BRPI0806340A2 - anticorpos de sp35 e usos dos mesmos - Google Patents

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Blake R Pepinsky
Zhaohui Shao
Ellen A Garber
Steven D Miklasz
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Abstract

ANTICORPOS DE 5P35 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção redere-se a Sp35 endógeno, que é um regulador negativo para sobrevivência neuronal, regeneração dos axónios, diferenciação e mielinização dos oligodendrócitos. Moléculas que bloqueiam a função de Sp35 endógeno, tais anticorpos de antiSp35 podem ser usados como terapêuticas para o tratamento de disfunção dos neurónios e dos oh-godendrócitos. A presente invenção provê anticorpos específicos para Sp35, e métodos de usar tais anticorpos como antagonistas da função de Sp35 endógeno. A invenção também provê anticorpos monoclonais derivados de hibridomas específicos e de biblioteca de fago, ácidos nucleicos codificando estes anticorpos, e vetores e células hospedeiras compreendendo estes anticorpos. A invenção também provê métodos de promover sobrevivência e mielinização dos oligodendrócitos em um vertebrado, compreendendo administrar a um vertebrado em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo de antiSp35.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS DE SP35 E USOS DOS MESMOS".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à neurologia, neurobiologia e bio-
logia molecular. Mais particularmente, esta invenção refere-se a moléculas e métodos para tratamento de doenças, distúrbios e lesões neurológicas tais como lesão da espinha dorsal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Axônios e dendritos estendem-se dos neurônios. A ponta distai de um axônio extensor ou neurite inclui uma região especializada, conhecida como o cone de crescimento. Cones de crescimento sentem o ambiente lo- cal e guiam o crescimento axonal para a célula-alvo de um neurônio. Cones de crescimento respondem às sugestões ambientais, por exemplo, adesivi- dade da superfície, fatores de crescimento, neurotransmissores e campos elétricos. Os cones de crescimento em geral avançam para uma taxa de um a dois milímetros por dia. O cone de crescimento explora a área à frente dele e em ambos os lados, por meio de alongamentos classificados como Iameli- pódios e filopódios. Quando um alongamento contata uma superfície desfa- vorável, recolhe-se. Quando um alongamento contata uma superfície de crescimento favorável, ele continua estendendo-se e guiando o cone de crescimento naquela direção. Quando o cone de crescimento alcança uma célula-alvo apropriada uma conexão sináptica é criada.
Função das células nervosas é influenciada pelo contato entre os neurônios e outras células em seu ambiente imediato (Rutishauser, et ai, 1988, Physiol Rev. 68:819). Estas células incluem células gliais especializa- das, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC), e células de Sch- wann no sistema nervoso periférico (PNS), que embainham o axônio neuro- nal com mielina (Lemke, 1992, em An Introduction to Molecular Neurobio- logy, Z. Hall, Ed., p. 281, Sinauer).
Neurônios do SNC têm o potencial inerente para regenerar-se após lesão, mas eles são inibidos de fazê-lo através das proteínas inibidoras presentes na mielina (Brittis et ai, 2001, Neuron 30:11-14; Jones et ai, 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe et ai, 2002, J. Neurosci.: 22:3144-3160).
Várias proteínas inibidoras de mielina encontradas nos oligo- dendrócitos foram caracterizadas. Exemplos conhecidos de proteínas inibi- doras de mielina incluem NogoA (Chen et ai, Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et aí., Nature 2000, 403, 439-444), glicoproteína associada à mie- lina (MAG) (McKerracher et ai, 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay et ai, 1994, Neuron 73:757-767) e glicoproteína de oligodendrócitos (OM-gp), Mikol et ai, 1988, J. Celi Bioi 706:1273-1279). Cada uma destas proteínas foram separadamente mostradas ser um Iigante para o receptor-1 neuronal Nogo (NgR1) (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Grandpre et ai, Na- ture 2000, 403, 439-444; Chen et ai, Nature, 2000, 403, 434-439; Domeni- coni et ai., Neuron 2002, publicado online em 28 de junho de 2002).
Receptor-1 Nogo (NgR1) é uma proteína de membrana ancora- da a GPI contendo 8 repetições ricas em Ieucina (Fournier et al., 2001, Natu- re 409:341-346). Sob interação com as proteínas inibidoras (por exemplo, NogoA, MAG e OM-gp), o complexo de NgR1 transduz sinais que levam ao colapso do cone de crescimento e inibição do desenvolvimento de neurite.
Há uma necessidade não satisfeita por moléculas e métodos para inibir colapso do cone de crescimento mediado por NgR1 e a inibição resultante de desenvolvimento de neurite. Adicionalmente, há uma necessi- dade por moléculas que aumentem a sobrevivência neuronal e regeneração axonal. Particularmente para tratamento de doença, distúrbios ou lesões que envolvem lesão axonal, neuronal ou morte de células de oligodendrócitos, desmielinação ou dismielinação ou em geral refere-se ao sistema nervoso.
Tais doenças, distúrbios ou lesões incluem, mas não são limita- das a, esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielólise pontina central (CPM), adrenoleuco- distrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), Leucodistrofia de Célula Globoide (doença de Krabbe) e Degeneração Wal- leriana, neurite ótica, mielite transversal, esclerose lateral amilotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer1 doença de Parkinson, lesão da espinha dorsal, lesão traumática do cérebro, lesão pós-radiação, complica- ções neurológicas de quimioterapia, acidente vascular cerebral, neuropatia ótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, síndrome da deficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Mar- chiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, e para- lisia de Bell. Entre estas doenças, MS é a mais difundida, afetando aproxi- madamente 2,5 milhões de pessoas mundialmente.
MS em geral começa com um padrão recidivo-remitente de en- volvimento neurológico, que depois progride para uma fase crônica com da- no neurológico crescente. MS é associada à destruição da mielina, oligo- dendrócitos e axônios localizados nas lesões crônicas. A desmielinação ob- servada em MS nem sempre é permanente e remielinação foi documentada em estágios prematuros da doença. Remielinação dos neurônios requer oli- godendrócitos.
Vários tratamentos modificadores de doença estão disponíveis para MS, incluindo o uso de corticosteroides e imunomoduladores tais como interferona beta e Tysabri®. Além disso, por causa do papel central dos oli- godendrócitos e mielinação em MS, houve esforços para desenvolver terapi- as para aumentar os números dos oligodendrócitos ou intensificar a mielina- ção. Vide, por exemplo, Cohen et ai, Patente U.S. N0 5.574.009; Chang et ai, N. EngL J. Med. 346:165-73 (2002). Porém, resta uma necessidade ur- gente para inventar terapias adicionais para MS e outros distúrbios de des- mielinação e dismielinação.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é com base na descoberta que Sp35 (Sp35 é também designado na literatura como LINGO-1 e LRRN6) é expressado em oligodendrócitos e células neuronais e negativamente regula a diferenci- ação, sobrevivência dos oligodendrócitos/neurônios, e mielinação dos axô- nios. Além disso, certos antagonistas de Sp35 promovem sobrevivência, pro- liferação e diferenciação de oligodendrócitos e células neuronais, como tam- bém mielinação dos neurônios. Com base nestas descobertas, a invenção refere-se em geral a anticorpos, fragmento de ligação de antígeno ou deri- vados dos mesmos que podem ser usados como antagonista de Sp35. Adi- cionalmente, a invenção em geral refere-se aos métodos para tratar várias doenças, distúrbios ou lesões associados à desmielinação, dismielinação, morte de oligodendrócitos/células neuronais ou lesão axonal mediante a administração de um anticorpo de antagonista de Sp35 ou fragmento de li- gação de antígeno.
Em certas modalidades, a invenção inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga ao mesmo epitopo de Sp35 como um anticorpo monoclonal de referência sele- cionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1 D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81.
Certas modalidades da invenção incluem um polipeptídeo isola- do compreendendo uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas das se- qüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 4 ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 4 ou pelo menos 80%, 85%, 90, 95% ou 100% idênticas às regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de Vh da cadeia pesada de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou às regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de Vh da cadeia pesada de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Certas modalidades da invenção incluem um polipeptídeo isola- do compreendendo uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas das se- qüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 5 ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 5 ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas às regiões VL C- DR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibri- doma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou às regiões VL CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Certas modalidades da invenção incluem um polipeptídeo isola- do compreendendo uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 e 416, como mostradas na Tabela 6, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 e 416 como mostradas na Tabela 6 ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas à cadeia pesada da imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou à ca- deia pesada da imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (De- signação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Certas modalidades da invenção incluem um polipeptídeo isola- do compreendendo uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 e 417, como mostradas na Tabela 8, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 e 417, como mostradas na Tabela 8 ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas à cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hi- bridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou à ca- deia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Desig- nação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em modalidades adicionais, a invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas do grupo selecionado das seqüências de polinu- cleotídeo mostradas na Tabela 4 ou pelo menos 80%, 85%, 90 ou 95% idên- ticas às seqüências de polinucleotídeo mostradas na Tabela 4.
Em outras modalidades, a invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas das seqüências de polinucleotídeo mostradas na Tabela 5 ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de polinucleotídeo mostradas na Tabela 5.
Outras modalidades da invenção incluem um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 173 a 184, 370, 374, 378, 382 e 422, como mostradas na Tabela 7, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 173 a 184, 370, 374, 378, 382 e 422, como mostradas na Tabela 7.
Outras modalidades da invenção incluem um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 185 a 194, 371, 375, 379, 383 e 423, como mostradas na Tabela 9, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 185 a 194, 371, 375, 379, 383 e 423, como mostradas na Tabela 9.
Em certas modalidades, a invenção inclui composições compre- endendo os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui.
Em modalidades adicionais, a invenção inclui métodos para tra- tar lesão de SNC, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética e acidente vascular compreendendo ad- ministrar a um animal em necessidade do dito tratamento uma quantidade efetiva de um agente selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo ou composições compreendendo o dito anticorpo ou fragmento do mesmo.
Em outras modalidades, a invenção inclui métodos para tratar doença ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação dos oliqodendrócitos; desmielinação ou dismielinação dos neurônios do SNC incluindo esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocal progressiva (PML)1 encefalomielite (EPL), mielólise pontina central (CPM)1 Degeneração Walleriana, adrenoIeucodistrofia, doença de Alexander1 e Doença de Peliza- eus Merzbacher (PMZ) mediante administração em um animal em necessi- dade do dito tratamento uma quantidade efetiva de um agente selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo ou composições compreendendo o dito anticorpo ou fragmento do mesmo.
Outras modalidades da presente invenção incluem um método de inibir transdução de sinal pelo receptor 1 Nogo (NgR1), compreendendo contatar o NgR1 com uma quantidade efetiva de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo ou composições compreendendo o dito anticorpo ou fragmento do mesmo.
Modalidades adicionais da presente invenção incluem um méto- do de inibição decrescente do crescimento axonal de um neurônio do siste- ma nervoso central (SNC), compreendendo contatar o neurônio com uma quantidade efetiva de um agente selecionado do grupo que consiste no anti- corpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo ou composições compreen- dendo o dito anticorpo ou fragmento do mesmo.
Outras modalidades da presente invenção incluem um método de inibir o colapso do cone de crescimento de um neurônio do SNC1 com- preendendo contatar o neurônio com uma quantidade efetiva de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou frag- mento do mesmo ou composições compreendendo o dito anticorpo ou frag- mento do mesmo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
FIGURA 1: Gel de SDS-PAGE mostrando imunoprecipitação de Sp35 por anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3.
FIGURA 2: Resultado de FACS mostrando que MAbs 1A7 e 2F3 ligaram-se às células COS-7 ou 293 que expressam Sp35, mas não às célu- las sem expressão de Sp35.
FIGURA 3: MAbs 1A7 e 2F3 proteqeram os neurônios de DRG da inibição mediada por mielina do desenvolvimento de neurite.
FIGURA 4A-G: Manchamento imunoistoquímico ("IHC") das co- culturas de neurônios de DRG e oligodendrócitos tratados com anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3, ou anticorpo de controle. Painéis DeE são amplia- ções dos painéis B e C, respectivamente. Manchamento com anticorpo anti- βΙΙΙ-tubulina para identificar axônios, ou anticorpo anti-MBP para identificar oligodendrócitos. F: Quantificação de células mielinizantes de MBP+ no tra- tamento de coculturas com 1A7 ou 2F3. G: Análise de western blot para quantificar a MBP produzida das coculturas de neurônios de DRG e oligo- dendrócitos tratados com anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3.
FIGURA 5A-C: A: Manchamento de anticorpo de CC1 de oligo- dendrócitos de camundongo em modelo de cuprizona. B. Manchamento de anticorpo de proteína anti-MBP ou Iuxol fast blue de neurônios de camun- dongo em modelo de cuprizona. C: Quantificação de oligodendrócitos positi- vos para anticorpo CC1 em quatro semanas e 6 semanas.
FIGURA 6: RGCs sobreviventes. Tratamento com anticorpo mo- noclonal 1A7 animais tratados com anticorpo anti-Sp35 1A7 mostraram so- brevivência neuronal significativa (80%) quando comparados aos animais de anticorpo de controle ou tratados com PBS1 os quais cada apenas mostra- ram aproximadamente 50% de sobrevivência neuronal.
FIGURA 7. Classificações BBB de camundongos que recebem anticorpo anti-Sp35 1A7 após lesão da espinha dorsal como descrito no E- xemplo 8.
FIGURA 8. Western blot de oligodendrócitos e DRGs cocultiva- dos após incubação com anticorpos anti-Sp35 Li05, Li06 e 3, 10 e 30 mg de Sp35-Fc (LINGO-1-lg) como descrito no Exemplo 9.
FIGURA 9. Fotografias dos nervos óticos de A) Ratos Normais; B) Ratos com Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) induzida por Glicoproteina de Oligodendrócito de Mielina (MOG); e C) ratos com Encefa- lomielite Autoimune Experimental (EAE) induzida por Glicoproteína de Oli- godendrócito de Mielina (MOG) tratados com o anticorpo de Sp35 1A7. Mi- cróqrafos de elétrons de cada nervo ótico são mostrados abaixo de cada fotografia do nervo ótico.
FIGURA 10. Gráfico do número de fibras neuronais regenerati- vas por seção contada em animais que recebem uma injeção intravítrea do anticorpo de Sp35 1A7 após esmagamento do nervo ótico.
FIGURA 11. Resultado de FACS mostrando que MAbs 3B5.2 (3B5) e 7P1D5.1G9 (1D5) ligaram-se às células CHO estavelmente trans- feccionadas com Sp35 (LINGO-1). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
É para ser observado que o termo "um" ou "uma" refere-se a uma entidade ou mais daquela entidade; por exemplo, "um anticorpo de Sp35" é entendido representar um ou mais anticorpos de Sp35. Como tais, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menos um" podem ser u- sados alternadamente aqui.
Como aqui usado, o termo "polipeptídeo" é intencionado abran- ger um "polipeptídeo" singular como também vários "polipeptídeos", e refere- se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente li- gados por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídi- cas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do pro- duto. Desse modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usa- do em vez de, ou alternadamente, com quaisquer destes termos. O termo "polipeptídeo" é também intencionado a se referir aos produtos de modifica- ções de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação, glicosila- ção, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de prote- ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação através de aminoácidos de ocorrência não-natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou pode ser produzido através de tecnologia recombinante, mas não necessariamente é transladado de uma seqüência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, in- cluindo através de síntese química.
Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora eles não necessariamente tenham tal estrutura. Polipeptí- deos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobra- dos, e polipeptídeos não possuindo uma estrutura tridimensional definida, mas do contrário, podem adotar um número grande de conformações dife- rentes, e são referidos como desdobrados. Como aqui usado, o termo glico- proteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de carboidrato que é ligada à proteína por meio de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou de- rivado do mesmo, é intencionado um polipeptídeo que não esteja em seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é requerido. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas recombinantemente produzidos ex- pressos em células hospedeiras são considerados isolados para propósitos da invenção, como também polipeptídeos nativos ou recombinantes que fo- ram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.
Também inclusos como polipeptídeos da presente invenção es- tão fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos anterio- res, e qualquer combinação dos mesmos. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando referindo aos anticorpos de Sp35 ou polipep- tídeos de anticorpo da presente invenção incluem qualquer polipeptídeo que retém pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do anti- corpo ou polipeptídeo nativo correspondente. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, como também frag- mentos de deleção, além dos fragmentos de anticorpo específicos debatidos em outro lugar aqui. Variantes de anticorpos de Sp35 e polipeptídeos de an- ticorpo da presente invenção incluem fragmentos como descritos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácido alteradas devido a substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. Variantes podem o- correr naturalmente ou ser de ocorrência não-natural. Variantes de ocorrên- cia não-natural podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese co- nhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substitui- ções, deleções ou adições de aminoácido conservadoras ou não- conservadoras. Derivados dos anticorpos de Sp35 e polipeptídeos do anti- corpo da presente invenção são polipeptídeos que foram alterados para exi- bir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Exem- plos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes podem ser também referidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Como aqui usado, um "deri- vado" de um anticorpo de Sp35 ou polipeptídeo de anticorpo refere-se a um polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente derivati- zados por reação de um grupo lateral funcional. Também inclusos como "de- rivados" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de ami- noácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; ho- mosserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.
O termo "polinucleotídeo" é intencionado abranger um ácido nu- cleico singular como também ácidos nucleicos plurais, e refere-se a uma mo- lécula ou construção de ácido nucleico isolada, por exemplo, RNA mensa- geiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode com- preender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não- convencional (por exemplo, uma ligação de amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolado" é intencionado uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo de Sp35 contido em um vetor é considerado isolado para o propósito da presente invenção. Ou- tros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos re- combinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotí- deos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro dos polinucleo- tídeos da presente invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção também incluem tais moléculas sinteti- camente produzidas. Além disso, polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou incluir um elemento regulador tal como um promotor, sítio de ligação de ribossoma, ou um terminador de transcrição.
Como aqui usado, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons transladados em aminoácidos. Em- bora um "códon de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não seja transladado em um aminoácido, ele pode ser considerado fazer parte de uma região de codi- ficação, mas quaisquer seqüências de flanqueamento, por exemplo, promo- tores, sítios de ligação de ribossoma, terminadores transcricionais, íntrons, e similares, não faz parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em uma cons- trução de polinucleotídeo simples, por exemplo, em um vetor simples, ou em construções de polinucleotídeo separadas, por exemplo, em vetores separa- dos (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma região de codi- ficação simples, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor simples pode separadamente codificar uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina e uma região variável de ca- deia leve da imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fun- didas ou não-fundidas em um ácido nucleico que codifica um anticorpo de Sp35 ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Regiões de codificação heterólogas incluem sem limitação elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretário ou um domínio funcional heterólogo.
Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucle- ico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operavelmente as- sociados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, é associada a uma ou mais seqüências reguladoras em um tal modo a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou con- trole da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado a ela) são "operavelmente associados" se indução de função do promotor resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto de gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferirem com a habilidade das seqüências reguladoras de expressão para direcionar a ex- pressão do produto de gene ou interferir com a habilidade do modelo de DNA a ser transcrito. Desse modo, uma região de promotor seria operavel- mente associado a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de realizar transcrição daquele ácido nucleico. O pro- motor pode ser um promotor célula-específico que direciona transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificado- res, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição, podem ser operavelmente associados ao polinucleotídeo para direcionar transcrição célula-específica. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são descritos aqui.
Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conheci- da àqueles versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células vertebradas, tais como, mas não-limitadas a, segmentos de promotor e de intensificador de citome- galovírus (promotor prematuro imediato, junto com íntron-A), símio vírus 40 (promotor prematuro), e retrovírus (tal como vírus do sarcoma de Rous). Ou- tras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes vertebrados tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, como também outras seqüências capazes de controlar expressão de gene em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e in- tensificadores tecido-específicos como também os promotores induzíveis por linfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferonas ou interleuci- nas).
Similarmente, uma variedade de elementos de controle de tra- dução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não são limitados a, sítios de ligação de ribossoma, códons de iniciação e termi- nação de tradução, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada de ribossoma interno, ou IRES, também referido como uma seqüência CITE).
Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente inven- ção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).
Regiões de codificação de polinucleotídeo e de ácido nucleico da presente invenção podem ser regiões de codificação adicionais associa- das às que codificam peptídeos secretórios ou sinais que direcionam a se- creção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas secretadas por células mamíferas têm uma seqüência de peptídeo sinal ou de líder secretó- rio que é clivada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente ao longo do retículo endoplásmico bruto foi iniciada. Aqueles versados na técnica estão cientes que polipeptídeos segregados por células vertebradas em geral têm um peptídeo sinal fundido ao término N do polipeptídeo, o qual é clivado do polipeptídeo completo ou de "compri- mento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptí- deo. Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um pep- tídeo sinal de cadeia pesada ou cadeia leve da imunoglobulina, é usado, ou um derivado funcional daquela seqüência que retém a habilidade para dire- cionar a secreção do polipeptídeo que é operavelmente associado a ele. Al- ternativamente, um peptídeo sinal mamífero heterólogo, ou um derivado fun- cional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a seqüência líder do tipo selvagem pode ser substituída com a seqüência líder de ativador de plasmi- nogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.
A presente invenção é direcionada a certos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos. A menos que especificamente referindo a anticorpos de tamanho total tal como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos de Sp35" abran- ge anticorpos de tamanho total como também fragmentos de ligação de an- tígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de imunoglobulina ou molécu- las de anticorpo engenheirado ou fragmentos que ligam antígeno de uma maneira similar às moléculas de anticorpo.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados alternada- mente aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o do- mínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo me- nos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estru- turas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados são relativamente bem-entendidas. Vide, por exemplo, Harlow et ai., Anticorpos: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).
Como será debatido em mais detalhe abaixo, o termo "imuno- globulina" compreende várias classes vastas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica apreciarão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsi- lo, (γ, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γ1-γ4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG1 ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isótipos) por exemplo, IgGi, lgG2, IgG3, IgG4, IgAi, etc. são bem caracteri- zadas e são conhecidas conferir especialização funcional. Versões modifica- das de cada uma destas classes e isótipos são facilmente discerníveis ao artesão versado em vista da descrição imediata e, consequentemente, estão dentro do escopo da invenção imediata. Todas as classes de imunoglobulina estão claramente dentro do escopo da presente invenção, o debate a seguir será em geral direcionado à classe de IgG das moléculas de imunoglobulina. Com respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproxima- damente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas através de ligações de dissulfeto em uma configuração Ύ", em que as ca- deias leves que agrupam-se com as cadeias pesadas iniciam na boca do Ύ" e continuam através da região variável.
Cadeias leves são classificadas como capa ou Iambda (κ,λ). Ca- da classe de cadeia pesada pode estar ligada com uma cadeia leve capa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas entre si, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas umas às outras por ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não- covalentes quando as imunoglobulinas forem geradas por hibridomas, célu- las B ou células hospedeiras geneticamente engenheiradas. Na cadeia pe- sada, as seqüências de aminoácido correm de um término N nas extremida- des bifurcadas da configuração de Y para o término C ao fundo de cada ca- deia.
As cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homo- logia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são funcio- nalmente usados. Nesta consideração, será apreciado que os domínios vari- áveis das porções de cadeia tanto leve (Vl) como pesada (Vh) determinam o reconhecimento e especificidade do antigeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (Cl) e da cadeia pesada (Ch1 , Ch2 ou Ch3) confe- rem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacental, ligação de receptor Fc, ligação de complemento, e similares. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que eles ficam mais distais do sítio de ligação de antigeno ou térmi- no amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e a porção C-terminal é uma região constante; os domínios Ch3 e Cl na verdade com- preendem o término carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente. Como indicado acima, a região variável permite o anticorpo sele- tivamente reconhecer e especificamente ligar os epitopos nos antígenos. Ou seja, o domínio Vl e domínio Vh, ou subconjunto das regiões de determina- ção de complementaridade (CDRs)l de um anticorpo se combinam para for- mar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensio- nal. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação de antí- geno presente no término de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias Vh e VL. Em algumas circunstâncias, por exemplo, certas moléculas de imu- noglobulina derivadas das espécies de camelídeo ou engenheiradas com base nas imunoglobulinas de camelídeo, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir em cadeias pesadas apenas, sem cadeias leves. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman etal., Nature 363:446-448 (1993).
Em anticorpos de ocorrência natural, as seis "regiões de deter- minação de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação de antígeno são seqüências curtas não-contíguas de aminoácidos que especificamente estão posicionados para formar o domínio de ligação de antígeno quando o anticorpo assumir sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos no domínio de ligação de antígenos, referidos como regiões de "estrutura", mostram menos variabili- dade intermolecular. As regiões de estrutura adotam uma conformação de folha β em grande parte e as CDRs formam alças que conectam, e em al- guns casos fazem parte da estrutura de folha β. Desse modo, as regiões de estrutura agem para formar um andaime que provê posicionamento das CDRs em orientação correta através de interações intercadeia, não- covalentes. O domínio de ligação de antígeno formado pelas CDRs posicio- nadas define uma superfície complementar para o epitopo no antígeno imu- norreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não-covalente do anticorpo a seu epitopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser facilmente i- dentificados para qualquer região variável de cadeia pesada ou leve dada por alguém versado na técnica, uma vez eles tenham sido precisamente de- tinidos (vide, "Sequences of Proteins of Immunological lnterest", Kabat1 E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 796:901-917 (1987) que é incorporado aqui por referência em suas totalidades).
No caso onde houver duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou acordado dentro da técnica, a definição do termo como aqui usado é intencionada a incluir todos tais significados a menos que explicita- mente declarado o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "regi- ão de determinação de complementaridade" ("CDR") para descrever o antí- geno não-contíguo que combina os sítios encontrados dentro da região vari- ável de ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Se- quences of Proteins of Immunological lnterest" (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Bioi 196:901-917 (1987), que são incorporadas aqui por referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados um ao outro. Não obstante, aplicação de qualquer definição para referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é intencionada estar dentro do escopo do termo como definido e u- sado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados, os quais abrangem as CDRs definidas por cada uma das referências acima citadas estão expostos abaixo na Tabela I como uma comparação. Os números dos resíduos exatos que abrangem uma CDR particular variarão, dependendo da seqüência e tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica podem habitualmente de- terminar que resíduos compreendem uma CDR particular dada a seqüência de aminoácido de região variável do anticorpo.
TABELA 1. Definições de CDR1
<table>table see original document page 19</column></row><table> 1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 são de acordo com as convenções de numeração expostas por Kabat etal. (vide abaixo).
Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para se- qüências de domínio variável que são aplicáveis a qualquer anticorpo. Al- guém versado na técnica pode de forma não-ambígua atribuir este sistema de "numeração de Kabat" para qualquer seqüência de domínio variável, sem contar com quaisquer dados experimentais além da própria seqüência. Co- mo aqui usado, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração exposto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Se- quence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que do con- trário especificado, as referências à numeração das posições específicas do resíduo de aminoácido em um anticorpo de Sp35 ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da presente invenção são de a- cordo com o sistema de numeração de Kabat.
Em espécies de camelídeo, a região variável de cadeia pesada, referida como VhH1 forma o domínio de ligação de antígeno inteiro. As dife- renças principais entre as regiões variáveis VhH de camelídeo e aquelas de- rivadas de anticorpos convencionais (Vh) incluem (a) aminoácidos mais hi- drofóbicos na superfície de contato de cadeia leve de Vh quando comparado à região correspondente em VhH, (b) uma CDR3 mais longa em VhH, e (c) a ocorrência freqüente de uma ligação de dissulfeto entre CDR1 e CDR3 em VhH.
Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção incluem, mas não são limitados a, anti- corpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, de cadeia simples, fragmentos de ligação de epitopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), frag- mentos compreendendo um domínio Vl ou Vh, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-ld para anticorpos de Sp35 descritos aqui). Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou de anti- corpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.
Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia sim- ples, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma porção das seguintes: região de do- bradiça, domínios Ch1, Ch2, e CH3. Também inclusos na invenção estão fragmentos de ligação de antígeno também compreendendo qualquer com- binação de região(ões) variável(is) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e Ch3. Anticorpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nos métodos de diagnósticos e terapêuticos descritos aqui po- dem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferi- velmente, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos, de burro, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, lhama, cavalo, ou de galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser condrictoide em origem (por exem- plo, de tubarões). Como aqui usado, anticorpos "humanos" incluem anticor- pos tendo a seqüência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e in- cluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como infra descrito e, por e- xemplo, na Patente U.S. 5.939.598 por Kucherlapati et al.
Como aqui usado, o termo "porção de cadeia pesada" inclui se- qüências de aminoácido derivadas de uma cadeia pesada da imunoglobuli- na. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada com- preende pelo menos um de: um domínio Ch1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, intermediária, e/ou inferior), um do- mínio Ch2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para o uso na invenção pode compre- ender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio Ch2; uma cadeia de poli- peptídeo compreendendo um domínio CH1 e um domínio Ch3; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipep- tídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um do- mínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modali- dade, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH3. Também, um polipeptídeo de ligação para o uso na invenção pode desprover pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Como exposto acima, será entendido por alguém versado na técnica que estes domínios (por e- xemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de modo que eles variem em seqüência de aminoácido da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.
Em certos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de an- tígeno, variantes, ou derivados dos mesmos descritos aqui, as porções de cadeia pesada de uma cadeia de polipeptídeo de um multímero são idênti- cas às em uma segunda cadeia de polipeptídeo do multímero. Alternativa- mente, os monômeros contendo porção de cadeia pesada da invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação-alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico.
As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação pa- ra o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos aqui podem ser derivadas de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgGI e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de lgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgGI e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgGI e, em parte, de uma molécula de IgG4.
Como aqui usado, o termo "porção de cadeia leve" inclui se- quências de aminoácido derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. Preferivelmente, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio Vl ou Cl-
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos descritos aqui podem ser descritos ou es- pecificados em termos do(s) epitopo(s) ou porção(ões) de um antígeno, por exemplo, um polipeptídeo-alvo (Sp35) que eles reconhecem ou especifica- mente se ligam. A porção de um polipeptídeo-alvo que especificamente inte- rage com o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epitopo", ou um "determinante antigênico". Um polipeptídeo-alvo pode compreender um epitopo simples, mas tipicamente compreende pelo menos dois epitopos, e pode incluir qualquer número de epitopos, dependendo do tamanho, con- formação, e tipo do antígeno. Além disso, deveria ser observado que um "epitopo" em um polipeptídeo-alvo pode ser ou incluir elementos de não- polipeptídeo, por exemplo, um epitopo pode incluir uma cadeia lateral de carboidrato.
O tamanho mínimo de um epitopo de peptídeo ou polipeptídeo para um anticorpo é acreditado ser aproximadamente quatro a cinco amino- ácidos. Peptídeo ou epitopos de polipeptídeo preferivelmente contêm pelo menos sete, mais preferivelmente pelo menos nove e o mais preferivelmente entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Considerando que uma CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os aminoácidos compreendendo um epitopo não necessari- amente são contíguos, e em alguns casos, podem nem mesmo estar na mesma cadeia de peptídeo. Na presente invenção, epitopo de peptídeo ou polipeptídeo reconhecido por anticorpos de Sp35 da presente invenção con- tém uma seqüência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo me- nos 7, mais preferivelmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não-contíguos de Sp35.
Por "especificamente liga", é em geral significado que um anti- corpo liga a um epitopo por meio de seu domínio de ligação de antígeno, e que a ligação requer alguma complementaridade entre o domínio de ligação de antígeno e o epitopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito "especificamente ligar" a um epitopo quando se ligar àquele epitopo, por meio de seu domínio de ligação de antígeno, mais facilmente do que se Iiga- ria a um epitopo aleatório não relacionado. O termo "especificidade" é aqui usado para qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo se liga a um certo epitopo. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser julgado ter uma es- pecificidade mais alta para um epitopo dado que o anticorpo "B", ou anticor- po "A" pode ser dito ligar ao epitopo "C" com uma especificidade mais alta que ao epitopo relacionado "D".
Por "preferencialmente se liga", é significado que o anticorpo especificamente se liga a um epitopo mais facilmente do que se ligaria a um epitopo relacionado, similar, homólogo, ou análogo. Desse modo, um anti- corpo que "preferencialmente se liga" a um epitopo dado mais provavelmen- te se ligará àquele epitopo do que a um epitopo relacionado, embora um tal anticorpo possa reagir cruzado com o epitopo relacionado.
Por via de exemplo não-limitativo, pode ser considerado que um anticorpo se liga a um primeiro epitopo preferencialmente se ele se ligar ao dito epitopo primeiro com uma constante de dissociação (Kd) que é menor que a K0 do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não- limitativo, pode ser considerado que um anticorpo se ele se liga a um primei- ro antígeno preferencialmente se ligar ao primeiro epitopo com uma afinida- de que é pelo menos uma ordem de magnitude menor que a Kd do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não-limitativo, pode ser conside- rado que um anticorpo se ele se liga a um primeiro epitopo preferencialmen- te se ele se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor que a K0 do anticorpo para o segundo epi- topo.
Em outro exemplo não-limitativo, pode ser considerado que um anticorpo se liga a um primeiro epitopo preferencialmente se ele se ligar ao primeiro epitopo com uma taxa de dissociação ("offrate" (k(off))) que é menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não- limitativo, pode ser considerado que um anticorpo se ele se liga um primeiro epitopo preferencialmente se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não-limitativo, pode ser conside- rado que um anticorpo se liga a um primeiro epitopo preferencialmente se ele se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epito- po.
Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado descritos aqui pode ser dito se ligar a um polipeptídeo-alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 χ 10-3 s-1 ou 10-3 s-1. Mais pre- ferivelmente, pode ser dito que um anticorpo da invenção se liga a um poli- peptídeo-alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10~4 s"1, 10~4 s"1, 5 X 10-5 s-1, ou 10-5 s-1, 5 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 ou 10-7 s-1.
Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado descritos aqui pode ser dito se ligar a um polipeptídeo-alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa associação ("on rate" (k(on))) maior ou igual a 10^3 M-1 s-1, 5 X 10^3 M-1 s-1, 10^4 M-1 s-1 ou 5 X 10^4 M-1 s-1. Mais preferivelmente, pode ser dito que um anticorpo da inven- ção se liga a um polipeptídeo-alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa associação (k(on)) maior ou igual a 10^5 M-1 s-1, 5 X 10^5 M-1 s-1, 10^6 M-1 s1, ou 5 X 10^6 M-1 s-1 ou 10^7 M-1 s-1.
Um anticorpo é dito competitivamente inibir a ligação de um anti- corpo de referência a um epitopo dado se ele se ligar preferencialmente à- quele epitopo ao ponto de bloquear, até certo ponto, a ligação do anticorpo de referência ao epitopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA de competição. Um anticorpo pode ser dito competitivamente inibir a ligação do anticorpo de referência a um epitopo dado em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%. Como aqui usado, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da resistência da ligação de um epitopo individual com a CDR de uma molé- cula de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Harlow et ai, Antibodies: A Labo- ratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) nas pági- nas 27-28. Como aqui usado, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, a resistência de combinação funcional de uma mistura de imunoglobu- lina com o antígeno. Vide, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. Avidez é relacionada tanto à afinidade das moléculas de imunoglobulina individuais na população com epitopos específicos, e também às valências das imunoglo- bulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo mono- clonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epitopo altamente re- petitiva, tal como um polímero, seria um de avidez alta.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes ou derivados dos mesmos da invenção podem também ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Como aqui usado, o termo "reatividade cruzada" refere-se à habilidade de um anticorpo, específi- co para um antígeno, reagir com um segundo antígeno; uma medida de pa- rentesco entre duas substâncias antigênicas diferentes. Desse modo, um anticorpo é reativo cruzado se ele se ligar a um epitopo diferente daquele que induziu sua formação. O epitopo reativo cruzado em geral contém mui- tas das mesmas características estruturais complementares que o epitopo indutor, e em alguns casos, pode na verdade adequar-se melhor que o original.
Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reatividade cruzada, em que eles ligam epitopos relacionados, mas não-idênticos, por exemplo, epitopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (quando calculada usando métodos conhecidos na técnica e descritos aqui) para um epitopo de referência. Pode ser dito que um anticorpo tem pouca ou nenhuma reatividade cruzada se ele não ligar epitopos com menos que 95%, menos que 90%, menos que 85%, menos que 80%, menos que 75%, menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55%, e menos de 50% de identidade (quando calculada usando métodos conhecidos na técni- ca e descritos aqui) para um epitopo de referência. Um anticorpo pode ser julgado "altamente específico" para um certo epitopo, se ele não ligar qual- quer outro análogo, ortólogo, ou homólogo daquele epitopo.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes ou derivados dos mesmos da invenção podem também ser descritos ou especificados em termos de sua afinidade de ligação a um polipeptídeo da invenção. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menor que 5 x 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10" 3Μ, 5 x 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 x 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 x 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 x 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 x 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 x 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 x 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 x 10"11 Μ, 10" 11Μ, 5 x 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 x 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 x 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 x 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes ou derivados dos mesmos da invenção podem ser "multiespecíficos", por exemplo, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade, significando que reconhece e liga a dois ou mais epitopos diferentes presen- tes em um ou mais antígenos diferentes (por exemplo, proteínas) ao mesmo tempo. Desse modo, se um anticorpo de Sp35 é "monoespecífico" ou "multi- específico", por exemplo, "biespecífico", refere-se ao número de epitopos diferentes com os quais um polipeptídeo de ligação reage. Anticorpos multi- específicos podem ser específicos para epitopos diferentes de um polipeptí- deo-alvo descrito aqui ou podem ser específicos para um polipeptídeo-alvo como também para um epitopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heteró- logo ou material de suporte de sólido.
Como aqui usado, o termo "valência" refere-se ao número de domínios de ligação potenciais, por exemplo, domínio de ligação de antíge- nos, presentes em um anticorpo de Sp35, polipeptídeo ou anticorpo de liga- ção. Cada domínio de ligação especificamente se liga a um epitopo. Quando um anticorpo de Sp35, polipeptídeo ou anticorpo de ligação compreender mais de um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode especifica- mente ligar ao mesmo epitopo, a um anticorpo com dois domínios de liga- ção, denominado "monoespecífico bivalente", ou a epitopos diferentes, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "bivalente biespecí- fico". Um anticorpo pode também ser biespecífico e bivalente para cada es- pecificidade (denominado "anticorpos tetravalentes biespecíficos"). Em outra modalidade, minicorpos tetravalentes ou anticorpos com domínios deletados podem ser feitos.
Anticorpos bivalentes biespecíficos, e métodos de fazê-los, são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. N0 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; e Publ. do Pedido U.S. 2003/020734 e 2002/0155537, as descri- ções destes são aqui incorporadas por referência. Anticorpos tetravalentes biespecíficos, e métodos de fazê-los, são descritos por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788, as descrições de ambos são incorporadas por referência aqui. Vide em geral, publicações de PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al„ J. Immunol. 147:60-69 (1991); Patente U.S. 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny etal., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
Como previamente indicou, as estruturas de subunidade e confi- guração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imuno- globulina são bem-conhecidas. Como aqui usado, o termo "domínio de VH" inclui o domínio variável de amino terminal de uma cadeia pesada da imuno- globulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro (a maioria amino terminal) domínio de região constante de uma cadeia pesada da imunoglobulina. O domínio Ch1 é adjacente ao domínio de Vh e é amino terminal para a região de dobradiça de uma imunoglobulina molécula de cadeia pesada.
Como aqui usado, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de resí- duo 244 a resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resí- duos 231-340, sistema de numeração EU; vide Kabat EA et al. op. cit. O domínio CH2 é único em que não é estritamente pareado com outro domínio. Do contrário, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são inter- postas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Está também bem-documentado que o domínio CH3 se estende do domínio Ch2 ao terminal C da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
Como aqui usado, o termo "região de dobradiça" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio Ch1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, desse modo permitindo que as duas regiões de ligação de antígeno N-terminais movam-se independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, intermediário, e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
Como aqui usado, o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissul- feto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocor- rência natural, as regiões CH1 e Cl são ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas através de duas ligações de dissulfe- to nas posições correspondendo a 239 e 242 usando o sistema de numera- ção de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU).
Como aqui usado, o termo "anticorpo quimérico" será emprega- do para significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que po- de ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a invenção imediata) é obtida de uma segunda espécie. Em modalidades preferidas, a região ou sítio de ligação-alvo será de uma fonte não-humana (por exemplo, camun- dongo ou primata) e a região constante é humana.
Como aqui usado, o termo "anticorpo engenheirado" refere-se a um anticorpo em que o domínio variável ou na cadeia pesada e leve ou am- bas é alterado por pelo menos substituição parcial de uma ou mais CDRs de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, substituição da região de estrutura parcial e alteração de seqüência. Embora as CDRs pos- sam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesma subclasse como o anticorpo do qual as regiões de estrutura são derivadas, é visado que as CDRs serão derivadas de um anticorpo de classe diferente e preferi- velmente de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo engenhei- rado, em que uma ou mais CDRs "doadoras" de um anticorpo não-humano de especificidade conhecida é enxertado em uma região de estrutura de ca- deia pesada ou leve humana, é referido aqui como um "anticorpo humaniza- do". Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs com- pletas da região variável doadora para transferir a capacidade de ligação de antígeno de um domínio variável a outro. De preferência, pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação-alvo. Dadas as explanações expostas, por e- xemplo, nas Patentes U.S. N0 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.180.370, estará bem dentro da competência daqueles versados na técnica, ou Ievan- doa cabo experimentação ou testagem rotineira para se obter por tentativa e erro um anticorpo funcional engenheirado ou humanizado.
Como aqui usado, o termo "polipeptídeo corretamente dobrado" inclui polipeptídeos (por exemplo, anticorpos de Sp35) em que todos os do- mínios funcionais que compreendem o polipeptídeo são distintamente ativos. Como aqui usado, o termo "polipeptídeo impropriamente dobrado" inclui po- lipeptídeos em que pelo menos um dos domínios funcionais do polipeptídeo não é ativo. Em uma modalidade, um polipeptídeo corretamente dobrado compreende cadeias de polipeptídeo ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfeto e, inversamente, um polipeptídeo impropriamente dobrado com- preende cadeias de polipeptídeo não ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfeto.
Como aqui usado o termo "engenheirado" inclui manipulação de moléculas de ácido nucleico ou de polipeptídeo através de meios sintéticos (por exemplo, através de técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por acoplamento enzimático ou químico dos peptídeos ou um pouco da combinação destas técnicas).
Como aqui usado, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" são usados alternadamente. Estes termos referem-se à união de dois elementos ou mais componentes, por quaisquer meios incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão dentro da estrutura" refere-se à ligação de duas ou mais estruturas de leitura aberta de polinucleotídeo (ORFs) para formar uma ORF mais longa contínua, de uma maneira que mantém a estru- tura de leitura translacional correta das ORFs originais. Desse modo, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína simples que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente assim unidos na na- tureza). Embora a estrutura de leitura é, desse modo, feita contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser física ou espacialmente separados por, por exemplo, seqüência de ligante dentro da estrutura. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável da imunoglobulina podem ser fundidos, dentro da estrutura, mas separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura da imu- noglobulina ou regiões de CDR adicionais, contanto que as CDRs "fundidas" sejam cotransladadas como parte de um polipeptídeo contínuo.
No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma "seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma dire- ção terminal amino para carboxila em que os resíduos que se avizinham na seqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.
O termo "expressão", como aqui usado, refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipep- tídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula incluindo, sem limitação, knockdown do gene como também expressão transitória e expressão estável. Este inclui sem limitação transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), pequeno RNA em forma de grampo (shRNA), pequeno RNA de in- terferência (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução de tal mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto desejado final for um bioquímico, a expressão inclui a criação daquele bioquímico e qualquer precursor. Expres- são de um gene produz um "produto de gene". Como aqui usado, um produ- to de gene ou pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensagei- ro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é transla- dado de uma transcrição. Produtos de gene descritos aqui também incluem ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, por exemplo, polia- denilação, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, por exem- plo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras su- bunidades de proteína, clivagem proteolítica, e similares.
Como aqui usado, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se a tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo é impedir ou desacelerar (diminuir) uma alteração fisiológica indese- jada ou distúrbio, tal como a progressão de esclerose múltipla. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, não piorando), demora ou redução da progressão da doença, melho- ra ou paliação do estado de doença, e remissão (quer parcial quer total), detectável ou indetectável. "Tratamento" pode também significar prolongar a sobrevivência quando comparado à sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio como também aqueles propensos a ter a condi- ção ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio é para ser impedido.
Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamí- fero" são significado qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, a quem diagnose, prognose, ou terapia é desejada. Sujeitos mamíferos inclu- em seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda, e jardim zoo- lógico, de jogos esportivos, ou animais de estimação tais como cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, bois, va- cas, e assim por diante.
Como aqui usado, frases tais como "um sujeito que se beneficia- ria da administração de um anticorpo de Sp35" e "um animal em necessida- de de tratamento" incluem sujeitos, tais como sujeitos mamíferos que se be- neficiariam da administração de um anticorpo de Sp35 usada, por exemplo, para detecção de um polipeptídeo de Sp35 (por exemplo, para um procedi- mento diagnóstico) e/ou de tratamento, isto é, paliação ou prevenção de uma doença tal como MS, com um anticorpo de Sp35. Como descrito em mais detalhe aqui, o anticorpo de Sp35 pode ser usado na forma não- conjugada ou conjugada, por exemplo, com um fármaco, profármaco, ou um isótopo.
II. Sp35
Sp35 humano de ocorrência natural (Sp35) é uma proteína gli- cosilada específica para o sistema nervoso central que é prognosticada ter 614 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), incluindo uma seqüência sinal de 33 ami- noácidos. Sp 35 é também conhecido na técnica pelos nomes LINGO-1, LRRN6, LRRN6A, FLJ14594, LERN1, MGC17422 e UNQ201. O polipeptí- deo de Sp35 do tipo selvagem de comprimento total humano contém um domínio de LRR que consiste em 14 repetições ricas em Ieucina (incluindo tampas NeC terminais), um domínio de Ig, uma região de transmembrana, e um domínio citoplásmico. O domínio citoplásmico contém um sítio de fos- forilação de tirosina canônico. Além disso, a proteína de Sp35 de ocorrência natural contém uma seqüência sinal, uma região básica curta entre o domí- nio de LRRCT e de Ig, e uma região de transmembrana entre o domínio de Ig e o domínio citoplásmico. O gene de Sp35 humano (SEQ ID NO: 1) con- tém códons de partida de tradução alternativos, de forma que seis aminoáci- dos adicionais, isto é, MQVSKR (SEQ ID NO: 3) podem ou não estar presen- tes no término N da Seqüência sinal de Sp35. A Tabela 2 lista os domínios de Sp35 e outras regiões, de acordo com o número de resíduo de aminoáci- do, com base na seqüência de aminoácido de Sp35 apresentada aqui como SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo de Sp35 é caracterizado em mais detalhes na Publicação de PCT WO N0 2004/085648 que é incorporada aqui por referên- cia em sua totalidade. TABELA 2 - Domínios de Sp35
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Expressão de distribuição e desenvolvimento de tecido de Sp35 foi estudada em seres humanos e ratos. Biologia de Sp35 foi estudada em um modelo de animal experimental (rato). Expressão de Sp35 de rato fica localizada nos neurônios e oligodendrócitos, como determinado por northern blot e manchamento imunoistoquímico. Nível de expressão de mRNA de Sp35 de rato é regulado de forma desenvolvente, com pico logo após o nas- cimento, isto é, ca. dia um pós-natal. Em um modelo de lesão de transseção da espinha dorsal de rato, Sp35 é suprarregulado no sítio da lesão, como determinado por RT-PCR. Vide Mi et al. Nature Neurosci. 7:221-228 (2004).
No contexto dos aminoácidos compreendendo os vários domí- nios estruturais e funcionais de um polipeptídeo de Sp35, o termo "cerca de" inclui o valor particularmente citado e valores maiores ou menores por vários aminoácidos (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1). Uma vez que a localização destes domínios como listados na Tabela 1 foi prognosticada através de computação gráfica, alguém versado apreciaria que os resíduos de aminoácido que constituem os domínios podem variar ligeiramente (por exemplo, por cerca de 1 a 15 resíduos) dependendo dos critérios usados para definir o domínio.
Os inventores descobriram que Sp35 de comprimento total, do tipo selvagem liga a NgR1. Vide Publicação de PCT N0 WO 2004/085648. Os inventores também descobriram que Sp35 é expressado em oligoden- drócitos e que a proteína de Sp35 está envolvida na regulação de mielinação mediada por oligodendrócito dos axônios. Vide Publicação de Patente U.S. N0 2006/0009388 A1 que é incorporada aqui por referência em sua totalida- de.
A seqüência de nucleotídeo para a molécula de Sp35 de com- primento total é como segue:
ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTGGCCTGCTGGCAGCCCATCCTCCTGCTGGTGCTGG GCTCAGTGCTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGTGCTCCGCCCAGGACCGCGCTGTGCTGTG CCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTGGACCTAGGCAAGAACCGC ATCAAAACGCTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTCAACGAGAACATCGTGA GCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTCCGCAGCAACCGCCTGAAGCT CATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGACCAAGCTGGACATCAGCGAGAACAAGATTGTTATCCTG CTGGACTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCTCAAGTCACTGGAGGTTGGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTC ACCGCGCCTTCAGCGGCCTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTGGAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGA GGCGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTCCGGCACCTCAACATCAATGCCATCCGGGACTACTCC TTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATCTCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCAACTGCC TCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATCACACACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCA CCTAGTCTATCTCCGCTTCCTCAACCTCTCCTACAACCCCATCAGCACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTG CTCCGGCTGCAGGAGATCCAGCTGGTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACT ACCTGCGCGTGCTCAATGTCTCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCT GGAGACACTCATCCTGGACTCCAACCCGCTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGG CTCAACTTCAACCGGCAGCAGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTG ATGTGCTACTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGA CGAGGGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGCCCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGA AAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTACGCCC AGGTACAGGACAACGGCACGTACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCCCACCTGCA TGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAACCAGCCGGGCGAG GGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAGACCCTCATCATCGCCACCACCATGG GCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGTTTCTCTGGAGCCGGGGCAAGGGCAACAC AAAGCACAACATCGAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATCAGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAG TTCAACATGAAGATGATATGA (SEQ ID NO: 1).
A seqüência de polipeptídeo para o polipeptídeo de Sp35 de comprimento total é como segue:
MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNR IKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDISENKIVIL LDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRLRHLNINAIRDYS FKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHEL LRLQEIQLVGGQLA VVE PYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPLACDCRLLWV FRRRWR LNFNRQQPTCAT PE FVQGKE FKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPR KHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGE GEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLFLWSRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRK FNMKMI (SEQ ID NO: 2).
III. ANTICORPOS de Sp35
Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a anti- corpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deriva- dos dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção inclui pelo menos os domínios de ligação de antígeno de certos anticorpos monoclonais, e frag- mentos, variantes, e derivados dos mesmos mostrados nas Tabelas 3A a 3E.
A Tabela 3A descreve as regiões do polipeptídeo de Sp35 que estão ligadas através de certos anticorpos derivados da biblioteca de fago de comprimento total. Estes anticorpos têm as mesmas regiões variáveis que os fragmentos de Fab derivados da Biblioteca de Exibição de Fago-1, como indicado na Tabela 3B (por exemplo, D05 na Tabela 3A tem a mesma região variável que Li05 na Tabela 3B, D06 na Tabela 3A tem a mesma região vari- ável que Li06 na Tabela 3B, etc.)· Os anticorpos foram testados para ligar fragmentos de Sp35 como definidos na Tabela 3A, usando métodos bem- conhecidos na técnica.
Tabelas 3B-3E descrevem a habilidade dos anticorpos monoclo- nais nomeados ou fragmentos de Fab para detectar Sp35 em vários ensaios tais como: Classificação de Célula Ativada Fluorescente (FACS), Imunopre- cipitação (IP), Análise de western blot, Imunoistoquímica (IHC) e Ensaio I- munoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA). Protocolos detalhados para exe- cutar estes ensaios são descritos aqui ou são bem-conhecidos e entendidos por aqueles versados na técnica. Anticorpos monoclonais derivados de hi- bridoma listados nas Tabelas 3B e 3C foram produzidos por injeção de Sp35 solúvel em camundongos e depois isolados usando tecnologia de hibridoma que é bem-conhecida na técnica e descrita aqui. Anticorpos monoclonais e fragmentos de Fab de anticorpo listados na Tabela 3B foram isolados de duas bibliotecas de exibição de fago diferentes usando técnicas conhecidas na técnica. <table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 42</column></row><table> TABELA 3B
<table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table> TABELA 3B - Anticorpos Monoclonais de Sp35 (continuacao)
<table>table see original document page 46</column></row><table> Tabela 3a
<table>table see original document page 47</column></row><table> TABELA 3B - Anticorpos Monoclonais de Sp35 (continuacao)
<table>table see original document page 48</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 49</column></row><table> TABELA 3B
<table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table> Tabela 3C- Anticorpos Monoclonais de Sp35 Derivados de Hibridoma
<table>table see original document page 53</column></row><table> TABELA 3D
<table>table see original document page 54</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> TABELA 3D (continuacao)
<table>table see original document page 58</column></row><table> <table>table see original document page 59</column></row><table> <table>table see original document page 60</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 61</column></row><table> TABELA 3D (continuacao)
<table>table see original document page 62</column></row><table> <table>table see original document page 63</column></row><table> <table>table see original document page 64</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 65</column></row><table> TABELA 3E
<table>table see original document page 66</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 67</column></row><table> <table>table see original document page 68</column></row><table> <table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table> <table>table see original document page 73</column></row><table> <table>table see original document page 74</column></row><table> <table>table see original document page 75</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 76</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 77</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 78</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 79</column></row><table> <table>table see original document page 80</column></row><table> Como aqui usado, o termo "domínio de ligação de antígeno" in- clui um sítio que especificamente liga um epitopo em um antígeno (por e- xemplo, um epitopo de Sp35). O domínio de ligação de antígeno de um anti- corpo tipicamente inclui pelo menos uma porção de uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina e pelo menos uma porção de uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina. O sítio de ligação formado por estas regiões variáveis determina a especificidade do anticorpo.
A presente invenção mais especificamente é direcionada a um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou deriva- dos do mesmo, onde o anticorpo de Sp35 se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 2013A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (U01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81.
A invenção é também estendida a um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo de Sp35 competitivamente inibe um anticorpo monoclonal selecio- nado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1 D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LMO)1 30-B01 (LÍ11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, LÍ34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1 D5.1G9, 3B5.2 e Li81 de se ligar a Sp35.
A invenção é também estendida a um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo de Sp35 compreende pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1 D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81.
No dia 27 de dezembro de 2006, os hibridomas a seguir foram depositados com a American Type Culture Collection (ATCC) em Manassas, VA: 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106), 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107). O hibridoma 2.P3B5.2 depo- sitado produz o anticorpo monoclonal 3B5.2, descrito aqui e o hibridoma 7.P1D5.1.G9 depositado produz o anticorpo monclonal 7P1D5.1.G9, descrito aqui. Os hibridomas podem ser cultivados de acordo com métodos bem- conhecidos na técnica e podem ser descritos aqui.
Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo que específica ou preferencialmente liga a um fragmento ou domínio de polipeptídeo de Sp35 particular. Tais fragmentos de polipeptídeo de Sp35 incluem, mas não são limitados a, um polipeptídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493;66 a 532;417 a 532; 417 a 425 (a região básica de Sp35); 417 a 493; 417 a 532;, 419 a 493 (a região de Ig de Sp35); ou 425 a 532 da SEQ ID NO: 2; ou um polipeptídeo de Sp35 variante pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico aos aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493; 66 a 532; 417 a 532; 417 a 425 (a região básica de Sp35); 417 a 493; 417 a 532; 419 a 493 (a região de Ig de Sp35); ou 425 a 532 da SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma ou mais repetições ricas em Ieucina (LRR) de Sp35. Tais fragmentos incluem, por exemplo, fragmentos compreendendo, consis- tindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 66 a 137; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233;, 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 da SEQ ID NO: 2. Fragmentos correspondentes de um polipeptídeo de Sp35 variante pelo me- nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico aos aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233; 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 da SEQ ID NO: 2 são também contemplados.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma ou mais regiões ricas em cisteína flanqueando o LRR de Sp35. Tais fragmentos incluem, por exemplo, um fragmento compreen- dendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 34 a 64 da SEQ ID NO: 2 (a região de flanqueamento de LRR N-terminal (LR- RNT)), ou um fragmento compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 363 a 416 da SEQ ID NO: 2 (a região de flanqueamento de LRR C-terminal (LRRCT)), aminoácidos. Fragmentos cor- respondentes de um polipeptídeo de Sp35 variante pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticos aos aminoácidos 34 a 64 e 363 a 416 da SEQ ID NO: 2 são também contemplados.
Como conhecido na técnica, "identidade de seqüência" entre dois polipeptídeos é determinada comparando a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo à seqüência de um segundo polipeptídeo. Quando deba- tido aqui, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo, pode ser deter- minado usando métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica tais como, mas não-limitados a, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advan- ces in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar o melhor seg- mento de homologia entre duas seqüências. Quando usar BESTFIT ou qual- quer outro programa de alinhamento de seqüência para determinar se uma seqüência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma seqüência de refe- rência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, claro, de modo que a porcentagem de identidade é calculada no comprimen- to total da seqüência de polipeptídeo de referência e aqueles intervalos na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na seqüência de refe- rência são permitidos.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 41 a 525 da SEQ ID NO: 2; 40 a 526 da SEQ ID NO: 2; 39 a 527 da SEQ ID NO: 2; 38 a 528 da SEQ ID NO: 2; 37 a 529 da SEQ ID NO: 2; 36 a 530 da SEQ ID NO: 2; 35 a 531 da SEQ ID NO: 2; 34 a 531 da SEQ ID NO: 2; 46 a 520 da SEQ ID NO: 2; 45 a 521 da SEQ ID NO: 2; 44 a 522 da SEQ ID NO: 2; 43 a 523 da SEQ ID NO: 2; e 42 a 524 da SEQ ID NO: 2.
Ainda fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais cer- tos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deriva- dos dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são Iimi- tados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 1 a 33 da SEQ ID NO: 2; 1 a 35 da SEQ ID NO: 2; 34 a 64 da SEQ ID NO: 2; 36 a 64 da SEQ ID NO: 2; 66 a 89 da SEQ ID NO: 2; 90 a 113 da SEQ ID NO: 2; 114 a 137 da SEQ ID NO: 2; 138 a 161 da SEQ ID NO: 2; 162 a 185 da SEQ ID NO: 2; 186 a 209 da SEQ ID NO: 2; 210 a 233 da SEQ ID NO: 2; 234 a 257 da SEQ ID NO: 2; 258 a 281 da SEQ ID NO: 2; 282 a 305 da SEQ ID NO: 2; 306 a 329 da SEQ ID NO: 2; 330 a 353 da SEQ ID NO: 2; 363 a 416 da SEQ ID NO: 2; 417 a 424 da SEQ ID NO: 2; 419 a 493 da SEQ ID NO: 2; e 494 a 551 da SEQ ID NO: 2.
Ainda também, fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais cer- tos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deriva- dos dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são Iimi- tados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 1 a 33 da SEQ ID NO: 2; 1 a 35 da SEQ ID NO: 2; 1 a 64 da SEQ ID NO: 2; 1 a 89 da SEQ ID NO: 2; 1 a 113 da SEQ ID NO: 2; 1 a 137 da SEQ ID NO: 2; 1 a 161 da SEQ ID NO: 2; 1 a 185 da SEQ ID NO: 2; 1 a 209 da SEQ ID NO: 2; 1 a 233 da SEQ ID NO: 2; 1 a 257 da SEQ ID NO: 2; 1 a 281 da SEQ ID NO: 2; 1 a 305 da SEQ ID NO: 2; 1 a 329 da SEQ ID NO: 2; 1 a 353 da SEQ ID NO: 2; 1 a 416 da SEQ ID NO: 2; 1 a 424 da SEQ ID NO: 2; 1 a 493 da SEQ ID NO: 2; 1 a 551 da SEQ ID NO: 2; 1 a 531 da SEQ ID NO: 2 e 1 a 532 da SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 34 a 64 da SEQ ID NO: 2; 34 a 89 da SEQ ID NO: 2; 34 a 113 da SEQ ID NO: 2; 34 a 137 da SEQ ID NO: 2; 34 a 161 da SEQ ID NO: 2; 34 a 185 da SEQ ID NO: 2; 34 a 209 da SEQ ID NO: 2; 34 a 233 da SEQ ID NO: 2; 34 a 257 da SEQ ID NO: 2; 34 a 281 da SEQ ID NO: 2; 34 a 305 da SEQ ID NO: 2; 34 a 329 da SEQ ID NO: 2; 34 a 353 da SEQ ID NO: 2; 34 a 416 da SEQ ID NO: 2; 34 a 424 da SEQ ID NO: 2; 34 a 493 da SEQ ID NO: 2; e 34 a 551 da SEQ ID NO: 2.
Ainda, fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deri- vados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 34 a 530 da SEQ ID NO: 2; 34 a 531 da SEQ ID NO: 2; 34 a 532 da SEQ ID NO: 2; 34 a 533 da SEQ ID NO: 2; 34 a 534 da SEQ ID NO: 2; 34 a 535 da SEQ ID NO: 2; 34 a 536 da SEQ ID NO: 2; 34 a 537 da SEQ ID NO: 2; 34 a 538 da SEQ ID NO: 2; 34 a 539 da SEQ ID NO: 2; 30 a 532 da SEQ ID NO: 2; 31 a 532 da SEQ ID NO: 2; 32 a 532 da SEQ ID NO: 2; 33 a 532 da SEQ ID NO: 2; 34 a 532 da SEQ ID NO: 2; 35 a 532 da SEQ ID NO: 2; 36 a 532 da SEQ ID NO: 2; 30 a 531 da SEQ ID NO: 2; 31 a 531 da SEQ ID NO: 2; 32 a 531 da SEQ ID NO: 2; 33 a 531 da SEQ ID NO: 2; 34 a 531 da SEQ ID NO: 2; 35 a 531 da SEQ iD NO: 2; e 36 a 531 da SEQ ID NO: 2.
Ainda também, fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais cer- tos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deriva- dos dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são Iimi- tados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 36 a 64 da SEQ ID NO: 2; 36 a 89 da SEQ ID NO: 2; 36 a 113 da SEQ ID NO: 2; 36 a 137 da SEQ ID NO: 2; 36 a 161 da SEQ ID NO: 2; 36 a 185 da SEQ ID NO: 2; 36 a 209 da SEQ ID NO: 2; 36 a 233 da SEQ ID NO: 2; 36 a 257 da SEQ ID NO: 2; 36 a 281 da SEQ ID NO: 2; 36 a 305 da SEQ ID NO: 2; 36 a 329 da SEQ ID NO: 2; 36 a 353 da SEQ ID NO: 2; 36 a 416 da SEQ ID NO: 2; 36 a 424 da SEQ ID NO: 2; 36 a 493 da SEQ ID NO: 2; e 36 a 551 da SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 36 a 530 da SEQ ID NO: 2; 36 a 531 da SEQ ID NO: 2; 36 a 532 da SEQ ID NO: 2; 36 a 533 da SEQ ID NO: 2; 36 a 534 da SEQ ID NO: 2; 36 a 535 da SEQ ID NO: 2; 36 a 536 da SEQ ID NO: 2; 36 a 537 da SEQ ID NO: 2; 36 a 538 da SEQ ID NO: 2; e 36 a 539 da SEQ ID NO: 2.
Mais fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticor- pos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados à- queles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo nos aminoácidos 417 a 493 da SEQ ID NO: 2; 417 a 494 da SEQ ID NO: 2; 417 a 495 da SEQ ID NO: 2; 417 a 496 da SEQ ID NO: 2; 417 a 497 da SEQ ID NO: 2; 417 a 498 da SEQ ID NO: 2; 417 a 499 da SEQ ID NO: 2; 417 a 500 da SEQ ID NO: 2; 417 a 492 da SEQ ID NO: 2; 417 a 491 da SEQ ID NO: 2; 412 a 493 da SEQ ID NO: 2; 413 a 493 da SEQ ID NO: 2; 414 a
493 da SEQ ID NO: 2; 415 a 493 da SEQ ID NO: 2; 416 a 493 da SEQ ID NO: 2; 411 a 493 da SEQ ID NO: 2; 410 a 493 da SEQ ID NO: 2; 410 a 494
da SEQ ID NO: 2; 411 a 494 da SEQ ID NO: 2; 412 a 494 da SEQ ID NO: 2; 413 a 494 da SEQ ID NO: 2; 414 a 494 da SEQ ID NO: 2; 415 a 494 da SEQ ID NO: 2; 416 a 494 da SEQ ID NO: 2; 417 a 494 da SEQ ID NO: 2; e 418 a
494 da SEQ ID NO: 2.
Em uma modalidade adicional fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, varian- tes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeos do domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, varian- tes, ou derivados de tais polipeptídeos. Especificamente, polipeptídeos com- preendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seqüências de polipeptídeo a seguir: ITX1X2X3 (SEQ ID NO: 287), ACX1X2X3 (SEQ ID NO: 288), VCX1X2X3CSEQ ID NO: 289) e SPX1X2X3CSEQ ID NO: 290) onde X1 é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina, X2 é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina e X3 é lisina, arginina, histidina, glutami- na, ou asparagina. Por exemplo, fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou deri- vados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, aqueles frag- mentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seqüências de polipeptídeo a seguir: SPRKH (SEQ ID NO: 291), SPRKK (SEQ ID NO: 292), SPRKR (SEQ ID NO: 293), SPKKH (SEQ ID NO: 294), SPHKH (SEQ ID NO: 295), SPRRH (SEQ ID NO: 296), SPRHH (SEQ ID NO: 297), SPRRR (SEQ ID NO: 298), SPHHH (SEQ ID NO: 299) SPKKK (SEQ ID NO: 300), LSPRKH (SEQ ID NO: 301), LSPRKK (SEQ ID NO: 302), LSPRKR (SEQ ID NO: 303), LSPKKH (SEQ ID NO: 304), LSPHKH (SEQ ID NO: 305), LSPRRH (SEQ ID NO: 306), LSPRHH (SEQ ID NO: 307), LS- PRRR (SEQ ID NO: 308), LSPHHH (SEQ ID NO: 309) LSPKKK (SEQ ID NO: 310), WLSPRKH (SEQ ID NO: 311), WLSPRKK (SEQ ID NO: 312), WLSPRKR (SEQ ID NO: 313), WLSPKKH (SEQ ID NO: 314), WLSPHKH (SEQ ID NO: 315), WLSPRRH (SEQ ID NO: 316), WLSPRHH (SEQ ID NO: 317), WLSPRRR (SEQ ID NO: 318), WLSPHHH (SEQ ID NO: 319) WLSPKKK (SEQ ID NO: 320). Estes poiipeptídeos de Sp35 inciuem a "aiça de RKH" básica (aminoácidos de arginina-lisina-histidina 456-458) no domí- nio de Ig de Sp35. Peptídeos de Sp35 adicionais que incluem um tripeptídeo básico são ITPKRR (SEQ ID NO: 321), ACHHK (SEQ ID NO: 322) e VCHHK (SEQ ID NO: 323).
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeos do domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes, ou derivados de tais poiipeptídeos. Especificamente, peptídeos compreendendo, consis- tindo essencialmente em, ou consistindo nas seqüências de polipeptídeo a seguir: X4X5RKH (SEQ ID NO: 324), X4X5RRR (SEQ ID NO: 325), X4X5KKK (SEQ ID NO: 326), X4X5HHH (SEQ ID NO: 327), X4X5RKK (SEQ ID NO: 328), X4X5RKR (SEQ ID NO: 329), X4X5KKH (SEQ ID NO: 330), X4X5HKH (SEQ ID NO: 331), X4X5RRH (SEQ ID NO: 332) e X4X5RHH (SEQ ID NO: 333) onde X4 é qualquer aminoácido e X5 é qualquer aminoácido.
Em outras modalidades fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, um polipep- tídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis- tindo em peptídeos do domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes, ou derivados de tais poiipeptídeos. Especificamente, poiipeptídeos compreen- dendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seqüências de polipeptídeo a seguir: ITX6X7X8 (SEQ ID NO: 334), ACX6X7X8 (SEQ ID NO: 335), VCX6X7X8 (SEQ ID NO: 336) e SPX6X7X8 (SEQ ID NO: 337) onde X6 é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina, X7 é qualquer aminoáci- do e X8 é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina. Por exemplo, um polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis- tindo na seqüência de polipeptídeo a seguir: SPRLH (SEQ ID NO: 338).
Fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 compreen- dendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeos con- tendo aminoácidos 452-458 no domínio de Ig de Sp35, ou derivados dos mesmos, em que aminoácido 452 é um resíduo de triptofano ou de fenilala- nina.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeos do domínio básico de Sp35. Especificamente, peptídeos compre- endendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seqüências de polipeptídeo a seguir: RRARIRDRK (SEQ ID NO: 339), KKVKVKEKR (SEQ ID NO: 340), RRLRLRDRK (SEQ ID NO: 341), RRGRGRDRK (SEQ ID NO: 342) e RRIRARDRK (SEQ ID NO: 343).
Polipeptídeos de Sp35 solúveis exemplares adicionais e méto- dos e materiais para obter estas moléculas podem ser encontrados para produzir anticorpos ou fragmentos de anticorpos da presente invenção, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional PCT/US2004/008323, incorpo- rado aqui por referência em sua totalidade.
Métodos de fazer anticorpos são bem-conhecidos na técnica e descritos aqui. Uma vez anticorpos para vários fragmentos de, ou para o Sp35 de comprimento total sem a seqüência sinal, foram produzidos, deter- minar que aminoácidos, ou epitopo, de Sp35 ao(s) qual(is) o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno se liga pode ser determinado por protoco- los de mapeamento de epitopo como descritos aqui como também métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA intercalada de anticorpo duplo como descrito no "Capítulo 11- Imunologia", Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et ai, v. 2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Protocolos de mapeamento de epitopo adicionais podem ser encontrados em Morris, G., Epitope Mapping Protocols, Nova Jersey: Human Press (1996) que são ambos incorporados aqui por referência em suas totalidades. Mapeamento de epitopo pode também ser executado por meios comercialmente disponí- veis (isto é, ProtoPROBE1 Inc. (Milwaukee, Wisconsin)).
Adicionalmente, anticorpos produzidos que se liga a qualquer porção de Sp35 podem ser depois triados para sua capacidade de agir como antagonista de Sp35 e desse modo promover desenvolvimento de neurite, sobrevivência, proliferação e diferenciação neuronal e de oligodendrócitos como também promover mielinação. Anticorpos podem ser triados para so- brevivência de oligodendrócitos/neuronal usando o método como descrito nos Exemplos 10 e 11. Adicionalmente, anticorpos podem ser triados para sua habilidade para promover mielinação usando o método do Exemplo 9. Por fim, anticorpos podem ser triados para sua habilidade de promover proli- feração e diferenciação de oligodendrócitos, como também desenvolvimento de neurite usando o método como descrito no Exemplo 7. Outras funções de antagonista de anticorpos da presente invenção podem ser testadas usando outros ensaios como descrito nos Exemplos aqui.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor- po, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo que específica ou preferencialmente se liga pelo menos um epitopo de Sp35 onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos cerca de quatro a cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 2, pelo menos sete, pelo menos nove, ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos de um epitopo dado da SEQ ID NO: 2 como descritos podem ser, mas não necessariamente, contí- guos ou lineares. Em certas modalidades, o pelo menos um epitopo de Sp35 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um epitopo não- linear formado pelo domínio extracelular de Sp35 como expresso na superfí- cie de uma célula ou como um fragmento solúvel, por exemplo, fundido em uma região de Fc de IgG. Desse modo, em certas modalidades o pelo me- nos um epitopo de Sp35 compreende, consiste essencialmente em, ou con- siste em pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, entre cerca de 15 a cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 aminoácidos contíguos ou não-contíguos da SEQ iD NO: 2 onde os aminoácidos não- contíguos formam um epitopo através do dobramento da proteína.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor- po, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo que específica ou preferencialmente se liga pelo menos um epitopo de Sp35 onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, além de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contíguos ou não-contíguos da SEQ ID NO: 2 como descritos acima, e uma metade adi- cional que modifica a proteína, por exemplo, uma metade de carboidrato po- de ser incluída de modo que o anticorpo de Sp35 se liga com afinidade mais alta à proteína-alvo modificada que com uma versão inalterada da proteína. Alternativamente, o anticorpo de Sp35 de modo algum se liga à versão inal- terada da proteína-alvo.
Em certos aspectos, a presente invenção é direcionada a um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo que especificamente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmen- to do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade ca- racterizada por uma constante de dissociação (Kd) que é menos que a Kd para o dito anticorpo monoclonal de referência.
Em certas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção especificamente se liga a pelo menos um epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima, isto é, se liga a um tal epitopo mais facilmente que ligaria a um epito- po não relacionado, ou aleatório; se liga preferencialmente a pelo menos um epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima, isto é, se liga a um tal epitopo mais facilmente que ligaria a um epitopo relacionado, similar, homólogo, ou análogo; competitivamente inibe ligação de um anticorpo de referência que específica ou preferencialmente se liga a um certo epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima; ou liga pelo menos um epito- po de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima com uma afinidade ca- racterizada por uma constante de dissociação Kd de menos que cerca de 5 χ 10"2 M1 cerca de 10"2 M, cerca de 5 χ 10"3 M1 cerca de 10"3 M, cerca de 5 χ 10"4 Μ, cerca de IO"4 M1 cerca de 5 χ 10"5 Μ, cerca de 10'5 M1 cerca de 5 χ 10"6 Μ, cerca de 10"6 M1 cerca de 5 χ 10"7 Μ, cerca de 10"7 M1 cerca de 5 χ 10"8 M1 cerca de 10"8 M, cerca de 5 χ 10"9 Μ, cerca de 10"9 M, cerca de 5 χ 10"10 Μ, cerca de 10"10 M1 cerca de 5 χ 10"11 Μ, cerca de 10"11 M1 cerca de 5 χ 10"12 M1 cerca de 10"12 M1 cerca de 5 χ 10"13 Μ, cerca de 10'13 M, cerca de 5 χ 10"14 M, cerca de 10"14 M, cerca de 5 χ 10"15 M1 ou cerca de 10"15 M. Em um aspecto particular, o anticorpo ou fragmento do mesmo preferencialmen- te se liga a um polipeptídeo de Sp35 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de Sp35 murino ou fragmento do mesmo.
Como usado no contexto de constantes de dissociação de Iiga- ção de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nos métodos utilizados para medir afinidade de anticorpo. Por exemplo, depen- dendo do nível de precisão da instrumentação usada, erro padrão com base no número de amostras medidas, e erro de arredondamento, o termo "cerca de 10"2 M" poderia incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
Em modalidades específicas, um anticorpo, ou fragmento de li- gação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga poli- peptídeos de Sp35 ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"2 s"1, 10"2 s"1, 5 X IO"3 s"1 ou I0" 3 s"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga polipeptídeos de Sp35 ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"4 s\ 10"4 s"1, 5 X 10"5 s"\ ou 10"5 s"1 5 X 10"6 s"1, 10"6 S"-1, 5 X 10'7 S1 ou 10"7 S"1.
Em outras modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga polipeptídeos de Sp35 ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa associação (k(associação)) maior ou igual a 103 M1 s'1, 5 X 103 M"1 s"1, 104 M"1 s"1 ou 5 X 104 M"1 s"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antí- geno, variante, ou derivado do mesmo da invenção liga polipeptídeos de Sp35 ou fragmentos ou variantes dos mesmos com uma taxa associação (k(associação)) maior ou igual a 105 M"1 s"1, 5 X 105 M"1 s'\ 106 M1 s'\ ou 5 X10"6M*1 s1 ou 10"7 M-1 s-1.
Em várias modalidades, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como descrito aqui é antagonista da atividade de Sp35. Em certas modalidades, por exemplo, li- gação de um anticorpo de Sp35 de antagonista a Sp35, conforme expresso em neurônios, bloqueia inibição associada à mielina do desenvolvimento de neurite ou morte de célula neuronal. Em outras modalidades, ligação do an- ticorpo de Sp35 a Sp35, como expresso em oligodendrócitos, bloqueia a ini- bição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, ou bloqueia desmielinação ou dismielinação dos neurônios do SNC.
A menos que seja especificamente observado, como aqui usado um "fragmento do mesmo" em referência a um anticorpo refere-se a um fragmento de ligação de antígeno, isto é, uma porção do anticorpo que es- pecificamente liga ao antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo de Sp35, por exemplo, um anticorpo da invenção é um anticorpo de Sp35 biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífi- co, minicorpo, anticorpo com domínio excluído, ou proteína de fusão tendo especificidade de ligação para mais de um epitopo, por exemplo, mais de um antígeno ou mais de um epitopo no mesmo antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo de Sp35 biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou anticorpo tem pelo menos um domínio de ligação específico para pelo menos um epitopo em um polipeptídeo-alvo descrito aqui, por exemplo, Sp35. Em outra modali- dade, um anticorpo de Sp35 biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou anti- corpo tem pelo menos um domínio de ligação específico para um epitopo em um polipeptídeo-alvo e pelo menos um domínio de ligação-alvo específico para um fármaco ou toxina. Em ainda outra modalidade, um anticorpo de Sp35 biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou anticorpo tem pelo menos um domínio de ligação específico para um epitopo em um polipeptídeo-alvo descrito aqui, e pelo menos um domínio de ligação específico para um pro- fármaco. Um anticorpo de Sp35 biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou an- ticorpo pode ser um anticorpo tetravalente tendo dois domínios de ligação- alvos específicos para um epitopo de um polipeptídeo-alvo descrito aqui e dois domínios de ligação-alvos específicos para um segundo aivo. Desse modo, um anticorpo de Sp35 biespecífico tetravalente, polipeptídeo de liga- ção, ou anticorpo pode ser bivalente para cada especificidade.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção, como conhecidos por aqueles versados na técnica, podem compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, ligação do componente C1 do complemento a uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema do complemento. Ativação do complemento é importante na opsonização e Iise dos patógenos celulares. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Também, os anticorpos se ligam aos receptores em várias célu- las por meio da região de Fc, com um sítio de ligação do receptor Fc na re- gião de Fc de anticorpo que liga a um receptor Fc (FcR) em uma célula. Há vários receptores Fc que são específicos para classes diferentes de anticor- po, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores epsilo), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). Ligação do anticorpo aos receptores Fc nas su- perfícies celulares desencadeia várias respostas biológicas importantes e diversas incluindo englobamento e destruição das partículas revestidas com anticorpo, liberação dos complexos imunes, Iise de células-alvos revestidas com anticorpo através de células assassinas (chamadas citotoxicidade me- diada por célula anticorpo-dependente, ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle de produção de imunoglo- bulina.
Consequentemente, certas modalidades da invenção incluem um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo em que pelo menos uma fração de um ou mais dos do- mínios de região constante foram deletados ou do contrário alterados para fornecer características bioquímicas desejadas tais como funções efetoras reduzidas, a habilidade para não-covalentemente dimerizar, habilidade au- mentada para localizar no sítio de um tumor, meia-vida de soro reduzida, ou meia-vida de soro aumentada quando comparado com um todo, anticorpo inalterado de aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, certos anticorpos para o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos aqui são anticorpos com domínio excluído compreendendo uma cadeia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada da imunoglobulina, mas que carece de pelo menos uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, será deletado um domínio intei- ro da região constante do anticorpo modificado, por exemplo, todo ou parte do domínio Ch2 será deletada.
Em certos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de an- tígeno, variantes, ou derivados dos mesmos descrito aqui, a porção de Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações de ponto ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação do receptor Fc do anticorpo circulante modificado assim aumentando a localização do tumor. Em outros casos pode ser que modificações da regi- ão constante consistentes com a invenção imediata modere a ligação do complemento e desse modo reduza a meia-vida de soro e associação não- específica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar as ligações de dissulfeto ou me- tades de oligossacarídeo que permitem localização intensificada devido à especificidade de antígeno aumentada ou flexibilidade de anticorpo. O perfil fisiológico resultante, biodisponibilídade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como localização do tumor, biodistribuição e meia-vida de soro, podem ser facilmente ser medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem-conhecidas sem experimentação imprópria.
Formas modificadas de anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção po- dem ser feitas de anticorpos precursores inteiros ou de origem usando técni- cas conhecidas na técnica. Técnicas exemplares são debatidas em mais detalhe aqui.
Em certas modalidades ambas as regiões variáveis e constantes dos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos são completamente humanas. Anticorpos completa- mente humanos podem ser feitos usando técnicas que são conhecidas na técnica e como descritas aqui. Por exemplo, anticorpos completamente hu- manos contra um antígeno específico podem ser preparados administrando o antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos Ioci endógenos fo- ram inválidos. Técnicas exemplares que podem ser usadas para fazer tais anticorpos são descritas nas patentes US em: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140 que são incorporadas por referência em suas totalidades. Outras técnicas são conhecidas na técnica. Anticorpos completamente humanos podem ser igualmente produzidos através de várias tecnologias de exibição, por exemplo, exibição de fago ou outros sistemas de exibição viral, como descritos em outro lugar em mais detalhe aqui.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser feitos ou fabrica- dos usando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas modalida- des, moléculas de anticorpo ou fragmentos do mesmo são "recombinante- mente produzidas", isto é, são produzidas usando tecnologia de DNA re- combinante. Técnicas exemplares para fazer as moléculas de anticorpo ou fragmentos do mesmo são debatidas em outro lugar em mais detalhe aqui.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção também incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de modo que ligação covalente ao anticorpo não impede de especificamente ligar a seu epitopo cognato. Por exemplo, mas não por via de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, peguila- ção, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos de prote- ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer de numerosas modificações químicas pode ser realizada através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não-limitadas a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de íunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais ami- noácidos não-clássicos.
Em certas modalidades, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção não suscitará uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exem- pio, em um humano. Em uma modalidade, anticorpos de Sp35, ou fragmen- tos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção são modificados para reduzir sua imunogenicidade usando técnicas reco- nhecidas na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser anticorpos humani- zados, primatizados, desimunizados, ou quiméricos podem ser feitos. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não-humano, tipicamente um anticorpo murino ou primata, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo de origem, mas que é me- nos imunogênico em seres humanos. Isto pode ser alcançado através de vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não-humanos inteiros sobre regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões de determi- nação de complementaridade não-humanas (CDRs) em uma estrutura hu- mana e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos estruturais críticos; ou (c) transplantar os domínios variáveis não-humanos inteiros, mas "encapotar" os mesmos com uma seção semelhante à humana por substitui- ção dos resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851-6855 (1984); Morrison et ai, Adv. Immu- nol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et a/., Science 239:1534-1536 (1988); Pad- lan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan1 Molec. Immun. 31:169-217 (1994), e Pats. U.S. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.190.370 todas es- tas são por este meio incorporadas por referência em sua totalidade.
Desimunização pode também ser usada para diminuir a imuno- genicidade de um anticorpo. Como aqui usado, o termo "desimunização" inclui alteração de um anticorpo para modificar epitopos de célula T (vide, por exemplo, W09852976A1, W00034317A2). Por exemplo, seqüências de Vh e Vl do anticorpo de partida são analisadas e um "mapa" de epitopo de células T humanas de cada região V mostrando a localização dos epitopos em relação às regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e outros resíduos fundamentais dentro da seqüência. Epitopos de células T individuais do mapa de epitopo de células T São analisados para identificar substituições de aminoácido alternativas com um risco baixo de alterar a ati- vidade do anticorpo final. Uma faixa de seqüências Vh e Vl alternativas compreendendo combinações de substituições de aminoácido é projetada e estas seqüências são subseqüentemente incorporadas em uma faixa de po- Iipeptideos de ligação, por exemplo, anticorpos Sp35-específicos ou frag- mentos imunoespecíficos dos mesmos para o uso nos métodos de diagnós- tico e de tratamento descritos aqui que são depois testados para função. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e são testados. Genes de cadeia pesada e leve completos compreendendo regiões V modi- ficadas e C humanas são depois clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes introduzidos nas linhagens celulares para a pro- dução de anticorpo inteiro. Os anticorpos são depois comparados em ensai- os bioquímicos e biológicos apropriados, e a variante ótima é identificada.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser gerados por qual- quer método adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlonais para um antígeno de interesse podem ser produzidos por vários procedimentos bem- conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo de Sp35, por exemplo, um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpo Sp35-específico ou fragmento imunoespecífico do mesmo pode ser administrado a vários ani- mais hospedeiros incluindo, mas não-limitados a, coelhos, camundongos, ratos, galinhas, hamsters, cabras, burros, etc., para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antígeno. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, de- pendendo das espécies hospedeiras, e incluem mas não são limitados a, Freund (complete e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumí- nio, substâncias ativas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de lapa, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacille Calmet- te-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bem- conhecidos na técnica.
Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo o uso de tec- nologias de hibridoma, recombinante, e de exibição de fago, ou uma combi- nação das mesmas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produ- zidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et a/., Antibodies: A Laboratory Manu- al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Anticorpos and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades). O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclo- nal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um clone simples, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou de fago, e não o método pelo qual é produzido. Desse modo, o termo "anticorpo monoclonal" não é limita- do a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando camundongos knockout em Sp35 para aumentar as regiões de reconhecimento de epitopo. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técni- cas conhecidas na técnica incluindo o uso de tecnologia de hibridoma e re- combinante e de exibição de fago como descrita em outro lugar aqui. Usando os protocolos reconhecidos na técnica, em um exemplo, anticorpos são suscitados em mamíferos através de múltiplas injeções sub- cutâneas ou intraperitoneais do antígeno relevante (por exemplo, antígenos associados ao tumor purificados tais como Sp35 ou células ou extratos celu- lares compreendendo tais antígenos) e um adjuvante. Esta imunização tipi- camente provoca uma resposta imune compreendendo a produção de anti- corpos antígeno-reativos de esplenócitos ou linfócitos ativados. Embora os anticorpos resultantes possam ser colhidos do soro do animal para fornecer preparações policlonais, é freqüentemente desejável isolar os linfócitos indi- viduais do baço, Iinfonodos ou sangue periférico para fornecer preparações homogêneas de anticorpos monoclonais (MAbs). Preferivelmente, os linfóci- tos são obtidos do baço.
Neste processo bem-conhecido (Kohler et ai, Nature 256:495 (1975)) os linfócitos relativamente de vida curta, ou mortais, de um mamífero que foi injetado com antígeno são fundidos com uma linhagem de célula tu- moral imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma), desse modo, produzindo células híbridas ou "hibridomas" que são imortais e capazes de produzir o anticorpo geneticamente codificado da célula B. Os híbridos resul- tantes são segregados em cepas genéticas simples por seleção, diluição, e recultivo com cada cepa individual compreendendo genes específicos para a formação de um anticorpo simples. Eles produzem anticorpos que são ho- mogêneos contra um antígeno desejado e, em referência a sua ascendência genética pura, são denominados "monoclonais". Células de hibridoma desse modo preparadas são semeadas e crescidas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não-fundidas. Aqueles versados na técnica apreciarão que reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, se- leção e crescimento de hibridomas estão comercialmente disponíveis de vá- rias fontes e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Em geral, o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão cultivando é ensaiado para produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. Pre- ferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produ- zida por células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente liga- do a enzima (ELISA). Após as células de hibridoma serem identificadas que produzem os anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade deseja- das, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de dilui- ção e crescidos através de métodos padrões (Goding, Monoclonal Anticor- pos: Principies and Practice, Academic Press, páginas 59-103 (1986)). Tam- bém será apreciado que os anticorpos monoclonais segregados pelos sub- clones podem ser separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro através de procedimentos de purificação convencionais tais como, por e- xemplo, proteína-a, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmen- tos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de molécu- las de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o do- mínio CH1 da cadeia pesada.
Aqueles versados na técnica também apreciarão que DNA que codifica os anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sítios de ligação de antígeno) podem ser também derivados de bibliotecas de anticor- po, tais como bibliotecas de exibição de fago. Em particular, tal fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno expressos de um repertório ou biblioteca de anticorpo combinatória (por exemplo, humano ou murino). Fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que liga o antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou esfera. Fagos usados nestes métodos são tipica- mente fago filamentoso incluindo domínios de ligação de fd e M13 expressos do fago com Fab, Fv OE DAB (região de Fv individiual de cadeias leves ou pesadas) ou domínios de Fv estabilizados de dissulfeto recombinantemente fundidos ou o gene Ill de fago ou proteína do gene VIII. Métodos exemplares estão expostos, por exemplo, em EP 368 684 B1; patente U.S. 5.969.108, Hoogenboom, H. R. e Chames, Immunol. Today 27:371 (2000); Nagy et al. Nat Med. 8:801 (2002); Huie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:2682 (2001); Lui et al., J. Moi Biol. 315:1063 (2002), cada uma destas é incorpo- rada aqui por referência. Várias publicações (por exemplo, Marks et al., Bi- o/Technology 10:779-783 (1992)) descreveram a produção de anticorpos humanos de afinidade alta por embaralhamento de cadeias, como também infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago grandes. Em outra modalidade, exibição ribos- sômica pode ser usada para substituir o bacteriófago como a plataforma de exibição (vide, por exemplo, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 78:1287 (2000); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:3750 (2001); ou Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). Em ainda outra modalidade, bibliotecas de superfície celular podem ser tríadas para anticorpos (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:10701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Tais procedimentos provêem alternativas às técnicas de hibridoma tradicionais para o isolamento e clonagem subsequente dos anti- corpos monoclonais.
Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcio- nais são exibidos na superfície das partículas de fago que carregam as se- qüências de polinucleotídeo que os codificam. Por exemplo, seqüências de DNA que codificam as regiões Vh e Vl são amplificadas de bibliotecas de cDNA animais (por exemplo, bibliotecas de cDNA humanas ou murinas de tecidos linfoides) ou bibliotecas de cDNA sintéticas. Em certas modalidades, o DNA que codifica as regiões Vh e Vl é unido por um Iigante de scFv por PCR e clonado em um vetor de fagemídeo (por exemplo, ρ CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado em E. coli e o E. coli é infetado com fago auxiliar. Fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamen- tosos incluindo fd e M13 e as regiões Vh e Vl são usualmente recombinan- temente fundidas no gene Ill de fago ou gene VIII. Fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que liga a um antígeno de interesse (isto é, um polipeptídeo de Sp35 ou um fragmento do mesmo) pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou esfera.
Exemplos adicionais de métodos de exibição de fago que podem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles descritos em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Me- thods í84:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Im- munology 57:191-280 (1994); Pedido de Patente de PCT PCT/GB91/01134; publicações de PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Pats. U.S. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um destes é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Como descrito nas referências acima, após seleção de fago, as regiões de codificação de anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado, e expresso em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células mamíferas, células de inseto, células de planta, levedura, e bactérias. Por exemplo, técnicas para recombinante- mente produzir fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem ser também emprega- das usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles descritos na publicação de PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864- 869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (ditas referências incorporadas por referência em su- as totalidades).
Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia simples e anticorpos incluem aquelas descritas nas Pats. U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados, ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que as porções diferentes do anticorpo são derivadas de espécies animais diferentes, tais como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de i- munoglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et ai., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies ef a/., J. Immunol. Me- thods "/25:191-202 (1989); Pats. U.S. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397 que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Anticorpos huma- nizados são moléculas de anticorpo derivadas de um anticorpo de espécie não-humana que liga o antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) das espécies não-humanas e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüen- temente, os resíduos de estrutura serão substituídos nas regiões de estrutu- ra humanas com o resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR pa- ra alterar, preferivelmente melhorar, a ligação do antígeno. Estas substitui- ções de estrutura são identificadas por métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, modelagem das interações da CDR e resíduos de estrutura para identificar resíduos de estrutura importantes para ligação do antígeno e comparação de seqüência para identificar resíduos de estrutura incomuns em posições particulares. (Vide, por exemplo, Queen et ai., Patente U.S. 5.585.089; Riechmann et ai., Nature 332:323 (1988) que é incorporada aqui por referência em suas totalidades). Anticorpos podem ser humanizados u- sando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por e- xemplo, enxerto de CDR (EP 239,400; publicação de PCT WO 91/09967; Pats. U.S. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), capeamento ou recobrimento (EP 592,106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et ai, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et ai., PNAS 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeias (Patente U.S. 5.565.332 que é incorporada por referência em sua totalidade). Anticorpos completamente humanos são particularmente dese- jáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos huma- nos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição de fago descritos acima usando bibliotecas de anticorpo derivadas de seqüências de imunoglobulina humanas. Vide tam- bém, Pats. U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações de PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma destas é incorporada aqui por referên- cia em sua totalidade.
Anticorpos humanos podem ser também produzidos usando ca- mundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes humanos de imu- noglobulina. Por exemplo, os complexos de genes humanos de cadeia pe- sada e leve da imunoglobulina podem ser introduzidos fortuitamente ou por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo. Alternativamente, a região variável humana, região constante, e região de diversidade podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de ca- mundongo além dos genes humanos de cadeia pesada e leve. Os genes de camundongo de cadeia pesada e leve da imunoglobulina podem ser transmi- tidos de modo separado ou simultaneamente não-funcional com a introdução dos Ioci de imunoglobulina humana através de recombinação homóloga. Em particular, deleção homozigota da região JH impede a produção de anticorpo endógeno. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são depois criados para produzir descendência homozigota que expressam anticorpos humanos. Os camundongos transgê- nicos são imunizados na maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um polipeptídeo-alvo desejado. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos dos camun- dongos imunizados, transgênicos usando tecnologia de hibridoma conven- cional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camun- dongos transgênicos rearranjam-se durante a diferenciação de célula B, e subseqüentemente sofrem troca de classe e mutação somática. Desse mo- do, usando uma tal técnica, é possível produzir anticorpos de IgG1 IgA1 IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para pro- duzir anticorpos humanos, vide Lonberg e Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65- 93 (1995). Para um debate detalhado desta tecnologia para produzir anticor- pos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos por produzir tais anticorpos, vide, por exemplo, Publicações de PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Pats. U.S. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598, que são incorpo- radas por referência aqui em sua totalidade. Além disso, companhias tais como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) podem empenhar-se para fornecer anticorpos humanos direcionados contra um an- tígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epito- po selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "sele- ção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não-humano sele- cionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo. (Jespers et ai, Bio/Technology 12:899-903 (1988). Ver também, patente U.S. 5.565.332 que é incorporada por referência em sua totalidade).
Também, anticorpos para alvejar polipeptídeos da invenção po- dem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos de anti-idiotipo que "mimetizam" polipeptídeos alvos usando técnicas bem-conhecidas àquelas versadas na técnica. (Vide, por exemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5).437-444 (1989) e Nissindissociação, J. Immunol. 147(8)\2429-2438 (1991)). Por exemplo, anticorpos que ligam e competitivamente inibem mul- timerização de polipeptídeo e/ou ligação de um polipeptídeo da invenção a um Iigante podem ser usados para gerar anti-idiotipos que "mimetizam" a multimerização do polipeptídeo e/ou domínio de ligação e, como uma con- seqüência, ligam e neutralizam o polipeptídeo e/ou seu ligante. Tais anti- idiotipos neutralizantes ou fragmentos Fab de tais anti-idiotipos podem ser usados em regimes terapêuticos para neutralizar o ligante polipeptídico. Por exemplo, tais anticorpos anti-idiotípicos podem ser usados para ligar um po- lipeptídeo-alvo desejado e/ou ligar seus ligantes/receptores, e assim bloque- ar sua atividade biológica.
Em outra modalidade, DNA que codifica anticorpos monoclonais desejados pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de especificamente ligar aos genes que codificam as cadeias pesa- das e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma isoladas e sub- clonadas servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão que são depois transfec- cionados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chi- nês (CHO) ou células de mieloma que do contrário não produzem imunoglo- bulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético como descrito aqui) pode ser usado para clonar seqüências de região constante e variável para os anticorpos de fabricação como descritos em Newman et ai, Patente U.S. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que é incor- porada por referência aqui. Essencialmente, isto requer extração de RNA das células selecionadas, conversão para cDNA, e amplificação por PCR usando iniciadores Ig-específicos. Iniciadores adequados para este propósito são também descritos na Patente U.S. 5.658.570. Como será debatido em mais detalhe abaixo, células transformadas que expressam o anticorpo de- sejado podem ser crescidas em quantidades relativamente grandes para fornecer materiais clínicos e comerciais da imunoglobulina.
Em uma modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção com- preende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticor- po. Em outra modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo de Sp35 da invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais mo- léculas de anticorpo. Moléculas de anticorpo exemplares que compreendem pelo menos uma CDR que pode ser incluída nos anticorpos de Sp35 em questão são descritos aqui.
Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácido dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as seqüências das regiões de determinação de complementarida- de (CDRs) por métodos que são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por comparação às seqüências de aminoácido conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervaria- bilidade da seqüência. Usando técnicas de DNA recombinante rotineiras, uma ou mais do CDRs podem ser inseridas dentro das regiões de estrutura, por exemplo, em regiões de estrutura humanas para humanizar um anticor- po não-humano. As regiões de estrutura podem ser de ocorrência natural ou regiões de estrutura de consenso, e preferivelmente regiões de estrutura humanas (vide, por exemplo, Chothia et aí., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) para uma listagem de regiões de estrutura humanas). Preferivelmente, o po- linucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e CDRs codi- fica um anticorpo ao qual especificamente liga pelo menos a um epitopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, Sp35. Preferivelmente, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas dentro das regiões de estrutu- ra, e, preferivelmente, as substituições de aminoácido melhoram a ligação do anticorpo a seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usa- dos para fazer substituições ou deleções de aminoácido de um ou mais resí- duos de cisteína de regiões variáveis que participam em uma ligação de dis- sulfeto de intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que carecem de uma ou mais ligações de dissulfeto de intracadeia. Outras alterações para o polinucleotídeo são abrangidas pela presente invenção e estão dentro da habilidade da técnica.
Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor- pos quiméricos" (Morrison et ai., Proc. NatL Acad. Sei. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et ai, Nature 314:452- 454 (1985)) por splicing de genes de uma molécula de anticorpo de camun- dongo de especificidade de antígeno apropriada junto com genes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada podem ser usadas. Como aqui usado, um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes são derivadas de espécies animais diferentes, tais como aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados.
Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticor- pos de cadeia simples (Patente U.S. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988); e Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples. Anticorpos de cadeia simples são formados ligando os fragmentos de cadeia pesada e leve da região de Fv por meio de uma ponte de aminoácido, resultando em um anticorpo de cadeia simples. Técnicas para o conjunto de fragmentos de Fv funcionais em E. coli podem ser também usadas (Skerra etal., Science 242:1038-1041 (1988)).
Ainda outras modalidades da presente invenção compreendem a geração de anticorpos humanos ou substancialmente humanos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são incapazes de produção de imunoglobulina endógena (vide por exemplo, Pats. U.S. 6.075.181, 5.939.598, 5.591.669 e 5.589.369 cada uma destas é incorporada aqui por referência). Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota da região de junção de cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméri- cos e de linhagem germinal resulta em inibição completa da produção de anticorpo endógeno. Transferência de um arranjo de gene de imunoglobulina humana para tais camundongos mutantes de linhagem germinal resultará na produção de anticorpos humanos sob desafio de antígeno. Outros meios preferidos de gerar anticorpos humanos usando camundongos de SCID são descritos na Patente U.S. 5.811.524 que é incorporada aqui por referência. Será apreciado que o material genético associado a estes anticorpos huma- nos pode ser também isolado e manipulado como descrito aqui.
Ainda outros meios altamente eficientes para gerar anticorpos recombinantes são descritos por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, esta técnica resulta na geração de anticorpos pri- matizados contendo domínios variáveis de macaco e seqüências constantes humanas. Esta referência é incorporada por referência em sua totalidade aqui. Além disso, esta técnica é também descrita nas Pats. U.S. comumente atribuídas 5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096 cada uma destas é incorporada aqui por referência.
Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados por mi- cromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, células mono- nucleares de sangue periférico podem ser isoladas de um mamífero imuni- zado e cultivado durante cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser tria- das para IgGs específicos que satisfazem os critérios de triagem. As células podem ser isoladas de poços positivos. Células B produtoras de Ig individu- ais podem ser isoladas por FACS ou as identificando em um ensaio de placa hemolítico mediado por complemento. Células B produtoras de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genes de Vh e Vl podem ser amplifica- dos usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes de Vh e Vl podem ser clona- dos em um vetor de expressão de anticorpo e transfeccionados em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.
Alternativamente, linhagens celulares produtoras de anticorpo podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem-conhecidas ao artesão versado. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. Neste respeito, técnicas adequadas para o uso na invenção como descritas abaixo são descritas em Current Pro- tocols in Immunology, Coligan et ai., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience, John Wiley and Sons, Nova Iorque (1991) que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, incluindo suplementos.
Anticorpos para o uso nos métodos de diagnósticos e terapêuti- cos descritos aqui podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica pela síntese de anticorpos, em particular, através de síntese química ou preferivelmente, através de técnicas de expressão recombinantes como descritas aqui.
Em uma modalidade, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção compre- ende uma região constante sintética em que um ou mais domínios são par- cial ou completamente deletados ("anticorpos com domínio excluído"). Em certas modalidades os anticorpos modificados compatíveis compreenderão construções ou variantes com domínio excluído em que o domínio CH2 intei- ro foi removido (construções de ACh2). Para outras modalidades um peptí- deo de conexão curto pode ser substituído pelo domínio deletado para pro- ver flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Aqueles versados na técnica apreciarão que tais construções são particularmente preferidas devido às propriedades reguladoras do domínio CH2 na taxa cata- bólica do anticorpo. Construções com domínio deletado podem ser deriva- das usando um vetor (por exemplo, de Biogen IDEC Incorporated) codifican- do um domínio constante de IgGI humana (vide, por exemplo, WO 02/060955A2 e W002/096948A2, que são incorporados por referência em suas totalidades). Este vetor exemplar foi criado para excluir o domínio Ch2 e fornecer um vetor sintético que expressa uma região constante de IgGI com domínio excluído.
Em certas modalidades, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção são minicorpos. Minicorpos podem ser feitos usando métodos descritos na técni- ca (vide, por exemplo, Patente US 5.837.821 ou WO 94/09817A1, que são incorporados por referência em suas totalidades).
Em uma modalidade, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção uma com- preende cadeia pesada de imunoglobulina tendo deleção ou substituição de alguns ou até mesmo um só aminoácido contanto que permita associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um amino- ácido simples em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser bastante pa- ra substancialmente reduzir ligação de Fc e assim aumentar a localização do tumor. Similarmente, pode ser desejável simplesmente deletar aquela parte de um ou mais domínios de região constante que controlam a função efetora (por exemplo, ligação do complemento) a ser modulada. Tais deleções par- ciais das regiões constantes podem melhorar as características seleciona- das do anticorpo (meia-vida de soro) enquanto deixando outras funções de- sejáveis associadas ao domínio de região constante em questão intactas. Além disso, como aludido acima, as regiões constantes dos anticorpos des- critos podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que intensificam o perfil da construção resultante. Neste respeito pode ser possível romper a atividade fornecida por um sítio de liga- ção conservado (por exemplo, ligação de Fc) enquanto substancialmente mantendo a configuração e perfil imunogênico do anticorpo modificado. Ain- da outras modalidades compreendem a adição de um ou mais aminoácidos á região constante para intensificar as características desejáveis tais como função efetora ou prover mais ligação de citotoxina ou de carboidrato. Em tais modalidades pode ser desejável a inserção ou réplica daquelas seqüên- cias específicas derivadas dos domínios de região constante selecionados.
A presente invenção também fornece anticorpos que compreen- dem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões Vh e/ou regi- ões VL) descritas aqui cujos anticorpos ou fragmentos dos mesmos imuno- especificamente ligam a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento ou variante dos mesmos. Técnicas-padrão conhecidas àqueles de habilidade na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, incluindo, mas não-limitadas a, mutagê- nese dirigida e mutagênese mediada por PCR resultando em substituições de aminoácidos. Preferivelmente, as variantes (incluindo derivados) codifi- cam menos de 50 substituições de aminoácido, menos de 40 substituições de aminoácido, menos de 30 substituições de aminoácido, menos de 25 substituições de aminoácido, menos de 20 substituições de aminoácido, me- nos de 15 substituições de aminoácido, menos de 10 substituições de ami- noácido, menos de 5 substituições de aminoácido, menos de 4 substituições de aminoácido, menos de 3 substituições de aminoácido, ou menos de 2 substituições de aminoácido com relação à região Vh de referência, VhC- DR1, VhCDR2, VhCDR3, região VL, VlCDRI, VlCDR2, ou VlCDR3. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que o resíduo de ami- noácido é substituído com um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Estas famí- lias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, glici- na, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias late- rais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por e- xemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, muta- ções podem ser introduzidas fortuitamente ao longo de toda ou parte da se- qüência de codificação, tal como através de mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para atividade biológica para identi- ficar mutantes que retém a atividade (por exemplo, a habilidade de ligar um polipeptídeo de Sp35).
Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas nas regiões de estrutura ou apenas nas regiões de CDR de uma molécula de anticorpo. Mutações introduzidas podem ser mutações de sentido errado silenciosas ou neutras, isto é, têm nenhum, ou pequeno, efeito na habilidade de um anti- corpo para ligar o antígeno. Estes tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códon, ou melhorar a produção de anticorpo de um hibri- doma. Alternativamente, mutações de sentido errado não-neutras podem alterar a habilidade de um anticorpo para ligar o antígeno. A localização das mutações de sentido errado mais silenciosas e neutras é provável de estar nas regiões de estrutura, enquanto a localização da maioria das mutações de sentido errado não-neutras é provável estar na CDR, entretanto este não é um requerimento absoluto. Alguém de habilidade na técnica poderia proje- tar e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas tais como ne- nhuma alteração na atividade de ligação de antígeno ou alteração na ativi- dade de ligação (por exemplo, melhorias na atividade de ligação de antígeno ou alterações na especificidade de anticorpo). Seguindo mutagênese, a pro- teína codificada pode ser habitualmente expressada e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada, (por exemplo, habilidade para imuno- especificamente ligar pelo menos um epitopo de um polipeptídeo de Sp35) pode ser determinada usando as técnicas descritas aqui ou habitualmente modificando as técnicas conhecidas na técnica.
IV. POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM ANTICORPOS DE Sp35
A presente invenção também provê moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucle- otídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis- tindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pe- sada da imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às se- qüências de aminoácido de cadeia pesada de referência CDR1, CDR2, ou CDR3 dos anticorpos de Sp35 monoclonais descritos aqui. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácido de cadeia pesada de referência CDR1, CDR2, e CDR3 dos anticorpos de Sp35 monoclonais descritos aqui. Desse modo, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia pesada da invenção tem seqüências de polipeptídeo CDR1, CDR2, ou C- DR3 relacionadas às seqüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 4: TABELA 4: Seqüências de Aminoácido de CDR1, CDR2, e CDR3 de VH* de Referência
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*Determinado pelo sistema de Kabat (vide supra).
N=sequência de nucleotídeo, P=sequência de polipeptídeo.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vh específica ou preferencialmente codifica- da pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos CDRI CDR2 e CDR3 mostrados na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH específica ou prefe- rencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional da invenção, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencial- mente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas através das seqüências de nucleotídeo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas às regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VH do polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas por seqüências de nucleotídeo que são idênticas às sequên- cias de nucleotídeo que codificam os grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostra- dos na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de li- gação de antígeno compreendendo a VH específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional da invenção, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencial- mente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas através de seqüências de nucleotídeo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas ao polinucleotídeo que codi- fica as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VH da cadeia pesada de imunoglo- bulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou o polinucleotídeo que codifica as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de VH da cadeia pesada de imunoglobulina produzido pelo hibrido- ma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (LÍ022), 35-E04 (LÍ033), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e U81, ou com- petitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 x 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 x 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 x 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 x 10'5 Μ, 10"5 Μ, 5 x 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 x 10"7 Μ, 10-7 Μ, 5 x 10'8 Μ, 10"8 Μ, 5 x 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 x 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 x 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 x 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 x 10"13 Μ, 10'13 Μ, 5 x 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 x 10"15 Μ, ou 10'15 Μ.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das CDRs da região va- riável de cadeia leve ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequén- cias de aminoácido de cadeia leve de CDR1, CDR2, ou CDR3 de referência dos anticorpos de Sp35 monoclonais descritos aqui. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácido de cadeia leve de CDR1, C- DR2, e CDR3 de referência dos anticorpos monoclonais de Sp35 descritos aqui. Desse modo, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia leve da invenção tem seqüências de polipeptídeo de CDR1, CDR2, ou CDR3 relacionadas às seqüências de polipeptídeo mostradas na Tabela 5:
TABELA 5: Seqüências de Aminoácido de Vi de CDR1, CDR2. e CDR3 de Referência*
<table>table see original document page 121</column></row><table> <table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> *Determinado pelo sistema de Kabat (vide supra).
N=sequência de nucleotídeo, P=sequência de polipeptídeo.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL específica ou preferencialmente codifica- da pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional da invenção, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencial- mente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas através de seqüências de nucleotídeo são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas às regiões Vl CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) ou às regiões VL CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo de cadeia leve da imu- noglobulina produzido pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na Tabela 5. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL específica ou prefe- rencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas por seqüências de nucleotídeo que são idênticas às seqüências de nucleotídeo que codificam os grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na Tabela 5. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL específica ou preferencialmente codifica- da pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional da invenção, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencial- mente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 são codificadas através de seqüências de nucleotídeo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas ao polinucleotídeo que codi- fica as regiões VL CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA- 8106) ou o polinucleotídeo que codifica as regiões VL CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LÍ01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81, ou com- petitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10-2 Μ, 10-2 Μ, 5 χ 10-3 Μ, KT3 Μ, 5 χ 10-4 Μ, 10-4 Μ, 5 χ 10-5 Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10-6 M1 10-6 Μ, 5 χ 10-7 Μ, 10-7 Μ, 5 χ 10-8 Μ, 10'8 Μ, 5 χ 10-9 Μ, 10-9 M1 5 χ 10-10 M1 10-10 M1 5 χ 10-11 M1 KT11 M1 5 χ 10-12 M1 10-12 M1 5 χ 10-13 M1 10-13 M1 5 χ 10-14 M1 10-14 M1 5 χ 10-15 M1 ou 10-15 Μ.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma VH pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de VH de refe- rência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 e 416 mostrados na Tabela 6. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH especí- fica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma VH que tem uma se- qüência de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384 e 416 mostradas na Tabela 6. Em certas mo- dalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreenden- do a VH específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
TABELA 6 - Seqüências de Polipeptídeo de Vh
<table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table>
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vh pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de Vh de refe- rência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158-172, 372, 376, 380, 384 e 416,. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vh específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma Vh da invenção, selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158-172, 372, 376, 380, 384 e 416,. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antí- geno compreendendo a Vh específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vh pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de Vh de referência selecionada do grupo que consiste no polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) e o polipeptídeo de cadeia pesada da imu- noglobulina produzido pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vh codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em (201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13, 7P1D5.1G9 e 3B5.2, ou competiti- vamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vh codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10-2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, ΙΟ-9 Μ, 5 χ 10'10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ IO-11 Μ, IO-11 Μ, 5 χ 10-12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10-13 Μ, ΙΟ-13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10-14 Μ, 5 χ 10·15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em modalidades adicionais, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado que codifica uma cadeia pesada da imunoglobulina, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um áci- do nucleico que codifica uma cadeia pesada pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica ao polinucleotídeo da SEQ ID NO: 420 como mostra- da abaixo. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a cadeia pesada específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35 e/ou ao mesmo epitopo como o anticorpo monoclonal 3B5.2.
Seqüência do polinucleotídeo de cadeia pesada da imunoglobu- Iina para anticorpo monoclonal quimérico humano murino 3B5.2:
ATGGGATGGAGCTGTGTAATGCTCTTGGTATCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTG GGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTG GATGCACTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACT AACTACAATCAAAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA GCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACCTTACTACGGTAGTCACTGGTTCTTCGATGT CTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGA (SEQ ID NO: 4 20).
Em modalidades adicionais, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado que codifica uma região variável de cadeia pesada (VH), onde o polinucleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucleico de Vh selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 173 a 184, 370, 374, 378, 382 e 422, como mostradas na Tabela 7. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vh especí- fica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
TABELA 7 - Seqüências de Polinucleotídeo de Vh
<table>table see original document page 131</column></row><table> <table>table see original document page 132</column></row><table> <table>table see original document page 133</column></row><table> <table>table see original document page 134</column></row><table> <table>table see original document page 135</column></row><table>
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico de codificação de Vh pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma seqüência de ácido nucleico de referência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 173-184, 370, 374, 378, 382 e 422 da Tabela 7. Em certas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Vh que específica ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vh codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em (201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(Lia.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 3B5.2 e Li81 ou competitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vh codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ ΙΟ-10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ IO"11 Μ, IO"11 Μ, 5 χ ΙΟ-12 Μ, 10'12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10'14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vh pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo de Vh de referência selecionada do grupo que consiste no polinucleotídeo que co- difica a cadeia pesada da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) e o polinucleotídeo que codi- fica a cadeia pesada da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vl pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de Vl de refe- rência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 e 417 mostradas na Tabela 8. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vl especí- fica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma Vl que tem uma seqüên- cia de polipeptídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 385 e 417, mostradas na Tabela 8. Em certas modali- dades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vl específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
TABELA 8 - Seqüências de Polipeptídeo de VL
<table>table see original document page 137</column></row><table> <table>table see original document page 138</column></row><table>
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vl pelo menos 80%, 85%, 90%,ou 85% identica a uma sequencia de polipeptideo de VL de refe- rência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 385 e 417, como mostradas na Tabela 8. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL es- pecífica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma VL da invenção, selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385 e 417. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vl específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma VL pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma seqüência de polipeptídeo de VL de referência selecionada do grupo que consiste no polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina produzido pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de De- pósito de ATCC PTA-8106) e o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobuli- na produzido pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, LÍ33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81, ou com- petitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vl codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, KT3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10'5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 1CT6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 1CT8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, KT9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ KT11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10-12 Μ, 10'12 Μ, 5 χ TO"13 Μ, 10·13 Μ, 5 χ 10-14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou IO"15 Μ.
Em modalidades adicionais, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina onde o polinucleotídeo é um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica ao polinu- cleotídeo da SEQ ID NO: 421 como mostrada abaixo. Em certas modalida- des, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a cadeia leve específica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35 e ou ao mesmo epitopo como o anticorpo monoclonal 3B5.2.
Seqüência de polinucleotídeo de cadeia leve da imunoglobulina para o anticorpo quimérico murino e humano 3B5.2:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAATTGTTC TCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCACGTGT AAGTTACGTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGCTTTATGACACATCCAACCTGGCT TCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCGGTGGCAATGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTG AAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTACTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT AAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 421).
Em modalidades adicionais, a presente invenção inclui um poli- nucleotídeo isolado que codifica uma região variável de cadeia leve (VL), on- de o polinucleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucleico de Vl selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 185 a 194, 371, 375, 379, 383 e 423 como mostradas na Tabela 9. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a Vl especí- fica ou preferencialmente codificada pelo polinucleotídeo se liga a Sp35.
TABELA 9 - Seqüências de Polinucleotídeo de VL
<table>table see original document page 141</column></row><table> <table>table see original document page 142</column></row><table> <table>table see original document page 143</column></row><table>
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-
nucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucieico que codifica uma Vl peio menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntica a um polinucleotídeo de Vl selecionado do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 185-194, 371, 375, 379, 383 e 423 da Ta- bela 9. Em certas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Vl que específica ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vl codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LÍ01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36- A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), LÍ13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 3B5.2 e Li81, ou competitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma Vl codificada por um ou mais dos polinucleotídeos des- critos acima específica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10'8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10-9 Μ, 5 χ ΙΟ-10 Μ, 10'1° Μ, 5 χ ΙΟ-11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ ΙΟ-12 Μ, ΙΟ-12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma Vl pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo de Vl de referência selecionada do grupo que consiste no polinucleotídeo que co- difica a cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) e o polinuclèotídeo que codi- fica a cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Qualquer um dos polinucleotídeos descritos acima pode também incluir ácidos nucleicos adicionais, codificando, por exemplo, um peptídeo sinal para direcionar a secreção do polipeptídeo codificado, regiões constan- tes de anticorpo como descritas aqui, ou outros polipeptídeos heterólogos como descritos aqui.
Também, como descrito em outro lugar em mais detalhe aqui, a presente invenção inclui composições compreendendo os polinucleotídeos compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima. Em uma modalidade, a invenção inclui composições compreendendo um primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo em que o dito primeiro polinucleo- tídeo codifica um polipeptídeo de Vh como descrito aqui e em que o dito se- gundo polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Vl como descrito aqui. Especificamente uma composição que compreende, consiste essencialmen- te em, ou consiste em um polinucleotídeo de VH, como mostrado na Tabela 7, e um polinucleotídeo de VL, como mostrado na Tabela 9, em que o dito polinucleotídeo de Vh e o dito polinucleotídeo de Vl são selecionados do grupo que consiste em:
i) SEQ ID NO: 173 e SEQ ID NO: 185;
ii) SEQ ID NO: 174 e SEQ ID NO: 186;
iii) SEQ ID NO: 175 e SEQ ID NO: 187;
iv) SEQ ID NO: 176 e SEQ ID NO: 188;
v) SEQ ID NO: 178 e SEQ ID NO: 189;
vi) SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 190;
vii) SEQ ID NO: 180 e SEQ ID NO: 191;
viii) SEQ ID NO: 181 e SEQ ID NO: 192;
ix) SEQ ID NO: 182 e SEQ ID NO: 193;
x) SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 194; xi) SEQ ID NO: 370 e SEQ ID NO: 371;
xii) SEQ ID NO: 374 e SEQ ID NO: 375;
xiii) SEQ ID NO: 378 e SEQ ID NO: 379;
xiv) SEQ ID NO: 382 e SEQ ID NO: 385;
xv) SEQ ID NO: 422 e SEQ ID NO: 423;
xvi) SEQ ID NO: 448 e SEQ ID NO: 449; e
xvii) SEQ ID NO: 450 e SEQ ID NO: 449.
A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotí- deos da invenção, como descritos em outro lugar. Adicionalmente polinucle- otídeos que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos de Fab1 e ou- tros derivados, como descritos aqui, são também contemplados pela inven- ção.
Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência de nu- cleotídeo do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anti- corpo pode ser montado de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, como descrito em Kutmeier et ai, BioTechniques 17:242 (1994)) o que, brevemente, envolve a síntese de sobreposição dos oligonu- cleotídeos contendo porções da seqüência que codifica o anticorpo, anela- mento e ligação daqueles oligonucleotídeos, e depois amplificação dos oli- gonucleotídeos ligados por PCR.
Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser gerado de ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a seqüência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser quimicamente sintetiza- do ou pode ser obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada de, ou ácido nu- cleico, preferivelmente poly A+RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo ou outro anticorpo de Sp35, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hidrolisáveis nas terminações 3' e 5' da seqüência ou clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a seqüência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo ou outro anti- corpo de Sp35. Ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser depois clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer méto- do bem-conhecido na técnica.
Uma vez que a seqüência de nucleotídeo e a seqüência de ami- noácido correspondente do anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo seja determinada, sua seqüência de nucleotídeo pode ser manipulada usando métodos bem-conhecidos na técnica pela manipulação de seqüências de nucleotídeo, por exemplo, técni- cas de DNA recombinante, mutagênese loco-dirigida, PCR, etc. (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har- bor, N.Y. (1990) e Ausubel et ai, eds., Current Protocols in Molecular Bio- Iogy, John Wiley & Sons, Nl (1998) que são ambas incorporadas por refe- rência aqui em suas totalidades), para gerar anticorpos tendo uma seqüên- cia de aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos.
Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, ou frag- mento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxirribonucleotídeo que pode ser RNA ou DNA inalterado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de DNA uni e bifilamentar, DNA sendo uma mistura de regiões uni e bifilamentares, RNA uni e bifilamentar, e RNA sendo mistura de regiões uni e bifilamentares, moléculas híbridas compreendendo o DNA e RNA que podem ser unifila- mentares ou, mais tipicamente, bifilamentares ou uma mistura de regiões uni e bifilamentares. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de regiões trifilamentares compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode também conter uma ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tituladas e bases incomuns tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA; desse modo, "polinucleotídeo" abrange formas química, enzimática, ou metabolicamente modificadas.
Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não- natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção de cadeia pesada ou porção de cadeia leve da imunoglobulina) pode ser criado introduzindo uma ou mais substituições, adições ou dele- ções de nucleotídeo na seqüência de nucleotídeo da imunoglobulina de mo- do que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido se- jam introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas-padrão, tais como mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente1 substituições de aminoácido conservadoras são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não-essenciais.
V. POLIPEPTÍDEOS DE SP35 ANTICORPO
A presente invenção é também direcionada a polipeptídeos iso- lados que compõem anticorpos de Sp35, fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos. Anticorpos de Sp35 da presente inven- ção compreendem polipeptídeos, por exemplo, seqüências de aminoácido que codificam regiões de ligação de antígeno Sp35-específico derivadas das moléculas de imunoglobulina. Uma seqüência de polipeptídeo ou de amino- ácido "derivada de" uma proteína designada refere-se à origem do polipeptí- deo. Em certos casos, a seqüência de polipeptídeo ou de aminoácido que é derivada de um polipeptídeo de partida particular ou seqüência de aminoáci- do tem uma seqüência de aminoácido que é essencialmente idêntica à da seqüência de partida, ou uma porção da mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos, pelo menos 20-30 aminoácidos, pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que é do contrário identificável a alguém ver- sado na técnica como tendo sua origem na seqüência de partida.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptí- deo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácido de CDR de ca- deia pesadal, CDR2 ou CDR3 de referência dos anticorpos de Sp35 mono- clonais descritos aqui. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da Vh são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências a- minoácido de CDR de cadeia pesadal, CDR2 e CDR3 de referência dos anticorpos de Sp35 monoclonais descritos aqui. Desse modo, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia pesada da invenção tem seqüências de polipeptídeo de CDR1, CDR2, e CDR3 relacionadas aos grupos mostrados na Tabela 4, supra. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de Vh se liga a Sp35.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep- tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin- do em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (Vh) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na Tabela 4. Em cer- tas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que es- pecífica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de Vh se liga a Sp35.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptí- deo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas às seqüências de aminoácido de CDR de cadeia pesadal, CDR2 e CDR3 de referência selecionadas do grupo que consiste nas seqüências de aminoácido de Vh de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (De- signação de Depósito de ATCC PTA-8106) e as seqüências de aminoácido CDR1, CDR2 e CDR3 de Vh da cadeia pesada de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um polipeptídeo de Vh pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntico a uma seqüência de polipeptídeo de Vh de referência selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384, 416 e 433, como mostradas na Tabela 6 e SEQ ID NO: 435. Em certas mo- dalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de Vh se liga a Sp35.
Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um polipeptídeo de Vh selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, 384, 416 e 433, como mostradas na Tabela 6 e SEQ ID NO: 435. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compreende o poli- peptídeo de Vh se liga a Sp35.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um polipeptídeo de Vh pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idêntico a uma seqüência de polipeptídeo de Vh de referência selecio- nada do grupo que consiste na cadeia pesada de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) e na cadeia pesada da imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ou mais dos polipeptídeos de Vh descritos acima especí- fica ou preferencialmente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo mo- noclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81, ou competitivamente inibirá um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ou mais dos polipeptídeos de Vh descritos acima especí- fica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracteri- zada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10'5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ ΙΟ-7 Μ, ΙΟ-7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10-9 Μ, 5 χ 10'10 Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10'14 Μ, 10"14Μ, 5χ10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep- tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin- do em uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia pesada de referência de anticorpos de Sp35 monoclonais descri- tos aqui. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da Vl são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve de referência de anticorpos de Sp35 monoclonais descritos aqui. Desse modo, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia leve da invenção tem seqüências de polipep- tídeo de CDR1, CDR2, e CDR3 relacionadas aos polipeptídeos mostrados na Tabela 5, supra. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compreende o poli- peptídeo de Vl se liga a Sp35.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipep- tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistin- do em uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (Vl) em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptídeo que são i- dênticas aos grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na Tabela 5. Em cer- tas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que es- pecífica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de Vl liga a Sp35.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptí- deo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticas às seqüências de aminoácido de CDR de ca- deia levei, CDR2 e CDR3 de referência selecionadas do grupo que consiste nas seqüências aminoácido de Vl de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de De- pósito de ATCC PTA-8106) e nas seqüências de aminoácido de Vl de C- DR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibri- doma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um polipeptídeo de VL pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% i- dêntico a uma seqüência de polipeptídeo de Vl de referência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385, 417 e 434, mostradas na Tabela 8. Em certas modalidades, um anticorpo ou frag- mento de ligação de antígeno que específica ou preferencialmente compre- ende o polipeptídeo de Vl se liga a Sp35. Em outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um polipeptídeo de Vl selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381, 385, 417 e 434, mostradas na Tabela 8,. Em cer- tas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que es- pecífica ou preferencialmente compreende o polipeptídeo de Vl se liga a Sp35.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli- peptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um polipeptídeo de Vl pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou 100% idênticos a uma seqüência de polipeptídeo de Vl de referência sele- cionada do grupo que consiste na Vl da cadeia leve de imunoglobulina pro- duzida pelo hibridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA- 8106) e na Vl da cadeia leve de imunoglobulina produzida pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, um ou mais dos polipeptídeos de Vl descritos acima específica ou preferencial- mente se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1 D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 1968 (L1a.13), 7P1D5.1G9, 3B5.2 e Li81, ou competitivamente inibirá um tal anticorpo mo- noclonal de se ligar a Sp35.
Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ou mais dos polipeptídeos de Vl descritos acima especí- fica ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de Sp35 variante, com uma afinidade caracteri- zada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10~2 Μ, 5 χ 10'3 Μ, KT3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10-7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, IO-8 Μ, 5 χ KT9 Μ, IO-9 Μ, 5 χ 1(Τ10 Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10'14Μ, 5χ10"15Μ, ou 10"15 Μ.
Em outras modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende, consiste essencialmente em ou consis- te em um polipeptídeo de VH, como mostrado na Tabela 6, e um polipeptídeo de VL, como mostrado na Tabela 8, selecionados do grupo que consiste em:
i) SEQ ID NO: 170 e SEQ ID NO: 283;
ii) SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 284;
iii) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 285;
iv) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 286;
v) SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 273;
vi) SEQ ID NO: 159 e SEQ ID NO: 274;
vii) SEQ ID NO: 160 e SEQ ID NO: 275;
viii) SEQ ID NO: 161 e SEQ ID NO: 276;
ix) SEQ ID NO: 163 e SEQ ID NO: 277;
x) SEQ ID NO: 164 e SEQ ID NO: 278;
xi) SEQ ID NO: 165 e SEQ ID NO: 279;
xii) SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 280;
xiii) SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 281;
xiv) SEQ ID NO: 168 e SEQ ID NO: 282;
xv) SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO: 373; χ vi) SEQ ID NO: 376 e SEQ ID NO: 377;
xvii) SEQ ID NO: 380 e SEQ ID NO: 381;
xviii) SEQ ID NO: 384 e SEQ ID NO: 385;
xix) SEQ ID NO: 416 e SEQ ID NO: 417;
xx) SEQ ID NO: 433 e SEQ ID NO: 434;
xxi) SEQ ID NO: 435 e SEQ ID NO: 434. Em outras modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende, consiste essencialmente em ou consis- te em um polipeptídeo de Vh e um polipeptídeo de Vl selecionado do grupo que consiste no polipeptídeo de Vh e polipeptídeo de Vl produzidos pelo hi- bridoma 2.P3B5.2 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8106) e no poli- peptídeo de Vh e polipeptídeo de Vl produzidos pelo hibridoma 7.P1D5.1.G9 (Designação de Depósito de ATCC PTA-8107).
Qualquer um dos polipeptídeos descritos acima pode também incluir polipeptídeos adicionais, por exemplo, um peptídeo sinal para direcio- nar a secreção do polipeptídeo codificado, regiões constantes de anticorpo como descritas aqui, ou outros polipeptídeos heterólogos como descritos aqui. Adicionalmente, polipeptídeos da invenção incluem fragmentos de poli- peptídeo como descritos em outro lugar. Adicionalmente polipeptídeos da invenção incluem polipeptídeo de fusão, fragmentos de Fab, e outros deriva- dos, como descritos aqui.
Também, como descrito em outro lugar em mais detalhe aqui, a presente invenção inclui composições compreendendo os polipeptídeos descritos acima.
Também será entendido por alguém versado na técnica que po- lipeptídeo do anticorpo de Sp35 como descrito aqui pode ser modificado de modo que eles variem em seqüência de aminoácido do polipeptídeo de liga- ção de ocorrência natural do qual eles eram derivados. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou de aminoácido derivada de uma proteína de- signada pode ser similar, por exemplo, ter uma certa identidade percentual à seqüência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntica à seqüência de partida.
Além disso, substituições, deleções, ou inserções de nucleotídeo ou de aminoácido que levam às substituições ou alterações conservadoras nas regiões de aminoácido "não-essenciais" podem ser feitas. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou de aminoácido derivada de uma proteína designada pode ser idêntica à seqüência de partida com exceção de uma ou mais substituições, inserções, ou deleções de aminoácido individuais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinte ou mais substituições de aminoácido, inserções, ou deleções individu- ais. Em certas modalidades, uma seqüência de polipeptídeo ou de aminoá- cido derivada de uma proteína designada tem uma a cinco, uma a dez, uma a quinze, ou uma a vinte substituições, inserções, ou deleções de aminoáci- do individuais com relação à seqüência de partida.
Certos polipeptídeos de anticorpo de Sp35 da presente invenção compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em uma se- qüência de aminoácido derivada de uma seqüência de aminoácido humana. Porém, certos polipeptídeos de anticorpos de Sp35 compreendem um ou mais aminoácidos contíguos derivados de outras espécies mamíferas. Por exemplo, um anticorpo de Sp35 da presente invenção pode incluir uma por- ção de cadeia pesada primata, porção de dobradiça, ou região de ligação de antígeno. Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos derivados de murino podem estar presentes em um polipeptídeo de anticorpo não-murino, por exemplo, em um sítio de ligação de antígeno de um anticorpo de Sp35. Em certas aplicações terapêuticas, anticorpos Sp35-específicos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou análogos dos mesmos são projetados para não serem imunogênicos no animal ao qual o anticorpo é administrado.
Em certas modalidades, um polipeptídeo de anticorpo de Sp35 compreende uma seqüência de aminoácido ou uma ou mais porções não normalmente associadas a um anticorpo. Modificações exemplares são des- critas em mais detalhe abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo de fv de cadeia simples da invenção pode compreender uma seqüência Iigante flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou uma marcação).
Um polipeptídeo de anticorpo de Sp35 da invenção pode com- preender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma proteína de fu- são. Proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno da imunoglobulina com pelo menos um sítio de ligação-alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção à qual não está naturalmente ligado na natureza. As seqüências de aminoácido podem normalmente existir em proteínas separadas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente existir na mesma proteína mas são colocadas em um arranjo novo no polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, através de sínte- se química, ou criando e transladando um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeo são codificadas na relação desejada.
O termo "heterólogo", como aplicado a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade distinta daquela do resto da entidade à qual está sendo com- parado. Por exemplo, como aqui usado, um "polipeptídeo heterólogo" que é fundido a um anticorpo de Sp35, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou análogo do mesmo é derivado de um polipeptídeo de não- imunoglobulina das mesmas espécies, ou um polipeptídeo de imunoglobuli- na ou de não-imunoglobulina de uma espécie diferente.
Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que têm ca- deias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias late- rais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um resíduo de aminoácido não-essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina é preferivelmente substituído com outro resíduo de ami- noácido da mesma família de cadeia lateral. Em outra modalidade, uma ca- deia de aminoácidos pode ser substituída com uma cadeia estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição dos membros da família de cadeia lateral.
Alternativamente, em outra modalidade, mutações podem ser introduzidas fortuitamente ao longo de toda ou parte da seqüência de codifi- cação de imunoglobulina, tal como através de mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser incorporados nos anticorpos de Sp35 para o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos aqui e tria- dos quanto à sua capacidade de se ligar ao antígeno desejado, por exemplo, Sp35.
VI. PROTEÍNAS DE FUSÃO E CONJUGADOS DE ANTICORPO
Como debatido em outro lugar em mais detalhe aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser também recombinantemente fundidos em um polipeptídeo heterólogo ao término N ou C ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não-covalentes) para polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos de Sp35 Sp35-específicos po- dem ser recombinantemente fundidos ou conjugados em moléculas úteis como marcações em ensaios de detecção e moléculas efetoras tais como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionuclídeos, ou toxinas. Vide, por exemplo, Publicações de PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente U.S. 5.314.995; e EP 396.387 que são incorporadas aqui por refe- rência em suas totalidades.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção incluem derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de modo que ligação covalente não impeça o anticorpo de se ligar a Sp35. Por exemplo, mas não por via de limitação, os derivados de anticor- po incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, através de glico- silação, acetilação, peguilação, fosfilação, fosforilação, amidação, derivatiza- ção através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolíti- ca, ligação a um Iigante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer de numero- sas modificações químicas podem ser realizadas através de técnicas conhe- cidas, incluindo, mas não-limitadas à clivagem química específica, acetila- ção, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos. Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser compostos de a- minoácidos unidos um ao outro por ligações de peptídeo ou ligações de pep- tídeo modificadas, isto é, isósteres de peptídeo, e podem conter aminoáci- dos diferentes dos 20 aminoácidos codificados com gene. Anticorpos Sp35- específicos podem ser modificados por processos naturais, tais como pro- cessamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem-conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas nos textos básicos e em monografias mais detalhadas, como também em uma literatura de investigação volumosa. Modificações podem ocorrer em qual- quer lugar no anticorpo Sp35-específico, incluindo na cadeia principal do peptídeo, nas cadeias laterais de aminoácido e nos términos amino ou car- boxila, ou nas porções tais como carboidratos. Será apreciado que o mes- mo tipo de modificação possa estar presente nos mesmos graus ou variados em vários sítios em um anticorpo Sp35-específico dado. Também, um anti- corpo Sp35-específico dado pode conter muitos tipos de modificações. Anti- corpos Sp35-específicos podem ser ramificados, por exemplo, como resulta- do da ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Anticor- pos Sp35-específicos cíclicos, ramificados, e ramificados cíclicos podem ser o resultado dos processos de pós-tradução natural ou podem ser feitos atra- vés de métodos sintéticos. Modificações incluem acetilação, acilação, PAD- ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, demetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosi- lação, formação de ancora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoi- lação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, preni- lação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos às proteínas tais como arginilação, e ubiquiti- nação. (Vide, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T., Ε. Creighton, W. Η. Freeman and Company, Nova lorque 2a Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Aca- demic Press, Nova Iorque, págs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann Nl Acad Sci 663:48-62 (1992)).
A presente invenção também provê proteínas de fusão compre- endendo um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, vari- ante, ou derivado do mesmo, e um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido pode ser útil para função ou útil pa- ra direcionar o polipeptídeo de Sp35 que expressa as células. Em uma mo- dalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essen- cialmente em, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a seqüência de ami- noácido de qualquer uma ou mais das regiões de Vh de um anticorpo da in- venção ou a seqüência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regiões de Vl de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteróloga. Em outra modalidade, uma pro- teína de fusão para o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento des- critos aqui compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de qualquer uma, duas, três das CDRs de Vh de um anticorpo Sp35-específico, ou fragmentos, variantes, ou derivados do mesmo, ou a seqüência de aminoácido de qualquer uma, duas, três das CDRs de VI de um anticorpo Sp35-específico, ou fragmentos, variantes, ou derivados do mesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteró- loga. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de uma CDR3 de Vh de um anticorpo Sp35-específico da presente invenção, ou fragmento, derivado, ou variante do mesmo, e uma seqüência de polipeptídeo heteróloga para a que proteína de fusão especificamente ligue pelo menos um epitopo de Sp35. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido de pelo menos uma região de Vh de um anticorpo Sp35-específico da invenção e a seqüência de aminoácido de pelo menos uma região de Vl de um anticorpo Sp35-específico da invenção ou fragmen- tos, derivados ou variantes do mesmo, e uma seqüência de polipeptídeo he- teróloga. Preferivelmente1 as regiões de Vh e Vl da proteína de fusão cor- respondem a um anticorpo de fonte simples (fragmento de scFv ou de Fab) que especificamente liga pelo menos um epitopo de Sp35. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão para o uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento descritos aqui compreende um polipeptídeo tendo a se- qüência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das CDRs de Vh de um anticorpo Sp35-específico e a seqüência de aminoácido de qual- quer uma, duas, três ou mais da CDRs de Vl de um anticorpo Sp35- específico, ou fragmentos ou variantes do mesmo, e uma seqüência de poli- peptídeo heteróloga. Preferivelmente, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais das VhCDR(s) ou VlCDR(s) correspondem a anticorpo de fonte simples (gragmento de scFv ou de Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucleico que codificam estas proteínas de fusão são também abrangidas pela inven- ção.
Proteínas de fusão exemplares relatadas na literatura incluem fusões do receptor de célula T (Gascoigne et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Trau- necker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); e Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990)); L-selectina ("homing" do receptor) (Watson et ai, J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); e Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303- 1313 (1990)); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. -/74:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et ai, Eur. J. Immu- nol. 27:2883-2886 (1991); e Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); e receptor de IgE a (Ridgway e Gorman, J. Cell. Biol. Voi 115, Re- sumo No. 1448 (1991)).
Em certas modalidades, anticorpos de Sp35, fragmentos de an- ticorpo, derivados e variantes dos mesmos também compreendem uma por- ção de direcionamento. Porções de direcionamento incluem uma proteína ou um peptídeo que direciona a localização para uma certa parte do corpo, por exemplo, para o cérebro ou compartimentos dentro dele. Em certas modali- dades, anticorpos de Sp35, fragmentos de anticorpo, derivados e variantes dos mesmos são ligados ou fundidos em uma porção de direcionamento do cérebro. As porções de direcionamento do cérebro são ligadas covalente- mente (por exemplo, fusão translacional, direta, ou através de ligação quími- ca ou diretamente ou através de uma molécula espaçadora que pode ser opcionalmente clivável) ou não-covalentemente ligadas (por exemplo, atra- vés de interações reversíveis tais como avidina, biotina, proteína A, IgG1 etc.). Em outras modalidades, os anticorpos de Sp35, fragmentos de anti- corpo, derivados e variantes dos mesmos são ligados a mais porções de direcionamento do cérebro. Em modalidades adicionais, a porção de direcio- namento do cérebro é ligada a uma pluralidade de anticorpos de Sp35, fragmentos de anticorpo, derivados e variantes dos mesmos.
Uma porção de direcionamento do cérebro associada a um anti- corpo de Sp35, fragmento de anticorpo, derivado ou variante do mesmo in- tensifica a liberação no cérebro de tais anticorpos de Sp35, fragmentos de anticorpo, derivados e variantes dos mesmos. Vários polipeptídeos foram descritos que, quando fundidos em uma proteína ou agente terapêutico, libe- ram a proteína ou agente terapêutico através da barreira hematoencefálica (β). Exemplos não-limitativos incluem o anticorpo de domínio simples FC5 (Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, um anti- corpo monoclonal para o receptor de insulina humana (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); os peptídeos B2, B6 e B8 que se li- gam ao receptor de transferrina humana (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Virol. 74, 11359-11366); o anticorpo monoclonal 0X26 para o receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); e as SEQ ID NOs: 1-18 da patente U.S. 6.306.365. Os conteúdos das referências acima são incorporados aqui por referência em sua totalidade.
Liberação de cérebro intensificada de um anticorpo de Sp35, fragmento de anticorpo, derivado ou variante do mesmo é determinada por vários meios bem-estabelecidos na técnica. Por exemplo, administrar a um animal um anticorpo de Sp35 radioativa, enzimática ou fluorescentemente marcado, fragmento de anticorpo, derivado e variante do mesmo ligado a um porção de direcionamento do cérebro; determinar a localização no cérebro; e comparar a localização com um anticorpo de Sp35 radioativa, enzimática ou fluorescentemente marcado equivalente, fragmento de anticorpo, derivado ou variante do mesmo que está associado a uma porção de direcionamento do cérebro. Outros meios de determinar direcionamento intensificado são descritos nas referências acima.
Como debatido em outro lugar aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser fundidos a polipeptídeos heterólogos para aumentar a meia-vida in vivo dos polipeptídeos ou para o uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado aos anticorpos de Sp35 da invenção para aumentar sua meia-vida in vivo. Leong, S. R., et al., Cytokine 76:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); ou Weir et al., Biochem. Soe. Transactions 30:512 (2002).
Além disso, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser fun- didos às seqüências marcadoras, tais como um peptídeo para facilitar sua purificação ou detecção. Em modalidades preferidas, a seqüência de amino- ácido marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como o marcador for- necido em um vetor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros muitos dos quais estão comercialmente disponí- veis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina provê purificação conveniente da proteí- na de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para purificação incluem, mas não são limitados a, o marcador "HA" que corresponde a um epitopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e o marcador "flag".
Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem-conhecidos na técnica (vide por exemplo, patentes US 5.116.964 e 5.225.538). O sítio preciso ao que a fusão é feita pode ser empiricamente selecionado para otimizar a secreção ou características de ligação da prote- ína de fusão. DNA codificando a proteína de fusão é depois transfeccionado em uma célula hospedeira para expressão.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser usados na forma não-conjugada ou conjugados com pelo menos uma de uma varie- dade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuti- cas da molécula, facilitar detecção alvo, ou para imageamento ou terapia do paciente. Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, varian- tes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser marcados ou conju- gados antes ou após purificação, quando purificação for executada.
Em particular, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser con- jugados a agentes terapêuticos, profármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológicos, agentes farmacêuticos, ou PEG.
Aqueles versados na técnica apreciarão que conjugados possam ser também montados usando uma variedade de técnicas dependendo do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados por exemplo, reagindo um polipeptídeo de ligação com um éster ativado de biotina tal como o éster de N-hidroxissuccinimida de biotina. Similarmente, conjugados com um marcador fluorescente podem ser prepa- rados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles lis- tados aqui, ou por reação com um isotiocianato, preferivelmente isotiociana- to de fluoresceína. Conjugados dos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção são preparados de uma maneira análoga.
A presente invenção também abrange anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção conjugados com um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anti- corpos de Sp35 podem ser usados de forma diagnostica para, por exemplo, monitorar o desenvolvimento ou progressão de uma doença neurolóqica como parte de um procedimento de testagem clínica para, por exemplo, de- terminar a eficácia de um tratamento dado e/ou regime de prevenção. De- tecção pode ser facilitada acoplando o anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materi- ais bioluminescentes, materiais radioativos, metais de emissão de positron usando várias tomografias de emissão de positron, e íons de metal para- magnético não-radioativo. Vide, por exemplo, Patente U.S. 4.741.900 para íons de metal que podem ser conjugados com anticorpos para o uso como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas a- dequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos do grupo pro- fético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e equorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 111In ou 99Tc.
Um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo também pode ser detectavelmente marcado acoplando-o a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo de Sp35 quimioluminescente marcado é depois determinada detectando a presença da luminescência que surge durante o curso de uma reação quími- ca. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescentes particular- mente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
Um dos modos em que um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser detectavel- mente marcado é ligando o mesmo a uma enzima e usando o produto ligado em um imunoensaio de enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immu- nosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication1 Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pa- thol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enrymoi 73:482-523 (1981); Maggio1 E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton1 Fla., (1980); Ishikawa1 E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tok- yo (1981). A enzima que é ligada ao anticorpo de Sp35 reagirá com um substrato apropriado, preferivelmente um substrato cromogênico, em um tal maneira a produzir uma porção química que pode ser detectada, por exem- plo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Enzimas que podem ser usadas para a marcação detectável do anticorpo incluem, mas não são limitadas a, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5- esteroide isomerase, levedura álcool desidrogenase, alfa-glicerofosfato, de- sidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano silvestre, fosfa- tase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclea- se, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetil- colinesterase. Adicionalmente, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos empregando um substrato cromogênico para a enzima. De- tecção pode ser também realizada por comparação visual da extensão de reação enzimática de um substrato comparado com padrões similarmente preparados.
Detecção pode ser também realizada usando qualquer de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, marcando radioativamente o anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou deri- vado do mesmo, é possível detectar o anticorpo através do uso de um radio- imunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioim- munoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (março, 1986)) que é incorporada por referência a- qui). O isótopo radioativo pode ser detectado através de meios incluindo, mas não-limitados a, contador gama, contador de cintilação, ou autorradio- grafia.
Um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser também detectavelmente marcado usando metais emissores de fluorescência tais como 152Eu, ou outros da sé- rie de lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo usando tais grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
Técnicas para conjugar várias porções para um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo são bem-conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et ai, "Monoclonal Antibodi- es For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Anti- bodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.)> págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et ai, "Antibodies For Drug Delivery", em Control- Ied Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et ai (eds.), Mareei Dekker, Inc., págs. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cân- cer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clini- cai Applications, Pinchera et ai (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Re- sults, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Anti- body In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press págs. 303-16 (1985), e Thorpe et ai, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
VII. EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO
Como é bem-conhecido, RNA pode ser isolado das células de hibridoma originais ou de outras células transformadas através de técnicas- padrão, tais como extração de isotiocianato de guanidínio e precipitação se- guidas por centrifugação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA pode ser isolado de RNA total através de técnicas-padrão tais como cromatografia em celulose de oligo dT. Técnicas adequadas são familiares na técnica.
Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo podem ser feitos, simultânea ou separadamente, usan- do transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo com os métodos bem- conhecidos. PCR pode ser iniciada através de iniciadores de região constan- te de consenso ou através de iniciadores mais específicos com base no DNA e seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve publicadas. Como de- batido acima, PCR também pode ser usada para isolar os clones de DNA codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Neste caso, as biblio- tecas podem ser tríadas por iniciadores de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de região constante de camundongo.
DNA, tipicamente DNA de plasmídeo, pode ser isolado das célu- las usando técnicas conhecidas na técnica, mapeado por restrição e se- quenciado de acordo com as técnicas-padrão bem-conhecidas expostas em detalhes, por exemplo, nas referências anteriores relativas às técnicas de DNA recombinante. Claro que o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise subsequente.
Seguindo manipulação do material genético isolado para forne- cer anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos de Sp35 são tipicamente inseridos em um vetor de expressão para introdução nas células hospedeiras que podem ser usadas para produ- zir a quantidade desejada de anticorpo de Sp35.
Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, deriva- do ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que liga a uma molécula alvo descrita aqui, por exemplo, Sp35, requer construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez um polinucleotídeo que codifica uma mo- lécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou por- ção do mesmo (preferivelmente contendo o domínio variável de cadeia pe- sada ou leve), da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido através de tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem-conhecidas na técnica. Desse modo, métodos para preparar uma proteína expressando um polinucleotídeo que contém um anti- corpo que codifica a seqüência de nucleotídeo são descritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos àqueles versados na técnica podem ser usados para a construção de vetores de expressão contendo as seqüências de codi- ficação de anticorpo e sinais de controle transcricionais e translacionais a- propriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombi- nante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A inven- ção, desse modo, fornece vetores replicáveis compreendendo uma seqüên- cia de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operavelmente ligado a um promotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante da molé- cula de anticorpo (vide, por exemplo, Publicação de PCT WO 86/05807; Pu- blicação de PCT WO 89/01036; e Patente U.S. 5.122.464) e o domínio vari- ável do anticorpo pode ser clonado em um tal vetor para expressão da ca- deia pesada ou leve inteira.
A célula hospedeira pode ser cotransfeccionada com dois veto- res de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecio- náveis idênticos que permitem expressão igual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor simples pode ser usado que codi- fica ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a ca- deia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Ko- hler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüências de codifica- ção para as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNA genômico.
O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é aqui usado para signi- ficar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículo para introduzir e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Como conhecido àqueles versados na técnica, tais vetores podem ser facil- mente selecionados do grupo que consiste em plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a invenção imediata compre- enderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facili- tar a clonagem do gene desejado e a capacidade para entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procariótícas. Para o propósito desta invenção, numerosos sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus animais tais como vírus de papiloma bovino, vírus de polioma, adenovírus, vírus de vacínia, baculoví- rus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus de SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação de ribossoma inter- nos. Adicionalmente, células que integraram o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfeccionadas. O marcador pode prover prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como cobre. O gene mar- cador selecionável ou pode ser ligado diretamente às seqüências de DNA a ser expressadas, ou introduzidos na mesma célula através de cotransforma- ção. Elementos adicionais podem ser também necessários para síntese de mRNA ótima. Estes elementos podem incluir seqüências sinais, sinais de splice, como também promotores transcricionais, intensificadores, e sinais de terminação.
Em modalidades particularmente preferidas, os genes de região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão juntos com os genes de região constante de cadeia pesada e leve (preferivelmente huma- nos) sintéticos como debatido acima. Em uma modalidade, isto é realizado usando um vetor de expressão particular de Biogen IDEC, Inc., referido co- mo NEOSPLA (patente U.S. 6.159.730). Este vetor contém o promo- tor/intensificador de citomegalovírus, o promotor principal de globina beta de camundongo, a origem de SV40 da replicação, a seqüência de poliadenila- ção do hormônio de crescimento bovino, neomicina fosfotransferase éxon 1 e éxon 2, o gene de di-hidrofolato reductase e seqüência líder. Este vetor foi observado resultar em expressão de nível muito alta dos anticorpos sob in- corporação de genes de regiões variável e constante, transfecção em célu- las CHO, seguido por seleção em meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. Claro que, qualquer vetor de expressão que é capaz de suscitar expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não são limitados a, plasmí- deos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZeoSV2 (disponí- veis de Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponível de Prome- ga, Madison, Wl). Em geral, triar números grandes de células transformadas para aquelas que expressam níveis adequadamente altos se cadeias pesa- das e leves de imunoglobulina são experimentação rotineira que pode ser realizada, por exemplo, através de sistemas robóticos. Sistemas de vetor são também ensinados nas Patentes U.S. 5.736.137 e 5.658.570, cada um destes é incorporado por referência em sua totalidade aqui. Este sistema provê níveis de expressão altos, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sis- temas de vetor exemplares são descritos, por exemplo, na patente U.S. 6.413.777.
Em outras modalidades preferidas, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser expressados usando constructos policistrônicos tais como aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2003-0157641 A1, depositado em 18 de novembro de 2002 e incor- porado aqui em sua totalidade. Nestes sistemas de expressão novos, múlti- pios produtos de gene de interesse tais como cadeias pesadas e leves de anticorpos podem ser produzidas de um construto policistrônico simples. Es- tes sistemas vantajosamente usam um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) para fornecer níveis relativamente altos de anticorpos de Sp35, por exemplo, polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos Sp35- específicos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos em células hospe- deiras eucarióticas. Seqüências de IRES compatíveis são descritas na Pa- tente U.S. 6.193.980 que é também incorporada aqui. Aqueles versados na técnica apreciarão que tais sistemas de expressão podem ser usados para efetivamente produzir a faixa total de anticorpos de Sp35 descrita na aplica- ção imediata.
Mais em geral, uma vez o vetor ou seqüência de DNA que codi- fica uma subunidade monomérica do anticorpo de Sp35 foi preparada, o ve- tor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem-conhecidas àqueles versados na técnica. Estas incluem, mas não são limitadas à transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fu- são de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio, fusão de célula com DNA envelopado, microinjeção, e infecção com vírus intacto. Vide, Ridgway1 A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez e Denhardt, Eds., Butterworths1 Boston, Mass., Capítulo 24.2, páginas. 470-472 (1988).
Tipicamente, introdução de plasmídeo no hospedeiro é por meio de eletropo- ração. As células hospedeiras que abrigam a constructo de expressão são cultivadas sob condições apropriadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e ensaiadas para síntese de proteína de cadeia pesada e/ou leve. Técnicas de ensaio exemplares incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise de separador de célula ativada por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e outros.
O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfeccionadas são depois cultiva- das através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo para o uso nos métodos descritos aqui. Desse modo, a invenção inclui células hos- pedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da inven- ção, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, operavelmente ligado a um promotor heterólogo. Em modalidades preferidas para a expressão de anti- corpos de cadeia dupla, vetores que codificam ambas as cadeias pesada e leve podem ser coexpressados na célula hospedeira para expressão da mo- lécula de imunoglobulina inteira, como detalhado abaixo.
Como aqui usado, "células hospedeiras" refere-se às células que abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e codifi- cando pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições dos processos para isolamento de anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de célula" são usados alternadamente para denotar a fonte de an- ticorpo a menos que do contrário seja claramente especificado. Em outras palavras, restabelecimento de polipeptídeo das "células" pode significar tan- to de células inteiras giradas, como da cultura de célula contendo o meio e as células suspensas.
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedei- ro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para o uso nos métodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão de hospedeiro repre- sentam veículos pelos quais as seqüências de codificação de interesse po- dem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também repre- sentam células que podem, quando transformadas ou transfeccionadas com as seqüências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, mas não são limi- tados a, microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subti- lis) transformadas com vetores de expressão de DNA recombinante de bac- teriófago, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo contendo as seqüências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo as seqüências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infe- tados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, bacu- lovírus) contendo as seqüências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de planta infetados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico de couve-flor, CaMV; vírus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, Plasmídeo Ti) contendo as seqüências de codi- ficação de anticorpo; ou sistemas de célula mamífera (por exemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) abrigando constructos de expressão recombi- nante contendo os promotores derivados do genoma de células mamíferas (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus mamíferos (por e- xemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus de vacínia 7,5K). Preferivelmente, células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais preferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula inteira de anticorpo recombinante, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células mamífe- ras tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), juntamente com um vetor tal como o elemento de promotor de gene precoce intermediário principal do citomegalovírus humano é um sistema de expressão efetivo pa- ra anticorpos (Foecking et ai, Gene 45:101 (1986); Cockett et ai., Bi- o/Technology 8:2 (1990)).
A linhagem de célula hospedeira usada para expressão da pro- teína é freqüentemente de origem mamífera; aqueles versados na técnica são creditados com habilidade para determinar preferencialmente as linha- gens de células hospedeiras particulares que são melhor adaptadas para o produto de gene desejado a ser expressado nelas. Linhagens de células hospedeiras exemplares incluem, mas não são limitadas a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chi- nês, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno de SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster filhote), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linha- gem de rim de hamster), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Células CHO são particularmente preferidas. Linhagens de célula hospedeira estão tipicamente disponíveis de serviços comerciais, da American Tissue Culture Collection ou da literatura publicada.
Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser seleciona- da que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e proces- sa o produto de gene na maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Cé- lulas hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-translacional e modificação das proteínas e pro- dutos de gene. Linhagens celulares apropriadas ou sistemas de hospedeiro podem ser selecionadas para assegurar a modificação correta e processa- mento da proteína estranha expressada. Para este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular podem ser usadas para pro- cessamento apropriado da transcrição primária, glicosilação, e fosforilação do produto de gene.
Para produção de rendimento alto a longo prazo das proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celu- lares que estavelmente expressam a molécula de anticorpo podem ser en- genheiradas. Ao invés de usar vetores de expressão contendo origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exem- plo, promotor, intensificador, seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA estranho, as células engenheiradas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e depois são trocadas por um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células estavelmente integrem-se ao plasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser vantajosamente usado para criar linhagens celulares que estavel- mente expressam a molécula de anticorpo.
Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo mas não-limitados aos genes de timidina cinase do vírus do herpes simples (Wi- gler et ai, Cell 11:223 (1977)), de hipoxantina-guanina fosforribosiltransfera- se (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)), e de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et ai, Cell 22:817 1980) podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, resis- tência a antimetabólitos pode ser usada como a base de seleção para os genes a seguir: dhfr conferindo resistência ao metotrexato (Wigler et ai, Na- tl. Acad. Sei. USA 77:357 (1980); O1Hare et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt conferindo resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo conferindo resistência ao aminoglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, Biothe- rapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Reν. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (maio, 1993); e higro conferindo resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nl (1993); Krie- gler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nl (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Prolocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nl (1994); Colberre-Garapin et ai, J. MoL Biol. 150Λ (1981), que são incorporados por referência aqui em suas totalidades.
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, vide Bebbing- ton and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nova Iorque, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema de ve- tor que expressa anticorpo for amplificável, aumento no nível de inibidor pre- sente em cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Considerando que a região amplificada é associada ao gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
Produção in vitro permite escalonar para dar quantidades gran- des dos polipeptídeos desejados. Técnicas para cultivo de célula mamífera sob condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem cul- tura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de transporte aéreo ou em um reator de agitador contínuo, ou cultura de célula imobilizada ou capturada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microcontas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as so- luções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromato- grafia habituais, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de permuta iô- nica, cromatografia em DEAE-celulose ou cromatografia de (imu- no)afinidade, por exemplo, após biossíntese preferencial de um polipeptídeo sintético da região de dobradiça ou antes ou subsequente à etapa cromato- grafia de HIC descrita aqui.
Genes que codificam anticorpos de Sp35, ou fragmentos de li- gação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser também células não-mamíferas expressadas tais como bactérias ou cé- lulas de levedura ou de planta. Bactérias que facilmente carregam ácidos nucleicos incluem os membros da Enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella] Bacillaceae1 tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptoeoeeus, e Haemophilus influenzae. Também será apreciado que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólo- gos tipicamente se tornam parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e depois montados em molécu- las funcionais. Onde forma tetravalente de anticorpos for desejada, as subu- nidades então se autorrearranjarão em anticorpos tetravalentes (W002/096948A2).
Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso intencionado para a molécula de anticorpo que é expressada. Por exemplo, quando uma quanti- dade grande de uma tal proteína deve ser produzida para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que dire- cionam a expressão de níveis altos dos produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não são limitados ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)) em que a seqüência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codifi- cação de IacZ de forma que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & lnouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Bioi Chem. 24:5503-5509 (1989)); e outros vetores de pGEX podem ser também usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais prote- ínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células Iisadas por adsorção e ligação a esferas de matriz de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir sítios de clivagem de protease de trombina ou de Fa- tor Xa de forma que o produto de gene alvo clonado possa ser liberado da porção de GST.
Além de procariotos, micróbios eucarióticos podem ser também usados. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o co- mumente usado entre micro-organismos eucarióticos embora várias outras cepas estejam comumente disponíveis, por exemplo, Pichia pastoris.
Para expressão em Saceharomyees, o plasmídeo YRp7, por e- xemplo, (Stinchcomb et ai., Nature 282:39 (1979); Kingsman et ai, Gene 7:141 (1979); Tschemper et ai, Gene 10:157 (1980)) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1 que provê um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura que carece da habilidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Geneties 85:12 (1977)). A presença da lesão de trpl como uma característica do ge- noma de célula hospedeira de levedura depois provê um ambiente efetivo para detectar transformação através do crescimento na ausência de triptofano.
Em um sistema de inseto, vírus de poli-hedrose nuclear de Au- tographa caiiforniea (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para ex- pressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiper- da. A seqüência de codificação de anticorpo pode ser clonada individual- mente em regiões não-essenciais (por exemplo, o gene de poli-hedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poli-hedrina).
Uma vez uma molécula de anticorpo da invenção tenha sido re- combinantemente expressada, pode ser purificada por qualquer método co- nhecido na técnica por purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, permuta de íons, afinidade, particularmente por afinidade ao antígeno específico após Proteína A, e cromatografia de coluna por tamanho), centrifugação, solubilidade diferenci- al, ou por qualquer outra técnica-padrão para a purificação de proteínas. Al- ternativamente, um método preferido para aumentar a afinidade dos anticor- pos da invenção é descrito na US 2002 0123057 A1. VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS DE Sp35 TE- RAPÊUTICOS
Como descrito aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de Iiga- ção de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem aliviar a inibição mediada por NgR1 de extensão axonal que normalmente acontece nos neurônios do SNC. Este é benéfico em situações onde exten- são axonal ou brotamento de neurite são necessários no cérebro ou espinha dorsal. Lesão da espinha dorsal, incluindo esmagamento parcial ou completo ou separação, exemplifica uma situação em que extensão axonal é necessá- ria, mas é normalmente inibida por operação da via de Nogo. Exemplos de doenças ou distúrbios em que extensão axonal e/ou brotamento de neurite no cérebro seriam benéficas incluem acidente vascular, esclerose múltipla, e outras doenças neurodegenerativas ou distúrbios tais como esclerose múlti- pia (MS), Ieucoencefalopatia multifocal progressiva (PML)1 encefalomielite (EPL), mielólise pontina central (CPM), adrenoleucodistrofia, doença de Ale- xander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), Leucodistrofia de Célula Globoide (doença de Krabbe) e degeneração Walleriana, neurite ótica, mieli- te transversal, esclerose lateral amilotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesão da espinha dorsal, lesão traumática do cérebro, lesão pós radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascular, neuropatia, neuropatia ótica isquêmica a- guda, deficiência de vitamina E, síndrome de deficiência de vitamina E isola- da, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, paralisia de Sino, lesão da espinha dorsal e todas as doenças neurológicas relacionadas à morte de célula neuronal.
Os inventores também descobriram que Sp35 é expressado em oligodendrócitos, e contribui para a biologia dos oligodendrócítos. Derivados solúveis de Sp35, certos polinucleotídeos (por exemplo, RNAi), como tam- bém certos anticorpos que especificamente ligam a Sp35, como descritos aqui, atuam como antagonistas para função de Sp35 em oligodendrócitos, promovendo a proliferação, diferenciação e sobrevivência dos oligodendróci- tos e promovendo a mielinação dos neurônios in vitro e in vivo. Isto é benéfi- co para doenças, distúrbios ou condições que envolvem desmielinação e dismielinação. Exemplos de doenças ou distúrbios em que proliferação, dife- renciação e sobrevivência dos oligodendrócitos, e/ou mielinação ou remieli- nação seriam benéficos incluem esclerose múltipla (MS), leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielinólise pontina cen- tral (CPM), adrenoleucodistrofia, doença de Alexander1 doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), Leucodistrofia de Célula Globoide (doença de Krabbe), Degeneração Walleriana, neurite ótica, mielite transversal, esclerose lateral amilotrófica (ALS)1 doença de Huntington1 doença de Alzheimer1 doença de Parkinson, lesão de espinha dorsal, lesão traumática do cérebro, lesão pós radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascular, neuropatia ótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E1 síndrome de deficiência de vitamina E isolada, AR1 síndrome de Bassen-Kornzweig1 sín- drome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia tri- geminal, e paralisia de Sino.
Consequentemente, uma modalidade da presente invenção pro- vê métodos para tratar lesão de espinha dorsal, doenças ou distúrbios asso- ciados à inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação dos neurônios do SNC em um animal sofrendo de tal lesão ou doença ou predisposto a contra- ir tal doença, o método compreendendo, que consiste essencialmente em, ou consistindo em administrar ao animal uma quantidade efetiva de um anti- corpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo. Anticorpos da invenção são descritos aqui, e incluem os anticor- pos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B, anticorpos que especificamen- te ligam ao mesmo epitopo como os anticorpos monoclonais listados na Ta- bela 3A e 3B, anticorpos que competitivamente inibem a ligação dos anticor- pos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B para Sp35, e anticorpos que compreendem polipeptídeos derivados dos anticorpos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B.
Um anticorpo de Sp35 terapêutico a ser usado nos métodos de tratamento descritos aqui pode ser preparado e usado como um agente te- rapêutico que promove desenvolvimento de neurite do SNC1 sobrevivência neuronal, orientação de axônio e regeneração de axônio promovendo sobre- vivência, crescimento, e/ou diferenciação de oligodendrócito, e que promove mielinação ou remielinação dos neurônios do SNC. Características de anti- corpos de Sp35 terapêuticos adequados incluem: ligar a epitopos de Sp35 resultando no bloqueio da atividade de Sp35, ligar a Sp35 com afinidade su- ficiente para suscitar um efeito terapêutico, e ligar a Sp35 preferencialmente a pares de ligação normais, por exemplo, receptor Nogo.
Anticorpos de Sp35 terapêuticos podem ser anticorpos mono- clonais, quiméricos ou humanizados, ou fragmentos de anticorpos que espe- cificamente se ligam a Sp35. Os anticorpos podem ser monovalentes, biva- lentes, polivalentes, ou anticorpos bifuncionais. Fragmentos de anticorpo incluem sem limitação Fab F(ab')2, e fragmentos Fv.
Anticorpos de Sp35 terapêuticos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos de acordo com a invenção podem ser usados na forma não-marcada ou não-conjugada, ou pode ser acoplado ou ligado a fármacos, marcações ou agentes de estabilização que podem ou não exercer efeitos terapêuticos adicionais.
Uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer paciente particular dependerão de uma variedade de fatores, incluindo do anticorpo de Sp35 particular, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo usado, da idade do paciente, peso do corpo, saúde geral, sexo, e dieta, e do tempo de administração, taxa de excreção, combi- nação de fármaco, e da severidade da doença particular sendo tratada. Jul- gamento de tais fatores através de cuidadores profissionais de saúde está dentro da versatilidade na técnica. A quantidade também dependerá do pa- ciente individual a ser tratado, da rota de administração, do tipo de formula- ção, das características do composto usado, da severidade da doença, e do efeito desejado. A quantidade usada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem-conhecidos na técnica.
Nos métodos da invenção, os anticorpos de Sp35, ou fragmen- tos de ligação de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem ser administrados diretamente ao sistema nervoso, intracerebroventricular, ou intratecalmente, por exemplo, em uma lesão crônica de MS, como debatido em mais detalhe abaixo.
Em várias modalidades, um anticorpo de Sp35 como descrito acima é antagonista da atividade de Sp35. Em certas modalidades, por e- xemplo, ligação de um anticorpo de Sp35 de antagonista a Sp35, como ex- presso nos neurônios, bloqueia inibição associada à mielina de desenvolvi- mento de neurite ou morte de célula neuronal. Em outras modalidades, liga- ção do anticorpo de Sp35 a Sp35, como expresso em oligodendrócitos, blo- queia a inibição de crescimento ou diferenciação de oligodendrócito, ou blo- queia desmielinação ou dismielinação dos neurônios de SNC.
Em métodos da presente invenção, um anticorpo de Sp35, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, em particular os anticorpos de Sp35 descritos aqui, pode ser administrado dire- tamente como um polipeptídeo pré-formado, ou indiretamente através de um vetor de ácido nucleico, para permitir desenvolvimento axonal benéfico, pro- mover proliferação, diferenciação, e sobrevivência de oligodendrócitos, e/ou promover mielinação ou remielinação.
Em certas modalidades, um sujeito pode ser tratado com uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou análogo do mesmo, por exemplo, em um vetor. Doses para ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos variam de cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 30-300 pg de DNA por paciente. Doses para vetores virais infecciosos variam de 10-100, ou mais, virions por dose.
Em algumas modalidades da presente invenção um anticorpo de Sp35, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo é administrado em um método de tratamento que inclui: (1) trans- formar ou transfeccionar uma célula hospedeira implantável com um ácido nucleico, por exemplo, um vetor que expressa um anticorpo de Sp35 ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo; e (2) implantar a célula hospedeira transformada em um mamífero, no sítio de uma doença, distúrbio ou lesão. Por exemplo, a célula hospedeira transfor- mada pode ser implantada no sítio de uma lesão de espinha dorsal ou em um sítio de dismielinação. Em algumas modalidades da invenção, a célula hospedeira implantável é removida de um mamífero, temporariamente culti- vada, transformada ou transfeccionada com um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de Sp35, e implantada de volta no mesmo mamífero do qual foi removida. A célula pode ser, mas não é requerido que seja, re- movida do mesmo sítio ao qual implantou-se. Tais modalidades, às vezes conhecidas como terapia de gene ex vivo, podem fornecer uma provisão contínua do polipeptídeo de Sp35, localizada no sítio do sítio de ação, duran- te um período limitado de tempo.
Os métodos para tratar lesão de espinha dorsal, doenças ou dis- túrbios associados à inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oligo- dendrócitos, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação dos neurônios do SNC compreendendo administração de um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção são tipicamente testados in vitro, e depois in vivo em um modelo de animal aceitável, para a atividade terapêutica ou profiláctica desejada, antes do uso em seres humanos. Modelos animais adequados, incluindo animais transgênicos, serão conhecidos àqueles versados na técnica. Por exemplo, ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica do anticor- po de Sp35 descrito aqui incluem o efeito de um anticorpo de Sp35 em uma linhagem celular ou uma amostra de tecido de paciente. O efeito do anticor- po de Sp35 na linhagem celular e/ou amostra de tecido utilizando técnicas conhecidas pode ser determinado daqueles versados na técnica, tais como os ensaios descritos em outro lugar aqui. De acordo com a invenção, ensai- os in vitro que podem ser usados para determinar se administração de um anticorpo de Sp35 específico é indicada, incluem ensaios de cultura de célu- la in vitro em que uma amostra de tecido de paciente é crescida na cultura, e exposta ou do contrário administrado um composto, e o efeito de tal compos- to na amostra de tecido é observado.
Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições da invenção. Por exemplo, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da in- venção pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
A invenção abrange qualquer método de liberação adequado para um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção para um tecido alvo selecionado, inclu- indo injeção de bolo de uma solução aquosa ou implantação de um sistema de liberação controlada. Uso de um implante de liberação controlada reduz a necessidade por injeções repetidas.
IX. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
Métodos de preparar e administrar anticorpos de Sp35, ou frag- mentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da in- venção a um sujeito em necessidade dos mesmos são bem-conhecidos ou são facilmente determinados por aqueles versados na técnica. A rota de administração do anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou tópica. O termo parenteral como aqui usado inclui, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, sub- cutânea, retal ou vaginal. Embora todas estas formas de administração se- jam contempladas claramente como estando dentro do escopo da invenção, uma forma para administração seria uma solução para injeção, em particular para injeção intravenosa ou intra-arterial ou gotejamento. Usualmente, uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão de acetato, fosfato ou citrato), um tensoativo (por exemplo, polissorbato), opcionalmente um agente estabilizante (por e- xemplo, albumina humana), etc. Porém, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser libe- rados diretamente ao sítio da população celular adversa assim aumentando a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.
ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oli- godendrócitos, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação do SNC. Nesta consideração, será apreciado que os anticorpos descritos serão formulados para facilitar administração e promover estabilidade do agente ativo. Preferivelmente, as composições farmacêuticas de acordo com a pre- sente invenção compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável, não- tóxico, estéril tal como tampões salinos, não-tóxicos fisiológicos, conservan- tes e outros. Para o propósito do presente pedido de patente, uma quantida- de farmaceuticamente efetiva de um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, conjugado ou não- conjugado, será mantido para significar uma quantidade suficiente para al- cançar ligação efetiva a um alvo e alcançar um benefício, por exemplo, para melhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio ou detectar uma substân- cia ou uma célula.
As composições farmacêuticas usadas nesta invenção compre- ende veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, permu- tador de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tal como albumina de soro humano, substâncias de tampão tais como fosfato, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio de dissódio, fosfato de hidrogênio de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de mag- nésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina.
Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões, e emulsões aquosas ou não-aquosas estéreis. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Na inven- ção em questão, veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, 0,01-0,1 M e preferivelmente 0,05 M de tampão de fosfato ou 0,8% de solução salina. Outros veículos parenterais comuns incluem so- luções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem fluido e reposi- tores de nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aqueles com base na dextrose de Ringer, e outros. Conservantes e outros aditivos podem estar também presentes tais como por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e outros.
Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de so- luções ou dispersões injetáveis estéreis. Em tais casos, a composição deve ser estéril e deveria ser fluida ao ponto que siringabilidade fácil exista. Deve- ria ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deveria ser preferivelmente preservada contra a ação contaminante de microorga- nismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e outros), e misturas ade- quadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. For- mulações adequadas para o uso nos métodos terapêuticos descritos aqui são descritas em Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16a ed. (1980).
Prevenção da ação de microorganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e outros. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolon- gada das composições injetáveis pode ser provocada incluindo na composi- ção um agente que tarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alu- mínio e gelatina.
Em todo caso, soluções injetáveis estéreis podem ser prepara- das incorporando um composto ativo (por exemplo, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, por si só ou em combinação com outros agentes ativos) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aqui, como requeridos, seguido por esterilização filtrada. Em geral, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veí- culo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredien- tes requeridos que aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis pa- ra a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelação que rende um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo. As preparações para injeções são processadas, enchidas em recipientes tais como ampolas, sa- cos, garrafas, seringas ou frascos, e vedadas sob condições assépticas de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Também, as preparações podem ser empacotadas e vendidas na forma de um kit tal como aqueles descritos em U.S.S.N copendente. 09/259.337 (US-2002-0102208 A1) que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Tais artigos de fabricação terão preferivelmente rótulos ou bulas indicando que as composições asso- ciadas são úteis para tratar um sujeito sofrendo, ou predisposto a distúrbios autoimunes ou neoplásticos.
Formulações parenterais podem ser uma dose de bolo simples, uma infusão ou uma dose de bolo de carga seguida com uma dose de ma- nutenção. Estes composições podem ser administradas em intervalos fixos ou variáveis específicos, por exemplo, uma vez ao dia, ou em uma base "quando necessárias".
Certas composições farmacêuticas usadas nesta invenção po- dem ser administradas oralmente em uma forma de dosagem aceitável inclu- indo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquo- sas. Certas composições farmacêuticas podem também ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para intensificar a biodis- ponibilidade, e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais.
A quantidade de um anticorpo de Sp35, ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo que pode ser combinado com os materiais de veículo para produzir uma forma de dosagem simples variará, dependendo do hos- pedeiro tratado e do modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose simples, doses múltiplas ou em um perío- do estabelecido de tempo em uma infusão. Regimes de dosagem também podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profiláctica).
De acordo com o escopo da presente descrição, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados a um animal humano ou ou- tro de acordo com os métodos de tratamento mencionados acima em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados a tal animal humano ou outro em uma forma de dosagem convencional preparada combinando o anticorpo da invenção com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável con- vencional de acordo com as técnicas conhecidas. Será reconhecido por al- guém versado na técnica que a forma e caráter do veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável são ditados pela quantidade de ingrediente ativo com que será combinado, a rota de administração e outras variáveis bem- conhecidas. Aqueles versados na técnica também apreciarão que um coque- tel compreendendo uma ou mais espécies de anticorpos de Sp35, ou frag- mentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da in- venção podem provar ser particularmente efetivas.
Doses efetivas das composições da presente invenção, para tratamento de lesão de espinha dorsal, doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação do SNC variam, dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é ser humano ou um animal, outras medicações administradas, e se tratamento é profiláctico ou terapêu- tico. Usualmente, o paciente é um ser humano mas mamíferos não-humanos incluindo mamíferos transgênicos podem ser também tratados. Dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos rotineiros conhecidos àque- les de versado na técnica para otimizar a segurança e eficácia.
Para tratamento de lesão de espinha dorsal, doenças ou distúr- bios associados à inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oligo- dendrócitos, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação do SNC com um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, vari- ante, ou derivado do mesmo, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), do peso do corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg peso do corpo ou 10 mg/kg peso do corpo ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg, preferivelmente pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas acima são também intencionadas estar dentro do escopo da invenção. Os sujeitos podem ser administrados com tais doses diariamente, em dias alternativos, semanalmente ou de acordo com qualquer outro programa determinado por análise empírica. Um tratamento exemplar requer administração em dosa- gens múltiplas em um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Regimes de tratamento exemplares adicionais requerem administra- ção uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Programas de dosagem exemplares incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias sucessivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg sema- nalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro das fai- xas indicadas.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados em ocasiões múltiplas. Intervalos entre as dosagens simples podem ser diários, semanalmente, mensal ou anualmente. Intervalos podem ser também irregu- lares como indicado medindo os níveis sangüíneos do polipeptídeo-alvo ou molécula alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de polipeptídeo do plasma de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos 25-300 pg/ml. Alternativamente, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados como uma formulação de liberação con- tínua em cujo caso administração menos freqüente é requerida. Dosagem e freqüência variam, dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. A meia-vida de um anticorpo de Sp35 pode ser também prolongada por meio de fusão a um polipeptídeo estável ou metade, por exemplo, albumina ou PEG. Em geral, anticorpos humanizados apresentam a meia-vida mais lon- ga, seguidos por anticorpos quiméricos e anticorpos não-humanos. Em uma modalidade, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados em forma não-conjugada. Em outra modalidade, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser administrados múltiplas vezes em forma conjugada. Em ainda outra modalidade, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser ad- ministrados em forma não-conjugadas, depois em forma conjugada, ou vice- versa.
As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer método adequado, por exemplo, parenteral, intraventricular, oral, por pulverização de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginalmente ou por meio de um reservatório implantado. O termo "parenteral" como aqui usado inclui técnicas de injeção ou de infusão subcutânea, intravenosa, in- tramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intra- hepática, intralesional e intracraniana. Como previamente descrito, anticor- pos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da invenção atuam no sistema nervoso para promover sobrevi- vência, proliferação e diferenciação de oligodendrócitos e mielinação de neu- rônios e sobrevivência neuronal, regeneração de axônios e orientação axo- nal. Consequentemente, nos métodos da invenção, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos são administrados em um tal modo que eles cruzam a barreira hematoence- fálica. Este cruzamento pode resultar das propriedades fisicoquímicas ine- rente na própria molécula de anticorpo de Sp35, de outros componentes em uma formulação farmacêutica, ou do uso de um dispositivo mecânico tal co- mo uma agulha, cânula ou instrumentos cirúrgicos para quebrar a barreira hematoencefálica. Onde o anticorpo de Sp35 for uma molécula que não ine- rentemente cruza a barreira hematoencefálica, por exemplo, uma fusão a uma metade que facilita o cruzamento, rotas adequadas de administração são, por exemplo, intratecal ou intracranianas, por exemplo, diretamente em uma lesão crônica de SRA. Onde o anticorpo de Sp35 for uma molécula que inerentemente cruza a barreira hematoencefálica, a rota de administração pode ser antes de uma ou mais das várias rotas descritas abaixo. Em alguns métodos, os anticorpos são administrados como uma composição de libera- ção contínua ou dispositivo, tal como um dispositivo Medipad®. Liberação ao longo da barreira hematoencefálica pode ser intensificada por uma molécula de carga, tal como receptor anti-Fc, transferrina, receptor anti-insulina ou um conjugado de toxina ou intensificador de penetração.
Os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos usados nos métodos da invenção po- dem ser infundidos diretamente no cérebro. Vários implantes para infusão cerebral direta dos compostos são conhecidos e efetivos na liberação dos compostos terapêuticos para pacientes humanos que sofrem de distúrbios neurológicos. Estes incluem infusão crônica no cérebro usando uma bomba, estereotaticamente implantada, cateteres intersticiais temporários, implanta- ções de cateter intracraniano permanente, e implantes biodegradáveis cirur- gicamente implantados. Vide, por exemplo, Gill et ai, "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003); Scharfen et a!., "High Activity lodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-91 (1992); Gaspar et ai, "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-82 (1999); capítulo 66, páginas 577-580, Bellezza et aí., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," em Gilden- berg et ai, Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw- Hill (1998); e Brem et ai, "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BC- NU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Ne- wly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26:111- 23(1995).
As composições podem também compreender um anticorpo de Sp35 dispersado em um material de veículo biocompatível que funciona co- mo uma liberação adequada ou sistema de suporte para os compostos. E- xemplos adequados de veículos de liberação contínua incluem matrizes po- liméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados tais como supositó- rios ou cápsulas. Matrizes de liberação sustentada implantáveis ou micro- capsulares incluem polilactídeos (patente U.S. 3.773.319; EP 58.481), copo- límeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et ai, Bio- polymers 22:547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), acetato de etileno vinila (Langer et ai, J. Biomed. Mater. Res. 75:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).
Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo da invenção é administrado a um paciente através de infusão direta em uma região apropriada do cérebro. Vide, por exemplo, Gill et ai, supra. Técnicas alternativas estão disponíveis e podem ser aplicadas para administrar um anticorpo de Sp35 de acordo com a invenção. Por exemplo, colocação este- reotática de um cateter ou implante pode ser realizada usando a unidade de Riechert-Mundinger e a unidade de localização de multipropósitos ZD (Za- morano-Dujovny). Uma varredura de tomografia computadorizada de con- traste intensificado (CT), injetando 120 ml de omnipaque, 350 mg de iodo/ml, com 2 mm de espessura de fatia pode permitir plano de tratamento multipla- nar tridimensional (STP, Fischer, Friburgo, Alemanha). Este equipamento permite planejamento com base nos estudos de imageamento de ressonân- cia magnética, fundindo a informação alvo de CT e MRI para confirmação alvo clara.
O sistema estereotático de Leksell (Down Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para o uso com um escâner GE CT (General Electric Com- pany, Milwaukee, Wl) como também o sistema estereotático de Brown- Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) podem ser usados para este propósito. Desse modo, na manhã do implante, o anel de base anular da estrutura estereotática de BRW pode ser prendido ao crânio do paciente. Seções de CT em série podem ser obtidas em intervalos de 3 mm entretanto a região (tecido alvo) com uma estrutura de Iocalizador de haste de grafita prendida à placa de base. Um programa de planejamento de tratamento computadorizado pode ser operado em um computador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) usando coordenadas de CT das imagens da haste de grafita para mapear entre o espaço de CT e o espaço de BRW.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser opcionalmente administrados em combinação com outros agentes que são efetivos em tra- tar distúrbio ou condição em necessidade de tratamento (por exemplo, profi- láctico ou terapêutico).
X. DIAGNÓSTICOS
A invenção também fornece um método de diagnóstico útil du- rante a diagnose de distúrbios ou lesões neronais que envolvem medir o ní- vel de expressão da proteína de Sp35 ou transcrição em tecido ou outras células ou fluido do corpo de um indivíduo e comparar o nível de expressão medido com níveis de expressão de Sp35 padrões em tecido normal ou flui- do do corpo por meio do qual um aumento no nível de expressão comparado ao padrão é indicativo de um distúrbio.
Anticorpos Sp35-específicos podem ser usados para ensaiar níveis de proteína em uma amostra biológica usando métodos imunoistológi- cos clássicos conhecidos àqueles versados na técnica (por exemplo, vide Jalkanen1 et ai, J. CeH. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et ai, J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos com base em anticorpo úteis para detectar a expressão de proteína incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), imunoprecipitação, ou westem blot. Ensaios adequados são descritos em outro lugar em mais deta- lhe aqui.
Para "ensaiar o nível de expressão de polipeptídeo de Sp35" é intencionado qualitativa ou quantitativamente medir ou estimar o nível de polipeptídeo de Sp35 em uma primeira amostra biológica ou diretamente (por exemplo, determinando ou estimando o nível de proteína absoluto) ou relativamente (por exemplo, comparando ao nível de polipeptídeo de câncer associado por uma segundo amostra biológica). Preferivelmente, o nível de expressão do polipeptídeo de Sp35 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado a um nível de polipeptídeo de Sp35 padrão, o pa- drão sendo ocupado de uma segunda amostra biológica obtida de um indiví- duo não tendo o distúrbio ou sendo determinado ponderando os níveis de uma população de indivíduos não tendo o distúrbio. Como será apreciado na técnica, uma vez o nível de polipeptídeo de Sp35 "padrão" é conhecido, po- de ser usado repetidamente como um padrão para comparação. Por "amostra biológica" é intencionado qualquer amostra biológi- ca obtida de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecido, ou outra fonte de células que potencialmente expressam Sp35. Métodos para obter bióp- sias de tecido e fluidos do corpo de mamíferos são bem-conhecidos na téc- nica.
Anticorpos de Sp35 para o uso nos métodos diagnósticos descri- tos acima incluem qualquer anticorpo de Sp35 que especificamente liga a um produto de gene de Sp35, como descrito em outro lugar aqui.
XI. IMUNOENSAIOS
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção podem ser ensaiados para ligação imunoespecífica por qualquer método conhecido na técnica. Os imu- noensaios que podem ser usados incluem mas não são limitados a sistemas de ensaio competitivos e não-competitivos usando técnicas tais como wes- tem blot, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzi- ma), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodi- fusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para nomear alguns. Tais ensaios são rotineiros e bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel et ai, eds, Current Protocols in Molecu- lar Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) que é incor- porada por referência aqui em sua totalidade). Imunoensaios exemplares são brevemente descritos abaixo (mas não são intencionados por via de Iimi- tação).
Protocolos de imunoprecipitação em geral compreendem Iisar uma população de células em um tampão de Iise tal como tampão de RIPA (1% de NP-40 ou Triton X-100, 1% de deoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 0,15 M de NaCI, 0,01 M de fosfato de sódio em pH 7,2, 1% de Trasylol) su- plementado com inibidores de proteína fosfatase e/ou de protease (por e- xemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), acrescentando o anti- corpo de interesse ao Iisado de célula, incubando durante um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas) a 4 graus, adicionando esferas de sefarose de proteína A e/ou proteína G ao Iisado celular, incubando durante cerca de uma hora ou mais a 4 graus, lavando as esferas em tampão de Iise e res- suspendendo as esferas em tampão de SDS/amostra. A habilidade do anti- corpo de interesse para imunoprecipitar um antígeno particular pode ser ava- liada, por exemplo, por análise de western blot. Alguém versado na técnica seria instruído sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumen- tar a ligação do anticorpo a um antígeno e diminuir a base (por exemplo, pré- clareando a célula Iisada com esferas de sefarose). Para debate adicional com relação aos protocolos de imunoprecipitação vide, por exemplo, Ausub- el et ai, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) em 10.16.1.
Análise de western blot em geral compreende preparar as amos- tras de proteína, eletroforese das amostras de proteína em um gel de polia- crilamida (por exemplo, 8%-20% de SDS-PAGE dependendo do peso mole- cular do antígeno), transferir a amostra de proteína do gel de poliacrilamida para uma membrana tal como nitrocelulose, PVDF ou náilon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com 3% de BSA ou leite sem gordura), lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloquear a membrana com anticorpo primário (anticorpo de interesse) diluído em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, bloquear a membrana com um anticorpo secundário (que reconhe- ce o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugado com um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina) ou molécula radioativa (por exemplo, 32p ou 1251) diluída em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detectar a presença do antígeno. Alguém versado na técnica seria instruído sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal de- tectado e reduzir o ruído de fundo. Para mais debate com relação aos proto- colos de western blot vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque Vol. 1 (1994) em 10.8.1. ELISAs compreendem preparar o antígeno, revestir o poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com o antígeno, acrescentar o an- ticorpo de interesse conjugado com um composto detectável tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfa- tase alcalina) ao poço e incubar durante um período de tempo, e detectar a presença do antígeno. Em ELISAs, o anticorpo de interesse não tem que ser conjugado com um composto detectável; do contrário, um segundo anticorpo (que reconhece o anticorpo de interesse) conjugado com um composto de- tectável pode ser acrescentado ao poço. Também, em vez de revestir o poço com o antígeno, o anticorpo pode ser revestido no poço. Neste caso, um segundo anticorpo conjugado para um composto detectável seguinte pode ser acrescentado à adição do antígeno de interesse ao poço revestido. Al- guém versado na técnica seria instruído sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado como também outras variações de ELISAs conhecidas na técnica. Para mais debate com relação a ELISAs vide, por exemplo, Ausubel et ai, eds, Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque1VoI. 1 (1994) em 11.2.1.
A afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno e a taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno pode ser de- terminada através de ensaios de ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligação competitivo é um radioimunoensaio compreendendo a in- cubação do antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não-marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anti- corpo de interesse para um antígeno particular e as taxas dissociação de ligação podem ser determinadas dos dados através de análise gráfica scat- chard. Competição com um segundo anticorpo pode ser também determina- da usando radioimunoensaios. Neste caso, o antígeno é incubado com anti- corpo de interesse conjugado com um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não-marcado.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari- antes, ou derivados dos mesmos da invenção, adicionalmente, são empre- gados histologicamente, como em imunofluorescência, microscopia de imu- noelétron ou ensaios não-imunológicos, para detecção in situ de produtos de gene de antígeno de câncer ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo dos mesmos. Detecção in situ pode ser realizada removendo um espécime histológico de um paciente, e aplicando um anticorpo de Sp35 marcado a este, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, preferivelmente aplicado revestindo o anticorpo marcado (ou fragmento) sobre uma amostra biológica. Através do uso de tal procedimen- to, é possível não só determinar a presença de proteína de Sp35, ou varian- tes conservadas ou fragmentos de peptídeo, mas também sua distribuição no tecido examinado. Usando a presente invenção, aqueles versado facil- mente perceberão que qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de manchamento) podem ser modifi- cados para alcançar tal detecção in situ.
Imunoensaios e não-imunoensaios para produtos de gene de Sp35 ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo dos mesmos tipi- camente compreenderão incubar uma amostra, tal como um fluido biológico, um extrato de tecido, células recentemente colhidas, ou Iisados de células que foram incubados em cultura de célula, na presença de um anticorpo de- tectavelmente marcado capaz de ligar a Sp35 ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo do mesmo, e detectar o anticorpo ligado por quais- quer de várias técnicas bem-conhecidas na técnica.
A amostra biológica pode ser colocada em contato e imobilizada sobre um suporte de fase sólida ou veículo tal como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de célula ou pro- teínas solúveis. O suporte pode ser depois lavado com tampões adequados seguido por tratamento com o anticorpo de Sp35 detectavelmente marcado, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo. O suporte de fase sólida pode ser depois lavado com o tampão uma segunda vez para remover o anticorpo não-ligado. Opcionalmente o anticorpo é sub- seqüentemente marcado. A quantidade de marcação ligada no suporte sóli- do pode ser depois detectada por meios convencionais.
Por "suporte de fase sólida ou veículo" é intencionado qualquer suporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou veículos bem-conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dex- trana, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros, e magnetita. A natureza do veículo pode ser até certo ponto solúvel ou insolúvel para o propósito da presente invenção. O material de suporte pode ter virtualmente qualquer possível configuração estrutural desde que a molécula acoplada seja capaz de ligação a um antígeno ou anticorpo. Desse modo, a configuração de suporte pode ser esférica, como em uma esfera, ou cilíndrico, como na superfície de dentro de um tubo de teste, ou a superfície externa de uma haste. Alternativamente, a superfície pode ser plana tal co- mo uma folha, tira de teste, etc. Suportes preferidos incluem esferas de poli- estireno. Aqueles versados na técnica conhecerão muitos outros veículos adequados para ligar anticorpo ou antígeno, ou poderão apurar o mesmo mediante o uso de experimentação rotineira.
A atividade de ligação de um lote dado de anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser determinada de acordo com métodos bem-conhecidos. Aqueles versados na técnica poderão determinar operação e condições ótimas de ensaio para cada determinação empregando experimentação rotineira.
Há uma variedade de métodos disponíveis para medir a afinida- de de uma interação de anticorpo-antígeno, mas relativamente poucos para determinar constantes de taxa. A maioria dos métodos esfera com anticorpo ou antígeno de marcação que inevitavelmente complicam as medições roti- neiras e introduzem incertezas nas quantidades medidas.
Ressonância de plasmon de superfície (SPR) como executada em BIAcore oferece várias vantagens sobre os métodos convencionais de medir a afinidade das interações de anticorpo-antígeno: (i) nenhum requeri- mento para marcação anticorpo ou antígeno; (ii) anticorpos não necessitam ser purificados com antecedência, sobrenadante de cultura de célula pode ser usado diretamente; (iii) medições de tempo real, permitindo comparação semiquantitativa rápida das interações de anticorpos monoclonais diferentes, são permitidas e são suficientes para muitos propósitos de avaliação; (iv) superfície bioespecífica pode ser regenerada de forma que uma série de anticorpos monoclonais diferentes pode ser facilmente comparada sob con- dições idênticas; (v) procedimentos analíticos são completamente automati- zada e uma série extensiva de medições pode ser executada sem interven- ção do usuário. BlAappIications Handbook1 versão AB (reimpresso em 1998), código de BIACORE No. BR-1001-86; BIAtechnoIogy Handbook1 ver- são AB (reimpresso em 1998), código de BIACORE No. BR-1001-84.
Estudos de ligação com base em SPR requerem que o membro de um par de ligação seja imobilizado em uma superfície de sensor. O par de ligação imobilizado é referido como o ligante. O par de ligação na solução é referido como o analito. Em alguns casos, o ligante está indiretamente li- gado à superfície ligando a outra molécula imobilizada, que é referida como a molécula capturadora. Resposta de SPR reflete uma alteração na concen- tração de massa na superfície do detector conforme os analitos se ligam ou se dissociam.
Com base em SPR1 medições de BIAcore de tempo real monito- ram diretamente as interações à medida que elas ocorrem. A técnica é bem adaptada para a determinação de parâmetros cinéticos. Classificação por afinidade comparativa é extremamente simples de executar, e ambas cons- tantes cinéticas e de afinidade podem ser derivadas dos dados de sensor- grama.
Quando analito estiver injetado em um pulso distinto ao longo de uma superfície de ligante, o sensorgrama resultante pode ser divididos em três fases essenciais: (i) Associação de analito com ligante durante injeção da amostra; (ii) Estado de equilíbrio ou fixo durante a injeção da amostra onde a taxa de ligação do analito é equilibrada através de dissociação do complexo; (iii) Dissociação do analito da superfície durante o fluxo do tam- pão.
As fases de associação e de dissociação fornecem informação sobre a cinética de interação de analito-ligante (ka e kd, as taxas de formação complexa e dissociação, kd/ka = Kd). A fase de equilíbrio fornece informação sobre a afinidade da interação de anaIito-Iigante (KD).
Software de BIAevaIuation provê recursos inclusivos para ajuste de curva usando integração numérica e algoritmos de ajuste globais. Com análise adequada do^ dados, taxa separada e constantes de afinidade para interação podem„ser obtidas de investigações de BIAcore simples. A faixa de afinidades mensuráveis por esta técnica é muito vasta variando de mM a pM.
Especificidade do epitopo é uma característica importante de um anticorpo monoclonal. Mapeamento de epitopo com BIAcore1 em contraste com as técnicas convencionais usando radioimunoensaio, ELISA ou outros métodos de adsorção de superfície, não requerem anticorpos de marcação ou purificação, e permitem testes de especificidade de sítios múltiplos usan- do uma seqüência de vários anticorpos monoclonais. Adicionalmente, núme- ros grandes de análises podem ser automaticamente processados.
Experimentos de ligação em pares testam a habilidade dos dois MAbs para ligar simultaneamente ao mesmo antígeno. MAbs direcionados contra epitopos separados se ligarão independentemente, enquanto que os MAbs direcionados contra epitopos idênticos ou estritamente relacionados interferirão com a ligação um ao outro. Estes experimentos de ligação com BIAcore são objetivos.
Por exemplo, pode-se usar uma molécula de captura para ligar o primeiro Mab1 seguido seqüencialmente por adição de antígeno e segundo MAb. Os sensorgramas revelarão: 1. quanto do antígeno liga ao primeiro Mab, 2. até que ponto o segundo MAb liga ao antígeno ligado à superfície, 3. se o segundo MAb não se liga, se inverter a ordem do teste em pares altera os resultados.
Inibição de peptídeo é outra técnica usada para mapeamento de epitopo. Este método pode complementar os estudos de ligação de anticor- po em pares de complemento, e pode relatar epitopos funcionais às caracte- rísticas estruturais quando a seqüência primária do antígeno for conhecida. Peptídeos ou fragmentos de antígeno são testados para inibição da ligação de MAbs diferentes ao antígeno imobilizado. Peptídeos que interferem com a ligação de um MAb dado são assumidos ser estruturalmente relacionados ao epitopo definido por aquele MAb.
A prática da presente invenção empregará, a menos que do con- trário indicado, técnicas convencionais de biologia de célula, cultura de célu- la, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinan- te, e imunologia que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Vide, por exemplo, Molecular Clo- ning A Laboratory Manual, 2a Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambro- ok et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, Nova Iorque (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I e Il (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. Patente U.S. 4.683.195; NucIeicAcid Hy- bridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transeription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture OfAnimaI Cel- Is, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Praetieal Guide To Molecular Cloning (1984); o tratado, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Trans- fer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer e Walker, eds., Academic Press, Londres (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IVj D. M. Weire C. C. Blackwell, eds., (1986); Mani- pulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S- pring Harbor, N.Y., (1986); e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecu- lar Biology1 John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
Princípios gerais de engenheirar anticorpo estão expostos em Antibody Engineering, 2a edição, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995). Princípios gerais de engenheirar proteína estão expostos em Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press na Oxford Univ. Press, Oxford, Ing. (1995). Princípios gerais de ligação de anti- corpos e anticorpo-hapteno estão expostos em: Nisondissociação, A., Mole- cular Immunology, 2a ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); e Steward1 M. W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, Nova lorque, NI (1984). Adicionalmente, métodos padrões em imunolo- gia conhecidos na técnica e não especificamente descritos são em geral se- guidos como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova lorque; Stites et al. (eds), Basic and Clinicai -Immunology (8a ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) e Mishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., Nova lorque (1980).
Trabalhos de referência padrões expondo os princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimina- tion, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1982); Kennett, R., et al., eds., Mono- clonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Ple- num Press, Nova Iorque (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Tech- nology" em Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immun- nology 4a ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt e Barbara A. Osbor- ne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostdissociação, J. e Male D., Im- munology 6a ed. Londres: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. e Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann e Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffen- bach e Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).
Todas as referências citadas acima, como também todas as re- ferências citadas aqui, são incorporadas aqui por referência em suas totali- dades.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Sp35 está envolvido em biologia de oliqodendrócitos
Oligodendrócitos amadurecem através de vários estáqios de de- senvolvimento de células progenitoras de A2B5 (que expressam A2B5), dife- renciandos em oligodendrócitos pré-mielinizantes (que expressam 01 e 04) e por fim em oligodendrócitos mielinizantes maduros (que expressam 01, 04 e MBP). Desse modo, monitorando a presença e ausência dos marcado- res de A2B5, 01, 04 e MBP, é possível para determinar o estágio de desen- volvimento de uma célula dada e avaliar o papel de Sp35-Fc em biologia de oligodendrócitos. Para uma revisão geral de biologia de oligodendrócitos, vide, por exemplo, Baumann e Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: 871-927 (2001).
Anticorpos monoclonais contra 04, MBP e CNPase foram de Sternberger Monoclonais; anticorpo para APC (clone CC-1; ref. 29) foi de Calbiochem. Outros anticorpos foram a βΙΙΙ tubulina (Covance), Sp35 (Bio- gen ldec), Fyn (Santa Cruz Biotechnology) e fosfo-Fyn (Biosource). Anticor- pos monoclonais contra A2B5 são disponíveis de Chemicon. Sp35 é expressado em oligodendrócitos
A expressão de Sp35 em culturas de rato purificadas de neurô- nio de P13 CG, oligodendrócito de P2, e astrócito de P4 foi analisada atra- vés de reação em cadeia de polimerase após transcrição reversa (RT-PCR). Um kit de Ambion, Inc. foi usado para extrair o mRNA das células cerebrais de rato de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR semiquantitativa foi realizada usando iniciador direto 5* AGAGACATGCGATTGGTGA 3' (SEQ ID NO: 344), e iniciador reverso 5' AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3' (SEQ ID NO: 345) mostrou expressão alta em neurônios, expressão inferior em oligodendrócitos, e nenhuma expressão em astrócitros.
A expressão de Sp35 em oligodendrócitos foi confirmada por hibridação in situ em seções derivadas do nervo ótico de rato adulto. Seções do nervo ótico de rato foram preparadas e processadas como descrito em Mi et ai, "Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex", Nat. Neurosci. 7: 221-28 (2004) e sondadas com RNAs antissentido ou sen- tido de Sp35 marcado com digoxigenina usando os primeiros 500 nucleotí- deos da seqüência de codificação de Sp35. As seções foram tingidas de a- cordo com as instruções do fabricante usando um kit de Amplificação de Si- nal Tyramide (Amersham Biosciences) e um kit de anticorpo conjugado de anti-digoxigenina fluorescente (Perkin Elmer). Para análises combinadas in situ e de imunofluorescência, as seções foram primeiro sondadas com RNA marcados com digoxigenina e depois com anticorpos, por exemplo, anticor- po de CC1 (Calbiochem; um marcador de oligodendrócitos maduros) ou an- ticorpo anti-Sp35. Observou-se que os oligodendrócitos que hibridaram com a uma sonda de Sp35 antissentido também cotingiram com um anticorpo para CC1 (dados não mostrados). Nenhuma marcação específica foi obser- vada usando uma sonda de Sp35 sentido. Expressão de Sp35 em oligoden- drócitos foi também confirmada por estudos de imunoistoquímica das seções de tecido da região do ventrículo lateral do córtex de rato de P7. Uma maior parte das células corticais que marcaram com anticorpo de CC1 também marcaram com anticorpo anti-Sp35. Dados não mostrados. A especificidade da interação foi confirmada por pré-adsorção do anticorpo anti-Sp35 com Sp35-Fc (vide Exemplo 2) que eliminou o sinal.
Knockdown de RNAi Sp35-específico de expressão de Sp35 promove cres- cimento e diferenciação dos oligodendrócitos
RNAi Sp35-específico foi usado para ablação da expressão de Sp35 em células de precursor de oligodendrócitos para examinar como Sp35 contribui para o crescimento e diferenciação de oligodendrócitos. 50.000 cé- lulas de precursor de oligodendrócito de A2B5 foram infetadas com lentivírus carregando a seqüência de RNAi Sp35-específica ou controle RNAi prepa- rado como segue.
Seqüências de DNA de Sp35 murino e de rato foram compara- das para encontrar regiões homólogas para usar RNAs candidatos de hair- pin pequeno (shRNA). CH324, para expressão de lentivírus de RNAi de Sp35, foi construído anelando os oligonucleotídeos LV1-035 e LV1-036 e ligado a pLL3.7 digerido com Hpa\ e Xho\. A metodologia de vetor de pLL3.7 adicional, e produção de vírus foram como descritas em Rubinson et ai, Nat. Genet. 33, 401-06 (2003). Os oligonucleotídeos de RNAi de Sp35 foram comprados de MWG e têm as seqüências a seguir: LV1-035 (oligo de senti- do) LV1-035 (oligo de sentido) 5' - TGA TCG TCA TCC TGC TAG ACT TCA AGA GAG TCT AGC AGG ATG ACG ATC TTT TTT C - 3' (SEQ ID NO: 346) e LV1-036 (oligo de antissentido) 5' - TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTC TAG CAG GAT GAC GAT CA - 3' (SEQ ID NO: 347).
RNAi de controle foi projetado com as mesmas seqüências de oligonucleotídeo com exceção das alterações de nucleotídeo indicadas em letras minúsculas: 5'- TGA TCG TCA TCC TGC TAG ACT TCA AGA GAG TCT AGC AGG ATG ACG ATC TTT TTT C - 3' (SEQ ID NO: 348) e 5' - TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTC TAG CAG GAT GAC GAT CA - 3' (SEQ ID NO: 347).
Antes de produzir o lentivírus, DNA de pLL3.7 ou shRNA candi- dato em pLL3.7 foram cotransfectados com plasmídeo de Sp35-HA murino marcado em uma razão de 5 a 1 em células CHO em um formato de 6 po- ços. Knockdown foi analisado por detecção de western blot de marcador de Sp35-HA de Iisados de células CHO transfeccionados como também por northern blot de RNA total preparado de poços duplicados. O borrão foi son- dado com um fragmento de cDNA de Sp35. Ensaios foram executados 48 horas pós-transfecção. Como esperado, houve uma redução de 10 vezes do mRNA de Sp35 em células CHO tratadas com RNAi de CH324 com relação às células tratadas com controle. Dados não mostrados. Lentivírus de RNAi carregando a proteína fluorescente verde (GFP) foi gerado como descrito em Rubinson et al. Em culturas tratadas com controle ou RNAi de Sp35, aproxi- madamente 80% dos oligodendrócitos eram positivos de GFP. Número de células total não foi alterado pelos tratamentos de RNAi. Para quantificar os efeitos de RNAi na diferenciação, apenas oligodendrócitos expressando GFP foram contados.
Populações enriquecidas de oligodendrócitos foram crescidas de ratas de P2 Long Evans como descrito por Conn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (A- cademic Press; 1990) com modificações como segue. Brevemente, o cére- bro anterior foi o ditocado e colocado na solução salina tamponada de Hank (HBSS; Invitrogen). O tecido foi cortado em fragmentos de 1 mm e foi incu- bado a 37°C por 15 min em 0,01% de tripsina e 10 pg/ml de DNase. Células dissociadas foram banhadas em frascos de cultura de tecido de T75 revesti- dos com poli-L-lisina e foram crescidas às 37°C por 10 d em meio de DMEM com 20% de soro de bezerro fetal (Invitrogen). Precursores de oligodendróci- tos (A2B5+) foram colhidos agitando o frasco durante a noite a 200 rpm a Z1°C, resultando em uma população 95% pura. As culturas foram mantidas em glicose alta em meio de Eagle modificados de Dulbecco (DMEM) com FGF/PDGF (10 ng/ml; Peprotech) durante 1 semana. Remoção de FGF/PDGF permitiu as células de A2B5+ diferenciarem em oligodendrócitos pré-mielinizantes de 04+ após 3-7 d, e diferenciarem em oligodendrócitos maduros de 04+ e MBP+ após 7-10 d. Estes estados de diferenciação são facilmente evidentes das alterações na morfologia: células de A2B5+ são bipolares em forma, oligodendrócitos premielinizantes de 04+ têm processos muito mais demorados e ramificados e oligodendrócitos maduros de MBP+ contêm estruturas de folha de mielina entre os processos.
Células de precursor de oligodendrócitos de A2B5 foram infeta- das com o lentivírus contendo RNAi de CH324. As células resultantes foram cultivadas por 3 dias e o número de oligodendrócitos 04-positivos (um mar- cador para diferenciação de oligodendrócito) foi contado. Expressão de Sp35 endógeno foi reduzida através de infecção com lentivírus de RNAi de Sp35 e foi confirmada por RT-PCR. Redução de Sp35 resultou em oligodendrócitos maduros mais altamente diferenciados quando comparado com células infe- tadas com controle, como foi evidente pelos aumentos no comprimento dos processos de célula e pela presença de estruturas de folha de mielina abun- dantes (dados não mostrados). Em células que expressaram RNAi de Sp35, houve oligodendrócitos três vezes mais maduros (04-positivos) que nas cul- turas de controle. Estes dados indicam que Sp35 pode negativamente regu- lar a diferenciação de oligodendrócitos.
Sp35 dominante-negativo promove crescimento e diferenciação de oligo- dendrócitos
Vetores Ientivirais que expressam o tipo selvagem e uma forma dominante-negativa de Sp35 foram construídos. Seqüência de DNA que co- difica Sp35 de camundongo de comprimento total (FL-Sp35, resíduos de aminoácido 34-614 da SEQ ID NO: 2) foram amplificados por PCR usando iniciadores 5' - GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG - 3' (SEQ ID NO: 350) e 5' - GGG GCG GAA TTG GAT CCT CAC AGA TCC TCT TCT GAG ATG AG - 3' (SEQ ID NO: 351) e inseridos no vetor Ientiviral de HRST-IRESeGFP nos sítios Not\ e BamHl. Similarmen- te, a seqüência de DNA que codifica Sp35 dominante negativo (DN-Sp35, resíduos de aminoácido 34-581 da SEQ ID NO: 2) foi amplificada por PCT usando iniciadores 5" -GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG - 3' (SEQ ID NO: 352) e 5' - GAT ACG GAT CCT CAG CCT TTG CCC CGG CTC CAT AGA AAC AGC - 3' (SEQ ID NO: 353). Os plasmídeos FL-Sp35 e DN-Sp35 foram transfeccionados para células 293 para produzir lentivírus como descrito por Rubinson et ai, "A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference," Nat. Genet. 33: 401-06 (2003). Oligodendrócitos foram infetados com lentivírus a 2 MOI por célula e expres- são confirmada de FL-Sp35 e DN-Sp35 através de western blot.
DN-Sp35 promoveu diferenciação de oligodendrócitos, produ- zindo um aumento no número de oligodendrócitos maduros. Em contraste, supraexpressão de Sp35 de comprimento total (FL-Sp35) teve o efeito opos- to e inibiu a diferenciação, como foi evidente por uma redução no número de oligodendrócitos maduros quando comparado com o controle (dados não mostrados).
EXEMPLO 2
Construção e purificação de proteína de fusão de Sp35-Fc
Uma construção foi feita fundindo a porção extracelular de Sp35 humano (resíduos 1-532) para a região de dobradiça e de Fc de IgGI huma- na para estudar a função biológica de Sp35. Uma seqüência de codificação parcial para Sp35 humano foi obtida por PCR do clone 227.2 usando o inici- ador direto 5' - CAG CAG GTC GAC GCG GCC GCA TGC TGG CGG GGG GCG T -3' (SEQ ID NO: 354) e iniciador reverso 5' - CAG CAG GTC GAC CTC GCC CGG CTG GTT GGC CAA CCA GCC GGG CGA GGT CGA CCT CGA GG - 3' (SEQ ID NO: 355). O produto de PCR de extremidade cega foi subclonado no sítio de Srft do vetor PCR SCRIPT AMP (Stratagene) para criar PCR SCRIPT AMP-Sp35. Um fragmento de Sa/I foi isolado de PCR SCRIPT AMP-Sp35 e subclonado no vetor de Ig PCRCAMP (derivado do vetor de Stratagene PCR SCRIPT AMP). No vetor de Ig PCRCAMP, a seqüência de dobradiça e de Fc gama é subclonada como um fragmento de Sa/I(5") para Not\(3'). O fragmen- to de Sp35 de Sa/I foi subclonado no sítio de Sa/I do vetor de Ig PCRCAMP assim fundindo a seqüência sinal de Sp35 e o domínio extracelular (códons 1-532) dentro da estrutura com as seqüências que codificam a região de do- bradiça e de Fc de Ig1 humano. Isolamento correto foi identificado, e um fragmento de Not\ abrangendo o fragmento de Sp35-Fc foi subclonado no sítio de clonagem de Not\ simples do vetor de expressão de CHO, PV90 (Bi- ogen ldec). O plasmídeo resultante foi confirmado por sequenciação de DNA e designado GTI23.
Linhagens celulares estáveis que expressam a proteína de fusão de Sp35-Fc foram geradas por eletroporação de células hospedeiras de CHO DG44 com plasmídeo GT123. Células CHO transfeccionadas foram cultivadas em menos MEM alfa na presença de 10% de soro dializado e 4 mM de glutamina para selecionar o crescimento independente de nucleosí- deo. Quatorze dias pós-transfecção, células foram alimentadas com meios frescos. Para triar as células que expressam Sp35-Fc, as células CHO foram marcadas com IgG anti-humana de cabra marcada com ficoeritrina (PE) (Jackson Lab) e submetida à classificação de citometria de fluxo de veloci- dade alta em um FACS Mo-Flo (Cytomation). As células que expressaram os níveis mais altos de Sp35-Fc foram selecionadas. Estas células foram ex- pandidas em cultura durante 7 dias, depois remarcadas e reclassificadas. Células que expressam os níveis mais altos de Sp35-Fc foram isoladas co- mo clones de indivíduo em placas de 96 poços. Estes clones foram cresci- dos durante duas semanas e depois alimentados com meios frescos um dia antes da análise de FACS para verificar os níveis de expressão. Os clones que expressaram os níveis mais altos de Sp35-Fc foram expandidos, e ban- cos de célula congelados foram estabelecidos. As linhagens celulares foram adaptadas para crescer em cultura de suspensão nos meios livres de soro BCM16. A titulação de Sp35-Fc produzida por estes clones foi determinada cultivando as linhagens celulares a 37°C por 4-5 passagens, depois culti- vando as células a 50% de densidade celular máxima e cultivando-as duran- te 10-15 dias a 28°C até que a densidade celular viável caísse para 75%. Neste momento, os meios de cultura foram colhidos, limpados das células e restos através de centrifugação, e os sobrenadantes da cultura titulados para níveis de Sp35-Fc por análise de westem blot usando um anticorpo de Ig anti-humano (Jackson Lab) como a sonda.
Proteína de fusão de Sp35-Fc foi purificada do meio de cultura clarificado como segue: 9 ml de 1M de HEPES pH 7,5 foram acrescentados a 900 ml de meio condicionado. O meio foi carregado em bateladas por 3 h a 4°C sobre 3 ml de Proteína A Sepharose (Amersham Bioscience). A resina foi colhida em uma coluna de 1,5 cm (RG), e lavada quatro vezes com 3 ml de PBS, duas vezes com 4 ml de PBS contendo 800 mM de NaCI, e depois novamente com 3 ml de PBS. O Sp35-Fc foi eluído da coluna com 25 mM de NaH2P04, pH 2,8 e 100 mM de NaCI em frações de 1,5 ml e neutralizado adicionando 75 μΙ de 0,5 M de NaH2PO4, pH 8,6. Frações contendo proteína de pico foram identificadas através de absorbância a 280 nm, agrupadas, e submetidas à outra purificação em uma coluna de 1 ml de Proteína A. Antes de carregar, NaCI foi acrescentado a 600 mM e HEPES, pH 7,5 a 50 mm. A coluna foi lavada duas vezes com 600 μΙ de 10 mM pH de HEPES 7,5 e 1 M NaCI, e depois com 1 ml de PBS. Sp35-Fc foi eluído da coluna com 25 mM de NaH2PO4, pH 2,8 e 100 mM de NaCI, colhendo 0,5 ml de frações, e neu- tralizado adicionando 25 μΙ de 0,5 M de NaH2PO4, pH 8,6. Frações contendo proteína de pico foram identificadas através de absorbância a 280 nm e a- grupadas. Reduzindo SDS-PAGE, a proteína de Sp35-Fc migrou como uma banda simples (>95% pura) com uma massa evidente de 90 kDa. Sob con- dições não-redutoras, a proteína correu como um dímero com uma massa aproximada de 180 kDa. A proteína de Sp35-Fc purificada foi aliquotada e armazenada a -70°C.
EXEMPLO 3 Produção de Anticorpos Monoclonais Sp35-específicos
Anticorpos de Anti-Sp35 que especificamente ligam um polipep- tídeo de Sp35 da invenção foram feitos usando os métodos e procedimentos a seguir.
A. Ensaios de Triagem de Anticorpo
1. Ensaio de ELISA
Sp35-Fc (0,5 pg em 50 μΙ de 0,1 M de tampão de bicarbonato de sódio, pH 9,0) foi adicionado a cada poço das placas de 96 poços de Maxi- Sorp® (Nunc®). As placas foram depois incubadas a 37°C durante 1 hora ou 4°C durante 16 horas. Os sítios de ligação não-específicos nas placas foram bloqueados usando 25 mM de HEPES1 pH 7,4 contendo 0,1% de BSA, 0,1% de ovalbumina, 0,1% (5% (p/v) de leite seco sem gordura em 150 mM de NACE) e 0,001% de azida. Diluições de soro ou sobrenadantes de hibridoma (por exemplo, diluições de três vezes seriais) foram adicionados ao longo de cada fileira da placa, e incubadas a 25°C durante 1 hora. Após lavar três ve- zes com PBS, 50 μΙ de uma diluição de 1:10.000 de anticorpo secundário anticamundongo de cabra conjugado com peroxidase rábano silvestre (Jackson ImmunoResearch Inc.) foi adicionada a cada poço e incubada tam- bém durante 1 hora. Após três lavagens, a cor foi descrita por TMB (Pierce) e parada com 2 M de ácido sulfúrico. A intensidade da cor foi monitorada em um espectrofotômetro a 450 nm.
2. Ensaio de FACS
Células COS-7 ou células CHO foram marcadas com 0,1 μΜ de CellTracker® CMFDA Green (Molecular Probes, Eugene, OR) como descrito pelo vendedor. Volumes iguais de células de controle marcadas com Cell- Tracker® foram misturados com Sp35-células COS-7 ou Sp35-células CHO lavadas (produzidas por transfecção transitória de vetor de expressão de Sp35) antes da incubação com soros de teste de anti-Sp35 ou sobrenadan- tes de hibridoma. Cinqüenta microlitros da mistura de célula foram dispensa- dos em cada poço de umas placas de poliestireno de 96 poços de fundo V (Costar® 3877, Corning, NI) e 100 μΙ de soro de camundongo, sobrenadante de hibridoma, ou um anticorpo anti-Sp35 de controle foram adicionados. A- pós incubação a 4°C durante 30 minutos, as células foram lavadas e incuba- das com 50 μΙ do segundo anticorpo específico de Fc gama de IgG de anti- camundongo de cabra de fragmento F(ab'2) puro de afinidade conjugado com ficoeritrina (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove1 PA) em PBS. Ao término da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e suspensas em 200 μΙ de PBS contendo 1% de soro bovino fetal (FBS), e submetidas a análises de FACS. Alternadamente, as células Sp35- COS-7 ou células Sp35-CHO foram misturadas com soro de camundongo ou sobrenadante de hibridoma e depois tratadas com anticorpo secundário de anticamundongo de cabra conjugado com R-ficoeritrina e diretamente sub- metidas a análises de FACS padrões.
B. Produção de Hibridoma de Anticorpos de Anti-Sp35 Monoclonais Murinos Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmente com emulsão contendo 50 μg de Sp35-Fc (aminoácidos 34 a 532 da SEQ ID NO: 2 fundidos na região de dobradiça e de Fc de IgGI humano), produzida co- mo descrita no Exemplo 2 ou foram imunizados intraperitonealmente com uma emulsão contendo 50 pg de Sp35-Fc humano, e 50 μΙ do adjuvante de Freund completo (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez a cada duas semanas. Os soros dos camundongos imunizados foram colhidos an- tes da primeira imunização e 1 semana após as segunda e terceira imuniza- ções, e as titulações do anticorpo anti-Sp35 foram medidas através de en- saio de FACS em células COS-7 de expressão de Sp35 como descrito aci- ma. Uma dose final reforçada foi dada após a terceira imunização e três dias antes quando foram iniciadas as fusões de hibridoma.
Soros de camundongos imunizados com os vários peptídeos de Sp35 foram triados por ELISA como descritos acima. Camundongos que e- ram positivos para anticorpos que especificamente ligaram células CÓS-7 de expressão de Sp35 foram identificados através de citometria de fluxo (FACS) como descrito acima, e foram sacrificados. Esplenócitos foram isolados dos camundongos e fundidos ao mieloma de FL653 (um derivado de APRT de um mieloma de camundongo Balb/c de lg-/HGPRT, mantido em DMEM con- tendo 10% de FBS1 4500 mg/L de glicose, 4 mM de L-glutamina, e 20 mg/ml de 8-azaguanina) como descrito em Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett, R. H., McKeam1 T. J. e Bechtol1 Κ. B. Nova Iorque: Plenum Press (1982). As células fundidas foram banhadas em placas de 24 ou 48 poços (Corning Glass Works, Corning, NI), e alimentadas com adenina, aminopterina e timidina (AAT, disponível de Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) contendo meio de cultura. Culturas resistentes a AAT foram triadas por ELISA ou citometria de fluxo como des- crita acima para ligar às Sp35-células COS-7 ou Sp35-Fc. Hibridomas positi- vos foram também subclonados limitando a diluição.
Dezessete linhagens celulares de hibridoma que produzem anti- corpos monoclonais produzidos de camundongos imunizados com Sp35-Fc foram isoladas. As propriedades dos anticorpos monoclonais derivados de hibridoma são mostradas nas Tabelas 3A e 3B.
Polinucleotídeos que codificam os domínios variáveis (VH e VL) de anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3 e 3P1E11.3B7 foram iso- lados por PCR, cionados e submetidos a análise ue seqüência peio método a seguir. RNA total foi extraído das células de hibridoma usando kit de Qia- gen® RNeasy® Mini e cDNA foi gerado do RNA isolado através de RT PCR, usando condições padrões. Um coquetel de iniciadores foi usado para a RT- PCR. Um conjunto de iniciadores preferidos incluiu um iniciador com a 5' do iniciador hibridando com a seqüência sinal e a terminação 3' do iniciador hi- bridando com ao domínio constante 3' da junção de FR4/domínio constante. Isto permite a amplificação de um domínio variável intacto sem ambiguida- des a cerca do término N do anticorpo monoclonal e da junção de V/C. Al- guém versado na técnica reconhecerá que conjuntos de iniciador necessitam ser modificados para amplificar modelos diferentes e para condições de PCR diferentes. Ocasionalmente, a presença de mensagens não-produtivas alta- mente abundantes (por exemplo, a cadeia leve não-produtiva alterada na estrutura de CDR3-FR4 do par de fusão) ou mensagens produtivas não- específicas pode ser produzida e complicar a clonagem das cadeias variá- veis. Uma solução é usar dados de seqüência N-terminais do anticorpo puri- ficado autêntico para projetar um iniciador degenerado para permitir a clona- gem. Alternativamente, pode-se usar iniciadores de "estrutura universal", tais como aqueles descritos em Orlandi et al, PNAS 86:3833 (1989) que "fixam" os términos NeC dos domínios variáveis (isto é, o término N de FR1 e o término C de FR4 são determinado pelo iniciador).
Adicionalmente, dados de seqüência, para projetar iniciadores mais efetivos, podem ser obtidos dos produtos de RT-PCR de volume que foram purificados em gel e depois sequenciados. O produto de PCR pode ser também subclonado usando, por exemplo, o kit TOPO Cloning (Invitro- gen) depois seqüenciado. Dados de seqüência são depois obtidos de múlti- plos subclones independente ou fragmentos purificados em gel para firme- mente estabelecer a seqüência de consenso.
A seqüência da cadeia leve do P1E11.3B7 foi determinada u- sando um coquetel de iniciadores de seqüência sinal de cadeia leve capa murinos de 5': (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO: 356), (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ iD NO: 357), (iii) 5! GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G 3' (SEQ ID NO: 358), e (iv) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYT YCT KGG A 3' (SEQ ID NO: 359), com um iniciador de domínio constante capa murino de 3': 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3' (SEQ ID NO: 4), onde K=GZT1 R=A/G, W=A/T e Y=C/T. O produto de PCR resul- tante foi subclonado e múltiplos subclones independente foram sequencia- dos. A seqüência de consenso deduzida foi consistente com os dados de sequenciação de degradação de Edman. Sequenciação indicou que o inicia- dor 5' de seqüência sinal degenerada 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID NO: 357) foi o que tinha dado o domínio variável de cadeia leve de 3P1E11.3B7 durante a amplifica- ção.
A seqüência de cadeia pesada de 3P1E11.3B7 foi determinada usando um coquetel de iniciadores de PCR de seqüência sinal de cadeia pesada murina de 5': (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 3', (SEQ ID NO: 360) (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRA CTT CGG GYT GAG CTK GGT TTT 3' (SEQ ID NO: 361), e (iii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT 3' (SEQ ID NO: 362), com um iniciador de 3' de domínio constante de CH1 de IgG murino degenerado 5* AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 363), onde K=GZT1 M = A/C, R=A/G, e Y=CfT. PCR usando este coquetel de iniciadores, com uma variedade de condições de ciclagem diferentes, não rendeu uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada em que o término N deduzido foi consistente com o determinado por seqüência de degradação Edman do anticorpo de 3P1E11.3B7 purificado. Portanto, usamos iniciadores de cadeia pesada uni- versais: FR1 5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (SEQ ID NO: 364) e FR4 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3' (SEQ ID NO: 365), onde M = A/C, R=A/G, S=C/G, e W=A/T. Este conjunto rendeu um domínio variável de cadeia pesada murino cuja seqüência dedu- zida foi consistente com os dados empíricos de 3P1E11.3B7.
Para verificar que os términos N e C de domínio variável de ca- deia pesada eram autênticos e não determinados pelo iniciador, outra rea- ção de PCR foi executada com um iniciador de seqüência sinal degenerado 5' ATG GAR TGY AAY TGG ATH CTN CCN TTY A 3' (SEQ ID NO: 366) e o iniciador 3" de domínio constante acima mencionado 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 367), onde H=A/C/T, N=A/C/G/T, R=A/G, e Y=CfT. O projeto do iniciador de seqüência sinal degenerado foi com base nas seqüências sinais das melhores repeti- ções derivadas de uma pesquisa de TFASTA da base de dados de seqüên- cias de roedores de Genbank consultada com a seqüência de FR1 deduziu de consenso de 3P1E11.3B7 da reação de PCR com o "iniciador universal" descrito acima. Esta PCR deu um produto com um domínio variável de ca- deia pesada murina completa.
Os domínios variáveis murinos de 3P1E11.3B7 completos foram usados (com mutagênese silenciosa quando necessário para introduzir sítios de restrição) juntamente com cDNAs de IgGI humana e de domínio constan- te capa para construção de cDNAs quiméricos de cadeia pesada e leve, res- pectivamente. Os cDNAs de imunoglobulina de comprimento total foram subclonados em um vetor de expressão chamado pNEOOl, um derivado do vetor de expressão epissomal de células mamíferas de EBV comercial pCEP4. Os vetores de expressão de cadeia pesada e leve (chamados pXW372 e pXW363, respectivamente) foram co-transfeccionados em células 293-EBNA. Análise de western blot (sondada com reagentes específicos para IgG humana) de meio condicionado de células transientemente trans- feccionadas confirmou a expressão de 3P1E11.3B7-hulgG1 quimérico, mAb capa. As seqüências polipeptídeo Vh e Vl de 3P1E11.3B7 resultantes estão mostradas nas Tabelas 6 e 8 e são SEQ ID NOs: 173 e 209, respectivamen- te. As seqüências de cadeia pesada e leve para os anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, e 3P1 D10.2C3 foram determinadas através de métodos similares. C. Identificação de Anticorpos Monoclonais Anti-Sp35 através de Exibição de Faqo
Fragmentos Fab de anticorpo monoclonal de anti-Sp35 foram identificados e isolados de bibliotecas de exibição de fago como descritos em Hoet et ai, Nat. Biotech. 23:344-348 (2005); Rauchenberger, et ai, J. Biol. Chem. 278:194-205 (2003); e Knappik1 et aí., J. Mol. Bioi 296:57-86 (2000) todas estas são incorporadas aqui por referência em suas totalida- des.
A biblioteca de exibição de Fab-fago de MorphoSys HuCAL® GOLD ("Biblioteca de Exibição de Fago 2" na Tabela 3B) compreendendo regiões variáveis de anticorpo sintético humanizado foi triado contra proteína de Sp35-Fc solúvel humana recombinante por métodos de triagem padrões de ELISA E IHC. Vide, por exemplo, Ostendorp, R., Frisch, C. e Urban M, "Generation, engineering and production of human antibodies using Hu- CAL®". Antibodies, Volume 2 Novel Technologies and Therapeutic Use. No- va Iorque: Kluwer Academic/Plenum 13-52 (2004). Fagos de Fab que espe- cificamente ligaram a Sp35 foram purificados e caracterizados. Propriedades destes fragmentos Fab de anticorpo monoclonal derivado de exibição de fato são mostradas na Tabela 3B como "Fragmentos Fab monoclonais derivados da biblioteca exibição de fago 2". Fab-fago isolado 1968 foi selecionado para outra análise. EXEMPLO 4
Imunoprecipitação de Sp35 por Anti - Anticorpos Monoclonais de Sp35
Para executar a imunoprecipitação, células COS-1 que expres- sam Sp35, fundidas em um marcador de hemaglutinina (HA) no término N, foram produzidas transientemente transfeccionando células COS-1 com uma construção de DNA que expressa a proteína de Sp35 de comprimento total com um marcador de HA. As células foram colhidas 48 h após transfecção e lisadas em 1 ml de tampão de Iise (50 mM de HEPES, pH 7,5, 150 mM de NaCI, 1,5 mM de MgCI2, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100 e 10% de gli- cerol) por 30 min a 4°C. Após centrifugação a 14.000xg por 15 min, os so- brenadantes foram incubados com esferas de Proteína A/G-Sefarose (Santa Cruz) a 4°C por 1 h, e depois incubadas a 4°C durante 1 h com os anticor- pos anti-Sp35 monoclonais murinos 1A7 ou 2F3. As esferas foram lavadas 3 vezes com tampão de lise, fervidas em tampão de amostra de Laemmli, sub- metidas a 4-20% de SDS-PAGE, e analisadas por western blot usando um anticorpo que reconhece o marcador de HA. Como mostrado no gel de SDS- PAGE, anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3, humano de immunoprecipitated e Sp35 murino (Figura 1). Como mostrado em Figura 1, anticorpo 2F3 mono- clonal fortemente imunoprecipitaram Sp35 humano e murino, enquanto o anticorpo monoclonal 1A7 que fortemente imunoprecipitou Sp35 humano, apenas fracamente reconheceu a proteína de Sp35 murina. Similarmente, anticorpos monoclonais 1G7, 2B10, 2F3, 3P4C2.2D2, 3P4C8.2G9, Li01, Li03, Li05, Li06, Li07, Li08, Li11, Li12, 7P1D5.1G9 e 3B5.2 imunoprecipita- ram Sp35 humano ou de camundongo ou humano e de camundongo (Vide Tabela 3B e 3C). Adicionalmente, Li08 imunoprecipita AP-Sp35 e anticorpos monoclonais 1B6.4 e 3E3.1 imunoprecipita Sp35 endógeno (Vide Tabela 3B).
EXEMPLO 5
Anticorpo Anti-Sp35 que Especificamente Liga a Sp35 determinado por ELI- SA A fim de determinar quais regiões do polipeptídeo de Sp35 foram ligadas pelos vários anticorpos monoclonais derivados de exibição de hibri- doma e de fago produzidos no Exemplo 2, um ensaio de ELISA foi executa- do usando um painel de polipeptídeos de Sp35 truncado, cada fundido nas regiões de dobradiça e de Fc de IgGI pelos métodos descritos no Exemplo 1. O painel consistiu nos fragmentos de Sp35 a seguir: aminoácidos 34-425 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-532 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417- 493 da SEQ ID NO: 2, e aminoácidos 34-532 da SEQ ID NO: 2. Ovalbumina e BSA foram usados como controles. Como mostrado na Tabela 3B, mAbs derivados de hibridoma 2F3, 2B10, 3A3, 3P4c2,2d2, e 3P4c8,2g9, e mAbs derivados de Fab-fago 3383, 3563, 3564, 3565, 3568, 3569, 3570, e 3582 todos especificamente ligaram aos fragmentos de Sp351-417 e 1-534, suge- rindo que estes anticorpos ligam a epitopos na região de LRR de Sp35. Mabs derivados de hibridoma 1A7, 3P1B11F9, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C63G10.2H7, 2P2C9.2G4, 3P4A61D9, e 394C51D8, e Mabs derivados de Fab-fago 3495, 3566, 3567, e 1968 especificamente ligaram ao fragmen- to de Sp35 34-532 e fracamente ligaram ao Sp35417-532, sugerindo que estes anticorpos provavelmente ligam a epitopos que pelo menos incluem uma porção de Sp35 C-terminal na região de LRR. Em experimentos simila- res, estes anticorpos posteriores também especificamente ligaram um poli- peptídeo de Sp35 que consiste em aminoácidos 34-534 de Sp35 humano e afinidade baixa a Sp35 de camundongo e rato. A afinidade destes anticorpos posteriores para Sp35 de camundongo e rato foi restabelecida para o nível visto usando Sp35 humano quando o aminoácido 419 do Sp35 de camun- dongo ou rato é alterado de histidina (H) para arginina (R). Arginina é o ami- noácido na posição 419 em Sp35 humano. A K0 para anticorpo monoclonal 1A7 foi determinada ser 10 nM (1 χ 10"9M) para ligar Sp35 humano e 20 μΜ (2 χ 10"5 Μ) para ligar Sp35 murino. Para ELISA de Ap-Sp35 detectar os an- ticorpos ligados à região 417 a 532, ELISA foi executada como segue: Os Mabs foram revestidos sobre placas de ELISA, depois incubados com uma proteína fusão de Sp35-AP a 4°C durante a noite seguido por anti-humano ligado a AP (H+L) (1:5.000, Jackson ImmunoResearch) em TA por 1 h, ou com proteínas de fusão de AP a 4°C durante a noite. Substrato de AP foi depois desenvolvido por 10 mg/ml de 4NPP em 0,1 M de Glicina, 1 mM de MgCI2, 1 mM de ZnCI2, pH 10,5, e lido em O.D. 405.
Em experimentos similares, os anticorpos monoclonais 3B5.2 e 7P1D5.1G9, como também o fragmento Fab do anticorpo 7P1D5.1G9 foram testados em ensaios de ELISA para sua habilidade de ligar Sp35 humano, a região de LRR inteira de Sp35, a região de Ig de Sp35 e Sp35 murino. Como mostrado na Tabela 3C, fragmento Fab 3B5.2, 7P1D5.1G9 e o 7P1D5.1G9 ligado a Sp35 humano e murino. Os anticorpos monoclonais 3B5.2 e 7P1 D5.1G9 também ligaram à região LRR de Sp35. Vide Tabela 3C.
Em um ensaio de ligação de Sp35 com 3B5.5 monoclonal fixado ao fundo de um poço de cultura de tecido, os anticorpos a seguir não blo- quearam a ligação de 3B5.2 de Sp35: Li03, Li05, Li08, Li011 e o fragmento Fab de LiO13.
EXEMPLO 6
Anticorpo anti-Sp35 que Especificamente Liga a Sp35 Determinado por FACS
Para também caracterizar as propriedades de ligação dos mAbs anti-Sp35 derivado de hibridoma 1A7 e 2F3 produzidos como descrito no Exemplo 3, ligação de ambas células COS-7 ou 293 fixadas e vivas expres- sando Sp35 de camundongo ou humano foi comparada. Células de Sp35 transfeccionadas e não-transfeccionadas foram fixas e submetidas à análise de FACS (FACS: Células transfeccionadas foram dissociadas com Sp35 humano ou de camundongo ou controle de vetor das placas de cultura, Iava- das com 2% de FBS/PBS, e incubadas com anticorpo primário a 1 pg/ml em gelo por 1 h. As células foram lavadas 3 vezes com 2% de FBS/PBS, depois incubadas com anticorpo secundário marcado com PE (1:100, Jacksonlm- munoResearch) em gelo por 30 min. Após 2 lavagens com 2% de FBS/PBS, as células foram fixadas em 2% de PFA e submetidas á análise de FACS por PE). Resultado de FACS mostrou que MAbs 1A7 e 2F3 ligaram às célu- las COS-7 ou 293 expressando Sp35, mas não ligaram às células de contro- le sem expressão de Sp35 (Fig 2). Em experimentos similares, células CHO estavelmente transfec- cionadas com Sp35 foram usadas em análise de FACS para também carac- terizar as propriedades de ligação de 3B5.2 e 7P1D5.1G9. Como mostrado na FIGURA 11, 3B5.2 e 7P1D5.1G9 ligaram a Sp35 em células CHO trans- feccionadas. Especificamente, os anticorpos 3B5.2 e 7P1D5.1G9 foram tes- tados quanto à sua habilidade para ligar células CHO transfeccionadas, e expressar, Sp35 humano ou murino. Como mostrado na FIGURA 11, o nú- mero de células os anticorpos 3B5.2 e 7P1D5.1G9 ligaram, como medido pela fluorescência média (MCF), aumentou com a concentração de anticorpo usado. Adicionalmente, o anticorpo 3B5.2 ligou mais células quando medido pela fluorescência média (MCF) que 7P1D5.1G9.
EXEMPLO 7
Ensaio de Desenvolvimento de Neurite
Para testar a habilidade dos anticorpos monoclonais derivados de hibridoma e derivados de Fab-fago produzidos para inverter o efeito inibi- dor dos inibidores de mielina do SNC acima, por exemplo, OMgp, em neurô- nios, lâminas de cultura Lab-Tek® (4 poços) foram revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Ap-OMgp (1 pg/borrão) ou PBS foi manchado co- mo gotas de 3 μΙ. Lâminas de Lab-Tek® foram depois enxaguadas e revesti- das com 10 pg/ml de Iaminina (Gibco™). Gânglios de raiz dorsais (DRG's) de filhotes de rato Sprague Dawley de P6-7 foram dissociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington), triturados com pipetas Pasteur polidas com fogo pré-banhadas para enriquecer em células neuronais e finalmente banhadas a 10.000 células/poço nas lâminas de cultura de Lab-Tek® pré- revestidas. Dez pg/ml de mAbs 1A7 ou 2F3 foram adicionados imediatamen- te após colocação em placa dos DRGs. O meio de cultura era F12 (disponí- vel de Gibco/lnvitrogen) contendo 5% de soro de cavalo doador inativado a calor, 5% de soro bovino fetal inativado a calor e 50 ng/ml de fator de desen- volvimento nervoso de camundongo (mNGF) e incubado a 37°C e 5% de CO2 durante 6 horas. Seguindo incubação, as lâminas foram fixadas em 4% de paraformaldeído/20% de sucrose e tingidas com anticorpo de TUJ1 anti- βΙΙΙ-tubulina (Covance) após 16 horas. Como anticorpo secundário Alexa-Fluor® 594 de anticamundon- go (Molecular Probes) diluído 1:300 foi acrescentado às lâminas e incubado durante 2 horas em temperatura ambiente. As lâminas foram cobertas com lâminas com Gel/Mount® (Biomeda®). 5x imagens digitais foram adquiridas com software OpenLab® (Improvision, Inc., Lexington1 MA), e as imagens foram analisadas para quantificação de desenvolvimento de neurite usando o software OPENLAB®, tudo de acordo com os parâmetros especificados pelo fabricante.
Ambos os MAbs 1A7 e 2F3 protegeram os neurônios de DRG da inibição mediada por OMgp do desenvolvimento de neurite. (Figura 3). 3B5.2 também protegeu os neurônios de DRG da inibição mediada por OMgp do desenvolvimento de neurite (dados não mostrados). EXEMPLO 8
Anticorpo monoclonal 1A7 promove restabelecimento funcional no modelo de lesão da espinha dorsal de rato
Lesão de espinha dorsal ("SCI") foi induzida através de sobre- hemisseção dorsal como segue, modificada dos métodos previamente des- critos (Li, S., et al. J. Neurosci. 24, 10511-10520 (2004)). Ratas Long Evans anestesiadas (7 semanas de idade, Charles River) foram dadas analgesia pré-operativa (Buprenorphine/Buprenex, 0,05 mg/kg s.c.) e tranqüilizadas (Midazolam, 2,5 mg/kg i.p.) e uma hemi-seção dorsal foi executada na vérte- bra torácica 6/7 completamente interrompendo o trato corticoespinhal dor- somedial e dorsolateral principal (CST). Os componentes dorsais e dorsola- terais do trato corticoespinhal (CST) foram completamente interrompidos e a porção ventral do CST deixada intacta. A ponte de tecido ventral que perma- nece após a hemisseção constituía cerca de 20% do cordão em ambos os grupos de tratamento (dados não mostrados).
Função de membro posterior foi quantificada usando o método de classificação de campo aberto de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Eby, Μ. T. et al., J. Biol. Chem. 275, 15336-15342 (2000), incorporado aqui por referência) e todos os animais sustentaram déficits funcionais notáveis após SCI, com paralisia de membro posterior quase completa no dia após cirurgia. Imediatamente após transecção de CST1 um cateter intratecal foi inserido no espaço subaraquinoide em T7 e conectado a uma bomba miniosmótica pre- parada (Alzet modelo 2004, Alza Corp) inserida no espaço subcutâneo. Bombas miniosmóticas liberaram proteína de controle de isótipo de IgG hu- mana (5 mg/ml) ou anticorpo monoclonal 1A7 (4,8 mg/ml), continuamente a uma taxa de 0,25 μΙ/h em 5 semanas. Animais de controle (tratados com IgG Humana) restabeleceram a função substancial na duração de 5 semanas do experimento, mas com platôs em 3-4 semanas, por fim atingindo uma classi- ficação de BBB média de 9 ± 0,45 (Figura 7). Em contraste, infusão intrate- cal contínua de 1A7 durante 5 semanas após transecção da espinha dorsal resultou em contagens de BBB significativamente melhoradas nos animais de controle por 5 semanas com uma melhoria continuada na função no pra- zo de 2-5 semanas, alcançando uma classificação de BBB média de 11,1 ± 0,7 (Figura 4). Estes resultados demonstram que o tratamento com anticorpo anti-Sp35 monoclonal 1A7 promoveu restabelecimento da função após a lesão da espinha dorsal como demonstrado por um aumento na classifica- ção de BBB, regeneração de axônios e menos retração axonal observada por manchamento imunoistoquímico dos axônios. Anticorpo 3B5.2 também promoveu restabelecimento após lesão da espinha dorsal (dados não mos- trados).
EXEMPLO 9
Anticorpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3. 3P1E11.3B7. 6P4F4.1D3. 6P4F4.1 F9. 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Li13. Li28, Li33, D05, D08 e 3B5.2 promovem mielinação in vitro
O papel dos anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 foram investigados em mielinação in vitro tratando coculturas de neurônios e oligodendrócitos dos gânglios da raiz dorsal (DRG) com anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 e testando quanto à mielinação por imunoistoquímica e western blot. Para es- tes estudos, foi necessário primeiro gerar culturas primárias de neurônios e de oligodendrócitos de DRG.
Gânglios da raiz dorsal embrionários de ratas Long Evans ΕΜ- ΕΙ 7 foram cultivados como descrito por Plant et ai, J. Neurosci. 22:6083-91 (2002). DRGs dissecados foram colocados em placas em lâminas de cober- tura revestidas com poli-L-lisina (100 pg/ml) durante 2 semanas. As células foram incubadas na presença de fluorodeoxiuridina por 2-6 dias e em meio de NLA contendo 1 χ B27, 100 ng/ml de NGF (Gibco) por 8-11 dias.
Oligodendrócitos de ratas Long Evans 2 dias pós-natal (P2) fo- ram cultivados como descritos por Conn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (Academic Press; 1990) com modificações como segue. Brevemente, o cérebro anterior foi extirpado de ratos P2 e colocado em meio de HBSS frio (Gibco). Os fragmentos de tecido foram cortados em pedaços de 1 mm e incubados a 37°C durante 15 min em 0,01% de tripsina e 10 pg/ml de DNase. Células dissociadas foram colocadas em placas em uns frascos de cultura de tecido de T75 revestidos com poli-L-lisina e crescidas em DMEM com 20% de soro bovino fetal a 37°C durante 10 dias. Oligodendrócitos A2B5-positivos foram colhidos agitando os frascos durante a noite a 200 rpm a 37°C. Os oligoden- drócitos de A2B5 foram cultivados durante 7 dias em DMEM (Gibco) conten- do 25 mM de D-glicose, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 50 pg/ml de apo-transferrina humana, 5 pg/ml de insulina pancreática bovina, 30 nM de selenato de sódio, 10 nM de hidrocortisona, 10 nM de D-biotina, 1 mg/ml de BSA1 10 ng/ml de FGF e PDGF (Peprotech). As células foram de- pois colhidas através de tripsinização. As células foram depois cocultivadas com os neurônios de DRG na presença ou ausência de 1, 3, 10, ou 30 pg/ml de anticorpos monoclonais anti-Sp35 1A7 ou 2F3, ou um anticorpo de con- trole negativo em meio de NLA contendo 2% de soro bovino fetal, 50 Mg/ml de ácido ascórbico, 100 ng/ml de NGF (Gibco). Uma dose de anticorpo efeti- va para administrar em um tal ensaio foi determinada ser na faixa de 0,1 pg/ml a 10 pg/ml, dependendo do anticorpo. Alguém versado na técnica po- deria determinar uma dose efetiva usando ensaios descritos aqui.
O meio de cultura foi alterado e os vários anticorpos monoclo- nais foram renovados a cada três dias. Após 30 dias a 37°C, as células co- cultivadas foram tingidas por manchamento imunoistoquímico ("IHC") para neurofilamentos com anticorpo anti-pill-tubulina para identificar os axônios, ou anticorpo anti-MBP para identificar os oligodendrócitos (Figura 4A-E). Cé- lulas cocultivadas foram também Iisadas e submetidas à análise de western blot para quantificar a MBP (Figura 4G). Com base em análises de IHC e western blot, as células cocultivadas tratadas com anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 mostraram sobrevivência aumentada de oligodendrócitos e neurônios, números aumentados de axônios empacotados e números aumentados de células positivas de MBP (Figura 4F, 10 vezes mais células MBP-positivas quando comparadas às coculturas tratadas com controle-anticorpo).
Em um experimento similar, coculturas de oligodendrócito e de DRG foram incubadas na presença ou ausência de anticorpos anti-Sp35 Li05 e Li06, ou um anticorpo de controle negativo. Células cocultivadas fo- ram Iisadas e submetidas à análise de western blot para quantificar a MBP (Figura 8). Com base nas análises de western blot, as células cocultivadas tratadas com anticorpos anti-Sp35 Li05 e Li06 mostraram números aumen- tados de células MBP-positivas, similares às células cocultivadas tratadas com 3, 10 e 30 pg de Sp35-Fc (LINGO-1-Fc).
Em experimentos similares coculturas de oligodendrócito e de DRG foram incubadas na presença ou ausência de anticorpos anti-Sp35 3B5.2, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li08, Li13, Li28, e Li33 e também promoveram mielinação. Similarmente, anticorpos de comprimento total D05 e D08 também promoveram mielina- ção. A dose efetiva mais baixa do anticorpo 3B5.2 e 7P1D5.1G9 necessária para promover mielinação no experimento de cocultura de DRG foi 0,1 Mg/ml.
Adicionalmente, o fragmento Fab 7P1D5.1G9 foi testado em um ensaio de mielinação in vitro similar. O fragmento Fab 7P1D5.1G9 promoveu mielinação a uma concentração de 1,0 pg/ml.
Estes resultados indicaram que tratamento de coculturas de DRG-oligodendrócito com anticorpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Li13, Li28, Li33, D05, D08 e 3B5.2 promoveu interações de axônio de oligoden- drócito maduras e mielinação comparadas às coculturas tratadas com anti- corpo de controle. EXEMPLO 10
Anticorpos anti-Sp35 e fragmentos Fab promovem sobrevivência de oliqo- dendrócitos e mielinação in vivo
Camundongos machos adultos C57BI/6 do tipo selvagem foram alimentados com cuprizona (0,2% moída com ração de camundongo moída por peso) durante 6 semanas para induzir desmielinação dentro do corpo caloso de acordo com o método descrito por Morell P et ai, Mol Cell Neu- rose!. 12:220-7 (1998). Brevemente, anticorpo anti-Sp35 monoclonal 1A7 foi estereotaticamente injetado no corpo caloso desmielinizante em semanas 2, 2,5 e 3 semanas de alimentação de cuprizona, pelo método descrito abaixo. Camundongos de controle foram estereotaticamente injetados aos mesmos intervalos com meios esterilizados contendo anticorpo de controle. Após as 6 semanas de alimentação de cuprizona terem completado, os camundongos foram retornados a uma dieta normal por 2, 4 e 6 semanas (ração de ca- mundongo moída apenas) para permitir remielinação.
Os anticorpos monoclonais 1A7 e de controle foram liberados como segue. Os camundongos tratados com cuprizona foram anestesiados com cetamina (80 mg/kg do peso do corpo) e xilazina (10 mg/kg do peso do corpo) e posicionados em um aparelho de imobilização projetado para cirur- gia estereotática (David Kopf Instruments). O couro cabeludo foi aberto e os compostos estéreis injetados (1 μΜ em 1 ml de HBSS) unilateralmente no corpo caloso intensamente desmielinado dos camundongos recipientes do tipo selvagem com uma seringa Hamilton de 10 μΙ usando coordenadas es- tereotáticas de 0,7 mm posterior e 0,3 mm lateral para bregma a uma pro- fundidade de 1,7 mm (Messier et al., Pharmacoi Biochem. Behav. 63: 313- 18 (1999)). Camundongos recipientes de controle adicionais foram estereo- taticamente injetados com HBSS não contendo nenhum composto. A abertu- ra no crânio foi enchida com Gelfoam, e a área foi pincelada com penícilina e estreptomicina (Gibco) e a ferida foi suturada. Os camundongos foram sacri- ficados a cada semana do experimento após injeção e seu cérebro removido e processado para análise molecular, bioquímica e histológica.
Os animais que recebem o tratamento de anticorpo anti-Sp35 1Α7 mostraram sobrevivência aumentada de oligodendrócitos maduros (com base em manchamento de anticorpo CC1, Figura 5A) e mielinação de axônio por IHC usando anticorpo de proteína anti-MBP ou Iuxol fast blue (Figura 5B). Oligodendrócitos de anticorpo CC1-positivo foram quantificados em quatro semanas e 6 semanas (Figura 5C). Estes resultados indicaram que o tratamento com anticorpo anti-Sp35 1A7 promoveu sobrevivência de oligo- dendrócitos maduros e mielinação de axônios comparados aos camundon- gos tratados com anticorpo de controle. Similarmente, animais recebendo o anticorpo 1A7 ou 1 pg/ml de fragmento Fab de 7P1D5.1G9 em um modelo de Iisolecitina de desmielinação também promoveram mielinação de axônio comparados aos animais de controle. EXEMPLO 11
Anticorpo anti-Sp35 1A7 promove sobrevivência das células do gânglio reti- niano (RGC) no modelo de transecção do nervo ótico
Anticorpo anti-Sp35 1A7 foi testado em um modelo de transec- ção de nervo ótico investigando os fatores que afetam a função neuronal. Ratas Sprague Dawley adultas jovens (SD) foram usadas neste estudo. O nervo ótico direito de cada animal foi transeccionado intraorbitalmente 1,5 mm do disco ótico. Um pedaço de Gelfoam intumescido com 6% de Fluoro- Gold (FG) foi aplicado ao sítio recentemente transeccionado logo atrás do disco ótico para marcação das células sobreviventes do gânglio retiniano (RGCs). Os animais foram divididos em três grupos (n=6 em cada grupo) que recebeu ou anticorpo anti-Sp35 1A7, anticorpo de controle, ou só PBS, através de injeção intravítrea. O volume de cada injeção intravítrea foi 4 μl enquanto a dosagem de cada injeção foi 2 pg. As injeções intravítrea foram executadas imediatamente após a transecção do nervo ótico.
Todos os animais foram deixados sobreviver durante 1 semana. Dois dias antes de sacrificar os animais, o nervo ótico esquerda de cada a- nimal foi transeccionado e 6% de FG foram administrados como descrito a- cima para marcar RGCs sobreviventes, para servir como o controle interno. Os animais foram sacrificados com uma sobredose de Nembutal e as retinas dissecadas em 4% de paraformaldeído. Quatro cortes radiais foram feitos para dividir as retinas em quatro quadrantes (superior, inferior, nasal e tem- poral). As retinas foram depois pós-fixadas no mesmo fixador durante 1 hora antes de elas serem montados planas com o meio de montagem (Dako). As lâminas foram examinadas sob um microscópio de fluorescência usando um filtro ultravioleta (comprimento de onda de excitação = 330-380 nm). RGCs marcados foram contados ao longo da linha mediana de cada quadrantes a partir do disco ótico para a borda periférica da retina em intervalos de 500 μm, sob uma grade de lentes de 200 X 200 μηι2. A porcentagem de RGCs sobreviventes resultante de cada tratamento foi expressada comparando o número de RGCs sobreviventes nos olhos feridos com seus olhos contrala- terais. Todos os dados foram expressados como média ± SEM. Significação estatística foi avaliada através de ANOVA unidirecional, seguido por um tes- te Tukey-Kramer pós hoc. Diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05. Os animais tratados com anticorpo anti-Sp35 1A7 mostraram so- brevivência mais neuronal (80%) quando comparados aos animais tratados com anticorpo de controle ou com PBS, cada apenas mostrou aproximada- mente 50% de sobrevivência neuronal (Fig 6).
EXEMPLO 12
Testando anticorpos anti-Sp35 para remielinação no modelo de esmaqa- mento do nervo ótico
O nervo ótico direito recebe esmagamento completo através de fórceps #5 durante 10 segundos por volta de 1,5 mm atrás do globo ocular intraorbitalmente logo antes da administração de 2 μΙ de anticorpo monoclo- nal 1A7, 2F3, Li05 e Li06 em 2 ml por injeção intravítrea.
Os animais recebem uma segunda injeção intravítrea do mesmo tratamento uma semana após a cirurgia. Duas semanas após a cirurgia, os animais são perfundidos com fixadores EM, pós-fixados e processados para seções de semiestreita e ultraestreita. As seções longitudinais do nervo ótico são tingidas e preparadas para observação de mielina. A mielinação das partes proximais e distais do nervo ótico esmagados é comparada entre gru- pos de tratamento diferentes. Animais tratados com Sp35-Fc e 1A7, 2F3, Li05 e Li06, como também controles apropriados, serão analisados para re- mielinação na parte distai do nervo ótico comparado aos controles. EXEMPLO 13
Testando anticorpos anti-Sp35 para regeneração de axônio no modelo de esmagamento do nervo ótico
O nervo ótico direito foi esmagado por fórceps #5 durante 10 segundos por volta de 1,5-2 mm atrás do globo ocular intraorbitalmente logo antes da administração de 2 pg de anticorpo monoclonal 1A7 em PBS por meio de injeção intravítrea. 4 ratos foram testados com o anticorpo 1A7 e 8 ratos foram usados como animais de controle. Os animais receberam uma segunda injeção intravítrea do mesmo tratamento uma semana após a cirur- gia. Três dias antes do sacrifício dos animais de teste (dia 11 do experimen- to), 2 ml de CTB-FITC foram injetados intravitreamente para marcação, ante- rograde, dos axônios dos nervos óticos regenerativos. No 14° dia pós cirur- gia, os animais foram perfundidos e pós-fixados. O nervo ótico esmagado foi processado para seções longitudinais congeladas. Os axônios marcados com CTB-FITC, que cruzam o sítio de lesão foram contados como fibras re- generativas em várias distâncias além do sítio de esmagamento. Quando 1A7 foi injetado no olho, regeneração dos axônios foi observada até 250 pm além do sítio de esmagamento. Vide Figura 10. EXEMPLO 14
Anticorpos anti-Sp35 promovem remielinação e reparo no nervo ótico usan- do o modelo de rato EAE induzido por MOG.
Para estes experimentos, o modelo Experimental Autoimune de Encefalomielite (EAE) induzida por Glicoproteína de Oligodendrócito de Mie- lina (MOG) de rato foi usado. Este é o modelo animal para esclerose múltiplo humana. 50 μl de 200 ng de adjuvante de Freund completo (Chondrex Inc.) mais 50 μl de 50 μg de MOG em solução salina foram emulsificados (1:1) e mantidos em gelo antes de ser injetado intradermicamente na base da cauda para cada animal. Ratas norueguesas marrons de 8-10 semanas de idade foram usadas para todos os experimentos. Observação geral na técnica in- dica que o modelo de EAE é induzido por volta de 15 dias após injeção de MOG. Ratos são classificados para sinais clínicos de EAE. Os sinais são registrados como segue: grau 0,5, paresia distai da cauda; grau 1, paralisia completa da cauda,; grau 1,5, paresia da cauda e paresia da perna traseira moderadas; grau 2,0, paresia severa unilateral da perna traseira; grau 2,5, paresia severa bilateral do membro traseiro; grau 3,0, paralisia completa bi- lateral do membro traseiro; grau 3,5, paralisia completa bilateral do membro traseiro e paresia de um membro frontal; paralisia de grau total (tetraplegia), estado moribundo, ou morte. Os animais recebem tratamento uma vez o modelo de EAE é induzido.
2 pg/μΙ de um anticorpo anti-Sp35 (1A7) foram injetados intravi- treamente no dia 15 sob indução de MOG-EAE. 2 pg/pl do anticorpo anti- Sp35, 1A7, tempos adicionais foram dois injetados no dia 22 e dia 28. Sob terminação do experimento, os animais foram perfundidos com 4% de PFA. Os nervos óticos foram pós fixados em 1% de OsO4, desidratados e embe- bidos em Epon. Seções semiestreitas (1 μΜ) foram cortadas e tingidas com Toluidina azul para avaliação da mielinação. Os nervos óticos dos animais tratados foram comparados aos animais sem tratar para regeneração de a- xônio e remieiinação no nervo ótico. Todos os procedimentos foram execu- tados seguindo um protocolo aprovado por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Animais recebendo tratamento com o anticorpo anti-Sp35 1A7 mostraram remieiinação e reparo do nervo ótico quando comparado aos nervos óticos normais ou animais que foram submetidos à EAE induzida por MOG, mas não receberam nenhum tratamento (Figura 9). Na Figura 9C, as setas apontam para axônios mielinados. Animais recebendo um anticorpo que reconhece o domínio Ill da Proteína G de Streptococcus (M0PC21), não específico para Sp35, não mostraram nenhum sinal de remieiinação ou repa- ro do nervo ótico quando comparados aos nervos óticos normais ou aos ner- vos óticos de animais sem tratar (dados não mostrados). O anticorpo de an- tagonista de Sp35 1A7 promoveu remieiinação e reparo dos nervos óticos em um modelo de rato de EAE induzida por MOG de neurite ótica (Figura 9).
EXEMPLO 15
Testando anticorpos anti-Sp35 para promoção de remieiinação do SNC u- sando modelo de camundonqo de EAE induzida por MOG
EAE é induzida na cepa mista 129B6 dos camundongos através de imunização intradérmica (dia 0) com 100 pg de proteína de MOG1-125 emulsificada com o adjuvante de Freund completo (CFA). O volume injetado é 100 μl por camundongo e é distribuído em 3 sítios (orelhas, costas e pele). A emulsão é preparada em base de uma razão de volume 1:1 e contém 1 mg/ml de MOG1-125 e 2 mg/ml de M. tuberculosis (cepa H37Ra, Chondrex). Toxina de coqueluche (200 ng/camundongo) é administrada intraperitoneal- mente na hora da imunização e 2 dias após. Peso do corpo e classificações clínicas de EAE (0 = nenhum sinal clínico; 1 = cauda flácida; 2 = fraqueza do membro traseiro, reflexo de endireitamento prejudicado ou andadura ginga- da; 3 = paralisia completa do membro traseiro ou reflexo de endireitamento ausente; 4 = paralisia completa do membro traseiro com algum grau de en- volvimento do membro dianteiro; 5 = animal completamente paralisado; 6 = moribundo ou morto) são registradas diariamente. Todos os procedimentos são executados seguindo um protocolo, aprovado por nosso Institutional A- nirnai Care and Lise Committee (ÍACUC). Os animais recebem o tratamento com anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, Li05 e Li06 ou anticorpo de controle no dia 0 do estudo. As amostras de sangue são tiradas várias vezes ao Ion- go dos experimentos através de técnica de hemorragia retro-orbital. Plasma é separado de PBMC por centrifugação e fenotipagem celular executada por manchamento de FACS. Perfilação da resposta de anticorpo anti-MOG hu- moral é executada por ELISA usando mAbs subclasse/isótipo-específicos (Pharmingen). Ao término de cada experimento, cérebro, espinha dorsal, nervos óticos e nervos ciáticos são colhidos seguindo perfusão.
Este mesmo protocolo é usado para induzir a EAE em camun- dongos knockout em Sp35 e filhotes. Camundongos knockout em Sp35 tipi- camente mostram classificações de EAE mais baixas (1,5), e nenhuma reca- ída comparada aos controles (em um período de 45 dias), depois filhotes do tipo selvagem (classificação de EAE 3,5).
Animais tratados com Sp35-Fc e 1A7, 2F3 serão analisados pa- ra remielinação comparando ao controle. A proteína MOG 1.125 marcada com His foi expressada em Pichia pastoris usando um promotor de TetO-AOXI induzível por doxiciclina (M. Levesque, D. Krushinskie e K. Strauch, manuscrito em preparação). A se- qüência de codificação extracelular (Gly1 até Gly125 da proteína madura após remoção de seqüência sinal) de rato foi amplificada por PCR de MOG usando os iniciadores a seguir:
5'GGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGCATCATCATCATCATCATATGGGACAGTTCAGAGTGATAGGG 3 1 (SEQ ID NO: 368), e
51TTCGCGGCCGCTATTAGCCAGGGTTGATCCAGTAGAAGGG 3' {SEQ ID NO: 369).
EXEMPLO 16
Construção de Variante de 3B5.2
O seguinte é a seqüência de aminoácido para a cadeia leve va- riável (Vl) do anticorpo de 3B5.2, CDRs estão sublinhadas e o sítio de glico- silação N-Iigado está em negrito e sublinhado duplo: QIVLTQSPAI MSASP- GEKVT MTCSASSRVS YVHWYQQKSG TSPKRWLYDT SNLASGVPAR FGGNGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW STNPPTFGGG TKLEIK (SEQ !D NO: 417). Para determinar se expressão do anticorpo de 3B5.2 e/ou ligação do anticorpo a Sp35 foi afetada pela remoção do sítio de glicosi- lação, uma variante de 3B5.2 foi construída. Especificamente, posições de Kabat 63-68 foram mutadas em FR3 para a seqüência de cadeia leve capa humana e murina de consenso SGSGSG (SEQ ID NO: 418). A cadeia leve da variável de B5.2 mutante resultante é como segue, os aminoácidos muta- dos estão em negrito e sublinhado duplo: QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASS RVS YVHWYQQKSG TSPKRWLYDT SNLASGVPAR F§G§GSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW STNPPTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 419).
A habilidade do anticorpo de 3B5.2 e do anticorpo de 3B5.2 vari- ante para ligar à proteína de Sp35 é a mesma quando testada. Adicional- mente, com base nos dados de mobilidade eletroforética, parece que a ca- deia leve variável de 3B5.2 é glicosilada, enquanto a cadeia leve variante não. Por fim, os níveis de expressão de ambos os anticorpos nas células transfeccionadas foram os mesmos. EXEMPLO 17
Construção de anticorpo 1A7 humanizado SEQÜÊNCIAS DE CADEIAS LEVE E PESADA DE 1A7
Cadeia leve:
1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSAS SSV SYMHWYQQKS GTSPKRWIYD 50 51 TSKIASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ WSSNPFTFGS 100 101 GTKLEIK (SEQ ID NO: 283) Cadeia pesada:
1 QVQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW 50 51 INTDTGEPTYT EDFQGRFAFS LETSASTVYL QFNNLKNEDTATY FCAREGVHF 100 101 DYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO 170)
Sublinhado negrito: resíduos de CDR de Kabat Sublinhado itálico: resíduos de CDR de Chotia Resíduos canônicos Numeração é de acordo com o esquema de Kabat
ANÁLISE DAS REGIÕES VARIÁVEIS MURINAS
As regiões de determinação de complementaridade (CDRs) con- têm os resíduos mais prováveis de ligarem ao antígeno e devem ser retidos no anticorpo reformado. CDRs são definidas através de seqüência de acordo com Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5a Edição, U.S. Dept. Health and Human Services. U.S. Govt. Printing Office, que é incorporada por referência aqui em sua totalidade. CDRs entram nas classes canônicas (Chothia, C., Lesk, A. M., Tramontano, A., Levitt, M., Smi- th-Gill, S. J., Air, G., Sheriff, S., Padlan1 Ε. A., Davies, D., Tulip, W. R., Col- man, P. M., Spinelli, S., Alzari, Ρ. M. e Poljak1 R.J. (1989) Nature 342:877- 883 que é incorporada por referência aqui em sua totalidade) onde resíduos fundamentais determinam a uma extensão grande a conformação estrutural da alça de CDR. Estes resíduos são quase sempre retidos no anticorpo re- formado. As CDRs da cadeia pesada e leve foram classificadas em classes canônicas como segue:
Cadeia leve: Cadeia pesada:
L1: 10 resíduos Classel H1: 5 resíduos Classel L2: 7 resíduos Classe 1 H2: 17 resíduos Classe 2
L3: 9 resíduos Classe 1 H3: 7 resíduos Nenhuma classe canônica
Os resíduos canônicos importantes para estas classes de CDR estão indicadas na Tabela 10.
TABELA 10
<table>table see original document page 233</column></row><table>
As cadeias leve e pesada variáveis foram comparadas com as seqüências de consensos (Kabat et al, 1991) e de linhagem germinal (Bren- sing-Kuppers J, Zocher I, Thiebe R, Zachau HG. (1997). Gene. 191(2):173- 81 e Matsuda F, Ishii K1 Bourvagnet P1 Kuma K, Hayashida H1 Miyata T1 Honjo T.(1998) J Exp Med. 188(11 ):2151-62, que são incorporadas por refe- rência em suas totaiidades) para subgrupos murinos e humanos usando programa BLAST e base de dados de seqüência de proteína de BLAST de consensos e de linhagem germinal internamente compilados.
A cadeia leve variável é um membro de capa 6 de subgrupo mu- rino com uma identidade de 94% em sobreposição de 109 aminoácidos e originada da linhagem germinal de kk4 murina (100% ID) (Vide abaixo)
> mukk4
Cons.: 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR 60 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR
Suj . : 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR 60 Cons.: 61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 451) FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP (SEQ ID NO: 4 51)
Suj. : 61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 451)
A cadeia pesada variável é um membro do HVMS de subgrupo murino com uma identidade de 55% em sobreposição de 132 aminoácidos e originada da linhagem germinal de VGK6 murina (92% ID) (Vide abaixo) Cons.: 1 QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY 60
Q+QLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINT+TGEPTY Suj . : 1 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTY 60 Cons.: 61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFC 96 (SEQ ID NO: 452)
+DF+GRFAFSLETSAST YLQ NNLKNEDTATYFC (SEQ ID NO: 4 53) Suj. : 61 ADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 96 (SEQ ID NO: 454)
A cadeia leve variável corresponde a capa 3 de subgrupo huma- no com uma identidade de 67% em sobreposição de 109 aminoácidos e é a mais próxima à linhagem germinal de L6 humana (64% ID) (Vide abaixo)
> huL6
Cons.: 1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVS-YMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPA 59
+IVLTQSPA +S SPGE+ T++C AS SVS Y+ WYQQK G +P+ IYD S A+G+PA Suj. : 1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA 60 Cons.: 60 RFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ ID NO: 455)
RFSGSGSGT ++LTISS+E ED A YYCQQ S+ P (SEQ ID NO: 456) Suj. : 61 RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP 95 (SEQ ID NO: 457)
A cadeia pesada variável corresponde a MHV1 de subgrupo humano com uma identidade de 59% em sobreposição de 129 aa e é a mais próxima à linhagem germinal de huVH7-81 humana (70% ID) (Vide abaixo)
> huVH7-81
Cons.: 1 QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY 60
QVQLVQSG E+K+PG +VK+SCKASGY+FT YGMNWV QAPG+GL+WMGW NT TG PTY Suj . : 1 QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYSFTTYGMNWVPQAPGQGLEWMGWFNTYTGNPTY 60 Cons.: 61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAR 98 (SEQ ID NO: 458)
+ F GRF FS++TSAST YLQ ++LK ED A Y+CAR (SEQ ID NO: 459) Suj. : 61 AQGFTGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCAR 98 (SEQ ID NO: 460)
MODELANDO A ESTRUTURA DAS REGIÕES VARIÁVEIS
Para esta humanização foi construído o modelo de regiões vari- áveis de P1A7 com base nas estruturas cristalinas de anticorpos 0KT3 (PDB ID 1SY6 - usado para modelagem da cadeia leve) e TE33 (PDB ID 1TET - usado para modelagem da cadeia pesada). ANÁLISE DAS REGIÕES VARIÁVEIS REFORMADAS
Foi tentado encontrar as seqüências de anticorpo expressas humanas mais similares, que não necessitam ser retromutadas nas posições (L4,38,43,44,58,62,65-69,73,85,98 e H2,4,36,39,43,45,69,70,74,92) (vide por exemplo, Patente U.S. 6.407.213 que é incorporada por referência em sua totalidade), e as usa como as estruturas de anticorpo. Foi usada a base de dados de seqüência de anticorpo internamente curado e ferramentas de con- sulta para identificar os modelos adequados tendo a similaridade mais alta às seqüências de P1A7 murinas em resíduos canônicos, de interface e de zona de revestimento para minimizar o número de retromutações. Seqüên- cias de linhagem germinal preenchidas com resíduos de consenso na região de FR4 foram consideradas separadamente. Após estruturas múltiplas terem sido consideradas, seqüências de linhagem germinal huL6 e VH7-81 foram selecionadas como estruturas aceitantes para cadeias pesada e leve respec- tivamente.
Três versões da cadeia leve reformada variável e três versões da cadeia pesada reformada variável foram projetadas. A primeira versão contém menos retromutações e a terceira versão contém mais (isto é, as menos "humanizadas").
RETROMUTAÇÕES EM Vl REFORMADA
huL6
E1Q Ponto Q1 para antígeno e a alteração de carga pode alterar a ligação. Presente na versão 2 e 3
L46R R46 é um resíduo incomum na interface de VH/VL que suporta CDR-L1 e CDR-H3. Presente em todas as versões
L47W - W47 fica localizado em um agrupamento debaixo de CDR-L2. Pre- sente na versão 3 apenas
I58V - V58 fica localizado em um agrupamento debaixo de CDR-L2. Presen- te na versão 3 apenas
F71Y - Y71 é um resíduo canônico importante para suportar CDR-L1 e CDR- L3. Presente em todas as versões
RETROMUTAÇÕES EM Vh REFORMADO huVH7-81
P38K K38 suporta CDR-H2. Presente nas versões 2 e 3 E46K K46 suporta CDR-H2. Presente nas versões 2 e 3
10
M71L L71 é um resíduo canônico que suporta CDR-H1. Presente em todas as versões
A78V V78 é hipermutado da linhagem germinal A e suporta CDR-H1
I82F F82 é um resíduo de empacotamento do núcleo. Presente na versão 3 apenas
Y91F F91 é um resíduo na interface de VH/Vi_. Presente na versão 3 apenas
PROJETOS DE HUMANIZACÃO PARA P1A7
Estrutura tirada das seqüências: Cadeia leve: huL6 Cadeia pesada: huVH7-81
Retromutações estão em fonte tipo negrito minúscula
CDRs estão sublinhadas
> Variante de cadeia leve 1
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRrLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDyTLTISS LEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 430)
> Variante de cadeia leve 2
qlVLTQS PATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRrLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDyTLTISS LEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 431)
> Variante de cadeia leve 3
qlVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRrwIYDTSKLASGvPARFSGSGSGTDyTLTISS LEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 471)
> Variante pesada 1
QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVPQAPGQGLEWMGWINTDTGEPTYTEDFQGRFVFS1DTSA
STvYLQISSLKAEDMAMYYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4 72)
> Variante pesada 2
QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVkQAPGQGLkWMGWINTDTGEPTYTEDFQGRFVFSIDTSA
STvYLQISSLKAEDMAMYYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 432)
> Variante pesada 3 QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVkQAPGQGLkWMGWINTDTGEPTYTEDFQGRFVFSIDTSA STvYLQfSSLKAEDMAMYfCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 473)
SEQÜÊNCIA DA CADEIA PESADA DE POLIPEPTÍDEO E POLINUCLEO- TÍDEO DE COMPRIMENTO TOTAL PARA VARIANTE PESADA 2
Seqüência de DNA da cadeia pesada de huP1A7-lgG1 H2
(pXW465)
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC 51 CCACTCCCAG GTCCAACTGG TACAGTCTGG ACACGAGGTG AAGCAGCCTG 101 GAGCATCAGT CAAGGTCTCC TGCAAGGCCT CTGGGTATAC CTTCACAAAC 151 TATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCT GGACAAGGTT TAAAGTGGAT 201 GGGCTGGATA AACACCGACA CTGGAGAGCC AACATATACT GAAGATTTCC 251 AGGGACGGTT TGTCTTCTCT TTGGACACCT CTGCCAGCAC TGTTTATTTG 301 CAGATCAGCA GCCTCAAAGC TGAGGACATG GCAATGTATT ACTGTGCAAG 351 AGAGGGGGTC CACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGGACCCTT GTCACCGTCT 4 01 CCTCAGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC ACCCTCCTCC 4 51 AAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA 501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG 551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC 601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACCC AGACCTACAT 651 CTGCAACGTG AATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAAAGTTG 701 AGCCCAAATC TTGTGACAAG ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT 751 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG
1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCCG GTTGA (SEQ ID NO: 4 61)
Seqüência de proteína prognosticada da cadeia pesada de H2 de huP1A7 (seqüência sinal está sublinhada)
1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGHEV KQPGASVKVS CKASGYTFTN 51 YGMNWVKQAP GQGLfCWMGWI NTDTGEPTYT EDFQGRFVFS LDTSASTVYL 101 QISSLKAEDM AMYYCAKEGV HFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS 151 KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL 201 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP 251 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPG* (SEQ ID NO: 462)
SEQÜÊNCIA DE CADEIA PESADA DE POLIPEPTÍDEO E POLINUCLEO- TÍDEO DE COMPRIMENTO TOTAL PARA VARIANTE LEVE 1
Seqüência de DNA da cadeia leve de L1 de huP1A7 capa (pXW480)
1 ATGGATTTTC AGGTTCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT 51 CATAATATCC AGAGGAGAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAACCTTGT 101 CTTTATCTCC AGGGGAGAGA GCCACCTTGT CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT 151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGCCAAG CGCCCAGAAG 201 ACTGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAATCCCT GCTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC GATTACACTC TCACCATCAG CAGCTTGGAG 301 CCTGAAGATT TCGCCGTTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTAACCCATT 351 CACGTTCGGC CAGGGGACAA AGGTGGAAAT AAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGTTAG (SEQ ID NO: 4 63)
Seqüência de proteína prognosticada da cadeia leve de L1 de huP1A7 (seqüência sinal está sublinhada)
1 MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGEIVLTQSP ATLSLSPGER ATLSCSASSS 51 VSYMHWYQQK PGQAPRRLIY DTSKLASGXP ARFSGSGSGT DYTLTISSLE 101 PEDFAVYYCQ QWSSNPFTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC* (SEQ ID NO: 464)
SEQÜÊNCIA DE CADEIA PESADA DE POLIPEPTÍDEO E POLINUCLEO- TÍDEO DE COMPRIMENTO TOTAL PARA VARIANTE LEVE 2
Seqüência de DNA da cadeia leve de L2 de huP1A7 capa
(pXW476)
1 ATGGATTTTC AGGTTCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT 51 CATAATATCC AGAGGACAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAACCTTGT 101 CTTTATCTCC AGGGGAGAGA GCCACCTTGT CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT 151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGCCAAG CGCCCAGAAG 201 ACTGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAATCCCT GCTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC GATTACACTC TCACCATCAG CAGCTTGGAG 301 CCTGAAGATT TCGCCGTTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTAACCCATT 351 CACGTTCGGC CAGGGGACAA AGGTGGAAAT AAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 465
Seqüência de proteína prognosticada da cadeia leve de L2 de huP1A7 (seqüência sinal esta sublinhada)
1 MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGQIVLTQSP ATLSLSPGER ATLSCSASSS 51 VSYMHWYQQK PGQAPRRLIY DTSKLASGIP ARFSGSGSGT DYTLTISSLE 101 PEDFAVYYCQ QWSSNPFTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC* (SEQ ID NOS:466)
Seqüência de polipeptídeo e polinucleotídeo de cadeia pesada e leve de um anticorpo 1A7 quimérico murino e humano segue:
Seqüência de DNA de cadeia leve de chP1A7 capa (pEAG2110)
1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT 51 CATAATATCC AGAGGACAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT 101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT 151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG TCAGGCACCT CCCCCAAAAG 201 ATGGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTAACCCATT 351 CACGTTCGGC TCGGGGACAA AGTTGGAAAT AAAACGTACG GTGGCTGCAC 4 01 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 467)
Seqüência de proteína prognosticada da cadeia leve de chP1A7 (seqüência sinal está sublinhada)
1 MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCSASSS 51 VSYMHWYQQK SGTSPKRWIY DTSKLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSME 101 AEDAATYYCQ QWSSNPFTFG SGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC* (SEQ ID NO: 4 68)
Seqüência de DNA da cadeia pesada de hulgGI de chP1A7 (pEAG2112)
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC 51 CCACTCCCAG GTCCAACTGG TACAGTCTGG ACCTGAGCTG AAGAAGCCTG 101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCCT CTGGGTATAC CTTCACAAAC 151 TATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGGTT TAAAGTGGAT 201 GGGCTGGATA AACACCGACA CTGGAGAGCC AACATATACT GAAGATTTCC 251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGTTTATTTG 301 CAGTTCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG 351 AGAGGGGGTC CACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT
401 CCTCAGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC ACCCTCCTCC 451 AAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA 501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG 551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC 601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACCC AGACCTACAT
651 CTGCAACGTG AATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAAAGTTG 701 AGCCCAAATC TTGTGACAAG ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT 751 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG
901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA
1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCCG GTTGA (SEQ ID NO: 469)
Seqüência de proteína prognosticada da cadeia pesada de chP1A7 (seqüência sinal está sublinhada)
1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGPEL KKPGETVKIS CKASGYTFTN 51 YGMNWVKQAP GKGLKWMGWI NTDTGEPTYT EDFQGRFAFS LETSASTVYL 101 QFNNLKNEDT ATYFCAREGV HFDYWGQGTT VTVSSASTKG PSVFPLAPSS 151 KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL 201 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP 251 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPG* (SEQ ID NO: 470)
EXEMPLO 18
Reengeinheiramento de Li33lq2 para reduzir a função efetora, glicação e agregação
Várias mutações foram feitas em Li33 para potencialmente redu- zir a função efetora, glicação e agregação. O efeito de cada destas muta- ções na expressão de proteína, solubilidade, atividade do anticorpo no en- saio de cocultura de oligodendrócito-DRG, e glicação ou ligação de CD32 foi determinado. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 11.
TABELA 11: REENGEINHEIRAMENTO DE LI33IG2
<table>table see original document page 242</column></row><table> <table>table see original document page 243</column></row><table>
EXEMPLO 19
Construção de uma variante de Li81
Anticorpo Li81 é uma versão madura de afinidade do anticorpo Li13. Uma versão aglicosilada do anticorpo de Li81 foi criada alterando um aminoácido simples na seqüência de cadeia pesada de Li81. O seguinte é a seqüência de aminoácido para a cadeia pesada variável (Vh) da variante aglicosilada. Mdwtwrvfcliavapgahsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsayemkwvrqapgkglewvsvigpsggf t fyads vkgrftisrdnskntlylqmnslrae dtavyy categdndafdiwgqgttvtv s sastkgps vfplaps s kstsggtaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsn tkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfnwyvdgvev hnaktkpreeqyns^yrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltk nqvsltclvkgfypsdiavewe sngqpennykttppvlds dgs fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhy tqkslslspg (seq id no: 474)
A seqüência líder (os primeiros 19 aminoácidos) que não estarão presentes na proteína madura são mostrados em negrito, e as CDRSs estão sublinhadas. A alteração de aminoácido simples quando comparado à se- qüência de cadeia pesada variável de Li81 (SEQ ID NO: 433) é mostrada em negrito e sublinhada. O seguinte é a seqüência de nucleotídeo para a cadeia pesada variável (Vh) da variante aglicosilada.
gaagtacaattgttagagtctggtggcggtcttgttcagcctggtggttctttacgtctttcttgcgctgcttccg gattcactttctctgcttacgagatgaagtgggttcgccaagctcctggtaaaggtttggagtgggtttctgttat cggtccttctggtggctttactttttatgctgactccgttaaaggtcgcttcactatctctagagacaactctaag aatactctctacttgcagatgaacagcttaagggctgaggacacggccgtgtattactgtgcaacagagggtgata atgatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcaagcgcctccaccaagggcccatcggtctt ccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttcccc gaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcct caggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgt gaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaagactcacacatgccca ccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatga tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcgcgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcc cagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttct tcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatga ggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcccggttgaggatccctgcccgg (seq id no: 450). A presente invenção não será limitada em escopo pelas modali- dades específicas descritas que são intencionadas como meras ilustrações dos aspectos individuais da invenção, e quaisquer composições ou métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta inven- ção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui ficarão evidentes àqueles versados na técnica da descrição anterior e desenhos em anexo. Tais modificações são intencionadas enqua- drarem-se no escopo das reivindicações em anexo.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma propor- ção que se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicados ser incorporados por referência. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Biogen Idec MA Inc.
<120> ANTICORPOS DE SP35 E USOS DOS MESMOS
<130> 2159.128PC01
<150> US 60/879,324
<151> 2007-01-09
<160> 474
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 1845
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60
ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120
gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180
gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240
aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300
gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360
cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420
aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480
tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540
ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600
cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660
atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720
tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780
tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840
gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900
ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960
gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020
ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080
gactccaacc cgctggcctg cgactqtcqg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140 ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200 ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260 cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320 cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380 tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440 gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500 tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560 aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620 actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680 tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740 ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800 agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845
<210> 2 <211> 614
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys 1 5 10 15
Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser 20 25 30
Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala
35 40 45
Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro
50 55 60
Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu
65 70 75 80
Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu
85 90 95
Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu
100 105 110
Phe Asn Leu Arq Thr Leu Glv Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile 115 120 125
Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile
130 135 140
Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu 145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile
165 170 175
Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu
180 185 190
Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu
195 200 205
His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile
210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile 225 230 235 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly
245 250 255
Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val
260 265 270
Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu
275 280 285
Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu
290 295 300
Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val 305 310 315 320
Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val
325 330 335
Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Val
340 345 350
Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp
355 360 365
Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn 370
Arg Gln Gln Pro Thr 385
Phe Lys Asp Phe Pro 405
Arg Ala Arg Ile Arg 420
Gly His Thr Val Gln 435
Ala Ile Leu Trp Leu 450
Asn Gly Arg Leu Thr 465
Ala Gln Val Gln Asp 485
Gly Gly Asn Asp Ser 500
Pro Asp Trp Pro His 515
Gln Pro Gly Glu Gly 530
Pro Phe Asp Ile Lys 545
Ser Phe Leu Gly Val 565
Ser Arg Gly Lys Gly 580
Pro Arg Lys Ser Asp 595
Phe Asn Met Lys Met 610
<210> 3
375
Cys Ala Thr Pro Glu Phe 390 395
Asp Val Leu Leu Pro Asn 410
Asp Arg Lys Ala Gln Gln 425
Phe Val Cys Arg Ala Asp 440
Ser Pro Arg Lys His Leu 455
Val Phe Pro Asp Gly Thr 470 475
Asn Gly Thr Tyr Leu Cys 490
Met Pro Ala His Leu His 505
Gln Pro Asn Lys Thr Phe 520
Glu Ala Asn Ser Thr Arg 535
Thr Leu Ile Ile Ala Thr 550 555
Val Leu Phe Cys Leu Val 570
Asn Thr Lys His Asn Ile 585
Ala Gly Ile Ser Ser Ala 600
Ile
380
Val Gln Gly Lys Glu 400
Tyr Phe Thr Cys Arg 415
Val Phe Val Asp Glu 430
Gly Asp Pro Pro Pro 445
Val Ser Ala Lys Ser 460
Leu Glu Val Arg Tyr 480
Ile Ala Ala Asn Ala 495
Val Arg Ser Tyr Ser 510
Ala Phe Ile Ser Asn 525
Ala Thr Val Pro Phe 540
Thr Met Gly Phe Ile 560
Leu Leu Phe Leu Trp 575
Glu Ile Glu Tyr Val 590
Asp Ala Pro Arg Lys 605 249
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gln Val Ser Lys Arg
1 5
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar a cadeia leve de
P1E11.3B7
<400> 4
gcgtctagaa ctggatggtg ggagatgga 29
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CDRl
<400> 5
acttacccta tggtt 15
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CDRl
<400> 6
Thr Tyr Pro Met Val
1 5 Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CRD2
<400> 7
tggatcggtc cttctggtgg cgttactgct tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 8 17 PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400> 8
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CDR2
33 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CDR3
<400> 9
ccctatagca gtggctggtg ggacttcgat ctc 33
<210> 10 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VH-CDR3
<4 00> 10
Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
5 10
11 15 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VH-CDRl 11
atgtacttta tgggt
15
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
12 5
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VH-CDRl 12
Met Tyr Phe Met Gly
13 51 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VH-CDR2
<400> 13
tctatctctc cttctggtgg ctttacttct tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 14
<211> Π
<212> PRT <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VH-CDR2
<400> 14
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> S <220> <223> <400>
15 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 qúe codifica VH-CDR3 15
gatcggcatg cttttgatat c <210> 16
21
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VH-CDR3 16
Asp Arg His Ala Phe Asp Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
17 14 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDRl 17 cttacgctat gggt
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
18
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDRl 18
Ala Tyr Ala Met Gly
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
19 51 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDR2 19
tctatcgttt cttctggtgg ctatactgat tatgctgact ccgttaaagg t
51
17 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDR2
<400> 20
Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212>
21 27 DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDR3
<400> 21
gagggtgacc ataatgcttt tgatatc 27
<210> 22 <211> 9
<212> <213> <220> <223> <400>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VH-CDR3 22
Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
23 15 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDRl 23
tcttacgcta tgtat
15
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
24 5
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDRl 24
Ser Tyr Ala Met Tyr 1 5
<210> 25 <211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDR2
<400> 25
tctatctcta cttctggtgg ctatactggt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDR2
<400> 26
Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15 Gly
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDR3
<400> 27
gataccagcg ataatgacta ctactacatg gacgtc 36
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VH-CDR3 <400> 28
Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
15 10
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDRl
<400> 29
aagtaccaga tgact 15
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDRl
<4 00> 30
Lys Tyr Gln Met Thr
1 s
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDR2
<400> 31
tctatctatc cttctggtgg caatactgtt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDR2
<400> 32
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
33 27 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDR3
<400> 33
gggactacag aggcagtctt tgactac 27
<210> 34
9
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VH-CDR3 34
Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
35 15 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDRl 35
cagtacaata tgttt
15 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
36
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDRl 36
Gln Tyr Asn Met Phe
37 51 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDR2
<400> 37
cgtatctctt cttctggtgg catgactatg tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 38
17 PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDR2
<400> 38
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213>
39 69 DNA
Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDR3
<400> 39
gaagcgttac ggccttattg tagtggtggt agctgctact ccgactacta ctactacggt 60
atggacgtc 69
40 23 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil2 que codifica VH-CDR3
<400> 40
Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Asp Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 41 15 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDRl 41
gagtacccta tggat <210> 42
15
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
5
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDRl 42
Glu Tyr Pro Met Asp <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
43 51 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDR2 43
tctatctatt cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccattaaagg t
51
44 17 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDR2
<400> 44
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ile Lys 15 10 15
Gly
45 27 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDR3
<400> 45
gagggtgact ctgatgcttt tgatatc 27
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VH-CDR3
<4 00> 46
Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
47 15 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDRl 47
cattacgaga tggtt
15
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
48 5
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDRl 48
His Tyr Glu Met Val
49 51 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDR2
<400> 49
tctatccgtt cttctggtgg cgctactaag tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 50
<211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDR2
<400> 50
Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
51 27 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDR3
<400> 51
gagtcgccag acgactactt tgactac 27
<210> 52
9
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VH-CDR3 52
Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
53 15 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDRl <400> 53
cagtacccta tggag <210> 54
15
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDRl 54
Gln Tyr Pro Met Glu
55 51 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDR2
<400> 55
ggtatctatc cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 56
17 PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDR2
<400> 56
Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDR3
<400> 57
gcggggcagt ggctggggga ctttgactac 30
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VH-CDR3
<400> 58
Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDRl
<400> 59
atgtactcta tggtt 15
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDRl
<400> 60
Met Tyr Ser Met Val
1 5 <210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDR2
<400> 61
tatatctctc cttctggtgg caagactatg tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDR2
<400> 62
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
63 69 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDR3
<400> 63
gattcgagac gccggtatta cgatttttgg agtggttatc acaactacta ctactactac 60
atggacgtc 69
<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VH-CDR3
<400> 64
Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His Asn Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 20 65 15 DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDRl 65
cgttacaata tgggt
1 5
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
66 5
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDRl 66
Arg Tyr Asn Met Gly
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
67 51 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDR2 67
qttatctatc cttctggtqa cggtactcat tatgctgact ccgttaaaqq t
51 <210> 68 <211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDR2
<400> 68
Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDR3
<400> 69
tctatagcag atgatgcttt tgatatc 27
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li04 que codifica VH-CDR3
<400> 70
Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 71
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDRl
<400> 71
acttacgaga tgatt 15
<210> 72
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDRl 72
Thr Tyr Glu Met Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
73 48 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDR2 73
tctatcggtc cttctggtgg ccttacttgg tatgctgact ccgttaaa
48
74 17 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDR2
<400> 74
Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
75 51 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDR3 75
atgtattact gtgtacggat tgatgatagt agtggttggg cttttgatat c
51
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
76 17 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VH-CDR3 76
Met Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Asp
1
Ile
10
15
77 5
PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VH-CDRl
<4 00> 77
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VH-CDR2
<4 00> 78
Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VH-CDR3
<400> 79 Glu Gly Val His Phe Asp Tyr 1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VH-CDRl
<400> 80 Phe Ser Asp Ala Trp Leu Asp 1 5
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VH-CDR2
<4 00> 81 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
82 4
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VH-CDR3 82
Ser Phe Ala Tyr 1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
83
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 ou 3P1E11.3B7 que codifica VH-CDRl 83
Ser Ser Trp Thr Gln
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
84 17 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 ou 3P1E11.3B7 que codifica VH-CDR2 84
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arq Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly
10
15
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 ou 3P1E11.3B7 que
codifica VH-CDR3
<4 00> 85
His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDRl
<4 00> 86
cgggcgagtc agggtattgg caactggtta gcc 33
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDRl
<400> 87
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 21 DNA
Seqüência artificial
<212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDR2
<400> 88
gctgcatcca gtttggaaag t 21
<210> 89
7
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDR2 89
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser
90 27 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDR3
<4 00> 90
caacaggctc agactttccc gctcacc 27
<210> 91
9
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LilO que codifica VL-CDR3
<400> 91
Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
92 33 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDRl 92
tctggagatc agttgggtga caaacatgtg gct
33
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
93 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDRl 93
Ser Gly Asp Gln Leu Gly Asp Lys His Val Ala
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
94 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDR2 94
ctagacatta agaggcccgc a <210> 95
21
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDR2 95 Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
96 24 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDR3 96
caggcgtggg acatcaagac ggtc
24
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
97 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li07 que codifica VL-CDR3 97
Gln Ala Trp Asp Ile Lys Thr Val
98 33 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VL-CDRl
<400> 98
gggggagaca acattggaag taagagtgtc cac 33
<210> 99
<211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VL-CDRl
<400> 99
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
5 10
100 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VL-CDR2 100
qatgattatg accggccctc a
21
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
101 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VL-CDR2 101
Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser
102
33
DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOS que codifica VL-CDR3
<400> 102
caggtgaggg acagccgtac tgaggaacgg gtg 33
<210> 103
<211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li05 que codifica VL-CDR3
<4 00> 103
Gln Val Arg Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
104
33
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDRl 104
cgggcgagtc aggagattgc caactactta gcc
33
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
105 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDRl 105
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
106 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDR2 106
gatacataca ctttgcagac t <210> 107
21 7
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDR2
<400> 107
Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
108
27
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDR3 108
caacaggctg acattttccc gctctct
27
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
109 9
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lill que codifica VL-CDR3 109
Gln Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
110
32
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDRl 110 caggcgagtc aggacattag caactattta aa <210> 111 11 PRT
Seqüência artificial
32
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDRl 111
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
5 10
112 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDR2 112
gatgcatcca atttggaaac a <210> 113
21
7
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDR2
<400> 113
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDR3
<400> 114
caacaggctg acaggttccc tgcggtcact 30
<210> 115
<211> 10 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Seqüência sintética de anticorpo LiOl que codifica VL-CDR3 <400> 115
Gln Gln Ala Asp Arg Phe Pro Ala Val Thr 15 10
<210> 116 <211> 33 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDRl
<400> 116
cgggccagtc agagtattag tagctggttg gcc 33
<210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDRl
<400> 117
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 15 10
<210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDR2
<400> 118
gctgcatcca gtttacgaac t 2
<210> 119
7
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDR2 119
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr
120
27
DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDR3
<400> 120
ctacaagatt acagttaccc tctcact 2
<210> 121 9
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li06 que codifica VL-CDR3
<4 00> 121
Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 122 <211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDRl
<400> 122
caggcgagtc aggacattag ttactattta aat 33
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDRl
<4 00> 123
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn
15 10
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDR2
<400> 124
gatgtatcca atttgcaaac a 21
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDR2
<400> 125
Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDR3
<400> 126
caacagtctg ataatctccc tctcact 27
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li08 que codifica VL-CDR3
<400> 127
Gln Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr
128
32
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDRl
<400> 128
gggcaagtca gagcattagc agctatttaa at 32
<210> 129
11 PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223>
Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDR1 <400> 129
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
5 10
130
21
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDR2 130
gctgcatcca gtttgcaaag t
21
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
131 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDR2 131
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
132
27
DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDR3
<400> 132
caacagagtt acagtacccc gtggacg 27
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li03 que codifica VL-CDR3
<400> 133
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
134
33
DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDRl
<400> 134
cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta aat 33
<210> 135
11 PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDRl 135
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
136
21
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDR2 136
gctgcatcca agttggaaga c <210> 137
<211> 7
21 <212> <213> <220> <223> <400>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDR2 137
Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp
138 26 DNA
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDR3
<400> 138
caacagagtt acagtccccc tctcac 26
<210> 139
9
PRT
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Seqüência sintética de anticorpo Li09 que codifica VL-CDR3 139
Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
140
33
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDRl 140
tctggaqata aattggggqa taaatttgct tcc
33 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
141 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDRl 141
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
5 10
142 21 DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDR2 142
caagatagga agcgtctctc a <210> 143
21
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDR2 143
Gln Asp Arg Lys Arg Leu Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
144
27
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDR3 <400> 144
caggcgtggg acaccaacac tgtggtc 27
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li02 que codifica VL-CDR3
<4 00> 145
Gln Ala Trp Asp Thr Asn Thr Val Val
1 5
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VL-CDRl
<4 00> 146
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
15 10
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VL-CDR2
<4 00> 147
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 1A7 que codifica VL-CDR3
<4 00> 148
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
149 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VL-CDRl 149
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
150 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VL-CDR2 150
Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
151 9
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo 2F3 que codifica VL-CDR3 151
Gln His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr Thr 1 5
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 que codifica
VL-CDRl
<400> 152
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15
Thr
<210> 153
<211> Ί
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 que codifica VL-CDR2
<4 00> 153
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 154
<211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3P1D10.2C3 que codifica VL-CDR3
<400> 154
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10
<210> 155 <211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Synthetic sequence from 3Ρ1Ε11.3Β7 antibody which encodes for
VL-CDRl <400> 155
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu 1 5 10 15
Thr
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Synthetic sequence from 3P1E11.3B7 antibody which encodes for
VL-CDR2 <400> 156
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 157
<211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3P1E11.3B7 que codifica para
VL-CDR3 <400> 157
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10
<210> 158 <211> 133
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li02
<4 00> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20
Glu Met Ile Trp Val Arg Gln 35
Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly
50 55
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 85
Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser 100
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115
Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 159
<211> 145
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li09
<4 00> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Gly Gly Gly 10
Ala Ser Gly 25
Ala Pro Gly 40
Gly Leu Thr
Arg Asp Asn
Ala Glu Asp 90
Gly Trp Ala
105 Ser Ala Ser 120
Leu Val Gln
Phe Thr Phe
Lys Gly Leu 45
Trp Tyr Ala 60
Ser Lys Asn 75
Thr Ala Met
Phe Asp Ile
Thr Lys Gly 125
Pro Gly Gly 15
Ser Thr Tyr 30
Glu Trp Val
Asp Ser Val
Thr Leu Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Trp Gly Gln 110
Pro Ser Val 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His
100 105 110
Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro
160 131 PRT
Seqüência artificial
145 <210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li06
<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Pro Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Arg Glu Gly 100
Met Val Thr Val 115
Leu Ala Pro 130
<210> 161 <211> 131
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li05
<400> 161
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ile
55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
70 75 80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 120 125 100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro 130
<210> 162 <211> 131
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li04
<400> 162
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro 130
<210> 163
<211> 131 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li08
<400> 163
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro 130
<210> 164
<211> 134
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Lill
<400> 164
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 165
<211> 133
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de LilO
<4 00> 165
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arq Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 166 <211> 131
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de LiOl
<400> 166
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Gln Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 167 129 PRT
Seqüência artificial
Leu Ala Pro
130 <210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável
<400> 167
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25
Phe Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
85 90
Ala Arg Asp Arg His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120
Pro
<210> 168
<211> 132
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
sintética de Li07
Gln Pro Gly Gly 15
Phe Ser Met Tyr
30
Leu Glu Trp Val 45
Ala Asp Ser Val
Asn Thr Leu Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Thr Met Val 110
Phe Pro Leu Ala 125 <223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li03
<400> 168
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Pro Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro 130
<210> 169
<211> 145
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Lil2
<4 00> 169
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Glv Lys Gly Leu Glu Trp Val 35
Ser Arg Ile Ser Ser 50
Lys Gly Arg Phe Thr 65
Leu Gln Met Asn Ser 85
Ala Arg Glu Ala Leu 100
Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115
Thr Val Ser Ser Ala 130
Pro 145
<210> 170
<211> 116
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de 1A7
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
40
Ser Gly Gly Met Thr Met 55
Ile Ser Arg Asp Asn Ser 70 75
Leu Arg Ala Glu Asp Thr 90
Arg Pro Tyr Cys Ser Gly 105
Gly Met Asp Val Trp Gly 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser 135
45
Tyr Ala Asp Ser Val 60
Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Ser Cys Tyr Ser 110
Gln Gly Thr Thr Val 125
Val Phe Pro Leu Ala 140 Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val ^His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 171
<211> 115
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de 2F3
<400> 171
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Leu Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Phe Cys Thr Pro Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 172
<211> 117
<212> PRT <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de 3P1D10.2C3
3P1E11.3B7 <4 00> 172
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Thr Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 173
<211> 399
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li02
<400> 173
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacgaga tgatttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcggtcctt ctggtggcct tacttggtat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctaqagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac accgccatgt attactgtgt acggattgat 300 gatagtagtg gttgggcttt tgatatctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcaagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399
<210> 174
<211> 435
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li09
<400> 174
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtactcta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactatgtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactttctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcg 300 agacgccggt attacgattt ttggagtggt tatcacaact actactacta ctacatggac 360 gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttcccgctag caccc 435
<210> 175
<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li06
<400> 175
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gagtacccta tggattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctattctt ctggtggctc tactgtttat 180 gctgactcca ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300 gactctgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcgqtctt cccgctagca ccc 393 <210> 176
<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li05
<4 00> 176
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgcta tgggttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgtttctt ctggtggcta tactgattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300
gaccataatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360
accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 177
<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li04
<400> 177
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacaata tgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctatcctt ctggtggcgg tactcattat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttctata 300 gcagatgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 178
<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> <400>
gaagttcaat tcttgcgctg cctggtaaag gctgactccg ttgcagatga ccagacgact accaagggcc <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
gaagttcaat tcttgcgctg cctggtaaag gctgactccg ttgcagatga agcgataatg agcgcctcca
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
gaagttcaat
Seqüência
178 tgttagagtc cttccggatt gtttggagtg ttaaaggtcg acagcttaag actttgacta catcggtctt
179
402
DNA
Seqüência
Seqüência
179 tgttagagtc cttccggatt gtttggagtg ttaaaggtcg acagcttaag actactacta ccaagggccc
180
399
DNA
Seqüência
de cadeia pesada variável sintética de Li08
tggtggcggt cactttctct ggtttcttct cttcactatc ggctgaggac ctggggccag cccgctagca
cttgttcagc cattacgaga atccgttctt tctagagaca acggccgtgt ggaaccctgg
ctggtggttc tggtttgggt ctggtggcgc actctaagaa attactgtgc tcaccgtctc
tttacgtctt tcgccaagct tactaagtat tactctctac gaaagagtcg aagcgcctcc
artificial
de cadeia pesada variável sintética de Lill
tggtggcggt cactttctct ggtttcttct cttcactatc ggctgaggac catggacgtc atcggtcttc
cttgttcagc tcttacgcta atctctactt tctagagaca acggccgtgt tggggcaaag ccgctagcac
ctggtggttc tgtattgggt ctggtggcta actctaagaa attactgtgc ggaccacggt
tttacgtctt tcgccaagct tactggttat tactctctac gagagatacc caccgtctca
artificial
Seqüência de cadeia pesada variável sintética de LilO 180
tgttagagtc tggtggcggt cttattcagc ctggtggttc tttacgtctt
60 120 180 240 300 360 393
60 120 180 240 300 360 402
60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacccta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcgt tactgcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaccctat 300 agcagtggct ggtgggactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcaagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399
<210> 181 <211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de LiOl
<400> 181
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtaccaga tgacttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctatcctt ctggtggcaa tactgtttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgggact 300 acagaggcag tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 182 <211> 387
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li07
<400> 182
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacttta tgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctt tacttcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag qqctgaggac actgcaqtct actattqtgc gaqagatcgg 300 catgcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcaagcgc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccc 387
<210> 183
<211> 396
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li03
<400> 183
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacccta tggagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctatcctt ctggtggctc tactgtttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggg 300 cagtggctgg gggactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagcgcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta gcaccc 396
<210> 184
<211> 435
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Lil2
<400> 184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacaata tgttttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctcttctt ctggtggcat gactatgtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagcg 300 ttacggcctt attgtagtgg tggtagctgc tactccgact actactacta cggtatggac 360 gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttcccgctag caccc 435
<210> 185 <211> 357
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li02
<400> 185
ttctattctc acagtgcaca gtacgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60
ggacagacag ccagcatcac ctgctctgga gataaattgg gggataaatt tgcttcctgg 120
tatcagcaga aggcaggcca gtcccctgtg ctggtcatct ttcaagatag gaagcgtctc 180
tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctggga acacagccac tctgaccatc 240
agcgggaccc aggctatgga tgaggctgac tattactgtc aggcgtggga caccaacact 300
gtggtcttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccc 357
<210> 186
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li09
<400> 186
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60 tttgtgggag acagagtcgc catcacttgc cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta 120 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaaactcc tgatctatgc tgcatccaag 180 ttggaagacg gggtcccatc aagattcagt ggcagtggaa ctgggacaga tttcactctc 24 0
accatcagaa gtctgcaacc tgaagatttt ggaacttact actgtcaaca gagttacagt 300 ccccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 187
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li06
<400> 187 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccttccac cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggccagtc agagtattag tagctggttg 120
gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaacctcc tgatctatgc tgcatccagt 180
ttacgaactg gggtcccatc aagattcagg ggcagtggat ctggcacaga tttcactctc 240
accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacgtatt actgtctaca agattacagt 300
taccctctca cttttggcca ggggaccaag ctggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 188
<211> 363
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li05
<400> 188
ttctattctc acagtgcaca gagcgtcttg actcagccac cctcggtgtc agtggcccca 60
ggccagacgg ccaggatttc ctgtggggga gacaacattg gaagtaagag tgtccactgg 120
taccagcaga ggccaggcca ggcccctgtc ctggtcgtgt atgatgatta tgaccggccc 180
tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctgggg acacggccat cctgaccatc 240
accagggtcg aagtcgggga tgaggccgac ttttattgtc aggtgaggga cagccgtact 300
gaggaacggg tgttcggcgg agggaccaag gtgaccgtct taggtcagcc caaggctgcc 360
CCC 363
<210> 189
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li08
<400> 189
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag ttactattta 120
aattggtatc agcagaagcc agggaaagcc cctaaggtcc tgatctacga tgtatccaat 180
ttgcaaacag gggtcccatc aaggttcagt ggaagtgcgt ctgcgacaga ttttactctc 240
accatcagca gcctgcaqcc tgaagatatt gcgacatatt actgtcaaca gtctgataat 300 ctccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatta aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 190
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Lill
<400> 190
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc tgtgtctgca 60
cctataggag acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc aggagattgc caactactta 120
gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatga tacatacact 180
ttgcagactg acgtcccacc gaggttcagc ggcagtggtt cggggacaga tttcactctc 240 actatcagca gcctgcagcc tgaagatact gcaacttact tttgtcaaca ggctgacatt 300 ttcccgctct ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 191
<211> 366
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de LilO
<400> 191
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc catgtctgct 60
tctgtagggg acacagtcac catcacttgt cgggcgagtc agggtattgg caactggtta 120
gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc ccaactctcc tgatctatgc tgcatccagt 180
ttggaaagtg gggtcccatc aaggttcacc ggcagcggca gttcctctgg gatagatttc 240
actctcacca tcagcgacct gcaccctgaa gatttggcaa cttactattg tcaacaggct 300
cagactttcc cgctcacctt cggcggaggg accagggtgg acctcaagcg aactgtggct 360 gcacca 366
<210> 192
<211> 363
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de LiOl
<400> 192
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag caactattta 120
aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctacga tgcatccaat 180
ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagc ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240
accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttact attgtcaaca ggctgacagg 300
ttccctgcgg tcactttcgg cggagggacc aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca 360
cca 363
<210> 193
<211> 354
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li07
<400> 193
ttctattctc acagtgcaca gagcgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60
ggacagacag ccatcatcac ctgctctgga gatcagttgg gtgacaaaca tgtggcttgg 120
tatcaacaga agccaggcca gtcccctgtg ctggtcatct atctagacat taagaggccc 180
gcagggattt ctgagcgatt ctctggctcc aactctggaa atacagccac tctgaccatc 240
agagggaccc aggctatgga tgaagctgac tattactgtc aggcgtggga catcaagacg 300
gtcttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc ctgagtcagc ccaaggctgc cccc 354
<210> 194
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li03
<400> 194
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc aqaqcattaq cagctattta 120 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt accccgtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgaactgt ggctgcacca
<210> 195
PRT
Seqüência artificial
180 240 300 360
<211> <212> <213> <220> <223>
<400>
Seqüência sintética de anticorpo Lia.01 que codifica para VH
CDRl
195
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly
196
17
PRT
Seqüência artificial
1 5 10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.01 que codifica para VH
CDR2 <400> 196
Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
197 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lla. 01 que codifica para VH 10
15
20
25
CDR3 <400> 197
Ala Glu Phe Tyr Trp Gly Ala Tyr Asp Gly
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
198 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VH-
CDRl
198
Gly Gly Ser Xle Arg Gly Asn Tyr Trp Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
199
14
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VH-
CDR2
199
Ser Ile Asn Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
200 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VH- CDR3 200 315
Val Arg His Trp Tyr Phe Asp Val
10
15
20
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
201 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VH- CDRl 201
Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Phe Asp Met His
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
202
17
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VH- CDR2 202
Trp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1
Gly
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
203
13
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VH-
CDR3
203 Asp Phe Tyr Met Asp Gly His Tyr Tyr Ile Phe Asp Val 1 5 10
<210> 204
<211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VH-
CDRl
<400> 204
Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Tyr Ile His 1 5 10
<210> 205
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VH-
CDR2
<400> 205
Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 206 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VH-
CDR3 <400> 206 Asp Leu Ala Trp Ile Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 207 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.05 que codifica para VH- CDR1
<400> 207
Gly Phe Thr Phe Thr Ser His Thr Val Ser 1 5 10
<210> 208 <211> PRT <212> 17 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.05 que codifica para VH- CDR2
<400> 208
Ser Ile Thr Gly Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo L1a.05 que codifica para VH- CDR3
<400> 209 Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Ser 1 5
<210> 210 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VH-
CDRl
<400> 210
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Trp Met Ser
211
17
PRT
Seqüência artificial
15 10
<210> <211> <212>
<213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VH-
CDR2
<400> 211
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
25
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
212
17
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VH- CDR3 212 Asp Leu Pro Met Lys Gly Phe Xle Gln Gln Arg Tyr Gly Phe Asp Asp 15 10 15
Val
10
15
20
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
213 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.07 que codifica para VH-
CDRl
213
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser
214
17
PRT
Seqüência artificial
25
15 10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.07 que codifica para VH-
CDR2 <400> 214
Thr Ile Trp Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
215 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia. 07 que codifica para VH- CDR3 <4 00> 215
Glu Tyr Trp Tyr Tyr Asp Gln Phe Thr Ala Val
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
216 12 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifica para VH- CDRl 216
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
217 18 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifica para VH-
CDR2
217
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
10
15
25 Lys Ser
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
218 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifica para VH- CDR3 <4 00> 218
Glu Val Tyr Ser Ala Gly Ile Met Asp Tyr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
10
219 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VH-
CDRl
219
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn His Trp Ile Gly
220
17
PRT
Seqüência artificial
25
15 10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VH-
CDR2 <400> 220
Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 15 10 15
Gly
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
221 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VH- CDR3 <400> 221
Gly Phe Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Phe Asp Val
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
10
222
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VH- CDRl 222
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Ala
223
17
PRT
Seqüência artificial
25
10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VH-
CDR2 <400> 223
Met Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 15 10 15
Gly
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
224 9
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VH- 10
15
20
CDR3 <400> 224
Thr Asn Tyr Leu Gly Phe Tyr Asp Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
225 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VH-
CDRl
225
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
226
17
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VH- CDR2 226
Asn Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
25
ι
Gly
10
15
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
227 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VH- CDR3 <400> 227
Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Tyr Ser Phe Asp Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
228 12 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VH- CDRl 228
Gly Asp Ser Val Ser Asp Asn Ser Ala Ala Trp Gly
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
229 18 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VH-
CDR2
229
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
10
15
25 Lys Ser
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
230 16 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VH- 10
15
20
CDR3 <4 00> 230
Gly Arg His Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Met Asp His
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
10
15
231 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VH- CDRl 231
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
232
17
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VH- CDR2 232
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
25
ι
Gly
10
15
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
233 10 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VH- CDR3 <400> 233
His Tyr Thr Tyr Met His Phe Glu Asp Tyr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
234 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.01 que codifica para VL- CDRl 234
Ser Gly Asp Ser Leu Pro Ser Lys Phe Val His
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
235 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.01 que codifica para VL-
CDR2
235
Arg Asp Asn Asn Arg Pro Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
236 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.01 que codifica para VL-
CDR3
236 Ser Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Asp
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
237 12 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VL- CDRl 237
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Ser Tyr Leu Gly
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
238 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VL-
CDR2
238
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
239 8
PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.02 que codifica para VL-
CDR3 <400> 239
Gln Gln Ala Ser Asp Ala Pro Glu 1 5 <210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
240 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VL-
CDRl
240
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Phe Trp Leu Asn
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
5 10
241 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VL-
CDR2
241
Ala Gly Ser Asn Leu Gln Ser
242 8
PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.03 que codifica para VL-
CDR3 <400> 242
Met Gln Asp Ser Asp Phe Pro Phe 1 5
<210> 243
<211> 14 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VL- CDRl
<400> 243
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Ser 15 10
<210> 244
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VL-
CDR2
<4 00> 244 Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.04 que codifica para VL-
CDR3
<400> 245
Gln Thr Tyr Asp Asn Ser Thr Asp 1 5
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.05 que codifica para VL-
CDRl <400> 246
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Ser Tyr Tyr Val His 1 5 10
<210> 247
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.05 que codifica para VL-
CDR2
<400> 247
[ 15 Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 248
<211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.05 que codifica para VL-
CDR3 <400> 248
Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Ile Leu Leu His 1 5 10
<210> 249
<211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VL- CDRl
<400> 249
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn
30
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
10
15
250
7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VL-
CDR2
250
Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
251 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.06 que codifica para VL-
CDR3
251
Gln Gln Tyr Tyr Gly Met Pro Leu
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
252 12 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.07 que codifica para VL-
CDRl
252 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
253 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.07 que codifica para VL-
CDR2
253
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
254 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.07 que codifica para VL-
CDR3
254
Gln Gln Tyr Gly Ser Val Pro Arg
255 11 PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifics para VL-
CDRl <4 00> 255
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Ser Tyr Tyr Val His 15 10 <210> 256
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifica para VL-
CDR2 <400> 256
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 257
<211> 9
<212> <213>
<220>
<223>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.08 que codifica para VL- CDR3 <400> 257
Ser Ala Tyr Asp Tyr Ser Ala Arg Thr 5
258 11 PRT
Seqüência artificial
20
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VL-
CDRl <400> 258
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 259
<211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VL- CDR2
<400> 259 Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 260
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.09 que codifica para VL- CDR3
<400> 260
Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Asn Ile Gly Leu
15 10
<210> 261
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VL- CDRl
<400> 261
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Ser Val His
15 10
<210> 262
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VL-
CDR2 <400> 262
Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5
<210> 263
<211> 8 <212> <213> <220> <223>
<400>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.10 que codifica para VL-
CDR3
263
Ser Ser Tyr Thr Asn Ser Val Asp
264 11 PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> 20 <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VL-
CDRl <400> 264
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val Gly 15 10
<210> 265
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VL- CDR2 <4 00> 265
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
266 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.11 que codifica para VL- CDR3 266
Gln Ser Tyr Asp Asp Thr Ser Ile
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
267 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VL-
CDRl
267
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asn Lys Tyr Val His
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
5 10
268 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VL- CDR2 268 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
269 8
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.12 que codifica para VL
CDR3
269
Gln Thr Trp Asp Tyr Val Gly Tyr
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<400>
270
14
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VL CDRl 270
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
271 7
PRT
Seqüência artificial
1 5 10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VL
CDR2 <400> 271
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 272
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lia.13 que codifica para VL-
CDR3 <400> 272
Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn
1 5 10
<210> 273
<211> 119
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve vsiriável sintéticâ ds Li02
<4 00> 273
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 15 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys 20 25 30
Leu Gly Asp Lys Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Phe Gln Asp Arg Lys Arg Leu Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp 85 90 95
Asp Thr Asn Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro 115
<210> 274
<211> 120 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li09
<400> 274
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115 120
<210> 275
<211> 120
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li06
<400> 275
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
85 90 95
Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120
<210> 276
<211> 121 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li05
<400> 276
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 1 5 10 15
Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asp Asn
20 25 30
Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Ile Leu Thr Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Val Gly Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Val Arg
85 90 95
Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
100 105 110
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115 120
<210> 277
<211> 120 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cade ia leve variável sintética de Li08
<400> 277
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120
<210> 278
<211> 120 <212> prt <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Lill
<400> 278
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 15 10 15
Ser Val Ser Ala Pro Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr Asp
50 55 60
Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120
<210> 279
<211> 122 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de LilO
<400> 279
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 15 10 15
Ser Met Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45
Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ile Asp Phe 65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu His Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg
100 105 110
Val Asp Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115 120
<210> 280 <211> 121 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de LiOl
<400> 280
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 15 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ala Asp Arg Phe Pro Ala Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115 120
<210> 281 <211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li07
<4 00> 281
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln
20 25 30
Leu Gly Asp Lys His Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Tyr Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala Gly Ile Ser
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp
85 90 95
Asp Ile Lys Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro 115
<210> 282
<211> 120
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li03
<4 00> 282 Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 15 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120
<210> 283
<211> 106 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 1A7
<400> 283
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 284
<211> 108 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 2F3
<4 00> 284
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Phe Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 285
<211> 114
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 3P1D10.2C3 <400> 285
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Arg
286 114 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 3P1E11.3B7
<400> 286
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110
Ile Arg
10
15
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223>
287 5
PRT
Seqüência artificial
Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
CARACTERÍSTICA_MISTA (3) . . (5)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi-
20
<4 00>
287
25
30
Ile Thr Xaa Xaa Xaa
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223>
288 5
PRT
Seqüência artificial
Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
CARACTERÍSTICA_MISTA (3)..(5)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi- na
<4 00> 288 Ala Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
5 <210> 289
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
10 <223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (3) .. (5)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi
15 na
<400> 289 Val Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 290
20 <211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
25 <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (3)..(5)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi na
30 <4 00> 290
Ser Pro Xaa Xaa Xaa
1 5 <210> 291
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 291
Ser Pro Arg Lys His
1 5
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 292
Ser Pro Arg Lys Lys
1 5
<210> 293
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 293
Ser Pro Arg Lys Arg
1 5
<210> 294
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220> <223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<400> 294
Ser Pro Lys Lys His
1 5
<210> 295
<2ll> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 295
Ser Pro His Lys His
1 5
<210> 296
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 296
Ser Pro Arg Arg His
1 5
<210> 297
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 297
Ser Pro Arg His His
1 5
<210> 298 <211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 298
Ser Pro Arg Arg Arg
1 5
<210> 299
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 299
Ser Pro His His His
1 5
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 300
Ser Pro Lys Lys Lys
1 5
<210> 301
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <400> 301 Leu Ser Pro Arg Lys His
1 5
<210> 302
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<4 00> 302
Leu Ser Pro Arg Lys Lys
1 5
<210> 303
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<4 00> 303
Leu Ser Pro Arg Lys Arg
1 5
<210> 304
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<400> 304 Leu Ser Pro Lys Lys His
1 5
<210> 305
<211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 305 Leu Ser Pro His Lys His 1 5
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 306 Leu Ser Pro Arg Arg His 1 5
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<4 00> 307 Leu Ser Pro Arg His His 1 5
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 308 Leu Ser Pro Arg Arg Arg 1 5
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 309
Leu Ser Pro His His His 1 5
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 310
Leu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 311
Trp Leu Ser Pro Arg Lys His
1 5
<210> 312
<211> 7
<212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 312
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Lys
1 5
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 313
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Arg
1 5
<210> 314
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 314
Trp Leu Ser Pro Lys Lys His
1 5
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 315
Trp Leu Ser Pro H.is Lys His 1 5
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 316
Trp Leu Ser Pro Arg Arg His
1 5
<210> 317
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 317
Trp Leu Ser Pro Arg His His
1 5
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 318
Trp Leu Ser Pro Arg Arg Arg
1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<400> 319
Trp Leu Ser Pro His His His
1 5
<210> 320
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 320
Trp Leu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 321
Ile Thr Pro Lys Arg Arg
1 5
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 322
Ala Cys His His Lys
1 5 <210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 323
Val Cys His His Lys
1 5
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<4 00> 324
Xaa Xaa Arg Lys His
1 5
<210> 325
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1)..(2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <4 00> 325 Xaa Xaa Arg Arg Arg 1 5
<210> 326
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) . . (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<400> 326
Xaa Xaa Lys Lys Lys
1 5
<210> 327
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1) . . (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<400> 327
Xaa Xaa His His His
1 5
<210> 328
<211> 5
<212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<4 00> 328
Xaa Xaa Arg Lys Lys
1 5
<210> 329
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<4 00> 329
Xaa Xaa Arg Lys Arg
1 5
<210> 330
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1) . . (2) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<400> 330
Xaa Xaa Lys Lys His
1 5
<210> 331
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<400> 331
Xaa Xaa His Lys His
1 5
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍ STICA_MISTA
<222> (1)..(2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<4 00> 332
Xaa Xaa Arg Arg His
1 5
<210> 333
<211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido
<400> 333
Xaa Xaa Arg His His
1 5
<210> 334
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (3)..(3)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi na
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (4) . . (4)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (5)..(5)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi na
<4 00> 334 Ile Thr Xaa Xaa Xaa
10
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223>
335
PRT
Seqüência artificial
Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
CARACTERÍSTICA_MISTA (3) . . (3)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi
<220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223>
CARACTERISTICA_MISTA ( 4 ) . . ( 4 )
Xaa pode ser qualquer aminoácido
CARACTERÍSTICA_MISTA (5) . . (5)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi
<4 00>
335
25
30
Ala Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220>
336 5
PRT
Seqüência artificial
Fragmento de peptideo de Sp35 sintético <221> CARACTERISTICA_MISTA
<222> (3)..(3)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi
<220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223>
<400> Val Cys 1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223>
CARACTERISTICA_MISTA
(4) . . (4)
Xaa pode ser qualquer aminoácido
CARACTER!STICA_MISTA
(5) . . (5)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi na
336
Xaa Xaa Xaa 5
337 5
PRT
Seqüência artificial
Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
CARACTERÍSTICA_MISTA (3) . . (3)
Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi
<220> <221> <222> <223> <220>
CARACT ERISTICA_MISTA (4) . . (4)
Xaa pode ser qualquer aminoácido <221> CARACTERISTICA_MISTA
<222> (5)..(5)
<223> Xaa pode ser lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagi- na
<400> 337
Ser Pro Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 338
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 338
Ser Pro Arg Leu His 1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 339
Arg Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys
5
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 340 Lys Lys Val Lys Val Lys Glu Lys Arg
1 5
<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptídeo de Sp35 sintético
<4 00> 341
Arg Arg Leu Arg Leu Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 342
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 342
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Fragmento de peptideo de Sp35 sintético
<400> 343
Arg Arg Ile Arg Ala Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 344
<211> 19
<212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Synthetic forward primer used to show Sp35 expression
<400> 344
agagacatgc gattggtga
19
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
345
21
DNA
Seqüência artificial
Iniciador reverso sintético usado para mostrar expressão de Sp35 345
agagatgtag acgaggtcat t
21
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
346
55
DNA
Seqüência artificial
Nucleotideo de RNAi de Sp35 sintético 346
tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc
55
347
59
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Nucleotideo de RNAi de Sp35 sintético
<400> 347
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca <210> 348
<211> 59
<212> DNA
59 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Nucleotideo de RNAi de Sp35 sintético
<400> 348
tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59
<210> 349
<211> 59
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Nucleotideo de RNAi de Sp35 sintético
<400> 349
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59
<210> 350
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para amplificar Sp35 de comprimento
total de camundongo <400> 350
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 351
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Inieiador sintético usado para amplificar Sp35 de comprimento
total de camundongo <400> 351
ggggcggaat tggatcctca cagatcetct tctgagatga g 41
<210> 352 <211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador sintético usado para amplificar Sp35 negativo dominan- te
<400> 352
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 353
<211> 42
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador sintético usado para amplificar Sp35 negativo dominan-
te
<400> 353
gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc 42
<210> 354
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador sintético usado para obter seqüência de codificação
parcial para humano Sp35 <400> 354
cagcaggtcg acgcggccgc atgctggcgg ggggcgt 37
<210> 355
<211> 59
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador sintético usado para obter seqüência de codificacão parcial para humano Sp35 <4 00> 355
cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg
59
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
356
39
DNA
Seqüência artificial
Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia leve do P1E11.3B7 356
ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag
39
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
<4 00>
357
40
DNA
Seqüência artificial
Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia leve do P1E11.3B7 357
ggggatatcc accatgragt cacakacyca ggtcttyrta
40
358
37
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca-
deia leve do P1E11.3B7 <400> 358
ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37
<210> 359
<211> 40 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia leve do P1E11.3B7
<400> 359
ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga 40
<210> 360
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia pesada do P1E11.3B7
<400> 360
ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt 39
<210> 361
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia pesada do P1E11.3B7
<400> 361
ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210> 362
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca- deia pesada do P1E11.3B7 <4 00> 362
ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct
38
363
39
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Xniciador sintético usado para determinar uma seqüência da ca-
deia pesada do P1E11.3B7 <400> 363
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 364
<211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador universal de cadeia pesada sintética
<4 00> 364
aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
365
34
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Iniciador universal de cadeia pesada sintética
<400> 365
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag <210> 366
<211> 28 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
34 <223> Iniciador de seqüência sinal degenerada sintética <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (21)..(21)
<223> η pode ser qualquer nucleotideo <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (24) .. (24)
<223> η pode ser qualquer nucleotideo
<400> 366
atggartgya aytggathct nccnttya
<210> 367
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador de domínio constante sintético
<400> 367
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac
<210> 368
<211> 66
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado para amplificar MOG de rato
<4 00> 368
ggggtatctc tcgagaaaag agagcatcat catcatcatc atatgggaca gttcagagtg ataggg
<210> 369
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético usado pâlTâ ârnplifiCâX" MOG ClS ITâtO
<400> 369
ttcgcggccg ctattagcca gggttgatcc agtagaaggg 40
<210> 370
<211> 354
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Lil3
<400> 370
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcgtttctt ctggtggctt tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300 gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 371
<211> 324
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Lil3
<400> 371
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatgta cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 372 <211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Lil3
<400> 372
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 373
<211> 108 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Lil3
<400> 373
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe 50 55 60
5 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
10 100 105
<210> 374
<211> 354
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li32
<4 00> 374
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacatga tgcagtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcaa tactaagtat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggagat 300
tatggatact ggttcgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 375
<211> 321
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li32
<4 00> 375
gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aqgcqagtca agacattagc tactatttaa attqgtatca gcaqaaacca 120
Leu Ile
Ser Gly
Glu Pro 80 Pro Met
95 gggatggccc ctaaactcct catctacgat gccttcattt tggaaggagg ggccccatca 180
cggttcagtg ggagcggctc tgggacagat ttttctttca ccatcagcaa tctacagcct 240
gaggatattg caacttattt ctgtcaacag tctgatcaac tgcccgtgac cttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcag a 321
<210> 376
<211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li32
<400> 376
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
15 20 25 30
Met Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 377
<211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li32
<400> 377
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
5 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg 100 105
<210> 378
<211> 357
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li33
<400> 378
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atttacccta tgttttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcat tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagagagggg 300 cataacgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 379
<211> 321
<212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li33
<400> 379
gacatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaggattttg cagtttatta ctgtcagcag tatgataagt ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 380
<211> 119
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li33
<400> 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30
Pro Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 381
<211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li33
<400> 381
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 382
<211> 357
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li34
<400> 382
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattacgaga tgtattgggt tcgccaagct cctggtaaag gtttggagtg gqtttctggt atctattctt ctagtggcat tactgtttat gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagggcagcc 300 atcctcgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 383
<211> 321
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li34
<400> 383
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc atgcgagtca ggacattagc aactatttaa gttggtatca gcagaaacca 120 ggtaaagccc ctaaactcct gatctacgat gctttcaatt tggagacagg agtcccatcg 180 aggttcagtg gaagtggatc tggcacagat tttacattca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacatatta ctgtcagcac tatgataatc tcccattcac tttcggccct 300 gggaccagag tggcgatcag a 321
<210> 384
<211> 119
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável
<400> 384
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr
50 55 60
Lys Gly Arq Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lvs
sintética de Li34
Gln Pro Gly Gly 15
Phe Ser Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Val 45
Ala Asp Ser Val Asn Thr Leu Tyr 65
Leu Gln Met Asn
Ala Arg Ala Ala 100
Thr Leu Val Thr 115
<210> 385
<211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li34
<4 00> 385
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Ala Ile Arg 100 105
<210> 386
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
70
Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90
Ile Leu Asp Trp Tyr Phe 105
Val Ser Ser 75 80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Asp Leu Trp Gly Arg Gly 110 <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VL-CDRl
<4 00> 386
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
15 10
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VL-CDR2
<4 00> 387
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VL-CDR3
<4 00> 388
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met Tyr Thr
15 10
<210> 389
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VH-CDRl
<4 00> 389
His Tyr Glu Met Tyr <210> 390
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VH-CDR2
<400> 390
Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Lil3 que codifica VH-CDR3
<400> 391
Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile 1 5
<210> 392
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VL-CDRl
<400> 392
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10
<210> 393
<211> 7
<212> PRT 386
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VL-CDR2
<400> 393
Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly
1 5
<210> 3 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VL-CDR3
<400> 394
Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val Thr
1 5
<210> 395
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VH-CDRl
<400> 395
Ala Tyr Met Met Gln
1 5
<210> 396
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VH-CDR2
<400> 396
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
397
9
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li32 que codifica VH-CDR3 397
Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro 1 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
398 11 PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li33 que codifica VL-CDRl 398
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
399 7
PRT
Seqüência artificial
15 10
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li33 que codifica VL-CDR2
<400> 399
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 400
<211> 9
<212> PRT <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li33 que codifica VL-CDR3
<400> 400
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 401
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li33 que codifica VH-CDRl
<400> 401
Ile Tyr Pro Met Phe
1 5
<210> 402
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li33 que codifica VH-CDR2
<400> 402
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de
anticorpo Li33 que codifica VH-CDR3 <400> 403
Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
404
11
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VL-CDRl 404
His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser
1
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
5 10
405 7
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VL-CDR2 405
Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr
406 9
PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VL-CDR3
<400> 406
Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Thr 1 5
<210> 407
<211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VH-CDRl
<400> 407
Asn Tyr Glu Met Tyr
1 5
<210> 408
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VH-CDR2
<400> 408
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 409
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li34 que codifica VH-CDR3
<400> 409
Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
15 10
<210> 410
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220> <223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDRl
<400> 410
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 411
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDR2
<400> 411
Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15
Gly
<210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDR3
<400> 412
Pro Tyr Tyr Gly Ser His Trp Phe Phe Asp Val
15 10
<210> 413
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDRl
<400> 413
Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Val His 1 5 10
<210> 414
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDR2
<400> 414
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDR3
<400> 415
Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 416
<211> 120
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de 3B5.2
<400> 416
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser His Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 417
<211> 106 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 3B5.2
<4 00> 417
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Leu Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Asn
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 418 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve capa humana e murina de consenso sintética <400> 418
Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5
<210> 419
<211> 106 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável mutante sintética de 3B5.2
<400> 419
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Val 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Leu Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 420
<211> 1404 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de 3Β5.2 de anticorpo quimérico murino e humano sintético
<400> 420
atgggatgga gctgtgtaat gctcttggta tcaacagcta caggtgtcca ctcccaggtc 60
caactgcagc agcctggggc tgagctggtg aggcctggga cttcagtgaa gttgtcctgc 120
agggcttctg gctacacctt caccagctac tggatgcact gggtaaagca gaggcctgga 180
caaggccttg agtggatcgg agtgattgat ccttctgata gttatactaa ctacaatcaa 240
aagttcaggg gcaaggccac attgactgta gacacatcct ccagcacagc ctacatgcag 300
ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagacc ttactacggt 360
agtcactggt tcttcgatgt ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720
tgtgacaaga ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac 1260
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380
agcctctccc tgtctcccgg ttga 1404 <210> 421 <211> 708 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de 3Β5.2 de anticorpo quimérico murino e humano sinté- tico
<400> 421
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcacgt gtaagttacg tgcactggta ccagcagaag 180
tcaggcacct cccccaaaag atggctttat gacacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gctcgcttcg gtggcaatgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta ctaacccacc cacgttcgga 360
ggggggacca agctggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708
<210> 422
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de 3B5.2
<400> 422
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 60
tcctgcaggg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180
aatcaaaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaccttac 300
tacggtagtc actggttctt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 423 <211> 318
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de 3B5.2
<400> 423
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc acgtgtaagt tacgtgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggct ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcggtggca atgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtactaacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaa 318
<210> 424
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDRl
<400> 424
agctactgga tgcac 15
<210> 425
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDR2
<400> 425
gtgattgatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcagggg c 51
<210> 426
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VH-CDR3
<4 00> 426
ccttactacg gtagtcactg gttcttcgat gtc 33
<210> 427
30 DNA
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDRl
<4 00> 427
agtgccagct cacgtgtaag ttacgtgcac 30
<210> 428
21 DNft
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <4 00>
Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDR2 428
gacacatcca acctggcttc t <210> 429
21
27 DNA
Seqüência artificial
<211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo 3B5.2 que codifica VL-CDR3
<4 00> 429
cagcagtgga gtactaaccc acccacg 27
<210> 430
<211> 106 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Variante de cadeia leve sintética 1
<400> 430
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 10 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 431
<211> 106 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Variante de cadeia leve sintética 2
<400> 431
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
85 90
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 432
<211> 116 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Variante de cadeia pesada sintética 2
<400> 432
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 433
<211> 447
<212> PRT
Ser Leu Glu Pro Glu 80
Ser Asn Pro Phe Thr 95 <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li81
<400> 433
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Glu Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 434
<211> 215
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li81
<400> 434
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 435 <211> 447
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesda variável aglicosilada sintética de
Li81
<400> 435
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Glu Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 436 <211> <212> <213> <220> <223> <400>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDRl 436
Ala Tyr Glu Met Lys
437
17
PRT
Seqüência artificial
1
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDR2
<400> 437
Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
438 9
PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDR3
<400> 438
Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 439
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDRl
<400> 439
gcttacgaga tgaag 15
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
440
51
DNA
Seqüência artificial
Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDR2 440
gttatcggtc cttctggtgg ctttactttt tatgctgact ccgttaaagg t
51
441
27
DNA
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VH-CDR3
<400> 441
gagggtgata atgatgcttt tgatatc 27
<210> 442
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDRl
<400> 442
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 443
<211> 7
<212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDR2
<400> 443
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 444
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDR3
<400> 444
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met Tyr Thr
1 5 10
<210> 445
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDRl
<400> 445
agggccagtc agagtgttag cagctactta gcc 33
<210> 446
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDR2
<400> 446
gatgcatcca acagggccac t 21
<210> 447 <211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência sintética de anticorpo Li81 que codifica VL-CDR3
<400> 447
cagcagcgta gcaactggcc gatgtacact 30
<210> 448
<211> 1341
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável sintética de Li81
<400> 448
gaagtacaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttçagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgaga tgaagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atcggtcctt ctggtggctt tactttttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300 gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaga ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaaqqgcagc cccgagaacc acaggtçjtac accctqcccc catcccggaa tgagctgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctcccgg t 1341
<210> 449
<211> 648
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável sintética de Li81
<400> 449
gatatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 450 <211> 1341 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Seqüência de cadeia pesda variável aglicosilada sintética Li81 <4 00> 450 gaagtacaat tqttaqagtc tgqtqçcggt cttqttcagc ctqgtgqttc tttacqtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgaga tgaagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atcggtcctt ctggtggctt tactttttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300 gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaga ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcgcg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg "caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctcccgg t 1341 <210> 451
<211> 94
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável de capa 6 de subgrupo murino
sintética <400> 451
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
85 90
452 96 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> <4 00>
Seqüência de cadeia pesada variável de HVMS de subgrupo murino sintética 452
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
<210> 453
<211> 96 <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223>
PRT
Seqüência artificial
Seqüência de consenso murina sintética
CARACTERÍSTICA_MISTA (2) . . (2)
Xaa ou é isoluecina ou valina
CARACTERÍSTICA_MISTA (54)..(54)
Xaa ou é aspartato ou glutamato
CARACTERÍSTICA_MISTA (61) . . (61)
Xaa ou é treonina ou alanina
CARACTERÍ STICA_MISTA (62)..(62)
Xaa ou é glutamato ou aspartato
CARACTERÍSTICA_MISTA (65)..(65)
Xaa is either glutamina ou lisina
CARACTERÍSTICA_MISTA (79)..(79)
Xaa ou é valina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MXSTA (83) .. (83)
Xaa ou é fenilalanina ou isoleucina <400> 453
Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Xaa Xaa Asp Phe
50 55 60
Xaa Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Xaa Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Xaa Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
<210> 454
<211> 96
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Linhagem germinal de VGK6 murina
<400> 454
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 455
94
PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve variável capa 3 de subgrupo humano sin-
tética <400> 455
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
15 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
85 90
456 95 PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
Seqüência de consenso sintética
CARACTERíSTICA_MISTA (1) · · (1)
Xaa pode ser ou glutamina ou glutamato CARACTERÍSTICA MISTA <222> (10)..(10)
<223> Xaa pode ser ou isoleucina ou treonina
<220>
<221> CARACTERÍ STICA_MISTA
<222> (11)..(11)
<223> Xaa pode ser ou metionina ou leucina
<220>
<221> CARACTERÍ STICA_MISTA
<222> (13)..(13)
<223> Xaa pode ser ou alanina ou leucina
<220>
<221> CARACTER!STICA_MISTA
<222> (18)..(18)
<223> Xaa pode ser ou lisina ou arginina
<220>
<221> CARACTER!STICA_MISTA
<222> (19) .. (19)
<223> Xaa pode ser ou valina ou alanina
<220>
<221> CARACTERISTICA_MISTA
<222> (21) .. (21)
<223> Xaa pode ser ou metionina ou leucina
<220>
<221>CARACTERISTICA_MISTA
<222> (22)..(22)
<223> Xaa pode ser ou treonina ou serina
<220>
<221>CARACTER1STICA_MISTA
<222> (24) .. (24)
<223> Xaa pode ser ou serina ou arginina
<220>
<221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(27)..(27)
Xaa pode ser ou serina ou glutamina
CARACTERÍSTICA_MISTA (31)..(31)
Xaa pode ser ou serina ou não presente
CARACTERÍSTICA_MISTA
(33)..(33)
Xaa pode ser ou metionina ou leucina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(34)..(34)
Xaa pode ser ou histidina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA (40) . . (40)
Xaa pode ser ou serina ou prolina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(42) . . (42)
Xaa pode ser ou treonina ou glutamina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(43) . . (43)
Xaa pode ser ou serina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA (45) . . (45)
Xaa pode ser ou lisina ou arginina CARACTERÍSTICA MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(46) . . (46)
Xaa pode ser ou arginina ou leucina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(47) .. (47)
Xaa pode ser ou triptofan ou leucina
CARACTERÍSTICA_MISTA (51) .. (51)
Xaa pode ser ou treonina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(53)..(53)
Xaa pode ser ou lisina ou asparagina
CARACTERÍ STICA_MISTA
(54) . . (54)
Xaa pode ser ou leucina ou arginina
CARACTERÍSTICA_MISTA (56) . . (56)
Xaa pode ser ou serina ou treonina
CARACTERÍSTICA_MISTA (58)..(58)
Xaa pode ser ou valina ou isoleucina
CARACTERÍSTICA_MISTA (70) .. (70)
Xaa pode ser ou serina ou aspartato CARACTERÍSTICA MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(71)..(71)
Xaa pode ser ou tirosina ou fenilalanina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(72) . . (72)
Xaa pode ser ou serina ou treonina
CARACTERÍ STICA_MISTA (78) . . (78)
Xaa pode ser ou metionina ou leucina
CARACTERÍSTICA_MISTA (80)..(80)
Xaa pode ser ou alanina ou prolina
CARACTERÍSTICA_MISTA (83) . . (83)
Xaa pode ser ou alanina ou fenilalanina
CARACTERÍSTICA_MISTA (85)..(85)
Xaa pode ser ou treonina ou valina
CARACTERÍSTICA_MISTA (91)..(91)
Xaa pode ser ou triptofan ou arginina
CARACTERÍSTICA_MISTA (93)..(93)
Xaa pode ser ou serina ou asparagina CARACTERÍSTICA MISTA <222> (94) . . (94)
<223> Xaa pode ser ou asparagina ou triptofan
<400> 456
Xaa Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Glu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys Xaa 20
Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa
35 40
Tyr Asp Xaa Ser Xaa Xaa Ala Xaa
50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Xaa Xaa 65 70
Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys 85
<210> 457
<211> 95
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Linhagem germinal de L6 humana
<400> 457
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Ala Xaa Xaa Ser Xaa Ser Pro Gly
10 15
Ala Ser Xaa Ser Val Ser Xaa Tyr 25 30
Gly Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Ile 45
Gly Xaa Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60
Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Glu Xaa
75 80
Gln Gln Xaa Ser Xaa Xaa Pro 90 95 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95
<210> 458
<211> 98
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada variável de MHVl de subgrupo humano
sintética <400> 458
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 459
<211> 98
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de consenso sintética <220>
<221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(9) . . (9)
Xaa pode ser ou prolina ou histidina
CARACTERÍSTICA_MISTA (11)..(11)
Xaa pode ser ou leucina ou valina
CARACTERÍSTICA_MISTA (13)..(13)
Xaa pode ser ou lisina ou glutamina
CARACTERÍSTICA_MISTA (16)..(16)
Xaa pode ser ou glutamato ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA (17)..(17)
Xaa pode ser ou treonina ou serina
CARACTERÍSTICA_MISTA (20)..(20)
Xaa pode ser ou isoleucina ou valina
CARACTERÍSTICA_MISTA (28)..(28)
Xaa pode ser ou treonina ou serina
CARACTERÍSTICA_MISTA (31)..(31)
Xaa pode ser ou arginina ou treonina
CARACTERÍSTICA_MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(38)..(38)
Xaa pode ser ou lisina ou prolina
CARACTERÍSTICA_MISTA (43)..(43)
Xaa pode ser ou lisina ou glutamina
CARACTERÍSTICA_MISTA (46)..(46)
Xaa pode ser ou lisina ou glutamato
CARACTERÍSTICA_MISTA (51)..(51)
Xaa pode ser ou isoleucina ou fenilalanina
CARACTERÍSTICAJMISTA (54) . . (54)
Xaa pode ser ou aspartato ou tirosina
CARACTERÍSTICA_MISTA (57) . . (57)
Xaa pode ser ou glutamato ou arginina
CARACTERÍSTICA_MISTA (61)..(61)
Xaa pode ser ou treonina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA (62) . . (62)
Xaa pode ser ou glutamato ou glutamina CARACTERÍSTICA MISTA <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221>
(63)..(63)
Xaa pode ser ou aspartato ou glicina
CARACTERÍSTICA_MISTA (65)..(65)
Xaa pode ser ou glutamina ou treonina
CARACTERÍ ST X CA_MISTA (69)..(69)
Xaa pode ser ou alanina ou valina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(72).. (72)
Xaa pode ser ou leucina ou metionina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(73) .. (73)
Xaa pode ser ou glutamato ou aspartato
CARACTERÍSTICA_MISTA (79) . . (79)
Xaa pode ser ou valina ou alanina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(83)..(83)
Xaa pode ser ou fenilalanina ou isoleucina
CARACTERÍSTICA_MISTA
(84)..(84)
Xaa pode ser ou arginina ou serina CARACTERÍSTICA MISTA <222> (85)..(85)
<223> Xaa pode ser ou arginina ou serina
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (88)..(88)
<223> Xaa pode ser ou arginina ou alanina
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (91)..(91)
<223> Xaa pode ser ou treonina ou metionina
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (93)..(93)
<223> Xaa pode ser ou treonina ou metionina
<220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA
<222> (95)..(95)
<223> Xaa pode ser ou fenilalanina ou tirosina
<4 00> 459
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15
Xaa Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Xaa Trp Met
35 40 45
Gly Trp Xaa Asn Thr Xaa Thr Gly Xaa Pro Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Phe
50 55 60
Xaa Gly Arg Phe Xaa Phe Ser Xaa Xaa Thr Ser Ala Ser Thr Xaa Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Xaa Xaa Xaa Leu Lys Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Xaa Cys 85 90 95
Ala Arg PRT
Seqüência artificial
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Linhagem germinal de huVH7~81 humana
<4 00> 460
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
461
1395
DNA
Seqüência artificial
Ala Arg <210> <211> <212> <213> <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada de H2 de huPlA7-IgGl humana
<4 00> 461
atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactcccag gtccaactgg tacagtctgg acacgaggtg aagcagcctg gagcatcagt caaggtctcc tgcaaggcct ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcct ggacaaggtt taaagtggat gggctggata aacaccgaca ctggagagcc aacatatact gaaqatttcc agggacgqtt tqtcttctct ttqgacacct ctgccagcac tgtttattta
60 120 180 240 300 cagatcagca gcctcaaagc tgaggacatg gcaatgtatt actgtgcaag agagggggtc 360
cactttgact actggggcca agggaccctt gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaag 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctcccg gttga 1395 <210> 462
<211> 464
<212> PRT
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada de H2 de huPlA7-IgGl hum;
<400> 462
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gln Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335
5 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 10 370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415
15 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 20 450 455 460
<210> 463
<211> 708
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
25 <220>
<223> Seqüência de cadeia leve de Ll capa de huPlA7 humana
<4 00> 463
atggattttc aggttcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60
agaggagaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaaccttgt ctttatctcc aggggagaga 120
30 gccaccttgt cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180
ccaggccaag cgcccagaag actgatttat gacacatcca aactggcttc tggaatccct 240
qctcqcttca gtggcaqtga qtctgggacc gattacactc tcaccatcag cagcttggaq 300 cctgaagatt tcgccgttta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360 caggggacaa aggtggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708
<210> 464
<211> 235
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve de Ll de huPlA7 humana
<400> 464
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
<210> 465
<211> 708
<212> DNA
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve de L2 capa de huPlA7 humana
<400> 465
atggattttc aggttcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaaccttgt ctttatctcc aggggagaga 120
gccaccttgt cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180
ccaggccaag cgcccagaag actgatttat gacacatcca aactggcttc tggaatccct 240
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gattacactc tcaccatcag cagcttggag 300
cctgaagatt tcgccgttta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360
caggggacaa aggtggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 466 <211> 235
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve de L2 de huPlA7 humana
<400> 466
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 15 10 15
Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
<210> 467
<211> 708
<212> DNA
<220>
humana <400> 467
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180
tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 24 0
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360
tcggggacaa agttggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708
<210> 468
<211> 235
<212> PRT
<220>
<223> Seqüência de cadeia leve de chPlA7 quimérico murino
<400> 468
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala- Ser 1 5 10 15
Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 469
<211> 1395
<212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesada de chPlA7 quimérico murino e humana
<400> 469
atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactcccag 60 gtccaactgg tacagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggcct ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacaccgaca ctggagagcc aacatatact 240 gaagatttcc agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgtttatttg 300 cagttcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agagggggtc 360 cactttgact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaag 720 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctcccg gttga 1395
<210> 470
<211> 464
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de cadeia pesada de chPlA7 quimérico murino e humana
<400> 470
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225
Thr His Thr Cys
Ser Val Phe Leu 260
Arg Thr Pro Glu 275
Pro Glu Val Lys 290
Ala Lys Thr Lys 305
Val Ser Val Leu
Tyr Lys Cys Lys 340
Thr Ile Ser Lys 355
Leu Pro Pro Ser 370
Cys Leu Val Lys 385
Ser Asn Gly Gln
Asp Ser Asp Gly 420
Ser Arg Trp Gln 435
Ala Leu His Asn 450
<210> 471
<211> 106 <212> PRT
230
Pro Pro Cys Pro 245
Phe Pro Pro Lys
Val Thr Cys Val 280
Phe Asn Trp Tyr 295
Pro Arg Glu Glu 310
Thr Val Leu His 325
Val Ser Asn Lys
Ala Lys Gly Gln 360
Arg Asp Glu Leu 375
Gly Phe Tyr Pro 390
Pro Glu Asn Asn 405
Ser Phe Phe Leu
Gln Gly Asn Val 440
His Tyr Thr Gln 455
235
Ala Pro Glu Leu 250
Pro Lys Asp Thr 265
Val Val Asp Val
Val Asp Gly Val 300
Gln Tyr Asn Ser 315
Gln Asp Trp Leu 330
Ala Leu Pro Ala 345
Pro Arg Glu Pro
Thr Lys Asn Gln 380
Ser Asp Ile Ala 395
Tyr Lys Thr Thr 410
Tyr Ser Lys Leu 425
Phe Ser Cys Ser
Lys Ser Leu Ser 460
240
Leu Gly Gly Pro 255
Leu Met Ile Ser 270
Ser His Glu Asp 285
Glu Val His Asn
Thr Tyr Arg Val 320
Asn Gly Lys Glu 335
Pro Ile Glu Lys 350
Gln Val Tyr Thr 365
Val Ser Leu Thr
Val Glu Trp Glu 400
Pro Pro Val Leu 415
Thr Val Asp Lys 430
Val Met His Glu 445
Leu Ser Pro Gly <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Variante de cadeia leve sintética 3
<400> 471
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 472
<211> 116
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Variante de cadeia pesada sintética 1
<400> 472
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 473
<211> 116 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Variante de cadeia pesada sintética 3
<400> 473
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 474
<211> 466
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de cadeia pesda variável aglicosilada sintética de Li81
<400> 474
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ala Tyr Glu Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Pro Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 441
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pro Gly 465

Claims (212)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga ao mesmo epítopo de Sp35 como um anti- corpo monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em 3B5.2, 7P1D5.1G9 e Li81.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga a Sp35, em que o dito anticorpo ou frag- mento do mesmo competitivamente inibe um anticorpo monoclonal de refe- rência selecionado do grupo que consiste em 3B5.2, 7P1D5.1G9 e Li81.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga a Sp35, em que o dito anticorpo ou frag- mento do mesmo é selecionado do grupo que consiste em 3B5.2, 7P1D5.1G9 e Li81.
4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3 que liga a um epítopo linear.
5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3 que liga a um epítopo conformacional não-linear.
6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga ao domínio LRR de Sp35.
7. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga ao domínio LRRNT ou LRRCT de Sp35.
8. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga à região de Sp35 dos aminoácidos 417-532 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 495-532 da SEQ ID NO: 2.
9. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga ao domínio da região básica de Sp35.
10. Anticorpo ou fragmento do mesmo da reivindicação 9 que liga aos aminoácidos 415 a 424 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 417 a 424 da SEQ ID NO: 2.
11. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga ao domínio da imunoglobulina de Sp35.
12. Anticorpo ou fragmento do mesmo da reivindicação 11 que liga aos aminoácidos 419 a 493 da SEQ ID NO: 2.
13. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5 que liga ao domínio LLRCT de Sp35.
14. Anticorpo de fragmento do mesmo da reivindicação 13 que liga aos aminoácidos 363 a 414 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 363 a 416 da SEQ ID NO: 2.
15. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 14 que é um multivalente e compreende pelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas cadeias leves.
16. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 15 que é multiespecífico.
17. Anticorpo ou fragmento do mesmo da reivindicação 16 que é biespecífico.
18. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17 que é humanizado.
19. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17 que é quimérico.
20. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17 que é primatizados.
21. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17 que é completamente humano.
22. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 que é um fragmento Fab.
23. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 que é um fragmento Fab.
24. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 que é um fragmento F(ab)2.
25. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 que é um fragmento Fv.
26. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21 que é um anticorpo de cadeia simples.
27. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1, 2, ou 4 a 26 que especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) que é menos que a Kd para o dito anticorpo monoclonal de referência.
28. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 26 que especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35 com uma afi- nidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que χ KT2 Μ, 10'2 M, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 M, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 -10 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10'8 Μ, 5 χ ΙΟ-9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ -10"10 Μ, 10~10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ KT12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 1Ό~13 Μ, 10'13 Μ, 5 χ ΙΟ-14 Μ, ΙΟ-14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
29. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 28 que preferencialmente liga a um polipeptídeo de Sp35 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de Sp35 mürino ou fragmento do mesmo.
30. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista de inibição do desenvolvimento de neurite mediada por Sp35.
31. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista da morte de célula neuronal medi- ada por Sp35.
32. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista de inibição da mielinização media- da por Sp35.
33. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista da morte de células dos oligoden- drócitos mediada porSp35.
34. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista de inibição da diferenciação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
35. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 29 que é um antagonista de inibição da proliferação de oli- godendrócitos mediada porSp35.
36. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 35, adicionalmente compreendendo um polipeptídeo heteró- logo fundido a este.
37. Anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 36, em que o dito anticorpo é conjugado com um agente se- lecionado do grupo que consiste em um agente terapêutico, um pró- medicamento, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador de resposta biológica, um agente farmacêutico, ou PEG.
38. Composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 37, e um veículo.
39. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo uma região VH e uma região VL em que as ditas regiões VH e VL compreendem, respectivamente, seqüências de polipeptí- deo pelo menos 90% idênticas aos polipeptídeos de referência SEQ ID NO: -416 e SEQ ID NO: 417; SEQ ID NO: 433 e SEQ ID NO: 434; ou SEQ ID NO: -435 e SEQ ID NO: 434 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga a Sp35.
40. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo uma região VH e uma região VL em que as ditas regiões VH e VL, respectivamente, são idênticas, com exceção de menos de substituições de aminoácido conservadoras, aos polipeptídeos de refe- rência SEQ ID NO: 416 e SEQ ID NO: 417; SEQ ID NO: 433 e SEQ ID NO: -434; ou SEQ ID NO: 435 e SEQ ID NO: 434 e em que um anticorpo ou frag- mento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga a Sp35.
41. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo uma região VH e uma região VL em que as ditas regiões VH e VL compreendem, respectivamente, os polipeptídeos selecio- nados do grupo que consiste em
42. [Claim missing on original document]
43. [Claim missing on original document]
44. [Claim missing on original document]
45. [Claim missing on original document]
46. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região VH pelo menos 90 % idêntica à seqüência de poli- peptídeo de VH de referência da SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 433 ou SEQ ID NO: 435 em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga a Sp35.
47. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região VH idêntica à seqüência de polipeptídeo de VH de referência da SEQ ID NO: 416, 432, 433 ou 435, com exceção de menos de -20 substituições de aminoácido conservadoras, e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH es- pecificamente liga a Sp35.
48. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 46 ou -47, em que a dita VH é idêntica à dita VH de referência.
49. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 46 ou -47, em que a dita VH é codificada pela seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 422, 448 ou 450.
50. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 49, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal fundido à dita VH.
51. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 49, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH1 fundido à dita VH.
52. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 49, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH2 fundido à dita VH.
53. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 49, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH3 fundido à dita VH.
54. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 49, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica a região de dobradiça fundida à dita VH.
55. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 54, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH especificamente liga ao mesmo epítopo que o anticor- po monoclonal 3B5.2 ou Li81.
56. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 54, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH competitivamente inibe o anticorpo monoclonal 3B5.2 ou Li81 de ligar-se a Sp35.
57. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 54, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 M, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10-6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 1CT7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 1CT9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10-10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10'12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10-13 Μ, - 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
58. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são pelo menos 90 % idên- ticas, respectivamente, às seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de referência SEQ ID NO: 413, 414 e 415, ou SEQ ID NO: 442, 443 e 444 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
59. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são respectivamente idên- ticas, com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conserva- doras, às seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de referência SEQ ID NO: 413, 414 e 415 ou SEQ ID NO: 442, 443 e 444 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
60. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 ou -59, em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL compreendem, res- pectivamente, as seqüências de polipeptídeo SEQ ID NO: 413, 414 e 415 ou SEQ ID NO: 442, 443 e 444.
61. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que as ditas regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são codificadas pela seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, e SEQ ID NO: 429; ou SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, e SEQ ID NO: 447.
62. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região VL pelo menos 90 % idêntica à seqüência de poli- peptídeo de VL de referência da SEQ ID NO: 417 ou 434, em que um anti- corpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
63. Polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região VL idêntica à seqüência de polipeptídeo de VL de referência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 417; SEQ ID NO: 430; SEQ ID NO: 431; SEQ ID NO: 442; SEQ ID NO: 443 e SEQ ID NO: -444; com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conservado- ras, e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
64. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 62 ou -63, em que a dita VL é idêntica à dita VL de referência.
65. Polinucleotídeo da reivindicação 64, em que a dita VL é codi- ficada pela seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 423 ou SEQ ID NO: -449.
66. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 65, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal fundido à dita VL.
67. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 65, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH1 fundido à dita VL.
68. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 65, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH2 fundido à dita VL.
69. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 65, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica um domínio CH3 fundido à dita VL.
70. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 65, adicionalmente compreendendo um ácido nucléico que codifica a região de dobradiça fundida à dita VL.
71. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 70, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VL especificamente liga ao mesmo epítopo que o anticor- po monoclonal 3B5.2 ou Li81.
72. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 70, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VL competitivamente inibe o anticorpo monoclonal 3B5.2 ou Li81.
73. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 72, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VL especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M.
74. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 73, adicionalmente compreendendo um polinucleotídeo heterólogo.
75. Polinucleotídeo da reivindicação 74, em que o dito polinucle- otídeo heterólogo codifica um polipeptídeo heterólogo.
76. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga a um epítopo linear.
77. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga a um epítopo con- formacional não-linear.
78. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga ao domínio LRR de Sp35.
79. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga ao domínio LRRNT de Sp35.
80. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga ao domínio LRRCT de Sp35.
81. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga ao domínio da imu- noglobulina de Sp35.
82. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga à região básica de Sp35.
83. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é uma molécula de anticorpo multivalente compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas ca- deias leves.
84. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é multiespecífico.
85. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é biespecífico.
86. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é monovalente, bivalente, polivalente, ou bifuncional.
87. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é humanizado.
88. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é quimérico.
89. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é primatizado.
90. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é completamente humano.
91. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um fragmento Fab.
92. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um fragmento Fab'.
93. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um fragmento F(ab)2.
94. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um fragmento Fv.
95. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um anticorpo de cadeia simples.
96. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35 com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, KT5 Μ, 5 χ KT6 Μ, KT6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10'7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, KT8 Μ, 5 χ 10'9 Μ, KT9 Μ, 5 χ KT10 Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ KT11 Μ, 10~11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, ΙΟ-12 Μ, 5 χ -10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 M1 ou 10"15 Μ.
97. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL preferencialmente liga a um polipeptídeo de Sp35 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de Sp35 murino ou fragmento do mesmo.
98. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um antagonista de inibição do desen- volvimento de neurite mediada por Sp35.
99. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VH ou a dita VL é um antagonista de inibição da mielini- zação mediada por Sp35.
100. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a -75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH ou a dita VL é um antagonista da morte de células dos oligodendrócitos mediada por Sp35.
101. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a -75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH ou a dita VL é um antagonista de inibição da dife- renciação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
102. Polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 75, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH ou a dita VL é um antagonista de inibição da proli- feração de oligodendrócitos mediada por Sp35.
103. Composição compreendendo o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 102.
104. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi- cação de VH e um polinucleotídeo de codificação de VL1 em que o dito poli- nucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL, respectivamente, compreendem polinucleotídeos que codificam seqüên- cias de aminoácido pelo menos 90 % idênticas aos polipeptídeos de referên- cia SEQ ID NO: 416 e SEQ ID NO: 417; ou SEQ ID NO: 433 e SEQ ID NO: 434; ou SEQ ID NO: 435 e SEQ ID NO: 434 e em que os ditos polinucleotí- deos de codificação de VH e VL juntos codificam um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que especificamente liga a Sp35.
105. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi- cação de VH e um polinucleotídeo de codificação de VL1 em que o dito poli- nucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL, respectivamente, compreendem polinucleotídeos que codificam sequên- cias de aminoácido idênticas, com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conservadoras, aos polipeptídeos de referência SEQ ID NO: 416 e SEQ ID NO: 417; ou SEQ ID NO: 433 e SEQ ID NO: 434; ou SEQ ID NO: 435 e SEQ ID NO: 434 e em que os ditos polinucleotídeos de codificação de VH e VL juntos codificam um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que especificamente liga a Sp35.
106. Composição compreendendo um polinucleotídeo de codifi- cação de VH e um polinucleotídeo de codificação de VL, em que o dito poli- nucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleotídeo de codificação de VL, respectivamente, compreendem polinucleotídeos que codificam sequên- cias de aminoácido idêntica aos polipeptídeos de referência selecionados do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 416 e SEQ ID NO: 417; (ii) SEQ ID NO: 430 e SEQ ID NO: 432; (iii)SEQ ID NO: 431 e 432 (iv) SEQ ID NO: 433 e 434; e (v) SEQ ID NO: 435 e 434.
107. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -106, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleo- tídeo de codificação de VL compreendem, respectivamente, as seqüências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 422 e SEQ ID NO: 423; ou SEQ ID NO: 448 e SEQ ID NO: 449; ou SEQ ID NO: 450 e SEQ ID NO: 449.
108. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que o dito polinucleotídeo de codificação de VH e o dito polinucleo- tídeo de codificação de VL estão contidos na mesma estrutura de leitura a- berta, de modo que os polipeptídeos de VH e VL codificados pelos ditos po- linucleotídeos estão compreendidos em um anticorpo de cadeia simples ou fragmento do mesmo.
109. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga a um epítopo linear.
110. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga a um epítopo con- formacional não-linear.
111. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRR de Sp35.
112. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRRNT de Sp35.
113. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRRCT de Sp35.
114. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga ao domínio da imu- noglobulina de Sp35.
115. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga à região básica de Sp35.
116. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é uma molécula de anticorpo multivalente compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas ca- deias leves.
117. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é multiespecífico.
118. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é biespecífico.
119. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é monovalente, bivalente, polivalente, ou bifuncional.
120. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é humanizado.
121. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a 107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é quimérico.
122. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é primatizado.
123. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é completamente humano.
124. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um fragmento Fab.
125. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um fragmento Fab'.
126. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um fragmento F(ab)2.
127. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um fragmento Fv.
128. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um anticorpo de cadeia simples.
129. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35 com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10'4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10*6 Μ, 5 χ 10-7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ IO-8 Μ, IO-8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, ΙΟ-9 Μ, 5 χ ΙΟ-10 Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ IO-11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ ΙΟ-12 Μ, 10'12 Μ, 5 χ -10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
130. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL preferencialmente liga a um polipeptídeo de Sp35 humano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de Sp35 murino ou fragmento do mesmo.
131. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um antagonista de inibição do desenvol- vimento de neurite mediada por Sp35.
132. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um antagonista de inibição da mieliniza- ção mediada por Sp35.
133. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um antagonista da morte de células dos oligodendrócitos mediada por Sp35.
134. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um antagonista de inibição da diferenci- ação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
135. Composição de qualquer uma das reivindicações 104 a -107, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo as ditas VH e VL é um antagonista de inibição da prolifera- ção de oligodendrócitos mediada por Sp35.
136. Vetor compreendendo o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 102.
137. Vetor da reivindicação 136, em que o dito polinucleotídeo é operavelmente associado a um promotor.
138. Vetor da reivindicação 136, em que o dito polinucleotídeo que codifica uma VH e o dito polinucleotídeo que codifica uma VL são fundi- dos em estrutura, cotranscritos de um promotor simples operavelmente as- sociado a este, e são cotransladados em um anticorpo de cadeia simples ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
139. Vetor da reivindicação 136, em que o dito polinucleotídeo que codifica uma VH e o dito polinucleotídeo que codifica uma VL são co- transcritos de um promotor simples operavelmente associado a este, mas são transladados separadamente.
140. Vetorda reivindicação 139, adicionalmente compreendendo uma seqüência de IRES disposta entre o dito polinucleotídeo que codifica uma VH e o dito polinucleotídeo que codifica uma VL.
141. Vetor da reivindicação 139, em que o dito polinucleotídeo que codifica uma VH e o dito polinucleotídeo que codifica uma VL são trans- critos separadamente, cada sendo operavelmente associado a um promotor separado.
142. Vetor da reivindicação 141, em que os ditos promotores separados são cópias do mesmo promotor.
143. Vetor da reivindicação 141, em que os ditos promotores separados não-idênticos.
144. Composição compreendendo o vetor de qualquer uma das reivindicações 136 a 143.
145. Composição compreendendo um primeiro vetor compreen- dendo um polinucleotídeo de codificação de VH de qualquer uma das reivin- dicações 45 a 57 ou 74 a 102 e um segundo vetor compreendendo um poli- nucleotídeo de codificação de VL de qualquer uma das reivindicações 58 a -73 ou 74 a 102.
146. Célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 102 ou o vetor de qualquer uma das reivindicações 136 a 145.
147. Célula hospedeira compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo vetor, em que os ditos primeiro e segundo vetores são não- idênticos, em que o dito primeiro vetor compreende o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 42 a 57 ou 74 a 112 que codifica uma regi- ão variável de cadeia pesada da imunoglobulina, e em que o dito segundo vetor compreende o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 58 a 73 ou 74 a 102 que codifica uma região variável de cadeia leve da imuno- globulina.
148. Método de produzir um anticorpo de antiSp35, compreen- dendo cultivar a célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 146 a 147, e restabelecer o dito anticorpo.
149. Anticorpo de antiSp35, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, produzido pelo método da reivindicação 148.
150. Polipeptídeo isolado compreendendo uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VH são pelo menos 90 % idênticas, respectivamente, às se- qüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada de referência SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, e SEQ ID NO: 412; ou SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 e SEQ ID NO: 438 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga a Sp35.
151. Polipeptídeo isolado compreendendo uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VH são idênticas respectivamente, com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conservadoras, às seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada de referência SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, e SEQ ID NO: 412; ou SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 e SEQ ID NO: 438 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga a Sp35.
152. Polipeptídeo isolado, compreendendo uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VH são SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, e SEQ ID NO: 412; ou SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 e SEQ ID NO: 438.
153. Polipeptídeo isolado compreendendo uma VH pelo menos 90 % idêntica à seqüência de VH de referência SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 433 ou SEQ ID NO: 435, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga a Sp35.
154. Polipeptídeo isolado compreendendo uma VH idêntica à VH de referência SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 433 ou SEQ ID NO: 435, com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conservadoras, e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compre- endendo a dita VH especificamente liga a Sp35.
155. Polipeptídeo da reivindicação 153, em que a dita VH é SEQ ID NO: 416 ou SEQ ID NO: 433 ou SEQ ID NO: 435.
156. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a -155, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 3B5.2 ou Li81.
157. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a -155, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH competitivamente inibe o anticorpo monoclonal 3B5.2 ou Li81 de ligar-se a Sp35.
158. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a -157, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10~2 M, 5 χ 10-3 Μ, IO-3 Μ, 5 χ 10'4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10~6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ ΙΟ-11 Μ, IO-11 Μ, 5 χ 10~12 Μ, ΙΟ-12 M1 5 χ 10"13 Μ, -10"13 Μ, 5 χ 10"14 M1 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10'15 Μ.
159. Polipeptídeo isolado compreendendo uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são pelo menos 90 % idênticas, respectivamente, às se- qüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve de referência SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 414 e SEQ ID NO: 415; ou SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 e SEQ ID NO: 444 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
160. Polipeptídeo isolado compreendendo uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são idênticas, respectivamente, com exceção de menos de -20 substituições de aminoácido conservadoras, às seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve de referência SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: -414 e SEQ ID NO: 415; ou SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 e SEQ ID NO: -444 e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
161. Polipeptídeo isolado compreendendo uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da dita VL são SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 414 e SEQ ID NO: 415; ou SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 e SEQ ID NO: 444.
162. Polipeptídeo isolado compreendendo Uma VL pelo menos -90 % idêntica à seqüência de VL de referência da SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 434 em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
163. Polipeptídeo isolado compreendendo uma VL idêntica a uma seqüência de VL de referência da SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 434, com exceção de menos de 20 substituições de aminoácido conservadoras, e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo com- preendendo a dita VL especificamente liga a Sp35.
164. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 162 ou 163, em que a dita VL é SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 434.
165. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 159 a 164, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga ao mesmo epítopo que o an- ticorpo monoclonal 3B5.2 ou Li81.
166. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 159 a 164, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL competitivamente inibe o anticorpo monoclonal -3B5.2 ou Li81 de ligar-se a Sp35.
167. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 159 a 166, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VL especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) não maior que 5 χ 10"2 M, KT2 M, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, ΙΟ-6 M1 5 χ ΙΟ-7 M1 10"7 M1 5 χ 10"8 M1 10"8 M1 5 χ 1CT9 Μ, 10-9 Μ, 5 χ 10"10 M1 10"10 M1 5 χ 10"11 M1 10"11 M, 5 χ 10"12 M1 10"12 M1 5 χ 10"13 M1 - 10"13 M1 5 χ 10"14 M1 10"14 M1 5 χ 10"15 M1 ou 10"15 Μ.
168. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 167, adicionalmente compreendendo um polipeptídeo heterólogo fundido a este.
169. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 168, em que o dito polipeptídeo é conjugado com um agente selecionado do grupo que consiste em um agente terapêutico, um pró-medicamento, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador de resposta biológica, um agente farmacêutico, ou PEG.
170. Composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH e a dita VL especi- ficamente liga a Sp35.
171. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL especificamente liga a um epítopo linear.
172. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL especificamente liga a um epítopo conformacional não- linear.
173. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRR de Sp35.
174. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRRNT de Sp35.
175. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL especificamente liga ao domínio LRRCT de Sp35.
176. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL especificamente liga à região básica de Sp35.
177. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL especificamente liga ao domínio da imunoglobulina de Sp35.
178. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é uma molécula de anticorpo multivalente compreen- dendo pelo menos duas cadeias pesadas e pelo menos duas cadeias leves.
179. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é multiespecífico.
180. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é biespecífico.
181. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é monovalente, bivalente, polivalente, ou bifuncional.
182. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL é humanizado.
183. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é quimérico.
184. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL é primatizado.
185. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é completamente humano.
186. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um fragmento Fab.
187. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um fragmento Fab'.
188. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um fragmento F(ab)2.
189. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um fragmento Fv.
190. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL é um anticorpo de cadeia simples.
191. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL especificamente liga a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo de variante de Sp35 com uma afi- nidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não maior que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 M1 5 χ 10"3 Μ, 10"3 M, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, IO-5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10'8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ IO-12 Μ, 10-12 Μ, 5 χ 10-13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10·14 Μ, 5 χ 10-15 Μ, ou 10-15 M..
192. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169 ou a composição da reivindicação 170, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a dita VH1 a dita VL, ou ambas ditas VH e VL preferencialmente liga a um polipeptídeo de Sp35 hu- mano ou fragmento do mesmo, com relação a um polipeptídeo de Sp35 mu- rino ou fragmento do mesmo.
193. Composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192, e um veículo.
194. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 170 ou 193, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden- do a dita VH1 a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um antagonista de inibi- ção do desenvolvimento de neurite mediada por Sp35.
195. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 170 ou 193, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden- do a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um antagonista de inibi- ção da mielinização mediada por Sp35.
196. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 170 ou 193, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden- do a dita VH1 a dita VL1 ou ambas ditas VH e VL é um antagonista da morte de células dos oligodendrócitos mediada por Sp35.
197. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 170 ou 193, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden- do a dita VH1 a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um antagonista de inibi- ção da diferenciação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
198. Polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 170 ou 193, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreenden- do a dita VH, a dita VL, ou ambas ditas VH e VL é um antagonista de inibi- ção da proliferação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
199. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 150 a 169.
200. Método para tratar lesão do CNS compreendendo adminis- trar a um animal sofrendo de tal lesão uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou frag- mento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 41 ou 199, o poli- nucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 42 a 102, o polipep- tídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou 194 a 198, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
201. Método da reivindicação 200, em que a dita lesão do CNS é selecionada do grupo que consiste em lesão cerebral traumática, lesão da espinha dorsal, e lesão do nervo ótico.
202. Método para tratar doenças ou distúrbios associados à ini- bição do desenvolvimento neuronal no CNS compreendendo administrar a um animal em necessidade do dito tratamento uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 41 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 42 a 102, o poli- peptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou 194 a -198, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
203. Método da reivindicação 202, em que a dita doença ou dis- túrbio é selecionado do grupo que consiste em ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, e acidente vascular cerebral.
204. Método para tratar doenças ou distúrbios associados à ini- bição do desenvolvimento ou diferenciação dos oligodendrócitos compreen- dendo administrar a um animal em necessidade do dito tratamento uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anti- corpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivin- dicações 1 a 41 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das rei- vindicações 42 a 102, o polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindi- cações 150 a 192 ou 194 a 198, ou a composição de qualquer uma das rei- vindicações 103 a 135, 144 ou 193.
205. Método para tratar doenças ou distúrbios associados à desmielinização ou dismielinização dos neurônios do CNS compreendendo administrar a um animal em necessidade do dito tratamento uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 41 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações -42 a 102, o polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a -192 ou 194 a 198, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
206. Método da reivindicação 205, em que a dita doença ou dis- túrbio é selecionado do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), Ieu- coencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielinó- lise pontina central (CPM)1 degeneração walleriana, adrenoleucodistrofia, doença de Alexander1 e doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ).
207. Método da reivindicação 206, em que a dita doença ou dis- túrbio é esclerose múltipla.
208. Método de qualquer uma das reivindicações 200 a 207, em que o dito animal é um mamífero.
209. Método da reivindicação 208, em que o dito mamífero é um ser humano.
210. Método de inibir transdução de sinal por NgR1, compreen- dendo contatar o NgR1 com uma quantidade eficaz de um agente selecio- nado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 41 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 42 a 102, o polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou 194 a 198, ou a composi- ção de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
211. Método de diminuir a inibição do crescimento axonal de um neurônio do sistema nervoso central (CNS), compreendendo contatar o neu- rônio com uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 41 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 42 a 102, o polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a 192 ou 194 a 198, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
212. Método de inibir colapso do cone de crescimento de um neurônio do CNS1 compreendendo contatar o neurônio com uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou 199, o polinucleotídeo isolado de qualquer uma das reivindicações -42 a 102, o polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 150 a -192 ou 194 a 198, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 103 a 135, 144 ou 193.
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