizados, o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a Sp35. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes, bivalentes, polivalentes o bifuncionales. Los fragmentos de anticuerpos incluyen sin limitación fragmentos Fab F(ab')2 y Fv.
Los anticuerpos Sp35 terapéuticos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de acuerdo con la descripción pueden usarse en forma no marcada o no conjugada, o pueden estar acoplados o enlazados con fármacos, etiquetas o agentes de estabilización que pueden ejercer o no efectos terapéuticos adicionales.
La pauta posológica y terapéutica específica para cualquier paciente en particular dependerá de diversos factores, que incluyen el anticuerpo Sp35 en particular, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo usado, la edad del paciente, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad en particular que se trata. La valoración de estos factores por los cuidadores médicos está dentro del ámbito de los expertos en la materia. La cantidad dependerá también del paciente individual sometido a tratamiento, la vía de administración, el tipo de formulación, las características del compuesto usado, la gravedad de la enfermedad y el efecto deseado. La cantidad usada puede determinarse por principios farmacológicos y farmacocinéticos bien conocidos en la técnica.
En los procedimientos de la descripción los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse directamente al sistema nervioso, por vía intracerebroventricular o intratecal, por ejemplo, en una lesión crónica de EM, tal como se expone en mayor detalle más adelante.
En varios casos, un anticuerpo Sp35 tal como se describe anteriormente es un antagonista de la actividad Sp35. En algunos casos, por ejemplo, la unión de un anticuerpo Sp35 antagonista a Sp35, tal como se expresa en las neuronas, bloquea la inhibición del crecimiento de neuritas asociada a la mielina o la muerte de las células neuronales. En otros casos, la unión del anticuerpo Sp35 a Sp35, tal como se expresa en los oligodendrocitos, bloquea la inhibición del crecimiento o diferenciación de oligodendrocitos, o bloquea la desmielinización o dismielinización de las neuronas del SNC.
En los procedimientos de la presente descripción, un anticuerpo Sp35, o un fragmento de unión a antígeno, variante
o derivado del mismo, en particular los anticuerpos Sp35 descritos en el presente documento, puede administrarse directamente como un polipéptido preformado, o indirectamente a través de un vector de ácido nucleico, para permitir el crecimiento axonal beneficioso, promover la proliferación, diferenciación y supervivencia de oligodendrocitos y/o promover la mielinización o remielinización.
En algunos casos, un sujeto puede ser tratado con una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo Sp35,
o fragmento de unión a antígeno, variante o análogo del mismo, por ejemplo, en un vector. Las dosis de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos están comprendidas entre aproximadamente 10 ng y 1 g, 100 ng y 100 mg, 1 µg y 10 mg o 30-300 µg de ADN por paciente. Las dosis para vectores víricos infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis.
En algunos casos de la presente descripción un anticuerpo Sp35, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se administra en un procedimiento de tratamiento que incluye: (1) la transformación o transfección de una célula hospedadora implantable con un ácido nucleico, por ejemplo, un vector, que expresa un anticuerpo Sp35, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo; y (2) la implantación de la célula hospedadora transformada en un mamífero, en el sitio de una enfermedad, trastorno o lesión. Por ejemplo, la célula hospedadora transformada puede implantarse en el sitio de una lesión de la médula espinal o en un sitio de dismielinización. En algunos casos de la descripción la célula hospedadora implantable se extrae de un mamífero, cultivada temporalmente, transformada o transfectada con un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo Sp35, y se implanta de nuevo en el mismo mamífero del que se extrajo. La célula puede ser extraída, aunque no se requiere que lo sea, del mismo sitio en el que se implanta. Dichos casos, conocidos en ocasiones como terapia génica ex vivo, pueden proporcionar un suministro continuo del polipéptido Sp35, localizado en el sitio de acción, durante un periodo de tiempo limitado.
Los procedimientos para tratar una lesión de la médula espinal, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento neuronal en el SNC, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento
o diferenciación de oligodendrocitos, y enfermedades que implican desmielinización o dismielinización de neuronas del SNC que comprenden la administración de un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se prueban normalmente in vitro, y después in vivo en un modelo animal aceptable, para valorar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Los modelos animales adecuados, incluidos animales transgénicos, son bien conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, los ensayos in vitro para mostrar la utilidad terapéutica del anticuerpo Sp35 descrito en el presente documento incluyen el efecto de un anticuerpo Sp35 en una línea celular o una muestra de tejido del paciente. El efecto del anticuerpo Sp35 en la línea celular y/o la muestra de tejido puede determinarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como los ensayos descritos en otra parte en el presente documento. De acuerdo con la descripción entre los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si la administración de un anticuerpo Sp35 específico está indicada se incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en los que se hace crecer en cultivo una muestra de tejido del paciente, y se expone o se administra de otro modo un compuesto, y se observa el efecto de dicho compuesto en la muestra de tejido.
También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones de la descripción. Por ejemplo, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción puede formularse y/o administrarse conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
La descripción comprende cualquier procedimiento de suministro adecuado para un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción a un tejido diana seleccionado, que incluye inyección de bolo de una solución acuosa o implantación de un sistema de liberación controlada. El uso de un implante de liberación controlada reduce la necesidad de inyecciones repetidas.
IX. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE ADMINISTRACIÓN
Los procedimientos de preparación y administración de anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción a un sujeto que los necesita son bien conocidos o son fáciles de determinar para los expertos en la materia. La vía de administración del anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. SI bien todas estas formas de administración se contemplan claramente como situadas dentro del alcance de la descripción, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Por lo general, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las enseñanzas del presente documento, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden suministrarse directamente en el sitio de la población celular adversa incrementando así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.
Tal como se expone anteriormente, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de una lesión de la médula espinal de un mamífero, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento neuronal en el SNC, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento
o diferenciación de oligodendrocitos y enfermedades que implican desmielinización o dismielinización del SNC. A este respecto, se observará que los anticuerpos descritos se formularán de manera que se facilite la administración y se promueva la estabilidad del agente activo. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente descripción comprenden un vehículo estéril no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como suero salino fisiológico, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, conjugado o no conjugado, será tal que se mantenga en una cantidad suficiente para alcanzar una unión efectiva a una diana y para conseguir un beneficio, por ejemplo, para mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o para detectar una sustancia o una célula.
Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente descripción comprenden vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.
Entre las preparaciones para la administración parenteral se incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas, suspensiones y emulsiones. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Entre los vehículos acuosos se incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y media tamponado. En la descripción objeto, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampón de fosfato 0,01-0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer de lactato o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.
Más en particular, entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable se incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En estos casos, la composición debe ser estéril y ha de ser fluida para que sea fácil de utilizar en jeringas. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se preservará preferentemente frente a la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para el uso en los procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16ª ed. (1980).
La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse con varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando un compuesto activo (por ejemplo, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, solo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, según sea necesario, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son secado al vacío y liofilización, que produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución estéril previamente filtrada del mismo. Las preparaciones para inyecciones son procesadas, se vierten en recipientes tales como ampollas, bolsas, frascos, jeringas o viales, y se sellan herméticamente en condiciones asépticas de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones pueden envasarse y comercializarse en forma de un kit tal como los descritos en el documento en tramitación U.S.S.N. 09/259.337 (US-2002-0102208 A1). Dichos artículos de fabricación tendrán preferentemente etiquetas o prospectos en el envase que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que sufre o tiene predisposición a trastornos autoinmunitarios o neoplásicos.
Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis en bolo único, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida por una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse en intervalos fijos o variables específicos, por ejemplo, una vez al día, o según “se necesite".
Algunas composiciones farmacéuticas usadas en la presente descripción pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Algunas composiciones farmacéuticas pueden administrarse también por aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones pueden prepararse como soluciones en suero salino, que emplean alcohol bencílico u otros conservantes, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad y/u otros agentes convencionales de solubilización o dispersión adecuados.
La cantidad de un anticuerpo Sp35, o fragmento, variante o derivado del mismo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del hospedador tratado y del modo de administración en particular. La composición puede administrarse como una dosis única, en dosis múltiples o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. También pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse a un ser humano u otro animal de acuerdo con los procedimientos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse a dicho ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo con un vehículo farmacéuticamente aceptable convencional o un diluyente de acuerdo con técnicas conocidas. Un experto en la materia reconocerá que la forma y el carácter del vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente están dictados por la cantidad de ingrediente activo con la que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la materia apreciarán además que un cóctel que comprenda una o más especies de anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos puede demostrar ser particularmente efectivo.
Las dosis efectivas de las composiciones de la presente descripción, para el tratamiento de una lesión de la médula espinal, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento neuronal en el SNC, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento o diferenciación de oligodendrocitos y enfermedades que implican desmielinización o dismielinización del SNC variarán dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Por lo general, el paciente es un ser humano, aunque puede tratarse también a mamíferos no humanos incluidos mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento pueden valorarse usando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y la eficacia.
Para el tratamiento de una lesión de la médula espinal, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento neuronal en el SNC, enfermedades o trastornos asociados con la inhibición del crecimiento o diferenciación de oligodendrocitos, y enfermedades que implican desmielinización o dismielinización del SNC con un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, la dosificación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más por lo general 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o estar en el intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. Las dosis intermedias en los intervalos anteriores también pretenden estar dentro del alcance de la descripción. A los sujetos pueden administrárseles dichas dosis de forma diaria, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro calendario determinado por análisis empírico. Un tratamiento de ejemplo comprende la administración en múltiples dosis durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento adicionales comprenden la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los calendarios de dosificación de ejemplo incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg cada semana. En algunos procedimientos, se administran dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión de forma simultánea, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser diarios, semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según lo indique la medida de los niveles en sangre de polipéptido diana o molécula diana en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de polipéptidos en plasma de 1-1.000 µg/ml y en algunos procedimientos 25-300 µg/ml. Alternativamente, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes
o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse en una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. La semivida de un anticuerpo Sp35 puede prolongarse también por medio de la fusión con un polipéptido o fracción estable, por ejemplo, albúmina o PEG. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más larga, seguidos por los anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. En un caso, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse en forma no conjugada, En otro caso, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse múltiples veces en forma conjugada. En otro caso más, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse en forma no conjugada, y después en forma conjugada, o a la inversa.
Las composiciones de la presente descripción pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por vía parenteral, intraventricular, oral, por inhalación en nebulizador, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por medio de un reservorio implantado. El término "parenteral" tal como se usa en el presente documento incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Tal como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos actúan sobre el sistema nervioso para promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de oligodendrocitos y la mielinización de neuronas y la supervivencia neuronal, regeneración de axones y orientación de axones. Por consiguiente, en los procedimientos de la descripción, los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos se administran de forma que atraviesan la barrera hematoencefálica. Este cruce puede proceder de las propiedades fisicoquímicas inherentes en la molécula del anticuerpo Sp35 en sí, de otros componentes en una formulación farmacéutica o del uso de un dispositivo mecánico tal como una aguja, cánula o instrumentos quirúrgicos para superar la barrera hematoencefálica. Cuando el anticuerpo Sp35 es una molécula que no cruza intrínsecamente la barrera hematoencefálica, por ejemplo, una fusión con una fracción que facilita el cruce, las vías de administración adecuadas son, por ejemplo, intratecal o intracraneal, por ejemplo, directamente en una lesión crónica de EM. Cuando el anticuerpo Sp35 es una molécula que cruza intrínsecamente la barrera hematoencefálica, la vía de administración puede ser por una o más de las diversas vías descritas más adelante. En algunos procedimientos, los anticuerpos se administran en una composición o dispositivo de liberación sostenida, tales como un dispositivo Medipad™. El suministro a través de la barrera hematoencefálica puede mejorarse si lleva una molécula, tal como un receptor anti-Fc, transferrina, receptor anti-insulina o un conjugado de toxinas o un potenciador de penetración.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos usados en los procedimientos de la descripción pueden infundirse directamente en el encéfalo. Se conocen varios implantes para la infusión directa en el encéfalo de compuestos y son efectivos en el suministro de compuestos terapéuticos en pacientes humanos que sufren trastornos neurológicos. Entre ellos se incluyen infusión crónica en el encéfalo usando una bomba, catéteres intersticiales temporales implantados por vía estereotáctica, implantes de catéteres intracraneales permanentes e implantes biodegradables de implantación quirúrgica. Véase, por ejemplo, Gill et al., "Direct brain infusion of glial celular line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease”, Nature Med. 9: 589-95 (2003); Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas”, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-91 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas”, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-82 (1999); capítulo 66, páginas 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy”, en Gildenberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); y Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial”, J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995).
Las composiciones pueden comprender también un anticuerpo Sp35 dispersado en un material de vehículo biocompatible que funciona como un sistema de soporte o suministro adecuado para los compuestos. Entre los ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida se incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados tales como supositorios o cápsulas. Entre las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares se incluyen polilactidas (patente de EE. UU. nº 3.773.319; documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)); poli(2hidroxietil-metacrilato), acetato de etilenvinilo (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).
En algunos casos de la descripción, un anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción se administra a un paciente por infusión directa en una región apropiada del encéfalo. Véase, por ejemplo, Gill et al., más arriba. Se dispone de técnicas alternativas y pueden aplicarse para administrar un anticuerpo Sp35 de acuerdo con la descripción. Por ejemplo, la colocación estereotáctica de un catéter o implante puede conseguirse usando la unidad de Riechert-Mundinger y la unidad de localización multiuso ZD (Zamorano-Dujovny). Un estudio de tomografía computarizada (TC) con realce de contraste, que inyecta 120 ml de omnipaque, 350 mg de yodo/ml, con grosor de corte de 2 mm puede permitir una planificación del tratamiento tridimensional en planos múltiples (STP, Fischer, Friburgo, Alemania). Este equipo permite la planificación basándose en estudios de imagen de resonancia magnética, combinando la información objeto de TC y RM para una confirmación objeto clara.
Para este fin pueden usarse el sistema estereotáctico de Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para el uso con un escáner TC GE (General Electric Company, Milwaukee, WI) así como el sistema estereotáctico de Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA). Así, en la mañana del implante, el anillo de base anular del marco estereotáctico BRW puede fijarse al cráneo del paciente. Pueden obtenerse secciones de TC en serie en intervalos de 3 mm a través de la región (tejido diana) con un marco localizador de barra de grafito sujeto a la placa base. Puede ejecutarse un programa de planificación de tratamiento computarizado en un ordenador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) usando coordinadas TC de las imágenes de la barra de grafito para cartografiar las posiciones entre el espacio TC y el espacio BRW.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son efectivos en el tratamiento del trastorno o afección que necesita el tratamiento (por ejemplo, profilácticos o terapéuticos).
X. DIAGNÓSTICO
La descripción proporciona además un procedimiento diagnóstico útil durante el diagnóstico de trastornos o lesiones neuronales, que implica la medida del nivel de expresión de la proteína o transcripción Sp35 en tejido u otras células
o fluidos corporales de un individuo y la comparación del nivel de expresión medido con niveles de expresión de Sp35 estándar en tejido o fluido corporal normal, con lo que un aumento en el nivel de expresión en comparación con el estándar es indicativo de un trastorno.
Los anticuerpos específicos Sp35 pueden usarse para someter a ensayo los niveles de proteínas en una muestra biológica usando procedimientos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, véase Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión de proteínas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación o Western blot. Los ensayos adecuados se describen en mayor detalle en otra parte en el presente documento.
Por "ensayo del nivel de expresión de polipéptido Sp35" se entiende la medida o estimación cualitativa o cuantitativa del nivel de polipéptido Sp35 en una primera muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel absoluto de proteínas) o relativamente (por ejemplo, comparando con el nivel de polipéptidos asociado al cáncer en una segunda muestra biológica). Preferentemente, se mide o estima el nivel de expresión del polipéptido Sp35 en la primera muestra biológica y se compara con un nivel de polipéptido Sp35 estándar, tomándose el estándar de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o determinándose mediante promediado de los niveles a partir de una población de individuos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel “estándar” del polipéptido Sp35, puede usarse repetidamente como estándar de comparación.
Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo tisular u otra fuente de células que expresan potencialmente Sp35. Los procedimientos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos son bien conocidas en la técnica.
Los anticuerpos Sp35 para el uso en los procedimientos diagnósticos descritos anteriormente incluyen cualquier anticuerpo Sp35 que se une específicamente a un producto génico Sp35, tal como se describe en otra parte en el presente documento.
XI. INMUNOENSAYOS
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden someterse a ensayo sobre unión inmunoespecífica por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Entre los inmunoensayos que pueden usarse se incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como Western blot, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, entre otros. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Vol. 1 (1994)). A continuación, se describen brevemente inmunoensayos de ejemplo (pero no se pretende que sean limitantes).
Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente el lisado de una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, SDS al 0,1 %, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,2, Trasylol al 1 %) suplementado con proteína fosfatasa y/o inhibidores de proteasa (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), la adición del anticuerpo de interés al lisado celular, la incubación durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4 °C, la adición de perlas de sefarosa de proteína A y/o proteína G al lisado celular, la incubación durante aproximadamente una hora o más a 4 °C, el lavado de las perlas en tampón de lisis y la resuspensión de las perlas en SDS/tampón de muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para la inmunoprecipitación de un antígeno en particular puede evaluarse, por ejemplo, por análisis por Western blot. Un experto en la materia conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y reducir el sustrato (por ejemplo, aclarado previo del lisado celular con perlas de sefarosa). Para un estudio adicional sobre los protocolos de inmunoprecipitación véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Vol. 1 (1994) en 10.16.1.
El análisis por Western comprende generalmente la preparación de muestras de proteínas, la electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE al 8 %-20 % dependiendo del peso molecular del antígeno), la transferencia de la muestra de proteínas desde el gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, el bloqueo de la membrana en solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA al 3 % o leche desnatada), el lavado de la membrana en tampón de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), el bloqueo de la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en tampón de bloqueo, el lavado de la membrana en tampón de lavado, el bloqueo de la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo antihumano) conjugado con un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o molécula radiactiva (por ejemplo, 32p o 1251) diluido en tampón de bloqueo, el lavado de la membrana en tampón de lavado y la detección de la presencia del antígeno. Un experto en la materia conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para una exposición más detallada sobre los protocolos de Western véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York Vol. 1 (1994) en 10.8.1.
Los procedimientos ELISA comprenden la preparación del antígeno, el recubrimiento del pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, la adición del anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo y la incubación durante un periodo de tiempo, y la detección de la presencia del antígeno. En los procedimientos ELISA el anticuerpo de interés no tiene que conjugarse con un compuesto detectable; en su lugar, puede añadirse al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable. Además, en lugar de recubrir el pocillo con el antígeno, el anticuerpo puede recubrirse en el pocillo. En este caso, puede añadirse un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable después de la adición del antígeno de interés al pocillo recubierto. Un experto en la materia conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada, así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica. Para una exposición más en detalle en relación con las técnicas ELISA véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, Vol. 1 (1994) en 11.2.1.
La afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno y la tasa de reacción de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno pueden determinarse por ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo de interés por un antígeno en particular y las tasas de reacción de disociación de unión pueden determinarse a partir de los datos por análisis de representación de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo puede determinarse también usando radioinmunoensayos. En este caso, el antígeno incubado con el anticuerpo de interés se conjuga con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no marcado.
Los anticuerpos Sp35, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la descripción pueden emplearse además histológicamente, por ejemplo, en inmunofluorescencia, microscopia de inmunoelectrones o ensayos no inmunológicos, para la detección in situ de productos génicos de antígenos del cáncer o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos. La detección in situ puede conseguirse extrayendo una muestra histológica de un paciente, y aplicándole al mismo un anticuerpo Sp35 marcado, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, aplicado preferentemente por superposición del anticuerpo (o fragmento) marcado en una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de proteína Sp35, o variantes conservadas o fragmentos peptídicos, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente descripción, los expertos en la materia percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia variedad de procedimientos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para conseguir dicha detección in situ.
Los inmunoensayos y no inmunoensayos para productos génicos Sp35 o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos comprenderán normalmente la incubación de una muestra, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recogidas o lisados de células que se han incubado en cultivo celular, en presencia de un anticuerpo marcado de forma detectable capaz de unión a Sp35 o variantes conservadas o fragmentos peptídicos del mismo, y la detección del anticuerpo ligado por cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la técnica.
La muestra biológica puede ponerse en contacto e inmovilizarse en un soporte o vehículo de fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte puede lavarse a continuación con tampones adecuados por tratamiento con el anticuerpo Sp35 marcado de forma detectable, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo. A continuación, el soporte de fase sólida puede lavarse con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo no ligado. Opcionalmente el anticuerpo es marcado posteriormente. La cantidad de etiqueta unida en el soporte sólido puede detectarse a continuación por medios convencionales.
Por "soporte o vehículo de fase sólida" se entiende cualquier soporte capaz de unirse a un antígeno o un anticuerpo. Entre los soportes o vehículos bien conocidos se incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los fines de la presente descripción. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible en la medida en que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Así, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una perla,
o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una lámina, una tira de prueba, etc. Los soportes preferentes incluyen perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conocerán otros muchos vehículos adecuados para unión a anticuerpo o antígeno, o serán capaces de elucidar los mismos mediante el uso de experimentación rutinaria.
La actividad de unión de un lote dado de anticuerpo Sp35, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede determinarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los expertos en la materia serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.
Existen diversos procedimientos disponibles para medir la afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno, aunque relativamente pocos para determinar las constantes de velocidad. La mayoría de los procedimientos se basan en el marcado de anticuerpo o antígeno, lo que complica inevitablemente las medidas de rutina e introduce incertidumbres en las cantidades medidas.
La resonancia por plasmones de superficie (SPR) tal como se realiza en BIAcore ofrece diversas ventajas sobre los procedimientos convencionales de medición de la afinidad de las interacciones anticuerpo-antígeno: (i) no se requiere marcar el anticuerpo o antígeno; (ii) no es preciso purificar los anticuerpos con antelación, el sobrenadante de cultivo celular puede usarse directamente; (iii) se permiten medidas en tiempo real, que permiten una rápida comparación semicuantitativa de diferentes interacciones de anticuerpos monoclonales, y son suficientes para muchos fines de evaluación; (iv) puede regenerarse la superficie bioespecífica de manera que pueda compararse fácilmente una serie de diferentes anticuerpos monoclonales en condiciones idénticas; (v) los procedimientos analíticos están totalmente automatizados y pueden realizarse series extensas de medidas sin intervención del usuario. BIAapplications Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), nº código BIACORE BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), nº código BIACORE BR-1001-84.
Los estudios de unión basados en SPR requieren que un miembro de un par de unión se inmovilice en la superficie de un sensor. La pareja de la unión inmovilizada se refiere como el ligando. La pareja de la unión en solución se refiere como el analito. En algunos casos, el ligando se une indirectamente a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada, que se refiere como la molécula de captura. La respuesta de SPR refleja el cambio en la concentración de masa en la superficie del detector cuando los analitos se unen o se disocian.
Basándose en SPR, las medidas de BIAcore en tiempo real monitorizan las interacciones directamente cuando suceden. La técnica está bien adaptada para la determinación de parámetros cinéticos. La clasificación de la afinidad comparativa es extremadamente sencilla de realizar, y tanto las constantes cinéticas como de afinidad pueden obtenerse de datos del sensorgrama.
Cuando se inyecta analito en un pulso discreto a lo largo de una superficie de ligando, el sensorgrama resultante puede dividirse en tres fases esenciales: (i) asociación de analito con ligando durante la inyección de la muestra; (ii) estado de equilibrio o estacionario durante la inyección de muestra, donde la tasa de unión a analito se compensa con la disociación desde el complejo; (iii) disociación de analito desde la superficie durante el flujo de tampón.
Las fases de asociación y disociación proporcionan información sobre la cinética de la interacción analito-ligando (ka y kd, las tasas de formación y disociación de complejo, kd/ka = KD). La fase de equilibrio proporciona información sobre la afinidad de la interacción analito-ligando (KD).
El software BIAevaluation proporciona instalaciones extensas para el ajuste de la curva usando algoritmos de ajuste de integración y globales. Con un análisis adecuado de los datos, pueden obtenerse tasa y las constantes de afinidad separadas para la interacción a partir de investigaciones con BIAcore sencillas. El intervalo de afinidades mensurable por esta técnica es muy amplio y está comprendido entre mM y pM.
La especificidad de epítopos es una característica importante de un anticuerpo monoclonal. La cartografía de epítopos con BIAcore, a diferencia de las técnicas convencionales que usan radioinmunoensayo, ELISA u otros procedimientos de adsorción superficial, no requiere marcado o anticuerpos purificados, y permite pruebas de especificidad multisitio que usan una secuencia de varios anticuerpos monoclonales. Además, pueden procesarse grandes números de análisis automáticamente.
Los experimentos de unión por pares prueban la capacidad de dos AMc para unirse simultáneamente al mismo antígeno. Los AMc dirigidos contra epítopos separados se unirán de forma independiente, mientras que los AMc dirigidos contra epítopos idénticos o estrechamente relacionados interferirán con la unión de cada uno de los otros. Estos experimentos de unión con BIAcore son sencillos de realizar.
Por ejemplo, se puede usar una molécula de captura para unirse al primer AMc, seguido por la adición de antígeno y el segundo AMc secuencialmente. Los sensorgramas revelarán: 1. cuánto antígeno se une al primer AMc, 2. en qué medida el segundo AMc se une al antígeno unido a la superficie, 3. si el segundo AMc no se une, si al invertir el orden de la prueba por pares se alteran los resultados.
La inhibición de péptidos es otra técnica usada para cartografía de epítopos. Este procedimiento puede complementar los estudios de unión a anticuerpos por pares, y puede relacionar los epítopos funcionales con las características estructurales cuando se conoce la secuencia primaria del antígeno. Los péptidos o fragmentos de antígenos se someten a prueba en lo relativo a la inhibición de la unión de diferentes AMc a antígeno inmovilizado. Se supone que los péptidos que interfieren con la unión de un AMc dado están relacionados estructuralmente con el epítopo definido por ese AMc.
La práctica de la presente descripción empleará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican de forma completa en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1992), ADN Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.
J. Gait ed., (1984); Mullis et al. patente de EE. UU. nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells,
R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., N.S.; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer y Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir y
C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.S., (1986); y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
Los principios generales de diseño de anticuerpos se exponen en Antibody Engineering, 2ª edición, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995). Los principios generales del diseño de proteínas se exponen en Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). Los principios generales de anticuerpos y unión de anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2ª ed., Sinauer Asociates, Sunderland, MA (1984); y Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman y Hall, Nueva York, NY (1984). Además, los procedimientos estándar en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente se siguen generalmente como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al. (eds), Basic and Clinical -Immunology (8ª ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman y Co., Nueva York (1980).
Entre los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de la inmunología se incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination,, John Wiley & Sons, Nueva York (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Nueva York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" en Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4ª ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt y Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. y Male D., Immunology 6ª ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. y Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann y Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlag (2001); Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Sp35 está implicado en la biología de los oligodendrocitos
Los oligodendrocitos maduran a través de varias fases de desarrollo desde células progenitoras A2B5 (que expresan A2B5), diferenciación en oligodendrocitos premielinizantes (que expresan O1 y O4) y finalmente en oligodendrocitos mielinizantes maduros (que expresan O1, O4 y MBP). Así, vigilando la presencia y la ausencia de los marcadores A2B5, O1, O4 y MBP es posible determinarla fase de desarrollo de una célula dada y evaluar el papel de Sp35-Fc en la biología de los oligodendrocitos. Para una revisión general de la biología de los oligodendrocitos, véase, por ejemplo, Baumann y Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: 871-927 (2001).
Los anticuerpos monoclonales contra O4, MBP y CNPasa se obtuvieron de Sternberger Monoclonals; el anticuerpo para APC (clon CC-1; ref. 29) se obtuvo de Calbiochem. Otros anticuerpos fueron para tubulina βIII (Covance), Sp35 (Biogen Idec), Fyn (Santa Cruz Biotechnology) y fosfo-Fyn (Biosource). Los anticuerpos monoclonales contra A2B5 están disponibles en Chemicon.
Sp35 se expresa en oligodendrocitos
Se analizó la expresión de Sp35 en cultivos de neuronas P13 CG, oligodendrocitos P2 y astrocitos P4 de rata por reacción en cadena de la polimerasa después de transcripción inversa (RT-PCR). Se usó un kit de Ambion, Inc. Para extraer ARNm de las células de encéfalo de rata de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo RT-PCR semicuantitativa usando cebador directo 5' AGAGACATGCGATTGGTGA 3' (SEQ ID NO: 344) y cebador inverso 5' AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3' (SEQ ID NO: 345) para mostrar alta expresión en neuronas, baja expresión en oligodendrocitos y ausencia de expresión en astrocitos.
La expresión de Sp35 en oligodendrocitos se confirmó por hibridación in situ en secciones obtenidas del nervio óptico de rata adulta. Las secciones de nervio óptico de rata se prepararon y procesaron tal como se describe en Mi et al., "Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex”, Nat. Neurosci. 7: 221-28 (2004) y se sondearon con ARN de sentido directo o antisentido Sp35 marcado con digoxigenina usando los 500 primeros nucleótidos de la secuencia codificante de Sp35. Se tiñeron las secciones de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes usando un kit Tyramide Signal Amplification kit (Amersham Biosciences) y un kit de anticuerpo conjugado anti-digoxigenina fluorescente (Perkin Elmer). Para análisis in situ y de inmunofluorescencia combinados, primero se sondearon las secciones con ARN marcados con digoxigenina y a continuación con anticuerpos, por ejemplo, anticuerpo CC1 (Calbiochem; un marcador de oligodendrocitos maduros) o anticuerpo anti-Sp35. Los autores de la invención observaron que los oligodendrocitos que hibridaron con una sonda Sp35 antisentido también se tiñeron conjuntamente con un anticuerpo para CC1 (datos no mostrados). No se observó marcado específico usando una sonda Sp35 de sentido directo. La expresión de Sp35 en los oligodendrocitos se confirmó por estudios de inmunohistoquímica de secciones de tejido de la región del ventrículo lateral de la corteza de rata P7. Una mayoría de las células corticales que se marcaron con anticuerpo CC1 también se marcaron con Sp35 anti-anticuerpo. Datos no mostrados. La especificidad de la interacción se confirmó por preadsorción del anticuerpo anti-Sp35 con Sp35-Fc (véase Ejemplo 2), que eliminó la señal.
La inactivación de ARNi específica de Sp35 de la expresión de Sp35 promueve crecimiento y diferenciación de oligodendrocitos
Se usó ARNi específico de Sp35 para la ablación de la expresión de Sp35 en células precursoras de oligodendrocitos para examinar el modo en que Sp35 contribuye al crecimiento y diferenciación de oligodendrocitos. Se infectaron 50.000 células precursoras de oligodendrocitos A2B5 con lentivirus que transportaban secuencia de ARNi específica de Sp35 o ARNi de control preparados del modo siguiente.
Se compararon secuencias de ADN de Sp35 murinas y de rata para encontrar regiones homólogas para el uso de ARN de horquillas pequeñas (shRNA) candidatos. Se construyó CH324, para expresión por lentivirus de ARNi de Sp35 por hibridación de oligonucleótidos LV1-035 y LV1-036 y ligado a HpaI y XhoI digerido pLL3.7. El vector pLL3.7, la metodología adicional y la producción de virus fueron tal como se describe en Rubinson et al., Nat. Genet. 33, 401-06 (2003). Los oligonucleótidos ARNi de Sp35 se adquirieron en MWG y tienen las siguientes secuencias: LV1-035 (oligo de sentido directo) 5' - TGA TCG TCA TCC TGC TAG ACT TCA AGA GAG TCT AGC AGG ATG ACG ATC TTT TTT C - 3' (SEQ ID NO: 346) y LV1-036 (oligo antisentido) 5' - TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTC TAG CAG GAT GAC GAT CA - 3' (SEQ ID NO: 347).
Se diseñó ARNi de control con las mismas secuencias de oligonucleótidos con la salvedad de los cambios en los nucleótidos indicados en letras minúsculas: 5'-TGA TCc TCA TcC ttC Tat ACT TCA AGA GAG TgT AGC AGG ATG AcG ATC TTT TTT CTC GA-3' (SEQ ID NO: 348) y 5'-TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTa TAG aAG GAT GAC GAT CA-3'. (SEQ ID NO: 349).
Antes de producir el lentivirus, se cotransfectó ADN de pLL3.7 o shRNA candidato en pLL3.7 con plásmido marcado con Sp35-HA murino en una proporción de 5 a 1 en células CHO en un formato de 6 pocillos. La inactivación se analizó mediante detección por Western blot de la marca Sp35-HA a partir de lisados celulares CHO transfectados así como por Northern blot del ARN total preparado a partir de pocillos duplicados. Se sondeó el blot con un fragmento de ADNc de Sp35. Los ensayos se realizaron 48 horas después de la transfección. Como se esperaba, se produjo una reducción de 10 veces del ARNm de Sp35 en células CHO tratadas con ARNi de CH324 en relación con células tratadas con control. Datos no mostrados. Se generaron lentivirus de ARNi que transportan proteína fluorescente verde (GFP) tal como se describe en Rubinson et al. En cultivos tratados con control o con ARNi de Sp35, aproximadamente el 80 % de los oligodendrocitos fueron positivos para GFP. El número total de células no se vio alterado por los tratamientos con ARNi. Para cuantificar los efectos de ARNi en la diferenciación, solo se contaron los oligodendrocitos que expresan GFP.
Se cultivaron poblaciones de oligodendrocitos enriquecidas a partir de ratas Long Evans P2 hembra tal como se describe en Conn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (Academic Press; 1990) con las siguientes modificaciones. Brevemente, se diseccionó el prosencéfalo y se colocó en solución salina con tampón de Hank (HBSS; Invitrogen). Se cortó el tejido en fragmentos de 1 mm y se incubó a 37 °C durante 15 min en tripsina al 0,01 % y 10 µg/ml de ADNasa. Se sembraron las células disociadas en matraces de cultivo tisular T75 recubiertos con poli-L-lisina y se cultivaron a 37 °C durante 10 d en medio DMEM con suero de ternera fetal al 20 % (Invitrogen). Los precursores de oligodendrocitos (A2B5+) se recogieron por agitación del matraz durante toda la noche a 200 rpm a 37 °C, para producir una población pura al 95 %. Se mantuvieron los cultivos en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) rico en glucosa con FGF/PDGF (10 ng/ml; Peprotech) durante 1 semana. La eliminación de FGF/PDGF permitió que las células A2B5+ se diferenciaran en oligodendrocitos premielinizantes O4+ después de 3-7 d, y para diferenciarse en oligodendrocitos maduros O4+ y MBP+ después de 7-10 d. Estos estados de diferenciación son fácilmente visibles a partir de cambios en la morfología: las células A2B5+ tienen forma bipolar, los oligodendrocitos premielinizantes O4+ tienen prolongaciones más largas y ramificadas y los oligodendrocitos MBP+ maduros contienen estructuras de láminas de mielina entre las prolongaciones.
Las células precursoras de oligodendrocitos A2B5 se infectaron con el lentivirus que contenía el ARNi de CH324. Se cultivaron las células resultantes durante 3 días y se contó el número de oligodendrocitos positivos para O4 (un marcador para diferenciación de oligodendrocitos). Se redujo la expresión de Sp35 endógena por infección con lentivirus de ARNi de Sp35 y se confirmó por RT-PCR. La reducción de Sp35 produjo oligodendrocitos maduros más diferenciados que las células infectadas con control, como resulta evidente por los aumentos en la longitud de las prolongaciones celulares y por la presencia de abundantes estructuras de láminas de mielina (datos no mostrados). En células que expresaban ARNi de Sp35, había oligodendrocitos tres veces más maduros (positivos a O4) que en los cultivos de control. Estos datos indican que Sp35 puede regular negativamente la diferenciación de oligodendrocitos.
El Sp35 negativo dominante promueve el crecimiento y diferenciación de oligodendrocitos
Se construyeron vectores de lentivirus que expresan una forma presente en la naturaleza y una forma negativa dominante de Sp35. Se amplificó por PCR la secuencia de ADN que codifica Sp35 de ratón de longitud completa (FL-Sp35, residuo de aminoácidos 34-614 de SEQ ID NO: 2) usando cebadores 5' - GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG - 3' (SEQ ID NO: 350) y 5' - GGG GCG GAA TTG GAT CCT CAC AGA TCC TCT TCT GAG ATG AG-3' (SEQ ID NO: 351) y se insertó en el vector de lentivirus HRST-IRESeGFP en los sitios NotI y BamHI. De forma similar, la secuencia de ADN que codifica Sp35 negativo dominante (DN-Sp35, residuo de aminoácidos 34-581 de SEQ ID NO: 2) se amplificó por PCR usando cebadores 5' - GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG - 3' (SEQ ID NO: 352) y 5' - GAT ACG GAT CCT CAG CCT TTG CCC CGG CTC CAT AGA AAC AGC -3' (SEQ ID NO: 353). Los plásmidos FL-Sp35 y DN-Sp35 se transfectaron en células 293 para producir lentivirus tal como se describe por Rubinson et al., "A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mouses by ARN interference”, Nat. Genet. 33: 401-06 (2003). Los oligodendrocitos se infectaron con lentivirus a 2 MOI por célula y confirmaron la de FL-Sp35 y DN-Sp35 por Western blot.
DN-Sp35 promovió la diferenciación de oligodendrocitos, que produjo un aumento en el número de oligodendrocitos maduros. En cambio, la hiperexpresión de Sp35 de longitud completa (FL-Sp35) tuvo el efecto contrario e inhibió la diferenciación, como resultó evidente por una reducción en el número de oligodendrocitos maduros en comparación con el control (datos no mostrados).
EJEMPLO 2
Construcción y purificación de proteína de fusión Sp35-Fc
Se preparó una construcción que fusionaba la parte extracelular de Sp35 humano (residuos 1-532) con la región bisagra y Fc de IgG1 humano para estudiar la función biológica de Sp35. Se obtuvo una secuencia codificante parcial para Sp35 humano por PCR a partir del clon 227.2 usando el cebador directo 5' - CAG CAG GTC GAC GCG GCC GCA TGC TGG CGG GGG GCG T - 3' (SEQ ID NO: 354) y el cebador inverso 5' - CAG CAG GTC GAC CTC GCC CGG CTG GTT GGC CAA CCA GCC GGG CGA GGT CGA CCT CGA GG - 3' (SEQ ID NO: 355).
Se subclonó el producto PCR de extremos romos en el sitio SrfI del vector PCR SCRIPT AMP (Stratagene) para crear PCR SCRIPT AMP-Sp35. Se aisló un fragmento SalI a partir de PCR SCRIPT AMP-Sp35 y se subclonó en el vector de Ig PCRCAMP (derivado de vector PCR SCRIPT AMP de Stratagene). En el vector de Ig PCRCAMP, se subclona la secuencia gamma Fc y bisagra como un fragmento SalI(5') a NotI(3'). Se subclonó el fragmento Sp35 SalI en el sitio SalI del vector de Ig PCRCAMP fusionando así la secuencia señal Sp35 y el dominio extracelular (codones 1-532) en marco con las secuencias que codifican la región bisagra y Fc de Ig1 humana. Se identificaron los aislados correctos, y se subclonó un fragmento NotI que comprendía el fragmento Fc Sp35 en el sitio de clonación NotI individual del vector de expresión de CHO, PV90 (Biogen Idec). El plásmido resultante se confirmó por secuenciación de ADN y se denominó GT123.
Se generaron líneas celulares estables en la proteína de fusión Sp35-Fc por electroporación de células hospedadoras CHO DG44 con plásmido GT123. Se cultivaron las células CHO transfectadas en MEM alfa menos en presencia de suero dializado al 10 % y glutamina 4 mM para seleccionar crecimiento independiente de nucleósidos. Catorce días después de la transfección, se suministró a las células medio nuevo. Para cribar las células que expresan Sp35-Fc, se marcaron células CHO con IgG antihumana de cabra marcada con ficoeritrina (PE) (Jackson Labs) y se sometieron a citometría de flujo de alta velocidad que las clasificó en FACS Mo-Flo (Cytomation). Se seleccionaron las células que expresaban los niveles más altos de Sp35-Fc. Estas células se expandieron en cultivo durante 7 días, a continuación, se remarcaron y se reclasificaron. Se aislaron las células que expresan los niveles más altos de Sp35-Fc como clones individuales en placas de 96 pocillos. Estos clones se cultivaron durante dos semanas y, a continuación, se les suministró medio nuevo un día antes del análisis FACS para verificar los niveles de expresión. Se expandieron los clones que expresaban los niveles más altos de Sp35-Fc, y se establecieron bancos de células congeladas. Las líneas celulares se adaptaron para crecimiento en cultivo en suspensión en el medio libre de suero BCM16. Se determinó la valoración de Sp35-Fc producido por estos clones cultivando líneas celulares a 37 °C durante 4-5 pasos, y, a continuación, se cultivaron las células a una densidad celular máxima del 50 % y se cultivaron durante 10-15 días a 28 °C hasta que la densidad celular viable disminuyó al 75 %. En este momento, se recogió el medio de cultivo, se limpió de células y residuos por centrifugación y se valoraron los sobrenadantes de cultivo en cuanto a los niveles de Sp35-Fc por análisis por Western blot usando un anticuerpo Ig antihumano (Jackson Lab) como sonda.
La proteína de fusión Sp35-Fc se purificó a partir del medio de cultivo aclarado del modo siguiente: se añadieron 9 ml de HEPES 1 M pH 7,5 a 900 ml de medio acondicionado. Se cargó el medio en lotes durante 3 h a 4 °C en 3 ml de Proteína A Sefarosa (Amersham Bioscience). Se recogió la resina en una columna de 1,5 cm (D.I.), y se lavó cuatro veces con 3 ml de PBS, dos veces con 4 ml de PBS que contenía NaCl 800 mM y después de nuevo con 3 ml de PBS. Sp35-Fc se eluyó de la columna con NaH2PO4 25 mM, pH 2.8 y NaCl 100 mM en fracciones de 1,5 ml y se neutralizó añadiendo 75 µl de NaH2PO4 0,5 M, pH 8,6. Se identificaron fracciones que contenían proteínas máximas por absorbancia a 280 nm, se guardaron en reserva y se sometieron a mayor purificación en una columna de Proteína A de 1 mL. Antes de la carga, se añadió NaCl a 600 mM y HEPES, pH 7,5 a 50 mM. Se lavó la columna dos veces con 600 µl de HEPES 10 mM pH 7,5 y NaCl 1 M, y, a continuación, con PBS 1 ml. Se eluyó Sp35-Fc a partir de la columna con NaH2PO4 25 mM, pH 2.8 y NaCl 100 mM, recogiendo fracciones de 0,5 mL, y se neutralizó añadiendo 25 µl de NaH2PO4 0,5 M, pH 8,6. Se identificaron fracciones que contenían proteínas máximas por absorbancia a 280 nm y se guardaron en reserva. Al reducir SDS-PAGE, la proteína Sp35-Fc migró como una única banda (>95 % de pureza) con una masa aparente de 90 kDa. En condiciones de no reducción, la proteína actuó como un dímero con una masa aproximada de 180 kDa. Se repartió la proteína Sp35-Fc purificada en partes alícuotas y se almacenó a -70°C.
EJEMPLO 3 Producción de anticuerpos monoclonales específicos de Sp35
Se prepararon anticuerpos anti-Sp35 que se unen específicamente a un polipéptido Sp35 de la descripción usando los siguientes métodos y procedimientos.
A. Ensayos de cribado de anticuerpos
1.
Ensayo ELISA
Se añadió Sp35-Fc (0,5 µg en 50 µl de tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 9,0) a cada pocillo de placas de MaxiSorp™ de 96 pocillos (Nunc™). A continuación, se incubaron las placas a 37 °C durante 1 hora o 4 °C durante 16 horas. Se bloquearon los sitios de unión no específicos en las placas usando HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía BSA al 0,1 %, ovoalbúmina al 0,1 %, leche seca desnatada al 0,1 % (5 % (p/v) en NACE 150 mM) y azida al 0,001 %. Se añadieron diluciones de sobrenadantes de hibridoma o suero (por ejemplo, diluciones en serie tres veces) en cada hilera de la placa, y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS, se añadieron 50 µl de una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario antirratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson InmunoResearch Inc.) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora más. Después de tres lavados, se desarrolló el color por TMB (Pierce) y se interrumpió con ácido sulfúrico 2 M. Se vigiló la intensidad del color en un espectrofotómetro a 450 nm.
2.
Ensayo FACS
Se marcaron células COS-7 o células CHO con CellTracker™ Green CMFDA 0,1 µM (Molecular Probes, Eugene, OR) tal como describe el vendedor. Se mezclaron volúmenes iguales de células de control marcadas CellTracker™ con células Sp35-COS-7 o células Sp35-CHO lavadas (producidas por transfección temporal de vector de expresión de Sp35) antes de la incubación con sueros de prueba anti-Sp35 o sobrenadantes de hibridoma. Se dispensaron 50 ml de la mezcla celular en cada pocillo de placas de poliestireno de base en V de 96 pocillos (Costar® 3877, Corning, NY) y se añadieron 100 µl de suero de ratón, sobrenadante de hibridoma o un anticuerpo anti-Sp35 de control. Después de incubación a 4 °C durante 30 minutos, se lavaron las células y se incubaron con 50 µl de segundo anticuerpo específico de IgG Fc gamma antirratón de cabra de fragmento F(ab')2 de afinidad pura conjugado con ficoeritrina (1:200, Jackson InmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) en PBS. Al final de la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS y se suspendieron en 200 µl de PBS que contenía suero bovino fetal (FBS) al 1 %, y se sometieron a análisis FACS. Alternativamente, las células Sp35-COS-7 o las células Sp35-CHO se mezclaron con suero de ratón o sobrenadante de hibridoma y a continuación se trataron con anticuerpo secundario antirratón de cabra conjugado con R-ficoeritrina y se sometieron directamente a análisis FACS estándar.
B. Producción de hibridoma de anticuerpos monoclonales anti-Sp35 murinos
Se inmunizó por vía peritoneal a ratones RBF hembra de ocho semanas (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) con una emulsión que contenía 50 µg de Sp35-Fc (aminoácidos 34 a 532 de SEQ ID NO: 2 fusionada con la región bisagra y Fc de IgG1 humana), producidos tal como se describe en el Ejemplo 2 o se inmunizó por vía intraperitoneal con una emulsión que contenía 50 µg de Sp35 humano-Fc, y 50 µl de adyuvante de Freund completo (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) una vez cada dos semanas. Se recogieron sueros de los ratones inmunizados antes de la primera inmunización y 1 semana después de las inmunizaciones segunda y tercera, y se midieron valoraciones de anticuerpo anti-Sp35 por ensayo FACS en células COS-7 de expresión Sp35 tal como se describe anteriormente. Se administró una dosis final de recuerdo después de la tercera inmunización y tres días antes cuando se iniciaron fusiones de hibridoma.
Se sometieron a cribado mediante ELISA los sueros de ratones inmunizados con los diversos péptidos Sp35 tal como se describe anteriormente. Los ratones con resultado positivo de anticuerpos que se unieron específicamente a células COS-7 que expresan Sp35 se identificaron por citometría de flujo (FACS) tal como se describe anteriormente, y se sacrificaron. Se aislaron esplenocitos de los ratones y se fusionaron con el mieloma FL653 (un derivado de APRT de un mieloma de ratón Ig-/HGPRT-Balb/c, mantenido en DMEM que contenía FBS al 10 %,
4.500 mg/L de glucosa, L-glutamina 4 mM y 20 mg/ml de 8-azaguanina) tal como se describe en Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett, R.H., McKearn, T.J. y Bechtol, K.B. Nueva York: Plenum Press (1982). Se sembraron las células fusionadas en polacas de 24 o 48 pocillos (Corning Glass Works, Corning, NY), y se suministró adenina, aminopterina y timidina (AAT, disponible en Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) que contenía medio de cultivo. Se sometieron a cribado cultivos resistentes a AAT por ELISA o citometría de flujo tal como se describe anteriormente en cuanto a su unión con células COS-7 Sp35 o con Sp35-Fc. Se subclonaron adicionalmente los hibridomas positivos por dilución limitante.
Se aislaron 17 líneas celulares de hibridoma que producían anticuerpos monoclonales producidos a partir de ratones inmunizados con Sp35-Fc. Las propiedades de los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma se muestran en las tablas 3A y 3B.
Se aislaron por PCR polinucleótidos que codifican los dominios variables (VH y VL) de los anticuerpos monoclonales 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3 y 3P1E11.3B7 PCR, se clonaron y se sometieron a análisis de secuencias mediante el siguiente procedimiento. Se extrajo ARN total de células de hibridoma usando el mini kit Qiagen® RNeasy® y se generó ADNc a partir del ARN aislado por RT PCR, usando condiciones estándar. Para la RT-PCR se usó un cóctel de cebadores. Un conjunto preferente de cebadores incluyó un cebador con el 5' del cebador que se hibrida con la secuencia señal y el extremo 3' del cebador se hibrida con el dominio constante 3' de la unión de FR4/dominio constante. Esto permite la amplificación de un dominio variable intacto sin ambigüedades en torno al extremo N del anticuerpo monoclonal y la unión V/C. Un experto en la materia reconocerá que es preciso modificar los conjuntos de cebadores para amplificar diferentes plantillas y para diferentes condiciones de PCR. En ocasiones, la presencia de mensajes no productivos muy abundantes (por ejemplo, la cadena ligera no productiva con desplazamiento de marco CDR3-FR4 de la pareja de fusión) o mensajes productivos no específicos puede producirse y complicar la clonación de cadenas variables. Una solución consiste en usar datos de secuencias de extremo N a partir del anticuerpo purificado auténtico para diseñar un cebador degenerado y permitir la clonación. Alternativamente, se pueden usar cebadores de "marco universal", tales como los descritos en Orlandi et al., PNAS 86:3833 (1989), que "fijan" los extremos N y C de los dominios variables (es decir, el extremo N de FR1 y el extremo C de FR4 están determinados por el cebador).
Además, los datos de secuencias, para diseñar cebadores más efectivos, pueden obtenerse de los productos RT-PCR en volumen que han sido purificados por gel y, a continuación, secuenciados. El producto PCR también puede subclonarse usando, por ejemplo, TOPO Cloning Kit (Invitrogen) y después secuencia. A continuación, se obtienen los datos de secuencia a partir de múltiples subclones independientes o fragmentos purificados por gel para establecer firmemente la secuencia de consenso.
La secuencia de la cadena ligera del P1E11.3B7 se determinó usando un cóctel de cebadores de la secuencia señal de cadena ligera kappa murina en 5’: (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO: 356), (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID NO: 357), (iii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G 3' (SEQ ID NO: 358) y (iv) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYT YCT KGG A 3' (SEQ ID NO: 359), con un único cebador de dominio constante kappa murino en 3': 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 4), donde K=G/T, R=A/G, W=A/T y S=C/T. Se subclonó el producto de PCR resultante y se secuenciaron múltiples subclones independientes. La secuencia de consenso deducida estaba de acuerdo con los datos de secuenciación de degradación de Edman. La secuenciación indicó que el cebador en 5’ de la secuencia señal degenerada 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID NO: 357) fue el que había producido el dominio variable de cadena ligera 3P1E11.3B7 durante la amplificación.
La secuencia de cadena pesada 3P1E11.3B7 se determinó usando un cóctel de cebadores PCR de 5’ de la secuencia señal de cadena pesada murina: (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 3', (SEQ ID NO: 360) (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA CTT CGG GYT GAG CTK GGT TTT 3' (SEQ ID NO: 361), y (iii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT 3' (SEQ ID NO: 362), con un cebador 3’ de dominio constante de IgG CH1 murino degenerado 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 363), donde K=G/T, M= A/C, R=A/G, y S=C/T. PCR usando este cóctel de cebadores, con diversas condiciones de ciclado diferentes, no logró producir una secuencia de dominio variable de cadena pesada en la que el extremo N deducido estuviera de acuerdo con el determinado por la secuencia de degradación de Edman del anticuerpo 3P1E11.3B7 purificado. Los autores de la invención usaron por tanto los cebadores universales de cadena pesada: FR1 5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (SEQ ID NO: 364) y FR4 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3' (SEQ ID NO: 365), donde M= A/C, R=A/G, S=C/G, y W=A/T. Este conjunto produjo un dominio variable de cadena pesada murino cuya secuencia deducida estuvo de acuerdo con los datos de 3P1E11.3B7 empíricos.
Con el fin de verificar que los extremos N y C del dominio variable de cadena pesada eran auténticos y no estaban determinados por el cebador, se realizó otra reacción de PCR con un cebador de secuencia señal degenerado 5' ATG GAR TGY AAY TGG ATH CTN CCN TTY A 3' (SEQ ID NO: 366) y el cebador 3’ de dominio constante mencionado anteriormente 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 367), donde H=A/C/T, N=A/C/G/T, R=A/G, y S=C/T. El diseño del cebador de secuencia señal degenerado se basó en secuencias señal de los mejores aciertos derivados de una búsqueda TFASTA de la base de datos de secuencias de roedores Genbank consultada con la secuencia de consenso deducida FR1 de 3P1E11.3B7 de la reacción de PCR con el "cebador universal" descrito anteriormente. Esta PCR produjo un producto con un dominio variable de cadena pesada murino completo.
Los dominios variables murinos 3P1E11.3B7 completos se usaron (con mutagénesis silente según lo necesario para introducir sitios de restricción) en conjunción con ADNc de dominio constante IgG1 y kappa humanos para construir ADNc quiméricos de cadena pesada y ligera, respectivamente. Los ADNc de inmunoglobulina de longitud completa se subclonaron en un vector de expresión denominado pNE001, un derivado del vector de expresión episomal de células de mamífero de VEB comercial pCEP4. Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera (denominados pXW372 y pXW363, respectivamente) se cotransfectaron en células 293-EBNA. Los análisis por Western blot (sondeados con reactivos específicos de IgG humana) de medio acondicionado de células transfectadas de forma transitoria confirmaron la expresión de AMc kappa quiméricos 3P1E11.3B7-huIgG1. Las secuencias de polipéptidos VH y VL de 3P1E11.3B7 resultantes se muestran en las tablas 6 y 8 y son las SEQ ID NO: 173 y 209, respectivamente. Las secuencias de cadena pesada y ligera para los anticuerpos monoclonales 1A7, 2F3, y 3P1D10.2C3 se determinaron por procedimientos similares.
C. Identificación de anticuerpos monoclonales anti-Sp35 por presentación de fagos
Los fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal anti-Sp35 se identificaron y aislaron a partir de bibliotecas de presentación de fagos tal como se describe en Hoet et al., Nat. Biotech. 23:344-348 (2005); Rauchenberger, et al., J. Biol. Chem. 278:194-205 (2003); y Knappik, et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000).
La biblioteca de presentación de fagos Fab MorphoSys HuCAL® GOLD ("Biblioteca de presentación de fagos 2" en la tabla 3B), que comprende regiones variables de anticuerpos sintéticos humanizados se cribó frente a proteína Sp35-Fc soluble humana recombinante por procedimientos de cribado ELISA e IHC estándar. Véase, por ejemplo, Ostendorp, R., Frisch, C. y Urban M, "Generation, engineering and production of human antibodies using HuCAL®”. Anbitodies, Volume 2 Novel Technologies and Therapeutic Use. Nueva York: Kluwer Academic/Plenum 13-52 (2004). Los fagos Fab que se unieron específicamente a Sp35 se purificaron y se caracterizaron. Las propiedades de estos fragmentos Fab de anticuerpo monoclonal derivados de presentación de fagos se muestran en la tabla 3B como "fragmentos Fab monoclonales derivados de biblioteca de presentación de fagos 2”. Se seleccionó el fago Fab 1968 para un análisis adicional.
EJEMPLO 4
Inmunoprecipitación de Sp35 por anticuerpos monoclonales anti-Sp35
Para realizar la inmunoprecipitación, se produjeron células COS-1 que expresaban Sp35, fusionadas con una marca de hemaglutinina (HA) en el extremo N, mediante transfección transitoria de células COS-1 con una construcción de ADN que expresa la proteína Sp35 de longitud completa con una marca HA. Se recogieron las células 48 h después de la transfección y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1 % y glicerol al 10 %) durante 30 min a 4°C. Después de centrifugado a 14.000xg durante 15 min, se incubaron los sobrenadantes con perlas de Proteína A/G-Sefarosa (Santa Cruz) a 4 °C durante 1 h y, a continuación, se incubaron a 4 °C durante 1 h con los anticuerpos monoclonales 1A7 o 2F3 anticuerpos anti-Sp35 murinos. Se lavaron las perlas 3 veces con tampón de lisis, se hirvieron en tampón de muestra Laemmli, se sometieron a SDS-PAGE al 4-20 % y se analizaron por Western blot usando un anticuerpo que reconoce la marca HA. Tal como se muestra en el gel de SDS-PAGE, los anticuerpos monoclonales 1A7 y 2F3 inmunoprecipitaron Sp35 humano y murino (Fig. 1). Tal como se muestra en la Fig. 1, el anticuerpo monoclonal 2F3 inmunoprecipitó intensamente Sp35 humano y murino, mientras que el anticuerpo monoclonal 1A7, que inmunoprecipitó intensamente Sp35 humano, reconoció la proteína Sp35 murina solo débilmente. De forma similar, los anticuerpos monoclonales 1G7, 2B10, 2F3, 3P4C2.2D2, 3P4C8.2G9, Li01, Li03, Li05, Li06, Li07, Li08, Li11, Li12, 7P1D5.1G9 y 3B5.2 inmunoprecipitan Sp35 humano o de ratón o humano y de ratón (Véase la tabla 3B y 3C). Además, Li08 inmunoprecipita AP-Sp35 y los anticuerpos monoclonales 1B6.4 y 3E3.1 inmunoprecipitan Sp35 endógeno (véase la tabla 3B).
EJEMPLO 5
Anticuerpo anti-Sp35 que se une específicamente a Sp35 determinado por ELISA Con el fin de determinar las regiones del polipéptido Sp35 que se unieron por los diversos anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma y de presentación de fagos producidos en el Ejemplo 2, se realizó un ensayo ELISA usando un panel de polipéptidos Sp35 truncados, cada uno de ellos fusionado con las regiones bisagra y Fc de IgG1 por los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. El panel consistió en los siguientes fragmentos de Sp35: aminoácidos 34425 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-532 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-493 de SEQ ID NO: 2 y aminoácidos 34-532 de SEQ ID NO: 2. Se usaron ovoalbúmina y BSA como controles. Tal como se muestra en la tabla 3B, los AMc derivados de hibridoma 2F3, 2B10, 3A3, 3P4c2.2d2 y 3P4c8.2g9, y los AMc derivados de fago Fab 3383, 3563, 3564, 3565, 3568, 3569, 3570 y 3582 se unieron todos específicamente a los fragmentos de Sp35 1-417 y 1-534, lo que sugiere que estos anticuerpos se unen a los epítopos en la región LRR de Sp35. Los AMc derivados de hibridoma 1A7, 3P1B11F9, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C63G10.2H7, 2P2C9.2G4, 3P4A61D9 y 394C51D8, y los AMc derivados de fago Fab 3495, 3566, 3567 y 1968 se unen específicamente al fragmento de Sp35 34-532 y se unen débilmente al Sp35 417-532, lo que sugiere que estos anticuerpos se unen probablemente a epítopos que incluyen al menos una parte de extremo C de Sp35 en la región LRR. En experimentos similares, estos últimos anticuerpos se unieron también específicamente a un polipéptido Sp35 que consistía en los aminoácidos 34534 de Sp35 humano y con baja afinidad a Sp35 de ratón y de rata. La afinidad de estos últimos anticuerpos para Sp35 de ratón y rata fueron restaurados al nivel observado usando Sp35 humano cuando en el aminoácido 419 del Sp35 de ratón o rata se cambió de histidina (H) a arginina (R). La arginina es el aminoácido en la posición 419 en Sp35 humano. La KD para el anticuerpo monoclonal 1A7 se determinó como 10 nM (1 x 10-9 M) para la unión a Sp35 humano y 20 µM (2 x 10-5 M) para la unión a Sp35 murino. Para ELISA Ap-Sp35 para detectar los anticuerpos unidos a la región 417 a 532, la ELISA se realizó del modo siguiente: los AMc se recubrieron en placas ELISA, a continuación, se incubaron con una proteína de fusión Sp35-AP a 4 °C durante toda la noche seguido por antihumano unido a AP (H+L) (1:5.000, Jackson InmunoResearch) a t.a. durante 1 h o bien con proteínas de fusión AP a 4 °C durante toda la noche. A continuación, se desarrolló el sustrato AP mediante 10 mg/ml de 4NPP en glicina 0,1 M, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM, pH 10,5 y se leyó a D.O. 405.
En experimentos similares, se probaron los anticuerpos monoclonales 3B5.2 y 7P1D5.1G9, así como el fragmento Fab del anticuerpo 7P1D5.1G9 en ensayos ELISA para comprobar su capacidad de unirse a Sp35, la región LRR de Sp35 completa, la región Ig de Sp35 y Sp35 murino. Tal como se muestra en la tabla 3C, 3B5.2, 7P1D5.1G9 y el fragmento Fab 7P1D5.1G9 se unieron a Sp35 humano y murino. Los anticuerpos monoclonales 3B5.2 y 7P1D5.1G9 también se unieron a la región LRR de Sp35. Véase la tabla 3C.
En un ensayo de unión a Sp35 con 3B5.5 monoclonal fijado al fondo de un pocillo de cultivo tisular, los siguientes anticuerpos no bloquearon la unión a 3B5 de Sp35: Li03, Li05, Li08, Li011 y el fragmento Fab de Li013.
EJEMPLO 6
Anticuerpo anti-Sp35 que se une específicamente a Sp35 determinado por FACS
Para caracterizar adicionalmente las propiedades de unión de los AMc anti-Sp35 derivados de hibridoma 1A7 y 2F3 producidos tal como se describe en el Ejemplo 3, se comparó la unión a células COS-7 o 293 tanto fijadas como vivas que expresan Sp35 humano o de ratón. Se fijaron células transfectadas y no transfectadas de Sp35 y se sometieron a análisis FACS (FACS: se disociaron células transfectadas con Sp35 humano o de ratón o control de vector de placas de cultivo, se lavaron con FBS/PBS al 2 % y se incubaron con anticuerpo primario a 1 µg/ml en hielo durante 1 h. Se lavaron las células 3 veces con 2 % FBS/PBS, a continuación, se incubaron con anticuerpo secundario marcado con PE (1:100, JacksonInmunoResearch) en hielo durante 30 min. Después de 2 lavados con FBS/PBS al 2 %, se fijaron las células en PFA al 2 % y se sometieron a análisis FACS por PE). El resultado de FACS mostró que los AMc 1A7 y 2F3 se unieron a las células COS-7 o 293 que expresaban Sp35, pero no se unieron a células de control sin expresión Sp35 (Fig. 2).
En experimentos similares, se usaron células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 en análisis FACS para caracterizar adicionalmente las propiedades de unión de 3B5.2 y 7P1D5.1G9. Tal como se muestra en la Fig. 11, 3B5.2 y 7P1D5.1G9 se unieron a Sp35 en las células transfectadas CHO. Específicamente, se probó en los anticuerpos 3B5.2 y 7P1D5.1G9 su capacidad de unirse a células CHO transfectadas con, y que expresan, Sp35 humano o murino. Tal como se muestra en la Fig. 11, el número de células a las que se unen los anticuerpos 3B5.2 y 7P1D5.1G9, medido por la fluorescencia media (MCF), aumentó con la concentración de anticuerpo usada. Además, el anticuerpo 3B5.2 se unió a más células medido por fluorescencia media (MCF) que el 7P1D5.1G9.
EJEMPLO 7
Ensayo de crecimiento de neuritas Para ensayar la capacidad de los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma y derivados de fago Fab producidos anteriormente de invertir el efecto inhibidor de los inhibidores de mielina en el SNC, por ejemplo, OMgp, en las neuronas, se recubrieron portaobjetos de cultivo Lab-Tek® (4 pocillos) con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Se distribuyó Ap-OMgp (1 µg/mancha) o PBS en forma de gotas de 3 µl. Los portaobjetos Lab-Tek® se aclararon y recubrieron a continuación con 10 µg/ml de laminina (Gibco™). Se disociaron los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de crías de rata Sprague Dawley P6-7 con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington), se trituró con pipetas Pasteur pulidas al fuego, se presembraron para su enriquecimiento con células neuronales y finalmente se sembraron como 10.000 células/pocillo en los portaobjetos de cultivo Lab-Tek® recubiertos previamente. Se añadieron 10 µg/ml de AMc 1A7 o 2F3 inmediatamente después de sembrar los GRD. El medio de cultivo fue F12 (disponible en Gibco/Invitrogen) que contenía suero de caballo donador inactivado por calor al 5 %, suero bovino fetal inactivado por calor al 5 % y 50 ng/ml de factor de crecimiento nervioso de ratón (mNGF) y se incubó a 37 °C y en CO2 al 5 % durante 6 horas. Después de la incubación, se fijaron los portaobjetos en paraformaldehído al 4 %/sacarosa al 20 % y se tiñeron con anticuerpo anti-βIII-tubulina TUJ1 (Covance) después de 16 horas.
Como anticuerpo secundario se añadió Alexa- Fluor® 594 antirratón (Molecular Probes) diluido a 1:300 a los portaobjetos y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos Gel/Mount™ (Biemeda™). Se adquirieron imágenes digitales 5x con el software OpenLab™ (Improvision, Inc., Lexington, MA), y se analizó en las imágenes la cuantificación del crecimiento de neuritas usando el software OPENLAB™, todo de acuerdo con los parámetros especificados por el fabricante.
Los AMc 1A7 y 2F3 protegieron los GRD de las neuronas de la inhibición del crecimiento de las neuritas mediada por OMgp. (Fig. 3). 3B5.2 también protegió a los GRD de las neuronas de la inhibición del crecimiento de las neuritas mediada por OMgp (datos no mostrados).
EJEMPLO 8
El anticuerpo monoclonal 1A7 promueve la recuperación funcional en el modelo de lesión de la médula espinal de rata
Se indujo una lesión de la médula espinal ("LME") hemisección dorsal del modo siguiente, modificado a partir de los procedimientos descritos anteriormente (Li, S. et al. J. Neurosci. 24, 10511-10520 (2004)). A ratas Long Evans hembra anestesiadas (7 semanas de vida, Charles River) se les suministró analgesia preoperatoria (Buprenorfina/Buprenex, 0,05 mg/kg s.c.) y tranquilizantes (Midazolam, 2,5 mg/kg i.p.) y se realizó una hemisección dorsal en la vértebra torácica 6/7 que interrumpía completamente el tracto dorsomedial principal y el corticoespinal (CST) dorsolateral. Los componentes dorsal y dorsolateral del tracto corticoespinal (CST) se interrumpieron completamente y la parte ventral del CST permaneció intacta. El puente de tejido ventral que quedaba después de la hemisección constituía aproximadamente el 20 % de la médula en los dos grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Se cuantificó la función de las extremidades posteriores usando el procedimiento de valoración de campo abierto de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Eby, M.T. et al., J. Biol. Chem. 275, 15336-15342 (2000)) y todos los animales mantuvieron déficits funcionales acusados después de la LME, con parálisis casi completa de las extremidades posteriores el día posterior a la cirugía. Inmediatamente después de la transección del CST, se insertó un catéter intratecal en el espacio subaracnoideo en T7 y se conectó con una bomba miniosmótica cebada (Alzet modelo 2004, Alza Corp) insertada en el espacio subcutáneo. Las bombas miniosmóticas suministraban proteína de control de isotipo IgG humano (5 mg/ml) o anticuerpo monoclonal 1A7 (4,8 mg/ml), de forma continua a una tasa de 0,25 µl/h durante 5 semanas. Los animales de control (tratados con IgG humana) recuperaron una función sustancial en el periodo de 5 semanas del experimento, pero alcanzaron una fase de meseta a las 3-4 semanas, para alcanzar finalmente una puntuación BBB media de 9 ± 0,45 (Fig. 7). En cambio, la infusión intratecal continua de 1A7 durante 5 semanas después de médula espinal transección produjo puntuaciones BBB significativamente mejoradas en los animales de control a las 5 semanas con una mejoría continua de la función en el marco de tiempo de 2-5 semanas, alcanzando una puntuación BBB media de 11,1 ± 0,7 (Fig. 4). Estos resultados demuestran que el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-Sp35 1A7 promovió la recuperación de la función después de una lesión de la médula espinal tal como se desprende del aumento en la puntuación BBB, la regeneración de axones y la menor retracción de axones observada por inmunohistoquímica de tinción de los axones. El anticuerpo 3B5.2 también promovió la recuperación después de una lesión de la médula espinal (datos no mostrados).
EJEMPLO 9 Los anticuerpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Li13, Li28, Li33, D05, D08 y 3B5.2 promueven la mielinización in vitro
Se investigó el papel de los anticuerpos anti-Sp35 1A7 y 2F3 en la mielinización in vitro tratando cocultivos de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (GRD) y oligodendrocitos con anticuerpos anti-Sp35 1A7 y 2F3 y ensayando la mielinización por inmunohistoquímica y Western blot. Para estos estudios, fue necesario generar primero cultivos primarios de neuronas GRD y de oligodendrocitos.
Se cultivaron ganglios de la raíz dorsal embrionarios E14-E17 de rata Long Evans hembra tal como describen Plant et al., J. Neurosci. 22:6083-91 (2002). Se sembraron GRD diseccionados en cubreobjetos recubiertos con poli-Llisina (100 µg/ml) durante 2 semanas. Se incubaron las células en presencia de fluorodesoxiuridina durante días 2-6 y en medio NLA que contenía 1 x B27, 100 ng/ml de NGF (Gibco) durante los días 8-11.
Se cultivaron oligodendrocitos de rata del día 2 posnatal (P2) Long Evans hembra tal como describen Conn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (Academic Press; 1990) con las siguientes modificaciones. Brevemente, se extirpó el prosencéfalo de ratas P2 y se colocó en medio HBSS frío (Gibco). Se cortaron los fragmentos de tejido en piezas de 1 mm y se incubó a 37 °C durante 15 min en tripsina al 0,01 % y 10 µg/ml de ADNasa. Se sembraron células disociadas en matraces de cultivo tisular T75 recubiertos con poli-L-lisina y se cultivó en DMEM con suero bovino fetal al 20 % a 37 °C durante 10 días. Se recogieron oligodendrocitos positivos para A2B5 mediante agitación de los matraces durante toda la noche a 200 rpm a 37°C. Se cultivaron los oligodendrocitos A2B5 durante 7 días en DMEM (Gibco) que contenía D-glucosa 25 mM, L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 µg/ml de apo-transferrina humana, 5 µg/ml de insulina pancreática bovina, selenato de sodio 30 nM, hidrocortisona 10 nM, D-biotina 10 nM, 1 mg/ml de BSA, 10 ng/ml de FGF y PDGF (Peprotech). A continuación, se recogieron las células por tripsinización. Seguidamente se cocultivaron las células con las neuronas GRD en presencia o ausencia de 1, 3, 10 o 30 µg/ml de anticuerpos monoclonales anti-Sp35 1A7 o 2F3, o un anticuerpo de control negativo en medio NLA que contenía suero bovino fetal al 2 %, 50 µg/ml de ácido ascórbico, 100 ng/ml de NGF (Gibco). En dicho ensayo se ha determinado que debe administrarse una dosis efectiva de anticuerpo comprendida en el intervalo de 0,1 µg/ml a 10 µg/ml, dependiendo del anticuerpo. Un experto en la materia podría determinar una dosis efectiva usando los ensayos descritos en el presente documento.
Se cambió el medio de cultivo y se repusieron los diversos anticuerpos monoclonales cada tres días. Después de 30 días a 37°C, se tiñeron las células cocultivadas por tinción inmunohistoquímica ("IHC") para neurofilamentos con anticuerpo anti-βIII-tubulina para identificar los axones, o anticuerpo anti-MBP para identificar los oligodendrocitos (Fig. 4A-E). Además, se lisaron las células cocultivadas y se sometieron a análisis por Western blot para cuantificar la MBP (Fig. 4G). Basándose en los análisis IHC y Western blot, las células cocultivadas tratadas con los anticuerpos anti-Sp35 1A7 y 2F3 mostraron una mayor supervivencia de oligodendrocitos y neuronas, números más altos de axones empaquetados y números mayores de células positivas a MBP (Fig. 4F, 10 veces más células positivas a MBP que en los cocultivos tratados con anticuerpos de control.
En un experimento similar, se incubaron los cocultivos de oligodendrocitos y GRD en presencia o ausencia de anticuerpos anti-Sp35 Li05 y Li06, o un anticuerpo de control negativo. Se lisaron las células cocultivadas y se sometieron a análisis por Western blot para cuantificar la MBP (Fig. 8). Basándose en los análisis por Western blot, las células cocultivadas tratadas con anticuerpos anti-Sp35 Li05 y Li06 mostraron números mayores de células positivas a MBP, similares a las células cocultivadas tratadas con 3, 10 y 30 µg de Sp35-Fc (LINGO-1-Fc).
En experimentos similares se incubaron los cocultivos de oligodendrocitos y GRD en presencia o ausencia de los anticuerpos anti-Sp35 3B5.2, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li08, Li13, Li28 y Li33 y también promovieron la mielinización. De forma similar, los anticuerpos D05 y D08 de longitud completa también promovieron la mielinización. La dosis efectiva mínima del anticuerpo 3B5.2 y 7P1D5.1G9 necesario para promover la mielinización en el experimento de cocultivo de GRD fue de 0,1 µg/ml.
Asimismo, se ensayó el fragmento Fab 7P1D5.1G9 en un ensayo de mielinización in vitro similar. El fragmento Fab 7P1D5.1G9 promovió la mielinización a una concentración de 1,0 µg/ml.
Estos resultados indicaron que el tratamiento de cocultivos de GRD-oligodendrocitos con los anticuerpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Li13, Li28, Li33, D05, D08 y 3B5.2 promovió interacciones de axones de oligodendrocitos maduros y mielinización en comparación con los cocultivos tratados con anticuerpos de control.
EJEMPLO 10 Los anticuerpos anti-Sp35 y fragmentos Fab promueven la supervivencia y mielinización de oligodendrocitos in vivo
Se alimentó a ratones macho adultos C57B1/6 de tipo natural con cuprizona (0,2 % molido con pienso de ratón picado en peso) durante 6 semanas para inducir desmielinización en el cuerpo calloso de acuerdo con el procedimiento descrito por Morell P et al., Mol Cell Neurosci. 12:220-7 (1998). Brevemente, se inyectó estereotácticamente anticuerpo monoclonal anti-Sp35 1A7 en el cuerpo calloso desmielinizante en las semanas 2, 2,5 y 3 de alimentación con cuprizona, por el procedimiento descrito más adelante. En los ratones de control se inyectó estereotácticamente en los mismos intervalos con medios esterilizados que contenían anticuerpo de control. Después de que se completaron las 6 semanas de alimentación con cuprizona, los ratones recuperaron una dieta normal durante 2, 4 y 6 semanas (pienso de ratón picado solo) para permitir la remielinización.
Los anticuerpos monoclonales 1A7 y de control se suministraron del modo siguiente. A los ratones tratados con cuprizona se les anestesió con ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y se colocaron en un aparato de inmovilización diseñado para cirugía estereotáctica (David Kopf Instruments). Se abrió el cuero cabelludo y se inyectaron los compuestos estériles (1 µM en 1 ml de HBSS) unilateralmente en el cuerpo calloso gravemente desmielinizado de los ratones receptores de tipo natural con una jeringa Hamilton de 10 µl usando coordenadas estereotácticas de 0,7 mm posterior y 0,3 mm lateral al bregma a una profundidad de 1,7 mm (Messier et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 63: 313-18 (1999)). En ratones receptores de control adicionales se inyectó estereotácticamente HBSS que no contenía compuestos. La apertura del cráneo se rellenó con Gelfoam, y se frotó la zona con penicilina y estreptomicina (Gibco) y se suturó la herida. Se sacrificó a los ratones cada semana del experimento después de la inyección y se les extrajo el encéfalo y se procesó para su análisis molecular, bioquímico e histológico.
Los animales que recibieron tratamiento con anticuerpo anti-Sp35 1A7 mostraron un aumento de la supervivencia de oligodendrocitos maduros (basado en tinción con anticuerpo CC1, Fig. 5A) y mielinización de axones por IHC usando anticuerpo de proteína anti-MBP o azul de luxol rápido (Fig. 5B). Los oligodendrocitos positivos para el anticuerpo CC1 se cuantificaron a las cuatro semanas y 6 semanas (Fig. 5C). Estos resultados indicaban que el tratamiento con anticuerpo anti-Sp35 1A7 promovió la supervivencia de oligodendrocitos maduros y la mielinización de axones en comparación con los ratones tratados con anticuerpos de control. De forma similar, los animales que recibieron el anticuerpo 1A7 o 1 µg/ml del fragmento Fab 7P1D5.1G9 en un modelo de desmielinización de lisolecitina también promovieron la mielinización de axones en comparación con los animales de control.
EJEMPLO 11
El anticuerpo anti-Sp35 1A7 promueve la supervivencia de células ganglionares retinianas (CGR) en el modelo de transección del nervio óptico
Se ensayó el anticuerpo anti-Sp35 1A7 en un modelo de transección del nervio óptico, que investiga los factores que afectan a la función neuronal. En este estudio se usaron ratas hembra adultas jóvenes Sprague Dawley (SD). Se realizó la transección del nervio óptico derecho de cada animal intraorbitariamente a 1,5 mm del disco óptico. Se aplicó una pieza de gelfoam empapada en Fluoro-Gold (FG) al 6 % en el sitio recién transectado justo detrás del disco óptico para marcar las células ganglionares retinianas (CGR) supervivientes. Se dividió a los animales en tres grupos (n=6 en cada grupo) que recibieron anticuerpo anti-Sp35 1A7, anticuerpo de control o solo PBS, por inyección intravítrea. El volumen de cada inyección intravítrea fue de 4 µl mientras que la dosificación de cada inyección fue de 2 µg. Las inyecciones intravítreas se realizaron inmediatamente después de la transección del nervio óptico.
Se dejó que todos los animales sobrevivieran 1 semana. Dos días antes del sacrificio de los animales, se realizó transección del nervio óptico izquierdo de cada animal y se administró FG al 6 % tal como se describe anteriormente para marcar las CGR supervivientes, que servirían de control interno. Se sacrificaron los animales con una sobredosis de Nembutal y se diseccionaron las retinas en paraformaldehído al 4 %. Se realizaron cuatro cortes radiales para dividir las retinas en cuatro cuadrantes (superior, inferior, nasal y temporal). A continuación, se fijaron posteriormente las retinas en el mismo fijador durante 1 hora antes de que se montaran en plano con el medio de montaje (Dako). Se examinaron los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia usando un filtro ultravioleta (longitud de onda de excitación = 330-380 nm). Se contaron las CGR marcadas a lo largo de la línea media de cada cuadrante empezando desde el disco óptico hasta el borde periférico de la retina en intervalos de 500 µm, con una cuadrícula ocular de 200 x 200 µm2. El porcentaje de CGR supervivientes resultante de cada tratamiento se expresión por comparación con el número de CGR supervivientes en los ojos lesionados con sus ojos contralaterales. Todos los datos se expresaron como media ± ECM. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía, seguido por una prueba post-hoc de Tukey-Kramer. Las diferencias se consideraron significativas para p < 0,05. Los animales tratados con anticuerpo anti-Sp35 1A7 mostraron más supervivencia neuronal (80 %) que los animales tratados con anticuerpo de control o PBS, que mostraron cada uno una supervivencia neuronal de solo aproximadamente el 50 % (Fig. 6).
EJEMPLO 12
Prueba de anticuerpos anti-Sp35 para remielinización en el modelo del aplastamiento del nervio óptico
El nervio óptico derecho recibe aplastamiento completo con fórceps nº 5 durante 10 segundos alrededor de 1,5 mm por detrás del globo ocular intraorbitariamente justo antes de la administración de 2 µl de anticuerpo monoclonal 1A7, 2F3, Li05 y Li06 en 2 ml por inyección intravítrea.
Los animales reciben una segunda inyección intravítrea del mismo tratamiento una semana después de la cirugía. Dos semanas después de la cirugía, se perfunden los animales con fijadores EM, se fijan posteriormente y se procesan para obtener secciones semifinas y ultrafinas. Las secciones longitudinales del nervio óptico se tiñen y se preparan para observación de mielina. Se compara la mielinización de las partes proximal y distal del nervio óptico aplastado entre diferentes grupos de tratamiento. Los animales tratados con Sp35-Fc y 1A7, 2F3, Li05 y Li06, así como los controles apropiados, serán analizados en relación con la remielinización en la parte distal del nervio óptico en comparación con los controles.
EJEMPLO 13
Prueba de anticuerpos anti-Sp35 para regeneración de axones en el modelo de aplastamiento del nervio óptico
Se aplastó el nervio óptico derecho con fórceps nº 5 durante 10 segundos alrededor de 1,5-2 mm por detrás del globo ocular intraorbitariamente justo antes de la administración de 2 µg de anticuerpo monoclonal 1A7 en PBS por medio de inyección intravítrea. Se sometieron a ensayo 4 ratas con el anticuerpo 1A7 y se usaron 8 ratas como animales de control. Los animales recibieron una segunda inyección intravítrea del mismo tratamiento una semana después de la cirugía. Tres días antes del sacrificio de los animales de ensayo (día 11 del experimento), se inyectaron 2 ml de CTB-FITC por vía intravítrea para marcar, de forma anterógrada, los axones regeneradores del nervio óptico. En el día 14 después de cirugía, se perfundieron los animales y se fijaron posteriormente. Se procesó el nervio óptico aplastado para las secciones longitudinales congeladas. Los axones marcados con CTB-FITC, que cruzan el sitio de la lesión, se contaron como fibras regeneradoras a distintas distancias más allá del sitio de aplastamiento. Cuando se inyectó 1A7 en el ojo, se observó regeneración de axones hasta 250 µm más allá del sitio de aplastamiento. Véase Fig. 10.
EJEMPLO 14
Los anticuerpos anti-Sp35 promueven la remielinización y reparación en el nervio óptico usando el modelo de rata EAE inducido por MOG.
Para estos experimentos, se usó el modelo de rata de Encefalitis Autoinmunitaria Experimental (EAE) inducida por Glucoproteína Mielínica de Oligodendrocitos (MOG). Este es el modelo animal para esclerosis múltiple humana. Se emulsionaron 50 µl de 200 ng de adyuvante de Freund completo (Chondrex Inc.) más 50 µl de 50 µg de MOG en solución salina (1:1) y se guardó en hielo antes de ser inyectado por vía intradérmica en la base de la cola para cada animal. Se usaron ratas hembra marrones Norway, de 8-10 semanas, para todos los experimentos. La observación general en la técnica indica que el modelo EAE se induce alrededor de 15 días después de la inyección de MOG. Se puntúa en las ratas los signos clínicos de EAE. Los signos se puntúan del modo siguiente: grado 0,5, paresia distal de la cola; grado 1, parálisis completa de la cola; grado 1,5, paresia de la cola y ligera paresia de las extremidades posteriores; grado 2,0, paresia unilateral grave de las extremidades posteriores; grado 2,5, paresia bilateral grave de las extremidades posteriores; grado 3,0, paresia bilateral completa de las extremidades posteriores; grado 3,5, parálisis bilateral completa de las extremidades posteriores y paresia de una extremidad delantera; grado parálisis completa (tetraplejía), estado moribundo, o muerte. Los animales reciben tratamiento una vez que se induce el modelo EAE.
Se inyectaron 2 µg/µl de un anticuerpo anti-Sp35 (1A7) por vía intravítrea en el día 15 tras inducción de MOG-EAE. Se inyectaron 2 µg/µl del anticuerpo anti-Sp35, 1A7, dos veces más en el día 22 y el día 28. Tras terminar el experimento, se perfundieron los animales con PFA al 4 %. Los nervios ópticos se fijaron posteriormente en OsO4 al 1 %, se deshidrataron y se incluyeron en Epon. Se cortaron secciones semifinas (1 µM) y se tiñeron con azul de toluidina para la evaluación de la mielinización. Se compararon los nervios ópticos de animales tratados con animales no tratados en regeneración de axones y remielinización en el nervio óptico. Todos los procedimientos se realizaron siguiendo un protocolo aprobado por el comité institucional para el cuidado y uso de animales (IACUC).
5 Los animales que recibieron tratamiento con el anticuerpo anti-Sp35 1A7 mostraron remielinización y reparación del nervio óptico en comparación con los nervios ópticos normales o los animales que se sometieron a EAE inducida por MOG, pero no recibieron tratamiento (Fig. 9). En la Fig. 9C, las flechas apuntan a los axones mielinizados. Los animales que reciben un anticuerpo que reconoce el dominio III de Proteína G de Streptococcus (MOPC21), no específico para Sp35, no mostraron signos de remielinización o reparación del nervio óptico en comparación con los nervios ópticos normales o los nervios ópticos de animales no tratados (datos no mostrados). El anticuerpo antagonista Sp35 1A7 promovió la remielinización y la reparación de los nervios ópticos en un modelo de neuritis óptica de EAE inducido por MOG en rata (Fig. 9).
EJEMPLO 15
15 Prueba de anticuerpos anti-Sp35 para la promoción de remielinización del SNC usando el modelo de ratón de EAE inducido por MOG
Se induce EAE en la cepa mixta 129B6 de ratones por inmunización intradérmica (día 0) con 100 µg de proteína MOG1-125 emulsionada con adyuvante de Freund completo (CFA). El volumen inyectado es 100 µl por ratón y se distribuye en 3 sitios (pabellón auricular, espalda y piel). La emulsión se prepara basándose en una proporción de volumen 1:1 y contiene 1 mg/ml de MOG1-125 y 2 mg/ml de M. tuberculosis (cepa H37Ra, Chondrex). Se administra toxina de tos ferina (200 ng/ratón) por vía intraperitoneal en el momento de la inmunización y 2 días después. Se anota diariamente el peso corporal y las puntuaciones EAE clínicas (0 = ausencia se signos clínicos; 1 = cola flácida; 25 2 = debilidad en las extremidades posteriores, alteración del reflejo de enderezamiento o marcha inestable; 3 = parálisis completa de las extremidades posteriores o reflejo de enderezamiento ausente; 4 = parálisis completa de las extremidades posteriores con cierto grado de afectación de las extremidades anteriores; 5 = animal totalmente paralizado; 6 = moribundo o muerto). Todos los procedimientos se realizan siguiendo un protocolo, aprobado por nuestro comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC). En el día 0 del estudio los animales reciben el tratamiento con los anticuerpos monoclonales 1A7, 2F3, Li05 y Li06 o el anticuerpo de control. Se toman muestras de sangre en varios momentos durante los experimentos por la técnica de sangrado retroorbitario. Se separa el plasma de PBMC por centrifugación y se realiza el fenotipado celular por tinción FACS. Se realiza el perfil de respuesta al anticuerpo anti-MOG humoral mediante por ELISA usando AMc específicos de subclase/isotipo (Pharmingen). Al término de cada experimento, se recogen el encéfalo, la médula espinal, los nervios ópticos y los
35 nervios ciáticos después de la perfusión.
Se usa el mismo protocolo para inducir la EAE en ratones con Sp35 inactivado y compañeros de camada. Los ratones con Sp35 inactivado muestran normalmente valores EAE inferiores (1,5), y ausencia de recidiva en comparación con el control (durante un periodo de 45 días), después compañeros de camada de tipo natural (puntuación EAE 3,5).
Los animales tratados con Sp35-Fc y 1A7, 2F3 se analizarán para determinar la remielinización en comparación con el control.
45 La proteína MOG 1-125 marcada con His se expresó en Pichia pastoris usando un promotor inducible por doxiciclina TetO-AOX1 (M. Levesque, D. Krushinskie y K. Strauch, manuscrito en preparación). La secuencia codificante extracelular (Gly1 a Gly125 de la proteína madura después de eliminación de la secuencia señal) de rata MOG se amplificó por PCR usando los cebadores siguientes:
EJEMPLO 16 Construcción de variante de 3B5.2 A continuación, se muestra la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable (VL) del anticuerpo 3B5.2,
las CDR están subrayadas y el sitio de glucosilación ligado a N está en negrita y con doble subrayado: QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSRVS YVHWYQQKSG TSPKRWLYDT SNLASGVPAR FGGNGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW STNPPTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 417). Para determinar si la expresión del anticuerpo 3B5.2 y/o la unión del anticuerpo a Sp35 se vieron afectadas por la eliminación del sitio de glucosilación, se construyó una variante 3B5.2. Específicamente, se mutaron las posiciones Kabat 63-68 en FR3 con la secuencia de cadena ligera
5 kappa murina y humana de consenso SGSGSG (SEQ ID NO: 418). La variable de cadena ligera 3B5.2 mutante resultante variable es la siguiente, los aminoácidos mutados están en negrita y con doble subrayado: QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSRVS YVHWYQQKSG TSPKRWLYDT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW STNPPTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 419).
10 La capacidad del anticuerpo 3B5.2 y de la variante de anticuerpo 3B5.2 de unirse a la proteína Sp35 fueron iguales cuando se realizó la prueba. Además, basándose en datos de movilidad electroforética, parece que la variable de cadena ligera 3B5.2 está glucosilada, mientras que la variante de cadena ligera no lo está. Finalmente, los niveles de expresión de los anticuerpos en células transfectadas fueron los mismos.
15 EJEMPLO 17
Construcción de anticuerpo 1A7 humanizado
SECUENCIAS DE CADENAS LIGERAS Y PESADAS DE 1A7
20 Cadena ligera:
25 Cadena pesada:
Negrita subrayado: residuos CDR de Kabat 30 Cursiva subrayado: residuos CDR de Chotia
Residuos canónicos
La numeración está de acuerdo con el esquema de Kabat 35
ANÁLISIS DE LAS REGIONES VARIABLES MURINAS
Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) contienen los residuos que más probablemente se
unirán a antígeno y deben conservarse en el anticuerpo remodelado. Las CDR se definen por la secuencia de 40 acuerdo con Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª edición, U.S. Dept. Health and
Human Services. U.S. Govt. Printing Office. Las CDR se encuadran en clases canónicas (Chothia, C., Lesk, A.M.,
Tramontano, A., Levitt, M., Smith-Gill, S.J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E.A., Davies, D., Tulip, W.R., Colman, P.M.,
Spinelli, S., Alzari, P.M. y Poljak, R.J. (1989) Nature 342:877-883) cuando los residuos clave determinan en gran
medida la conformación estructural del bucle de CDR. Estos residuos casi siempre están conservados en el 45 anticuerpo remodelado. Las CDR de la cadena pesada y ligera se clasificaron en las siguientes clases canónicas:
Cadena ligera:
Cadena pesada:
L1:
10 residuos Clase 1 H1: 5 residuos Clase 1
L2:
7 residuos Clase 1 H2: 17 residuos Clase 2
L3:
9 residuos Clase 1 H3: 7 residuos Clase no canónica
Los residuos canónicos importantes para estas clases CDR se indican en la tabla 10. TABLA 10
L1
Clase 1 2(1) 25 (A) 30(V) 33(M) 71(S)
L2
Clase 1 48 (I) 51(T) 52(S) 64(G)
L3
Clase 1 90(Q) 95(P)
H1
Clase 1 24(A), 26(G), 27(F), 29(F), 34(M), 94(R)
H2
Clase 2 52a(T) 55(G) 71(L)
H3
Clase no canónica
5 Las cadenas ligeras y pesadas variables se compararon con las secuencias de consenso (Kabat et al., 1991) y de línea germinal (Brensing-Kuppers J, Zocher I, Thiebe R, Zachau HG. (1997). Gene. 191(2):173-81 y Matsuda F, Ishii K, Bourvagnet P, Kuma K, Hayashida H, Miyata T, Honjo T. (1998) J Exp Med. 188(11):2151-62) para subgrupos murino y humano usando el programa BLAST y bases de datos de secuencias de proteínas de blastos de línea
10 germinal y de consenso compiladas internamente. La cadena ligera variable es un miembro del subgrupo Kappa 6 murino con un 94 % de identidad en 109 superposiciones de aminoácidos y con origen en la línea germinal kk4 murina (100 % ID) (Véase más adelante)
15 > mukk4 Consulta: 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR 60
20 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR Sujeto: 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR 60
25 Consulta: 61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 451) FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP (SEQ ID NO: 451)
30 Sujeto: 61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 451) La cadena pesada variable es un miembro del subgrupo HVMS murino con un 55 % de identidad en 132 superposiciones de aminoácidos y con origen en la línea germinal VGK6 murina (92 % ID) (Véase más adelante)
35 > muVGK6 Consulta: 1 QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY 60
40 Q+QLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINT+TGEPTY Sujeto: 1 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTY 60
45 Consulta: 61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFC 96 (SEQ ID NO: 452) +DF+GRFAFSLETSAST YLQ NNLKNEDTATYFC (SEQ ID NO: 453)
50 Sujeto: 61 ADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 96 (SEQ ID NO: 454) La cadena ligera variable corresponde al subgrupo Kappa 3 humano con un 67 % de identidad en 109 superposiciones de aminoácidos y es la más cercana a la línea germinal L6 humana (64 % ID) (Véase más adelante)
> huL6 Consulta: 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVS-YMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPA 59 +IVLTQSPA +S SPGE+ T++C AS SVS S+ WYQQK G +P+ IYD S A+G+PA Sujeto: 1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA 60 Consulta: 60 RFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 455) RFSGSGSGT ++LTISS+E ED A YYCQQ S+ P (SEQ ID NO: 456) Sujeto: 61 RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP 95 (SEQ ID NO: 457) La cadena pesada variable corresponde al subgrupo MHV1 humano con un 59 % de identidad en 129
superposiciones aa y es la más cercana a la línea germinal huVH7-81 humana (70 % ID) (Véase más adelante) > huVH7-81 Consulta: 1 QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY 60
QVQLVQSG E+K+PG +VK+SCKASGY+FT YGMNWV QAPG+GL+WMGW NT TG PTY Sujeto: 1 QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYSFTTYGMNWVPQAPGQGLEWMGWFNTYTGNPTY 60 Consulta: 61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAR 98 (SEQ ID NO: 458)
+ F GRF FS++TSAST YLQ ++LK ED A S+CAR (SEQ ID NO: 459) Sujeto: 61 AQGFTGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCAR 98 (SEQ ID NO: 460)
MODELIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LAS REGIONES VARIABLES
Para esta humanización los autores de la invención construyeron el modelo de regiones variables P1A7 basándose en las estructuras cristalinas de anticuerpos OKT3 (PDB ID 1SY6 – usado para modelización de cadena ligera) y TE33 (PDB ID 1TET - usado para modelización de cadena pesada).
ANÁLISIS DE LAS REGIONES VARIABLES REMODELADAS
Los autores de la invención intentaron encontrar las secuencias de anticuerpos expresadas humanas más similares que no necesitan retromutación en las posiciones (L4, 38, 43, 44, 58, 62, 65-69, 73, 85, 98 y H2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 92) (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. nº 6.407.213), y usarlas como marcos de anticuerpo. Los autores de la invención usaron la base de datos de secuencias de anticuerpos curadas internamente y herramientas de consulta para identificar plantillas adecuadas que tienen la máxima semejanza con las secuencias P1A7 murinas en residuos canónicos, de interfaz y de zona exterior para minimizar el número de retromutaciones. Las secuencias de línea germinal rellenas con residuos de consenso en la región FR4 se consideraron por separado. Después de haber considerado múltiples marcos, se seleccionaron las secuencias de línea germinal huL6 y VH7-81 como marcos aceptores para cadenas pesadas y ligeras respectivamente.
Se han diseñado tres versiones de la cadena remodelada ligera variable y tres versiones de la cadena remodelada pesada variable. La primera versión contiene el menor número de retromutaciones y la tercera versión contiene el mayor número (es decir las menos "humanizadas").
RETROMUTACIONES EN VL REMODELADAS
huL6 Punto E1Q Q1 hacia antígeno y el cambio de carga puede alterar la unión. Presente en versión 2 y 3 L46R R46 es un residuo no habitual en la interfaz VH/VL que soporta CDR-L1 y CDR-H3. Presente en todas las
versiones L47W - W47 está situada en un grupo debajo de CDR-L2. Presente en versión 3 solo 158V - V58 está situada en un grupo debajo de CDR-L2. Presente en versión 3 solo F71Y - Y71 es un residuo canónico importante para soporte de CDR-L1 y CDR-L3. Presente en todas las versiones
RETROMUTACIONES EN VH REMODELADAS
huVH7-81
P38K K38 soporta CDR-H2. Presente en versiones 2 y 3. E46K K46 soporta CDR-H2. Presente en versiones 2 y 3 M71L L71 es un residuo canónico que soporta CDR-H1. Presente en todas las versiones A78V V78 está hipermutada a partir de la línea germinal A y soporta CDR-H1 I82F F82 es un residuo de empaquetamiento de núcleo. Presente en versión 3 solo Y91F F91 es a residuo on VH/VL interface. Presente en versión 3 solo
DISEÑOS DE HUMANIZACIÓN PARA P1A7
Marco tomado de las secuencias:
Cadena ligera: huL6 Cadena pesada: huVH7-81 Las retromutaciones están en fuente negrita y en minúscula Las CDR están subrayadas
>Cadena ligera variante 1
>Cadena ligera variante 2
>Cadena ligera variante 3
>Pesada variante 1
>Pesada variante 2
>Pesada variante 3
10 SECUENCIA DE CADENA PESADA DE POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS DE LONGITUD COMPLETA PARA Pesada variante 2
Secuencia de ADN de cadena pesada H2 huP1A7-IgG1 (pXW465) 15
Secuencia de proteínas predicha de cadena pesada H2 huP1A7 (la secuencia señal está subrayada)
SECUENCIA DE CADENA PESADA DE POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS DE LONGITUD COMPLETA
PARA Ligera variante 1 Secuencia de ADN de cadena ligera kappa huP1A7 L1 (pXW480)
Secuencia de proteínas predicha de cadena ligera L1 huP1A7 (la secuencia señal está subrayada)
SECUENCIA DE CADENA PESADA DE POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS DE LONGITUD COMPLETA PARA Ligera variante 2 5 Secuencia de ADN de cadena ligera kappa huP1A7 L2 (pXW476)
Secuencia de proteínas predicha de cadena ligera huP1A7 L2 (la secuencia señal está subrayada)
Secuencia de polipéptidos y polinucleótidos de cadena pesada y ligera de un anticuerpo 1A7 quimérico murino y humano siguiente:
10 Secuencia de ADN de cadena ligera kappa chP1A7 (pEAG2110)
Secuencia de proteínas predicha de cadena ligera chP1A7 (la secuencia señal está subrayada)
Secuencia de ADN de cadena pesada chP1A7 huIgG1 (pEAG2112)
Secuencia de proteínas predicha de cadena pesada chP1A7 (la secuencia señal está subrayada)
EJEMPLO 18
5 Rediseño de Li33Ig2 para reducir la función efectora, la glucación y la agregación
Se realizaron varias mutaciones en Li33 para reducir potencialmente la función efectora, la glucación y la agregación. Se determinó el efecto de cada una de estas mutaciones en la expresión de proteínas, la solubilidad, la actividad de anticuerpos en el ensayo de cocultivo de oligodendrocitos-GRD y la glucación o la unión a CD32. Los
10 resultados se resumen a continuación en la tabla 11.
TABLA 11: REDISEÑO DE LI33IG2
Función efectora
Construcción expresada Solubilidad (mg/mL) CI50 unión CD32 (µg/mL) Ensayo de actividad (cocultivo)
Li33Ig2wt
S >20 4,3 +
Li33Ig2 agly
S 0,3 25 +
Li33Ig2 Rinat
S >5 9.5 +
Li33Ig2 PDL
S 5.8 >100 +
Li33Ig2 Alexion
En curso ND ND ND
Glucación
Construcción expresada Solubilidad (mg/mL) % Glucación Ensayo de actividad (cocultivo)
Li33wt
S >20 25 +
Li33Ig2 PDL
S 5.8 15(5) +
Li33Ig2 PDLW94G
S ND >2 -
Li33Ig2 PDLW94V
S ND <2 +
Li33Ig2 PDLW94Q
S ND <2 -
Li33Ig2 PDLW93N S Li33Ig2 PDLK93R S Agregación Li33Ig1a94V 157P Li33Ig1a94V 157S Li33Ig1a94V 157T Li33Ig1a94V 157V Li33Ig2PDL94V 157S Li33Ig2PDL94V 157A Li33Ig2PDL94V W103Q Li33Ig2PDL94V W103A Li33Ig2PDL94V 103Q57S Li33Ig2PDL94V 103Q57A
ND <2 0,4 <2 Construcción expresada Solubilidad (mg/mL) % glucación S ND ND S ND ND S ND ND S ND ND S ND ND S ND ND S ND ND S ND ND S ND <2 S ND <2 -+ Ensayo de actividad (cocultivo) + + -+ + + --+ +
EJEMPLO 19
5 Construcción de una variante de Li81
El anticuerpo Li81 es una versión de afinidad madurada del anticuerpo Li13. Se creó una versión aglicosilada del anticuerpo Li81 cambiando un único aminoácido en la secuencia de cadena pesada Li81. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable (VH) de la variante aglicosilada.
La secuencia delantera (los primeros 19 aminoácidos), que no estará presente en la proteína madura, se muestra en negrita, y las CDR están subrayadas. El único cambio de aminoácido comparado con la secuencia variable de 15 cadena pesada Li81 (SEQ ID NO: 433) se muestra en negrita y con doble subrayado. A continuación, se muestra la secuencia de nucleótidos para la cadena pesada variable (VH) de la variante aglicosilada.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Biogen Idec MA Inc. 5 <120> Anticuerpos SP35 y uso de estos
<130> P33659EP-PCT
<140> EP08724452.1
<141> 09/01/2008
<150> US 60/879,324 10 <151> 09/01/2007
<160> 474
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 1845 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 614
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la cadena ligera de P1E11.3B7
<400> 4 gcgtctagaa ctggatggtg ggagatgga 29
<210> 5
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CDR1
<400> 5 acttacccta tggtt 15
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CDR1
<400> 6
<210> 7
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CRD2
<400> 7 tggatcggtc cttctggtgg cgttactgct tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CDR2
<400> 8
<210> 9
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CDR3
<400> 9 ccctatagca gtggctggtg ggacttcgat ctc 33
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VH-CDR3
<400> 10
<210> 11
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR1
<400> 11 atgtacttta tgggt 15
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR1
<400> 12
<210> 13 15 <211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR2
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR2
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR3
<400> 15 gatcggcatg cttttgatat c 21
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VH-CDR3
<400> 16
<210> 17
<211> 14
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR1
<400> 17 cttacgctat gggt 14
<210> 18
129 <211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR1
<400> 18
<210> 19
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR2
<400> 19 tctatcgttt cttctggtgg ctatactgat tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR2
<400> 20
<210> 21
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR3
<400> 21 gagggtgacc ataatgcttt tgatatc 27
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VH-CDR3
<400> 22
<210> 23
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR1
<400> 23 tcttacgcta tgtat 15
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR1
<400> 24
<210> 25
<211> 51
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR2
<400> 25 tctatctcta cttctggtgg ctatactggt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR2
<400> 26
<210> 27
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR3
<400> 27 gataccagcg ataatgacta ctactacatg gacgtc 36
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VH-CDR3
<400> 28
<210> 29 35 <211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR1
<400> 29 aagtaccaga tgact 15
<210> 30
<211> 5
<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR1
<400> 30
<210> 31
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR2
<400> 31 tctatctatc cttctggtgg caatactgtt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR2
<400> 32
<210> 33
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR3
<400> 33 gggactacag aggcagtctt tgactac 27
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VH-CDR3
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR1
<400> 35 cagtacaata tgttt 15
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR1
<400> 36
<210> 37
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR2
<400> 37 cgtatctctt cttctggtgg catgactatg tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR2
<400> 38
<210> 39
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR3
<400> 39
15 <210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li12 que codifica VH-CDR3
<400> 40
<210> 41
<211> 15 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR1
<400> 41 30 gagtacccta tggat 15
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 35 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR1
<400> 42
<210> 43 40 <211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR2
45 <400> 43 tctatctatt cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccattaaagg t 51
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR2
<400> 44
<210> 45
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR3
<400> 45 gagggtgact ctgatgcttt tgatatc 27
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VH-CDR3
<400> 46
<210> 47
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR1
<400> 47 cattacgaga tggtt 15
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR1
<400> 48
<210> 49
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR2
<400> 49 tctatccgtt cttctggtgg cgctactaag tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR2
<400> 50
<210> 51
<211> 27
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR3
<400> 51 gagtcgccag acgactactt tgactac 27
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VH-CDR3
<400> 52
<210> 53
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR1
<400> 53 cagtacccta tggag 15
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR1
<400> 54
<210> 55 35 <211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR2
<400> 55 ggtatctatc cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 56
<211> 17
<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR2
<400> 56
<210> 57
<211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR3
<400> 57 gcggggcagt ggctggggga ctttgactac 30
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VH-CDR3
<400> 58
15 <210> 59
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR1
<400> 59 atgtactcta tggtt 15
<210> 60
<211>
5 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR1
<400> 60
<210> 61
<211>
51 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR2
<400> 61 tatatctctc cttctggtgg caagactatg tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR2
<400> 62
<210> 63
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR3 55 <400> 63
<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VH-CDR3
<400> 64
10 <210> 65
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR1
<400> 65 cgttacaata tgggt 15
<210> 66
<211> 5 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR1
<400> 66
<210> 67
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR2
<400> 67 gttatctatc cttctggtgg cggtactcat tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 68 35 <211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR2 40 <400> 68
<210> 69
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR3
<400> 69 tctatagcag atgatgcttt tgatatc 27
137 <210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li04 que codifica VH-CDR3
<400> 70
<210> 71
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR1
<400> 71 acttacgaga tgatt 15
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR1
<400> 72
<210> 73
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR2
<400> 73 tctatcggtc cttctggtgg ccttacttgg tatgctgact ccgttaaa 48
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR2
<400> 74
<210> 75
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR3
<400> 75 atgtattact gtgtacggat tgatgatagt agtggttggg cttttgatat c 51
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VH-CDR3
<400> 76
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VH-CDR1
<400> 77
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VH-CDR2
<400> 78
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VH-CDR3
<400> 79
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VH-CDR1
<400> 80
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VH-CDR2
<400> 81
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VH-CDR3
<400> 82
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 o 3P1E11.3B7 que codifica VH-CDR1
<400> 83
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 o 3P1E11.3B7 que codifica VH-CDR2
<400> 84
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 25 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 o 3P1E11.3B7 que codifica VH-CDR3
<400> 85
<210> 86
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR1
35 <400> 86 cgggcgagtc agggtattgg caactggtta gcc 33
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR1
<400> 87
45 <210> 88
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR2
<400> 88 gctgcatcca gtttggaaag t 21
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR2
<400> 89
<210> 90
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR3
<400> 90 caacaggctc agactttccc gctcacc 27
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li10 que codifica VL-CDR3
<400> 91
<210> 92
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR1
<400> 92 tctggagatc agttgggtga caaacatgtg gct 33
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR1
<400> 93
<210> 94
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR2
<400> 94 ctagacatta agaggcccgc a 21
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR2
<400> 95
<210> 96
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR3
<400> 96 caggcgtggg acatcaagac ggtc 24
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li07 que codifica VL-CDR3
<400> 97
<210> 98
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR1
<400> 98 gggggagaca acattggaag taagagtgtc cac 33
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR1
<400> 99
<210> 100
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR2
<400> 100 gatgattatg accggccctc a 21
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR2
<400> 101
<210> 102
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR3
<400> 102 caggtgaggg acagccgtac tgaggaacgg gtg 33
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li05 que codifica VL-CDR3
<400> 103
<210> 104
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR1
<400> 104 cgggcgagtc aggagattgc caactactta gcc 33
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR1
<400> 105
<210> 106
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR2
<400> 106 gatacataca ctttgcagac t 21
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR2
<400> 107
<210> 108
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR3
<400> 108 caacaggctg acattttccc gctctct 27
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li11 que codifica VL-CDR3
<400> 109
<210> 110
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR1
<400> 110 caggcgagtc aggacattag caactattta aa 32
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR1
<400> 111
<210> 112
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR2
<400> 112 gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR2
<400> 113
<210> 114
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR3
<400> 114 caacaggctg acaggttccc tgcggtcact 30
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li01 que codifica VL-CDR3
<400> 115
<210> 116
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR1
<400> 116 cgggccagtc agagtattag tagctggttg gcc 33
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR1
<400> 117
<210> 118
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR2
<400> 118 gctgcatcca gtttacgaac t 21
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR2
<400> 119
<210> 120
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR3
<400> 120 ctacaagatt acagttaccc tctcact 27
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li06 que codifica VL-CDR3
<400> 121
<210> 122
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR1
<400> 122 caggcgagtc aggacattag ttactattta aat 33
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR1
<400> 123
<210> 124
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR2
<400> 124 gatgtatcca atttgcaaac a 21
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR2
<400> 125
<210> 126
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR3
<400> 126 caacagtctg ataatctccc tctcact 27
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li08 que codifica VL-CDR3
<400> 127
<210> 128
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR1
<400> 128 gggcaagtca gagcattagc agctatttaa at 32
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR1
<400> 129
<210> 130
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR2
<400> 130 gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR2
<400> 131
<210> 132
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR3
<400> 132 caacagagtt acagtacccc gtggacg 27
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li03 que codifica VL-CDR3
<400> 133
<210> 134
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR1
<400> 134 cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta aat 33
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR1
<400> 135
<210> 136
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR2
<400> 136 gctgcatcca agttggaaga c 21
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR2
<400> 137
<210> 138
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR3
<400> 138 caacagagtt acagtccccc tctcac 26
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li09 que codifica VL-CDR3
<400> 139
<210> 140
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR1
<400> 140 tctggagata aattggggga taaatttgct tcc 33
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR1
<400> 141
<210> 142
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR2
<400> 142 caagatagga agcgtctctc a 21
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR2
<400> 143
<210> 144
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR3
<400> 144 caggcgtggg acaccaacac tgtggtc 27
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li02 que codifica VL-CDR3
<400> 145
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VL-CDR1
<400> 146
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VL-CDR2
<400> 147
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 1A7 que codifica VL-CDR3
<400> 148
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VL-CDR1
<400> 149
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VL-CDR2
<400> 150
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 2F3 que codifica VL-CDR3
<400> 151
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 que codifica VL-CDR1
<400> 152
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 que codifica VL-CDR2
<400> 153
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1D10.2C3 que codifica VL-CDR3
<400> 154
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1E11.3B7 que codifica VL-CDR1
<400> 155
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1E11.3B7 que codifica VL-CDR2
<400> 156
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3P1E11.3B7 que codifica VL-CDR3
<400> 157
<210> 158
<211> 133
<212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li02
<400> 158
<210> 159
<211> 145
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li09
<400> 159
<210> 160
<211> 131
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li06
<400> 160
<210> 161
<211> 131
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li05
<400> 161
<210> 162
<211> 131
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li04
<400> 162
<210> 163
<211> 131
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li08
<400> 163
10 <210> 164
<211> 134
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li11
<400> 164
<210> 165
<211> 133
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li10
<400> 165
<210> 166
<211> 131
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li01
<400> 166
<210> 167
<211> 129
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li07
<400> 167
<210> 168
<211> 132
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li03
<400> 168
<210> 169
<211> 145
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li12
<400> 169
<210> 170
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable 1A7
<210> 171 10 <211> 115
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable 2F3 15 <400> 171
<210> 172
<211> 117
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable 3P1D10.2C3 y 3P1E11.3B7
<210> 173
<211> 399
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li02
<400> 173
<210> 174 10 <211> 435
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li09 15 <400> 174
<210> 175
<211> 393
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li06
<400> 175
<210> 176
<211> 393
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li05
<400> 176
<210> 177
<211> 393
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li04
<400> 177
<210> 178
<211> 393
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li08
<400> 178
<210> 179
<211> 402
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li11
<400> 179
5 <210> 180
<211> 399
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li10
<400> 180
15 <210> 181
<211> 393
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li01
<400> 181
<210> 182
<211> 387
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li07
<400> 182
<210> 183
<211> 396
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li03
<400> 183
<210> 184
<211> 435
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li12
<400> 184
<210> 185
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li02
<400> 185
<210> 186
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li09
<400> 186
10 <210> 187
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li06
<400> 187
<210> 188
<211> 363 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li05 25 <400> 188
<210> 189
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li08
<400> 189
10 <210> 190
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li11
<400> 190
<210> 191
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li10
<400> 191
<210> 192
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li01
<400> 192
10 <210> 193
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li07
<400> 193
<210> 194
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li03
<400> 194
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VH-CDR1 10 <400> 195
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VH-CDR2
<400> 196
20 <210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VH-CDR3
<400> 197
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VH-CDR1
<400> 198
<210> 199
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 40 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VH-CDR2
<400> 199
<210> 200 45 <211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VH-CDR3
<400> 200
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VH-CDR1
<400> 201
<210> 202
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VH-CDR2
<400> 202
<210> 203
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VH-CDR3
<400> 203
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VH-CDR1
<400> 204
<210> 205
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VH-CDR2
<400> 205
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VH-CDR3
<400> 206
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VH-CDR1
<400> 207
<210> 208
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VH-CDR2
<400> 208
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VH-CDR3
<400> 209
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VH-CDR1
<400> 210
<210> 211
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VH-CDR2
<400> 211
<210> 212
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VH-CDR3
<400> 212
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VH-CDR1
<400> 213
15 <210> 214
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VH-CDR2
<400> 214
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VH-CDR3
<400> 215
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 35 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VH-CDR1
<400> 216
<210> 217 40 <211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VH-CDR2 45 <400> 217
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VH-CDR3
<400> 218
<210> 219
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VH-CDR1
<400> 219
<210> 220
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VH-CDR2
<400> 220
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VH-CDR3
<400> 221
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VH-CDR1
<400> 222
<210> 223
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VH-CDR2
<400> 223 <210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VH-CDR3
<400> 224
<210> 225
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VH-CDR1
<400> 225
<210> 226
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VH-CDR2
<400> 226
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VH-CDR3
<400> 227
<210> 228
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VH-CDR1
<400> 228
<210> 229
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VH-CDR2
<400> 229
<210> 230
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VH-CDR3
<400> 230
<210> 231
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VH-CDR1
<400> 231
<210> 232
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VH-CDR2
<400> 232
<210> 233
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VH-CDR3
<400> 233
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VL-CDR1
<400> 234
<210> 235
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VL-CDR2
<400> 235
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.01 que codifica VL-CDR3
<400> 236
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VL-CDR2
<400> 237
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VL-CDR2
<400> 238
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.02 que codifica VL-CDR3
<400> 239
<210> 240
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VL-CDR1
<400> 240
<210> 241
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VL-CDR2
<400> 241
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.03 que codifica VL-CDR3
<400> 242
<210> 243
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VL-CDR1
<400> 243
<210> 244
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VL-CDR2
<400> 244
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.04 que codifica VL-CDR3
<400> 245
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VL-CDR1
<400> 246
<210> 247
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VL-CDR2
<400> 247
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.05 que codifica VL-CDR3
<400> 248
<210> 249
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VL-CDR1
<400> 249
<210> 250
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VL-CDR2
<400> 250
<210> 251
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.06 que codifica VL-CDR3
<400> 251
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VL-CDR1
<400> 252
<210> 253
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VL-CDR2
<400> 253
<210> 254
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.07 que codifica VL-CDR3
<400> 254
<210> 255
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VL-CDR1
<400> 255
<210> 256
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VL-CDR2
<400> 256 <210> 257
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.08 que codifica VL-CDR3
<400> 257
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VL-CDR1
<400> 258
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VL-CDR2
<400> 259
<210> 260
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.09 que codifica VL-CDR3
<400> 260
<210> 261
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VL-CDR1
<400> 261
<210> 262
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VL-CDR2
<400> 262
<210> 263
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.10 que codifica VL-CDR3
<400> 263
<210> 264
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VL-CDR1
<400> 264
<210> 265
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VL-CDR2
<400> 265
<210> 266
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.11 que codifica VL-CDR3
<400> 266
<210> 267
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VL-CDR1
<400> 267
<210> 268
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VL-CDR2
<400> 268
<210> 269
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.12 que codifica VL-CDR3
<400> 269
<210> 270
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VL-CDR1
<400> 270
<210> 271
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VL-CDR2
<400> 271
<210> 272 15 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo L1a.13 que codifica VL-CDR3 20 <400> 272
<210> 273
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li02
<400> 273
<210> 274
<211> 120
<212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li09
<400> 274
<210> 275
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li06
<400> 275
<210> 276
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li05
<400> 276
<210> 277
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li08
<400> 277
<210> 278
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<210> 279
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li10
<400> 279
<210> 280
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li01
<400> 280
10 <210> 281
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li07
<400> 281
<210> 282
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li03
<400> 282
<210> 283
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 1A7
<400> 283
10 <210> 284
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 2F3
<400> 284
<210> 285
<211> 114
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 3P1D10.2C3
<400> 285
<210> 286
<211> 114
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 3P1E11.3B7
<400> 286
<210> 287
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento sintético de péptido Sp35
<220>
<221> variante
<222> (3)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 287
<210> 288
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 288
<210> 289
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante <222> (3)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 289
<210> 290
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 290
<210> 291
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 291
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 292
<210> 293
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 293
<210> 294
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 294
<210> 295
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 295 <210> 296
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 296
<210> 297
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 297
<210> 298
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 298
<210> 299
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 299
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 300
<210> 301
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 301
<210> 302
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 302
<210> 303
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 303
<210> 304
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 304
<210> 305
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 305
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 306
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 307
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 308
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 309
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 310
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 311
<210> 312
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 312
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 313
<210> 314
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 314
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 315
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 316
<210> 317
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 317
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 318
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 319 Trp Leu Ser Pro His His His
<210> 320
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 320
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 321
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 322 <210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 323
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 324
<210> 325
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 325
<210> 326
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 326
<210> 327
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 327 <210> 328
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 328
<210> 329
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 329
<210> 330
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 330
<210> 331
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 331
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220> <221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 332
<210> 333
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (1)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<400> 333
<210> 334
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(3)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<220>
<221> variante
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<220>
<221> variante
<222> (5)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 334
<210> 335
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(3)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<220>
<221> variante
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<220>
<221> variante
<222> (5)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 335 <210> 336
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(3)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<220>
<221> variante
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<220>
<221> variante
<222> (5)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 336
<210> 337
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<220>
<221> variante
<222> (3)..(3)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<220>
<221> variante
<222> (4)..(4)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
<220>
<221> variante
<222> (5)..(5)
<223> puede ser Arg, His, Gln o Asn
<400> 337
<210> 338
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 338 Ser Pro Arg Leu His
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 339
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 340
<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 341
<210> 342
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 342
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de péptido Sp35 sintético
<400> 343
<210> 344
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo sintético utilizado para mostrar expresión de Sp35
<400> 344 agagacatgc gattggtga 19
<210> 345
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso sintético utilizado para mostrar expresión de Sp35
<400> 345 agagatgtag acgaggtcat t 21
<210> 346
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Nucleótido ARNi Sp35 sintético
<400> 346 tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc 55
<210> 347
<211> 59
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Nucleótido ARNi Sp35 sintético
<400> 347 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59
<210> 348
<211> 59
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Nucleótido ARNi Sp35 sintético
<400> 348 tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59
<210> 349
<211> 59
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Nucleótido ARNi Sp35 sintético
<400> 349 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59
<210> 350
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar Sp35 de longitud completa de ratón
<400> 350 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 351
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar Sp35 de longitud completa de ratón
<400> 351 ggggcggaat tggatcctca cagatcctct tctgagatga g 41
<210> 352
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar Sp35 dominante negativo
<400> 352 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 353
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar Sp35 dominante negativo
<400> 353 gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc 42
<210> 354
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para obtener secuencia codificadora parcial para Sp35 humano
<400> 354 cagcaggtcg acgcggccgc atgctggcgg ggggcgt 37
<210> 355
<211> 59
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para obtener secuencia codificadora parcial para Sp35 humano
<400> 355 cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg 59
<210> 356
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena ligera del P1E11.3B7
<400> 356 ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag 39
<210> 357
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena ligera del P1E11.3B7
<400> 357 ggggatatcc accatgragt cacakacyca ggtcttyrta 40
<210> 358
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena ligera del P1E11.3B7
<400> 358 ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37
<210> 359
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena ligera del P1E11.3B7
<400> 359 ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga 40
<210> 360
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena pesada del P1E11.3B7
<400> 360 ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt 39
<210> 361
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena pesada del P1E11.3B7
<400> 361 ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210> 362
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena pesada del P1E11.3B7
<400> 362 ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 38
<210> 363
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para determinar la secuencia de la cadena pesada del P1E11.3B7
<400> 363 aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 364
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético universal de cadena pesada
<400> 364 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
<210> 365
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético universal de cadena pesada
<400> 365 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34
<210> 366
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético de secuencia señal degenerado
<220>
<221> variación
<222> (21)..(21)
<223> n puede ser a, g, c, t, o u
<220>
<221> variación
<222> (24)..(24)
<223> n puede ser a, g, c, t, o u
<400> 366 atggartgya aytggathct nccnttya 28
<210> 367
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético de dominio constante
<400> 367 aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 368
<211> 66
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar MOG en rata
<400> 368
<210> 369
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Cebador sintético utilizado para amplificar MOG en rata
<400> 369 ttcgcggccg ctattagcca gggttgatcc agtagaaggg 40
<210> 370 15 <211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li13 20 <400> 370
<210> 371
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li13
<400> 371
30 <210> 372
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li13
<400> 372
<210> 373
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li13
<400> 373
<210> 374
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li32
<400> 374
<210> 375
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li32
<400> 375
<210> 376 15 <211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li32 20 <400> 376
<210> 377
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li32
<400> 377
<210> 378
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li33
<400> 378
<210> 379
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li33
<400> 379
<210> 380 15 <211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li33 20 <400> 380
<210> 381
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li33
<400> 381
<400> 382
<210> 383
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li34
<400> 383
<210> 384
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li34
<400> 384
<210> 385
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li34
<400> 385
10 <210> 386
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VL-CDR1
<400> 386
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VL-CDR2
<400> 387
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VL-CDR3
<400> 388
<210> 389
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VH-CDR1
<400> 389
<210> 390
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 25 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VH-CDR2
<400> 390
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li13 que codifica VH-CDR3
<400> 391
<210> 392
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VL-CDR1
<400> 392
<210> 393
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VL-CDR2
<400> 393
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VL-CDR3
<400> 394
<210> 395
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VH-CDR1
<400> 395
<210> 396
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VH-CDR2
<400> 396
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li32 que codifica VH-CDR3
<400> 397
<210> 398
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VL-CDR1
<400> 398
<210> 399
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VL-CDR2
<400> 399
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VL-CDR3
<400> 400
<210> 401
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VH-CDR1
<400> 401
<210> 402
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VH-CDR2
<400> 402
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li33 que codifica VH-CDR3
<400> 403
<210> 404
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VL-CDR1
<400> 404
<210> 405
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VL-CDR2
<400> 405
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VL-CDR3
<400> 406
<210> 407
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VH-CDR1
<400> 407
<210> 408
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VH-CDR2
<400> 408
<210> 409
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li34 que codifica VH-CDR3
<400> 409
<210> 410
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR1
<400> 410
<210> 411
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR2
<400> 411
<210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR3
<400> 412
<210> 413 5 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR1 10 <400> 413
<210> 414
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR2
<400> 414
20 <210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR3
<400> 415
<210> 416
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena pesada variable 3B5.2 sintética
<400> 416
<210> 417
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 3B5.2
<400> 417
10 <210> 418
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia consenso sintética de cadena ligera kappa murina y humana
<400> 418
<210> 419
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 3B5.2 mutante
<400> 419
5 <210> 420
<211> 1404
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 quimérico humano y murino
<400> 420
<210> 421
<211> 708
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 quimérico humano y murino
<400> 421
<210> 422
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable 3B5.2
<400> 422
10 <210> 423
<211> 318
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia sintética de cadena ligera variable 3B5.2
<400> 423
<210> 424
<211> 15 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR1
<400> 424 25 agctactgga tgcac 15
<210> 425
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR2
<400> 425 gtgattgatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcagggg c 51
<210>
426 35 <211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VH-CDR3
<400> 426 ccttactacg gtagtcactg gttcttcgat gtc 33
<210>
427 5 <211> 30
220 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR1
10 <400> 427 agtgccagct cacgtgtaag ttacgtgcac 30
<210> 428
<211> 21
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR2
<400> 428
gacacatcca acctggcttc t 21 20 <210> 429
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Secuencia sintética de anticuerpo 3B5.2 que codifica VL-CDR3
<400> 429 cagcagtgga gtactaaccc acccacg 27
<210> 430
<211> 106 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variante de cadena ligera sintética 1
<400> 430
<210> 431
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variante de cadena ligera sintética 2
<400> 431
<210> 432 10 <211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variante de cadena pesada sintética 2 15 <400> 432
<210> 433
<211> 447
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li81
<400> 433
<210> 434
<211> 215
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li81
<400> 434
<210> 435
<211> 447
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable aglicosilada Li81
<400> 435
<210> 436
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR1
<400> 436
<210> 437
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR2
<400> 437
<210> 438
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR3
<400> 438
<210> 439
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR1
<400> 439 gcttacgaga tgaag 15
<210> 440
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR2
<400> 440 gttatcggtc cttctggtgg ctttactttt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 441
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VH-CDR3
<400> 441 gagggtgata atgatgcttt tgatatc 27
<210> 442
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR1
<400> 442
<210> 443
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR2
<400> 443
<210> 444
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR3
<400> 444
<210> 445
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR1
<400> 445 agggccagtc agagtgttag cagctactta gcc 33
<210> 446
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR2
<400> 446
gatgcatcca acagggccac t 21 5 <210> 447
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Secuencia sintética de anticuerpo Li81 que codifica VL-CDR3
<400> 447 cagcagcgta gcaactggcc gatgtacact 30
<210> 448
<211> 1341 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable Li81
<400> 448
<210> 449
<211> 648
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable Li81
<400> 449
<210> 450
<211> 1341
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable aglicosilada Li81
<400> 450 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable subgrupo kappa 6 murina 10 <400> 451
<210> 452
<211> 96
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable subgrupo HVMS murina
<400> 452
<210> 453
<211> 96
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia consenso sintética murina
<220>
<221> variante 20 <222> (2)..(2)
<223> puede ser Val
<220>
<221> variante
<222> (54)..(54)
<223> puede ser Glu
<220>
<221> variante
<222> (61)..(61) 5 <223> puede ser Ala
<220>
<221> variante
<222> (62)..(62)
<223> puede ser Asp 10 <220>
<221> variante
<222> (65)..(65)
<223> puede ser Lys
<220> 15 <221> variante
<222> (79)..(79)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> variante 20 <222> (83)..(83)
<223> puede ser Ile
<400> 453
<210> 454
<211> 96
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Línea germinal VGK6 murina
<400> 454
<210> 455
<211> 94
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena ligera variable subgrupo kappa 3 humana
<400> 455
<210> 456
<211> 95
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia consenso sintética
<220>
<221> Variante 20 <222> (10)..(10)
<223> puede ser Thr
<220>
<221> variante
<222> (11)..(11) 25 <223> puede ser Leucina <220>
<221> Variante
<222> (13)..(13)
<223> puede ser Leu
<220>
<221> Variante
<222> (18)..(18)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> Variante
<222> (19)..(19)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> Variante
<222> (21)..(21)
<223> puede ser Leu
<220>
<221> Variante
<222> (22)..(22)
<223> puede ser Ser
<220>
<221> Variante
<222> (24)..(24)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> Variante
<222> (27)..(27)
<223> puede ser Gln
<220>
<221> Variante
<222> (31)..(31)
<223> puede estar ausente
<220>
<221> Variante
<222> (33)..(33)
<223> puede ser Leu
<220>
<221> Variante
<222> (34)..(34)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> Variante
<222> (40)..(40)
<223> puede ser Pro
<220>
<221> Variante
<222> (42)..(42)
<223> puede ser Gln
<220>
<221> Variante
<222> (43)..(43)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> Variante
<222> (45)..(45)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> Variante
<222> (46)..(46)
<223> puede ser Leu <220>
<221> Variante
<222> (47)..(47)
<223> puede ser Leu
<220>
<221> Variante
<222> (51)..(51)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> Variante
<222> (53)..(53)
<223> puede ser Asn
<220>
<221> Variante
<222> (54)..(54)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> Variante
<222> (56)..(56)
<223> puede ser Thr
<220>
<221> Variante
<222> (58)..(58)
<223> puede ser Ile
<220>
<221> Variante
<222> (70)..(70)
<223> puede ser Asp
<220>
<221> Variante
<222> (71)..(71)
<223> puede ser Phe
<220>
<221> Variante
<222> (72)..(72)
<223> puede ser Thr
<220>
<221> Variante
<222> (78)..(78)
<223> puede ser Leu
<220>
<221> Variante
<222> (80)..(80)
<223> puede ser Pro
<220>
<221> Variante
<222> (83)..(83)
<223> puede ser Phe
<220>
<221> Variante
<222> (85)..(85)
<223> puede ser Val
<220>
<221> Variante
<222> (91)..(91)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> Variante
<222> (93)..(93)
<223> puede ser Asn
<220>
<221> Variante
<222> (94)..(94)
<223> puede ser Trp
<400> 456
<210> 457
<211> 95
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Línea germinal L6 humana
<400> 457
15 <210> 458
<211> 98
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Secuencia sintética de cadena pesada variable subgrupo MHV1 humana
<400> 458
<210> 459
<211> 98
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia consenso sintética
<220>
<221> variante
<222> (9)..(9)
<223> puede ser His
<220>
<221> variante
<222> (11)..(11)
<223> puede ser Val
<220>
<221> variante
<222> (13)..(13)
<223> puede ser Gln
<220>
<221> variante
<222> (16)..(16)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> variante
<222> (17)..(17)
<223> puede ser Ser
<220>
<221> variante
<222> (20)..(20)
<223> puede ser Val
<220>
<221> variante
<222> (28)..(28)
<223> puede ser Ser
<220>
<221> variante
<222> (31)..(31)
<223> puede ser Thr
<220>
<221> variante
<222> (38)..(38)
<223> puede ser Pro
<220>
<221> variante
<222> (43)..(43)
<223> puede ser Gln
<220>
<221> variante
<222> (46)..(46)
<223> puede ser Glu
<220>
<221> variante
<222> (51)..(51)
<223> puede ser Phe
<220>
<221> variante
<222> (54)..(54)
<223> puede ser Tyr
<220>
<221> variante
<222> (57)..(57)
<223> puede ser Arg
<220>
<221> variante
<222> (61)..(61)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> variante
<222> (63)..(63)
<223> puede ser Gly
<220>
<221> variante
<222> (65)..(65)
<223> puede ser Thr
<220>
<221> variante
<222> (69)..(69)
<223> puede ser Val
<220>
<221> variante
<222> (72)..(72)
<223> puede ser Met
<220>
<221> variante
<222> (73)..(73)
<223> puede ser Asp
<220>
<221> variante
<222> (79).. (79)
<223> puede ser Ala
<220>
<221> variante
<222> (83)..(83)
<223> puede ser Ile
<220>
<221> variante
<222> (84)..(84)
<223> puede ser Ser
<220>
<221> variante
<222> (85)..(85) 5 <223> puede ser Ser
<220>
<221> variante
<222> (88)..(88)
<223> puede ser Ala 10 <220>
<221> variante
<222> (91)..(91)
<223> puede ser Met
<220> 15 <221> variante
<222> (93)..(93)
<223> puede ser Met
<220>
<221> variante 20 <222> (95)..(95)
<223> puede ser Tyr
<400> 459
<210> 460
<211> 98
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Línea germinal huVH7-81 humana
<400> 460
<210> 461
<211> 1395
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena pesada huP1A7-IgG1 H2 humana
<400> 461
<210> 462
<211> 464
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena pesada huP1A7 H2 humana
<400> 462
<210> 463
<211> 708
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena ligera kappa huP1A7 L1 humana
<400> 463
<210> 464
<211> 235
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena ligera huP1A7 L1 humana
<400> 464
<210> 465
<211> 708
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena ligera kappa huP1A7 L2 humana
<400> 465
10 <210> 466
<211> 235
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Secuencia de cadena ligera huP1A7 L2 humana
<400> 466
<210> 467
<211> 708
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena ligera kappa chP1A7 quimérica humana y murina
<400> 467 <210> 468
<211> 235
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena ligera chP1A7 quimérica humana y murina
<400> 468 <210> 469
<211> 1395
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena pesada chP1A7 huIgG1 quimérica humana y murina
<400> 469 <210> 470
<211> 464
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cadena pesada chP1A7 quimérica humana y murina
<400> 470
<210> 471
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220
<220>
<223> Variante de cadena ligera sintética 3
<400> 471
<210> 472
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Variante de cadena pesada sintética 1
<400> 472
<210> 473
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variante de cadena pesada sintética 3
<400> 473
<210> 474
<211> 466
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia sintética de cadena pesada variable aglicosilada Li81
<400> 474

Claims (31)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo comprende:
    una región VH que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH indicadas en SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 438, respectivamente; y
    una región VL que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL indicadas en SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 y SEQ ID NO: 444, respectivamente,
    donde el anticuerpo se une al polipéptido Sp35 con una afinidad caracterizada por una constante de disociación no mayor que 5 x 10-10 M medido mediante FACS en células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 humano, y
    donde el anticuerpo es IgG1/kappa.
  2. 2.
    Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la región VL de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la región VH de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 433.
  3. 3.
    Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 435.
  4. 4.
    El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 435.
  5. 5.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está fusionado con una fracción de direccionamiento encefálico.
  6. 6.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, donde la fracción de direccionamiento encefálico se selecciona de entre el grupo que consiste en el anticuerpo de dominio único FC5, el anticuerpo monoclonal mAB 83-14 para el receptor de insulina humana, un péptido B2 que se une al receptor de transferrina humana, un péptido B6 que se une al receptor de transferrina humana y un péptido B8 que se une al receptor de transferrina humana, receptor anti-Fc, transferrina y receptor anti-insulina.
  7. 7.
    Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 7, donde la composición se formula para administración parenteral.
  9. 9.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la esclerosis múltiple en un sujeto humano.
  10. 10.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la neuritis óptica en un sujeto humano.
  11. 11.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la neuropatía óptica isquémica aguda en un sujeto humano.
  12. 12.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar el accidente cerebrovascular en un sujeto humano.
  13. 13.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la mielitis transversa en un sujeto humano.
  14. 14.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar una lesión por traumatismo craneoencefálico en un sujeto humano.
  15. 15.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar una lesión de la médula espinal en un sujeto humano.
  16. 16.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto humano.
  17. 17.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la adrenoleucodistrofia en un sujeto humano.
  18. 18.
    Uso del anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para tratar la leucodistrofia metacromática en un sujeto humano.
  19. 19.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple en un sujeto humano.
  20. 20.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la neuritis óptica en un sujeto humano.
  21. 21.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la neuropatía óptica isquémica aguda en un sujeto humano.
  22. 22.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de un accidente cerebrovascular en un sujeto humano.
  23. 23.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la mielitis transversa en un sujeto humano.
  24. 24.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de una lesión por traumatismo craneoencefálico en un sujeto humano.
  25. 25.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de una lesión de la médula espinal en un sujeto humano.
  26. 26.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto humano.
  27. 27.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la adrenoleucodistrofia en un sujeto humano.
  28. 28.
    El anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso en el tratamiento de la leucodistrofia metacromática en un sujeto humano.
  29. 29.
    Un anticuerpo monocatenario que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID NO: 2), donde el anticuerpo monocatenario comprende:
    una región VH que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VH indicadas en SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 438, respectivamente; y
    una región VL que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL indicadas en SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 y SEQ ID NO: 444, respectivamente,
    5 donde el anticuerpo se une al polipéptido Sp35 con una afinidad caracterizada por una constante de disociación no mayor que 5 x 10-10 M medido mediante FACS en células CHO transfectadas de forma estable con Sp35 humano.
  30. 30. Un anticuerpo monocatenario que puede unirse específicamente al polipéptido Sp35 humano (SEQ ID
    10 NO: 2), donde el anticuerpo monocatenario comprende la región VL de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 434 y la región VH de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 433.
  31. 31. El anticuerpo monocatenario de acuerdo con la reivindicación 29 o 30, donde el anticuerpo
    monocatenario es un scFv. 15
ES14154372.8T 2007-01-09 2008-01-09 Anticuerpos Sp35 y usos de los mismos Active ES2673153T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87932407P 2007-01-09 2007-01-09
US879324P 2007-01-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2673153T3 true ES2673153T3 (es) 2018-06-20

Family

ID=39609291

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14154372.8T Active ES2673153T3 (es) 2007-01-09 2008-01-09 Anticuerpos Sp35 y usos de los mismos
ES08724452.1T Active ES2464815T3 (es) 2007-01-09 2008-01-09 Anticuerpos SP35 y usos de éstos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08724452.1T Active ES2464815T3 (es) 2007-01-09 2008-01-09 Anticuerpos SP35 y usos de éstos

Country Status (27)

Country Link
EP (2) EP2740744B1 (es)
JP (4) JP2010515456A (es)
KR (1) KR101496479B1 (es)
CN (2) CN101636168B (es)
AU (1) AU2008205244B2 (es)
BR (1) BRPI0806340B8 (es)
CA (1) CA2674603C (es)
CY (2) CY1115105T1 (es)
DK (2) DK2068887T3 (es)
EA (2) EA020508B9 (es)
ES (2) ES2673153T3 (es)
GE (1) GEP20125693B (es)
HK (2) HK1131067A1 (es)
HR (2) HRP20140475T1 (es)
HU (1) HUE036793T2 (es)
IL (1) IL199754A (es)
LT (1) LT2740744T (es)
MX (1) MX2009007375A (es)
NO (1) NO2740744T3 (es)
NZ (1) NZ577976A (es)
PL (2) PL2740744T3 (es)
PT (2) PT2740744T (es)
SG (1) SG177966A1 (es)
SI (2) SI2740744T1 (es)
TR (1) TR201807425T4 (es)
UA (1) UA99120C2 (es)
WO (1) WO2008086006A2 (es)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7785829B2 (en) 2003-03-19 2010-08-31 Biogen Idec Ma, Inc. Nogo receptor binding protein
BRPI0512500A (pt) 2004-06-24 2008-03-11 Biogen Idec Inc tratamento ou condições envolvendo desmielinação
BRPI0613387A2 (pt) 2005-07-08 2011-01-11 Biogen Idec Inc anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antìgeno deste e o seu uso, polinucleotìdeo isolado, composição, vetor, célula hospedeira, anticorpo anti-sp35 e método para a produção do mesmo, polipeptìdeo isolado, método in vitro para redução da inibição do crescimento axonal e método in vitro para inibição do crescimento do colapso do cone
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
NZ590605A (en) 2008-07-09 2012-11-30 Biogen Idec Inc Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
CA2742817A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Arginine inactivation of viruses
DK2483289T3 (da) 2009-10-02 2019-06-11 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder til forebyggelse og fjernelse af trisulfidbindinger
JP6236383B2 (ja) 2011-05-13 2017-11-22 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． トリスルフィド結合を防止および除去する方法
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
WO2013173364A2 (en) 2012-05-14 2013-11-21 Biogen Idec Ma Inc. Lingo-2 antagonists for treatment of conditions involving motor neurons
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
KR20210063443A (ko) * 2012-10-09 2021-06-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 탈수초성 질환의 치료를 위한 복합 요법 및 용도
EP2983701A2 (en) 2013-03-11 2016-02-17 Genzyme Corporation Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
WO2015057939A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Biogen Idec Ma Inc. Anti-s1p4 antibodies and uses thereof
MX2016005687A (es) 2013-10-30 2017-03-30 Genzyme Corp Metodos para potenciar la terapia inmunosupresora mediante administracion multiple de polipeptido de union a tcr alfa beta.
SG10201808158UA (en) 2014-03-19 2018-10-30 Genzyme Corp Site-specific glycoengineering of targeting moieties
AU2015330869B2 (en) 2014-10-09 2021-07-08 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
JP2018504400A (ja) 2015-01-08 2018-02-15 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用
WO2016197009A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
MX2019000327A (es) * 2016-07-13 2019-04-11 Biogen Ma Inc Regímenes de dosificación de antagonistas de lingo-1 y usos para el tratamiento de trastornos desmielinizantes.
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
US20200031895A1 (en) 2016-12-16 2020-01-30 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
JP2022528045A (ja) * 2019-03-20 2022-06-08 グッド ティー セルズ、 インコーポレイテッド 脳神経系疾患の予防または治療用組成物
US11197910B1 (en) 2020-08-19 2021-12-14 Vitruviae LLC Fusion proteins for the diagnosis, prophylaxis and treatment of infectious diseases
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
EP4259658A1 (en) * 2020-12-10 2023-10-18 Wuxi Biologics Ireland Limited An antibody against p-cadherin and uses thereof
CN114805579B (zh) * 2022-06-08 2023-06-06 郑州大学 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL91501A (en) 1988-09-02 1998-03-10 Dyax Corp Generation of a variegated library of mutant potential binding proteins and screening of said library for proteins with a desired binding activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JP3583420B2 (ja) 1990-10-05 2004-11-04 メダレツクス・インコーポレーテツド 二特異的試薬を用いた標的免疫化
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
ES2093778T3 (es) 1991-04-26 1997-01-01 Surface Active Ltd Nuevos anticuerpos y metodos para su uso.
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
JPH07503124A (ja) 1991-06-14 1995-04-06 ゾーマ・コーポレーション 微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
DK0627940T3 (da) 1992-03-05 2003-09-01 Univ Texas Anvendelse af immunokonjugater til diagnose og/eller terapi af vaskulariserede tumorer
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
EP0669986B1 (en) 1992-11-13 2003-04-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
ATE300610T1 (de) 1994-01-31 2005-08-15 Univ Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
BR9808584A (pt) 1997-03-14 2000-05-23 Idec Pharma Corp Processo para integrar genes em sìtios especìficos em células de mamìferos via recombinação homóloga e vetores para obter os mesmos
JP3876002B2 (ja) 1997-04-14 2007-01-31 ミクロメート・アクチエンゲゼルシャフト 抗ヒト抗原受容体を産生するための斬新な方法およびそれらの使用
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
AU8619698A (en) 1997-07-25 1999-02-16 Ban C. H. Tsui Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
ATE352559T1 (de) 1998-12-08 2007-02-15 Biovation Ltd Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
CA2429544C (en) 2000-11-17 2010-10-19 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
US7785829B2 (en) 2003-03-19 2010-08-31 Biogen Idec Ma, Inc. Nogo receptor binding protein
CA2536408A1 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
BRPI0512500A (pt) 2004-06-24 2008-03-11 Biogen Idec Inc tratamento ou condições envolvendo desmielinação
KR100694862B1 (ko) 2004-07-20 2007-03-13 (주)인텔리안테크놀로지스 위성 안테나의 광대역 위성 탐색 장치 및 방법
BRPI0613387A2 (pt) * 2005-07-08 2011-01-11 Biogen Idec Inc anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antìgeno deste e o seu uso, polinucleotìdeo isolado, composição, vetor, célula hospedeira, anticorpo anti-sp35 e método para a produção do mesmo, polipeptìdeo isolado, método in vitro para redução da inibição do crescimento axonal e método in vitro para inibição do crescimento do colapso do cone
NZ590605A (en) * 2008-07-09 2012-11-30 Biogen Idec Inc Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20180596T1 (hr) 2018-07-27
WO2008086006A9 (en) 2008-09-12
DK2068887T3 (da) 2014-05-19
EP2068887B1 (en) 2014-03-12
HK1199041A1 (en) 2015-06-19
CA2674603C (en) 2016-03-29
NO2740744T3 (es) 2018-08-25
KR20090101958A (ko) 2009-09-29
EP2740744A2 (en) 2014-06-11
EP2068887A2 (en) 2009-06-17
KR101496479B1 (ko) 2015-02-26
BRPI0806340A2 (pt) 2011-09-06
EA020508B9 (ru) 2015-05-29
EA020508B1 (ru) 2014-11-28
EA200900971A1 (ru) 2010-02-26
EP2740744B1 (en) 2018-03-28
WO2008086006A2 (en) 2008-07-17
CA2674603A1 (en) 2008-07-17
CN103360495A (zh) 2013-10-23
SI2740744T1 (en) 2018-06-29
GEP20125693B (en) 2012-11-26
CY1115105T1 (el) 2016-12-14
JP2010515456A (ja) 2010-05-13
JP5716206B2 (ja) 2015-05-13
EA201490693A1 (ru) 2014-10-30
EP2068887A4 (en) 2010-11-03
HUE036793T2 (hu) 2018-07-30
CY1120285T1 (el) 2019-07-10
BRPI0806340B1 (pt) 2020-06-02
IL199754A0 (en) 2010-04-15
DK2740744T3 (da) 2018-04-23
JP2015180704A (ja) 2015-10-15
AU2008205244A1 (en) 2008-07-17
SG177966A1 (en) 2012-02-28
BRPI0806340B8 (pt) 2021-05-25
CN103360495B (zh) 2016-06-08
PL2068887T3 (pl) 2014-09-30
HK1131067A1 (en) 2010-01-15
CN101636168A (zh) 2010-01-27
JP5847881B2 (ja) 2016-01-27
HRP20140475T1 (hr) 2014-06-20
EA036660B1 (ru) 2020-12-04
PL2740744T3 (pl) 2019-01-31
EP2740744A3 (en) 2014-09-10
IL199754A (en) 2015-07-30
MX2009007375A (es) 2009-07-21
AU2008205244B2 (en) 2013-02-07
PT2068887E (pt) 2014-06-23
ES2464815T3 (es) 2014-06-04
PT2740744T (pt) 2018-06-06
TR201807425T4 (tr) 2018-06-21
SI2068887T1 (sl) 2014-06-30
CN101636168B (zh) 2013-05-29
NZ577976A (en) 2011-12-22
UA99120C2 (en) 2012-07-25
LT2740744T (lt) 2018-05-10
JP2013135695A (ja) 2013-07-11
JP2014155501A (ja) 2014-08-28
WO2008086006A3 (en) 2008-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2673153T3 (es) Anticuerpos Sp35 y usos de los mismos
US20210395360A1 (en) SP35 Antibodies And Uses Thereof
ES2434470T3 (es) Anticuerpos SP35 y usos de éstos
US9745375B2 (en) Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
JP2010515456A5 (es)
AU2013200333A1 (en) Sp35 Antibodies and Uses Thereof