JP2024500093A - Ｐ－カドヘリンに対する抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示では、抗Ｐ－カドヘリン抗体、抗Ｐ－カドヘリン抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、及び抗Ｐ－カドヘリン抗体の発現に使用される宿主細胞が提供される。本開示はさらに、抗体の機能及びその使用を検証するための方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年１２月１０日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３５１８５に対する優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。

技術分野
本出願は、一般に、抗体に関する。
より具体的には、本出願は、Ｐ－カドヘリンに対する完全ヒトモノクローナル抗体、それを調製する方法、及び抗体の使用に関する。

カドヘリンファミリータンパク質は、シス及び／又はトランス様式で、それぞれの細胞の表面における２つのカドヘリン分子間のホモフィリン相互作用によって細胞間接着を仲介し、カドヘリン－カテニン複合体は、接着型接合の主要な構成要素を構成する。これらの複合体はまた、細胞の成長、分化、細胞の運動性及び生存に影響を与える、細胞運命の決定を導く主要な調節メカニズムを表す（Cavallaro and Dejana, Adhesion molecule signalling: not always a sticky business. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011 Mar; 12 (3):189-97）。

カドヘリンは、シグナル伝達タンパク質、例えば、β－カテニン、ｐ１２０カテニン（ｐ１２０）、接合部プラコグロビン（プラコグロビン）を膜に動員することによって間接的にシグナルを伝達することができる。さらに、カドヘリンは増殖因子受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及びＴＧＦβ）と相互作用し、細胞内シグナル伝達パートナー、例えば、キナーゼ（例えば、ＳＲＣファミリーキナーゼ、ＣＳｋ）若しくはホスファターゼ（例えば、ＤＥＰ１、ＳＨＰ２、ＶＥ－ＰＴＰ）とシグナル伝達ユニットを形成することによって、又はアダプタータンパク質（例えば、ＳＲＣファミリーキナーゼ、ＣＳｋ）若しくはホスファターゼ（例えば、ＤＥＰ１、ＳＨＰ２、ＶＥ－ＰＴＰ）と相互作用することによって、又はカドヘリンを介したアダプタータンパク質（例えば、ＳＨＣファミリーメンバー）と相互作用することによって、シグナル伝達ユニットを形成することができる。ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）又はＡＤＡＭ（ジスインテグリン及びメタロプロテアーゼファミリーの一員）が媒介するエクトドメインの放出の後、カスパーゼ及びγ－セクレターゼのような細胞内プロテアーゼがカドヘリン細胞質尾部を切断し、それがその後核に移行し、転写を調節することができる（Cavallaro and Dejana, supra; Albergaria.A. et al, P-cadherin role in normal breast development and cancer. Int J Dev Biol. 2011; 55 (7-9):811-22）。

Ｐ－カドヘリン（ヒトのＣＤＨ３遺伝子によりコードされる胎盤－カドヘリン、又はカドヘリン－３）は、２６アミノ酸の長いシグナル配列及び８０３アミノ酸のプロペプチドを有する１１８ｋＤａの糖タンパク質古典的カドヘリンである。成熟タンパク質は、３つの異なるドメインをもつ１０８から始まる。５つの細胞外カドヘリン反復配列（５４８ａａ）は、隣接する細胞間でジッパー様構造を形成するのに不可欠である。１つの膜貫通領域（２３ａａ）、高度に保存された細胞内領域（１５１ａａ）は、カドヘリンとアクチン細胞骨格をつなぐカテニンと相互作用する細胞内ドメインである。

Ｐ－カドヘリンは、マウスの胎盤、ヒト胎盤組織（低濃度）及びいくつかのヒト胎児構造において発現される。成人では、それは、表皮の基底層、乳房、前立腺、中皮、卵巣、毛包、及び角膜内皮などの特定の組織でのみ発現され、通常は Ｅ－カドヘリンと共発現される（Imai et al., Identification of a novel tumor-associated antigen, cadherin 3/P-cadherin, as a possible target for immunotherapy of pancreatic, gastric, and colorectal cancers. Clin. Cancer Res. 2008, 14, 6487-6495）。ヒトタンパク質参照データベース（ＨＰＲＤ：００２２７）によって示される主な発現部位は、子宮内膜、糸球体、毛包、ケラチノサイト、乳房筋上皮、メラノサイト、卵母細胞、精子、胎盤、前立腺、網膜、血清、及び皮膚である。

Ｐ－カドヘリンは、乳がん及び他の腫瘍において過剰発現することが示されており、予後不良と相関する可能性がある。また，大腸がん，ＮＳＣＬＣ，胃がん，すいがんなどの多発がんでも高い発現率と陽性率を示した。ＴＣＧＡデータベースでは、Ｐ－カドヘリンは、胆管（１０．６×）、結腸（１３４×及び１０４×）、食道（３４×）、肺（６．５６×及び１１．８×）、胃（８．０２×及び１１．６×）及び甲状腺（２０．３×）の腫瘍において５倍以上の発現を示した。Ｐ－カドヘリンは、細胞浸潤、細胞運動性、幹細胞活性、及び異なる組織状況における転移形成を含む腫瘍促進作用を媒介する可能性がある。正常組織におけるＰ－カドヘリン遺伝子発現は非常に低く、卵巣及び乳腺における発現は非常に弱い（ＧＴｅｘデータベース及び文献）。Ｐｆｉｚｅｒ社のヒト化モノクローナル抗体抗Ｐ－カドヘリンｍＡｂ ＰＦ－０３７３２００１は、第Ｉ相試験において安全性を示したが、これらの患者に明らかな有益な効果は認められなかった。

本開示において、種々のがんを治療するために用いることができるＰ－カドヘリンに対するモノクローナル抗体が開発されている。

これら及び他の目的は、広い意味で、改善された効力を有する抗体を提供する化合物、方法、組成物及び製造物に関する本開示によって提供される。本開示によって提供される利点は、抗体治療及び診断の分野において広く適用可能であり、種々の標的と反応する抗体と共に使用することができる。

本開示は、Ｐ－カドヘリンに対する抗体、抗Ｐ－カドヘリン抗体をコードする核酸分子、抗Ｐ－カドヘリン抗体の発現に使用される発現ベクター及び宿主細胞、ならびにインビトロで抗体の機能を検証する方法を提供する。本開示の抗体は、ヒトの免疫機能を調節することにより、多発性がんの治療のための非常に強力な薬剤を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、ヒトＰ－カドヘリン、マウスＰ－カドヘリン又はカニクイザルＰ－カドヘリンのような、Ｐ－カドヘリンに対する単離された抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）（ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号６、８、９、１０又は１１を含むＨＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
（Ｂ）（ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３
からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；又は
（Ｃ）（Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲ及び（Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
を含む。

いくつかの態様において、Ｐ－カドヘリンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分は、
配列番号２を含むＨＣＤＲ１、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号２と異なるアミノ酸配列；
配列番号４を含むＨＣＤＲ２、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号４と異なるアミノ酸配列；
配列番号６を含むＨＣＤＲ３、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号６と異なるアミノ酸配列；
配列番号１３を含むＬＣＤＲ１、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号１３と異なるアミノ酸配列；
配列番号１５を含むＬＣＤＲ２、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号１５と異なるアミノ酸配列；
配列番号１７を含むＬＣＤＲ３、又は２個以下のアミノ酸のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号１７と異なるアミノ酸配列
を含む。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、翻訳後修飾の潜在的リスクを回避するために、ＰＴＭ除去がＣＤＲ上で行われることを除き、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｕＩｇＧ１Ｌのものと本質的に同じＣＤＲを有する。

いくつかの態様において、Ｐ－カドヘリンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分は、
配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
配列番号４を含むＨＣＤＲ２；
配列番号６を含むＨＣＤＲ３、又は２個以下のアミノ酸（例えば、１個以下のアミノ酸）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失により配列番号６と異なるアミノ酸配列；
配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
配列番号１７を含むＬＣＤＲ３
を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号６に記載のＨＣＤＲ３；および
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号８に記載のＨＣＤＲ３；および
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号９に記載のＨＣＤＲ３；及び
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
を

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号１０に記載のＨＣＤＲ３；及び
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号１１に記載のＨＣＤＲ３；及び
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
を含む。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む：
（ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号６、８、９、１０又は１１を含むＨＣＤＲ３；及び
ＶＬは、以下からなる群から選択される１以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。
（ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号２１～２５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号２１～２５のいずれかに記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＰ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；
（ｉｉｉ）配列番号２１～２５のいずれかに記載されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上の（例えば、２つ又は３つの）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列を含む；及び／又は
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）配列番号２６～２８のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号２６～２８のいずれかに記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、Ｐ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；
（ｉｉｉ）は、配列番号２６～２８のいずれかに記載されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上の（例えば、２つ又は３つの）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＶＨ又はＶＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、ＣＤＲ配列のいずれにおいてもなく、フレームワーク（ＦＲＷ）配列においてである。

いくつかの実施形態において、上記の単離された抗体又はその抗原結合部分は、例えば、フレームワーク配列（例えば、ＶＨ又はＶＬ領域のＦＲＷ１、ＦＲＷ２、ＦＲＷ３、及び／又はＦＲＷ４）中のアミノ酸の１つ以上の置換をさらに含む。
単離された抗体又はその抗原結合部分は、翻訳後修飾の潜在的リスクを回避するためにフレームワーク配列上でＰＴＭ除去が行われることを除き、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｕＩｇＧ１Ｌのものと本質的に同じフレームワーク配列を有し得る。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＶＨは、以下からなる群から選択される１以上の重鎖ＦＲＷｓ（ＨＦＲＷｓ）を含む：
（ｉ）配列番号１を含むＨＦＲＷ１；
（ｉｉ）配列番号３を含むＨＦＲＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号５を含むＨＦＲＷ３；及び
（ｉｖ）配列番号７を含むＨＦＲＷ４；及び
ＶＬは、以下からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＦＲＷｓ（ＬＦＲＷｓ）を含む：
（ｉ）配列番号１２、１９又は２０を含むＬＦＲＷ１；
（ｉｉ）配列番号１４を含むＬＦＲＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＬＦＲＷ３；及び
（ｉｖ）配列番号１８を含むＬＦＲＷ４。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２６、２７又は２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号２６に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号２７に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号２８に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２２に示される重鎖可変領域及び配列番号２７に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２３に示される重鎖可変領域及び配列番号２７に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２４に示される重鎖可変領域及び配列番号２７に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２５に示される重鎖可変領域及び配列番号２７に示される軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常ドメイン、場合によりヒトＩｇＧ１定常ドメインなどのヒトＩｇＧ定常ドメインをさらに含む。いくつかのさらなる態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、ＥＵ番号による、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ変異体、例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃを含む。具体的には、重鎖定常ドメインは、配列番号２９又は配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの態様において、本明細書に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下の特性の１つ以上を有する：
（ａ）ＦＡＣＳによって測定した場合、ｎＭグレードのＥＣ５０（例えば、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下）を有するヒトＰ－カドヘリン又はカニクイザルの細胞表面Ｐ－カドヘリンに結合する；
（ｂ）ＦＡＣＳ親和性試験によって測定した場合、ＫＤが０．１ｎＭ以下（例えば、０．０８ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０４ｎＭ以下、０．０３ｎＭ以下）のヒト細胞表面Ｐ－カドヘリンに結合する；
（ｃ）ヒトＥ－カドヘリン又はＮ－カドヘリンに対して交差反応性を示さない；
（ｄ）ベンチマーク抗体に匹敵する良好な内在化能を有する；
（ｅ）ベンチマーク抗体よりも有意に優れたＡＤＣＣ効果を有する；
（ｆ）ｎＭグレードのＥＣ５０を有するヒトＰ－カドヘリン発現細胞の凝集を阻害する；
（ｇ）非特異的結合効果を示さない；及び
（ｈ）血清中で少なくとも１４日間安定である。

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。好ましくは、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで：
（ａ）重鎖は、配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に示される重鎖可変領域、及び配列番号２９又は３１に示される重鎖定常領域を含み；及び
（ｂ）軽鎖は、配列番号２６、２７又は２８に示される軽鎖可変領域、及び配列番号３０に示される軽鎖定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで：
（ａ）重鎖は、配列番号２４に示される重鎖可変領域、及び配列番号３１に示される重鎖定常領域を含み；及び
（ｂ）軽鎖は、配列番号２７に示される軽鎖可変領域、及び配列番号３０に示される軽鎖定常領域を含む。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書中に開示されるように、単離された抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子を含むベクターに関する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示されるような少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。

いくつかの態様において、本開示は、上記のように宿主細胞内で抗体又はその抗原結合部分を発現し、そしてその抗体又は抗原結合部分を宿主細胞から単離することを含む、抗Ｐ－カドヘリン抗体又はその抗原結合部分を調製する方法に関する。

いくつかの態様において、本開示は、対象におけるＰ－カドヘリン関連免疫応答が調節されるように、本明細書に開示されているような抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象におけるＰ－カドヘリン関連免疫応答を調節する方法に関する。

いくつかの態様において、本開示は、対象においてＰ－カドヘリン陽性がんを治療又は予防するための方法であって、本明細書に開示されているように、有効量のその抗体又は抗原結合部分又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。ある実施形態において、前記がんは、Ｐ－カドヘリン陽性固形腫瘍である。ある態様において、該がんは、胆管がん、食道がん、口腔がん、甲状腺腫瘍、頭頸部がん、乳がん、肺がん、ＮＳＣＬＣ、悪性中皮腫、結腸がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、黒色腫、皮膚がん、膀胱がん、肝臓がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、肉腫、骨肉腫、及び骨がんから選択され得る。

いくつかの態様において、本開示は、Ｐ－カドヘリン陽性がんを診断、治療又は予防するための医薬の製造において本明細書に開示されているような抗体又はその抗原結合部分の使用に関する。

いくつかの態様において、本開示は、Ｐ－カドヘリン陽性がんの診断、治療又は予防に使用するために、本明細書に開示されている抗体又はその抗原結合部分に関する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示されるような抗体又はその抗原結合部分、及び本明細書に開示されるような医薬組成物を使用するキット又はデバイス及び関連する方法に関する。

以上は要約であり、したがって、必要に応じて、簡略化、一般化、及び詳細の省略を含み、従って、当業者は、本要約が単に例示的であり、いかなる意味においても限定することを意図しないことを理解するであろう。本明細書に記載される方法、組成物及び／又はデバイス及び／又は他の主題の他の態様、特徴、及び利点は、本明細書に記載される教示において明らかになるであろう。本要約は、簡略化された形式での概念の選択を導入するために提供され、詳細な説明で以下にさらに説明される。この要約は、クレームされた主題事項の主要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、クレームされた主題事項の範囲を決定する際の補助として使用することを意図したものでもない。

図１Ａは、免疫したＯＭＴラットにおけるヒトＰ－カドヘリン（ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈｉｓ）の血清力価データをＥＬＩＳＡで測定したものである。 図１Ｂ及び１Ｃは、それぞれ、抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）の結果を示す。 図１Ｂ及び１Ｃは、それぞれ、抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）の結果を示す。 図２は、ＦＡＣＳアフィニティー分析により試験したヒトＰ－カドヘリン発現ＤＵ－１４５細胞上の抗体のアフィニティー結果を示す。 図３は、ＤＵ－１４５（Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ１６５０（Ｂ）及びＨＣＴ１１６（Ｃ）細胞をそれぞれ発現するヒトＰ－カドヘリン上の抗体のＦＡＣＳ結合アッセイの結果を示す。 図４は、Ｗ３１９－ＣＨＯＫ１．ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＦＬ細胞を一過性に発現するシアノＰ－カドヘリン上の抗体のＦＡＣＳ結合アッセイの結果を示す。 図５は、ＥＬＩＳＡにより測定したヒトＥ－カドヘリン（Ａ、ＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ）及びヒトＮ－カドヘリン（Ｂ、ＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ３．ＥＣＤ．ｈＦｃＨｉｓ）に対する抗体の結合結果を示す。 図６は、ＥＬＩＳＡにより測定された抗体のドメイン結合の決定の結果を示す。試験した領域は、ヒトＰ－カドヘリン細胞外ドメイン１（Ａ、１０８－２３６、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ）、ドメイン１－２（Ｂ、ａａ１０８－３４８、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ））、ドメイン１－３（Ｃ、ａａ１０８－４６１、Ｗ３１９－Ｐｒｏｈ１．Ｄ１２３．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ））、ドメイン１－４（Ｄ、ａａ１０８－５５０、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２３４．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ））及びＷ３１９－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）－Ｐ３（Ｅ）である。Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）－Ｐ３は、精製中のヒトＰ－カドヘリン細胞外タンパク質フローの一部を指す。 図６は、ＥＬＩＳＡにより測定された抗体のドメイン結合の決定の結果を示す。 図７は、Ｆａｂ－ＺＡＰ ＣＴＧアッセイ（Ａ）及びＨＣＳアッセイ（Ｂ）による抗体の内在化能力を示す。 図７は、Ｆａｂ－ＺＡＰ ＣＴＧアッセイ（Ａ）及びＨＣＳアッセイ（Ｂ）による抗体の内在化能力を示す。 図８は、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を用いたヒトＰ－カドヘリン発現ＨＣＴ－１１６細胞に対する抗体のＡＤＣＣ効果を示す。 図９Ａは、細胞凝集アッセイによるＰ－カドヘリン依存性細胞凝集を妨害する抗体の能力を示す。 図９Ａは、細胞凝集アッセイによるＰ－カドヘリン依存性細胞凝集を妨害する抗体の能力を示す。 図１０は、同等のＦＡＣＳ結合によるＷ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌの血清安定性の結果を示す。 図１１は、（Ａ）ＨＣＴ－１１６細胞上のＦＡＣＳ結合試験；（Ｂ）ＤＵ－１４５細胞上のＦＡＣＳ結合試験；及び（Ｃ）Ｆａｂ－ＺＡＰによるＨＣＣ－１９５４細胞上のインターナリゼーション試験における異なる抗体の比較を示す。 図１１は、（Ａ）ＨＣＴ－１１６細胞上のＦＡＣＳ結合試験；（Ｂ）ＤＵ－１４５細胞上のＦＡＣＳ結合試験；及び（Ｃ）Ｆａｂ－ＺＡＰによるＨＣＣ－１９５４細胞上のインターナリゼーション試験における異なる抗体の比較を示す。

本開示は、多くの異なる形態で実施することができるが、本明細書に開示されたものは、開示の原理を例示するその具体的な例示的実施形態である。本開示は、示された特定の実施形態に限定されないことを強調すべきである。さらに、本明細書で使用されるセクションの見出しは、組織上の目的のみを目的とし、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書に別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとし、文脈上別段の要求がない限り、単数語は複数を含み、複数の用語は単数語を含むものとする。より具体的には、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形は「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」を含む。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質を含み、「細胞」への言及は、細胞の混合物などを含む。本出願において、「又は」の使用は、特に断らない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む」及び「含む」などの他の形態と同様に、用語「含む」の使用は、限定するものではない。さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両端点及び両端点間のすべての点を含む。

一般に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものであり、本開示の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の慣用的方法に従って実施され、特に断らない限り、本明細書全体を通して引用及び考察されている種々の一般的及びより具体的な参考文献に記載されているように、本開示の方法及び技術は一般的に実施される。例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 及びColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医薬化学と関連して使用される命名法、ならびに、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬化学及び医薬化学の実験手順及び技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

定義
開示内容の理解を深めるため、当該用語の定義及び説明を以下に示す。

用語「抗体」又は「Ａｂ」は、本明細書中で使用される場合、一般に、共有結合ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒に保持された２つの重い（Ｈ）及び２つの軽い（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字形四量体タンパク質を指す。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類できる。重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥとして抗体のイソタイプを定義するμ、δ、γ、α、εに分類される。軽鎖及び重鎖において、可変領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、重鎖は、さらに、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常部は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨとＶＬ領域はさらに、比較的保守的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）によって間隔を置いた超可変領域（相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分割できます。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にＮ末端からＣ末端までの３種類のＣＤＲ及び４種類のＦＲから構成される。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当技術分野で公知の方法論、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、ＥＵ定義、及び／又は接触定義を用いて正確に同定することができ、これらはいずれも当技術分野で周知である。例えば、Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; 及びAlmagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)を参照されたい。hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs.も参照されたい。異なる定義に従った番号間の対応又は整列は、例えば、http://www.imgt.org/に見出すことができる（Giudicelli V et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. (1997) 25:206-11; Lefranc MP et al. Unique database numbering system for immunogenetic analysis. Immunol Today (1997) 18:509; and Lefranc MP et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. (2003) 27:55-77も参照されたい）。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。

本出願の文脈で互換的に使用することができる抗体の用語「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」とは、全長抗体が特異的に結合する、及び／又は同一抗原への結合について全長抗体と競合する抗原へ特異的に結合する能力を保持する、全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。一般に、全ての目的で参照により本明細書に援用されるFundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は無傷抗体の酵素的又は化学的切断によって生成され得る。ある条件下では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補的決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、及びポリペプチドに対する特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むそのようなポリペプチドを含む。抗体の抗原結合断片は、所定の抗体（例えば、本出願で提供されるモノクローナル抗ヒトＰ－カドヘリン抗体）から、当業者に公知の慣用的技術（例えば、組換えＤＮＡ技術又は酵素的又は化学的切断方法）によって得ることができ、無傷抗体をスクリーニングするのと同じ方法で特異性についてスクリーニングすることができる。

本明細書中で使用される「フレームワーク領域」（又はＦＲＷ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲＷ１、ＦＲＷ２、ＦＲＷ３及びＦＲＷ４として識別される４つのＦＲを有する。

「Ｆｃ」は、抗体に関しては、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２及び第３の定常領域に結合した第１の重鎖の第２及び第３の定常領域を含む抗体の部分を指し、場合により、ヒンジ領域の一部又は全体を含む。抗体のＦｃ部分は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のような種々のエフェクター機能に関与するが、抗原結合においては機能しない。

本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する結合特異性及び親和性を示す。

用語「ヒト化抗体」は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を意味する。追加のフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワークシーケンス内で行うことができる。

用語「組換え抗体」とは、本明細書中で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離される抗体、例えば、別の種の免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換え抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、又は免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製又は単離される抗体を指す。

抗体又は抗原結合ドメインに関して、本明細書中で使用される「完全ヒト」という用語は、抗体又は抗原結合ドメインが、ヒト又はヒト免疫細胞により産生された抗体の配列に対応するアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用するトランスジェニック非ヒト動物などの非ヒト源由来のアミノ酸配列を有するか、又はそれらから構成されることを意味する。ある態様において、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体に由来するアミノ酸残基（特に抗原結合残基）を含まない。

本明細書で使用される用語「Ｐ－カドヘリン」は、胎盤カドヘリン（その名前にもかかわらず、Ｐ－カドヘリンはヒト胎盤では発現されない；その名前は、この分子が妊娠期間を通してマウス胎盤で高度に発現されることが最初に観察された事実に由来する）を指し、細胞－細胞接着を調節する膜貫通糖タンパク質の古典的なカドヘリンファミリーのメンバーである。ヒトＰ－カドヘリン（ＣＤＨ３遺伝子によりコードされる）の配列は、標準配列及びいくつかのアイソフォームを含むＩＤ Ｐ２２２２３の下のＵｎｉｐｒｏｔデータベースから得ることができる。用語「Ｐ－カドヘリン」は、組換えヒト、マウス、シアノＰ－カドヘリン及び組換え型Ｐ－カドヘリンを包含することを意図しており、これらは、標準的な組換え発現方法によって調製することができ、又は商業的に購入することができる。標準的なＰ－カドヘリン配列は、８２９個のアミノ酸を含み、ここで、成熟タンパク質は、３つの異なるドメイン：５つの細胞外カドヘリン反復（５４８ａａ）、単一の膜貫通領域（２３ａａ）及び高度に保存された細胞質尾部（１５１ａａ）を有するアミノ酸１０８から開始する。

本明細書で使用される用語「Ｅ－カドヘリン」及び「Ｎ－カドヘリン」は、それぞれ、古典的カドヘリンファミリーのメンバーである上皮性カドヘリン及び神経性カドヘリンを指す。カドヘリンはＩ型とＩＩ型に分けられる。Ｉ型カドヘリンには、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリン、レチナールカドヘリン（Ｒ－カドヘリン）、腎臓カドヘリン（Ｋ－カドヘリン）、骨芽細胞カドヘリン（ＯＢ－カドヘリン）がある。Ｅ－カドヘリンはヒトのＣＤＨ１遺伝子にコードされており、ＣＤＨ３遺伝子と６６％の相同性を有する。Ｎ－カドヘリンはヒトのＣＤＨ２遺伝子にコードされている。Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンは、最もよく研究されている接着タンパク質のサブグループである。

用語「抗Ｐ－カドヘリン抗体」又は「Ｐ－カドヘリン抗体」又は「Ｐ－カドヘリンに対する抗体」は、本明細書中で使用される場合、Ｐ－カドヘリンに結合することができ、例えば、ヒトＰ－カドヘリンタンパク質のＥＣＤ領域に結合することができる抗体を指す。

本明細書中で使用される用語「Ｋａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しており、一方、本明細書中で使用される用語「Ｋｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。抗体のＫｄ値は、当該分野で十分に確立された方法を用いて決定することができ、本明細書中で使用される用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことを意図する。抗体のＫｄを決定するための好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴を使用することによる。

本明細書で使用されるＩｇＧ抗体の用語「高親和性」とは、ＦＡＣＳ親和性試験によって測定される、標的抗原、例えばＰ－カドヘリンについて１×１０^－１０Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－１１Ｍ以下、さらにより好ましくは４×１０^－１１Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。

「最大有効濃度の半分」とも呼ばれる、本明細書中で使用される「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間後にベースラインと最大との間の半分の反応を誘導する薬物、抗体又は毒物の濃度を指す。本出願の文脈では、ＥＣ５０は、「ｎＭ」の単位で表される。

本明細書中で使用される「単離された」という用語は、人工的手段によって自然状態から得られる状態を指す。ある「単離された」物質又は成分が自然界に存在する場合には、その自然環境が変化するか、又はその物質が自然環境から単離されているか、又はその両方の理由で存在する可能性がある。例えば、特定の単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドは、ある生きている動物の体内に天然に存在し、そのような天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、単離された物質の活性に影響を及ぼさない、混合された人工又は合成された物質又は他の不純な物質のいずれも含まない。

用語「単離された抗体」は、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（例えば、Ｐ－カドヘリンタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、Ｐ－カドヘリンタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を実質的に含まない抗体を指すことを意図する。しかしながら、ヒトＰ－カドヘリンタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＰ－カドヘリンタンパク質のような他の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。

本明細書中で使用される用語「ベクター」は、その中に挿入されたポリヌクレオチドを有することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより、宿主細胞内で発現される担持遺伝物質要素を有することができる。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体のような人工染色体、細菌人工染色体又はＰ１由来人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージのようなファージ及び動物ウイルスを含むが、これらに限定されない、当業者によって周知である。ベクターとして用いることができる動物ウイルスは、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスのような）、痘瘡ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０のような）を含む。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための複数のエレメントを含み得る。さらに、ベクターは複製起点を含み得る。

用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合、目的のタンパク質、タンパク質断片、又はペプチドを生成するように操作することができる細胞系を指す。宿主細胞には、限定されるものではないが、培養細胞、例えば、げっ歯類（ラット、マウス、モルモット、又はハムスター）由来の哺乳類培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０；又はヒト組織又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞、ならびにトランスジェニック動物又は培養組織内に含まれる細胞が含まれる。用語は、特定の被験細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。突然変異又は環境の影響のいずれかにより、ある種の修飾が次世代に起こる可能性があるため、そのような子孫は親細胞と同一ではなくても、「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

用語「同一性」は、本明細書中で使用される場合、配列を整列及び比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一パーセント」とは、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子のうち最も小さいもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントのギャップ（もしあれば）は、好ましくは、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。整列した核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法は、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073に記載されているものが含まれる。

本明細書中で使用される用語「免疫原性」は、生物における特異的抗体又は感作されたリンパ球の形成を刺激する能力を指す。これは、特異的な免疫細胞を刺激して活性化、増殖、分化させ、最終的に抗体及び感作リンパ球のような免疫エフェクター物質を生成するための抗原の特性を指すだけでなく、生物を抗原で刺激した後に、生物の免疫系において抗体又は感作されたＴリンパ球が形成され得る特異的な免疫応答を指す。免疫原性は抗原の最も重要な性質である。抗原が宿主において免疫応答の生成をうまく誘導できるかどうかは、３つの因子、抗原の性質、宿主の反応性、免疫手段に依存する。

本明細書中で使用される「トランスフェクション」という用語は、核酸が真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションのためのプロトコール及び技術には、脂質トランスフェクション、及び電気穿孔のような化学的及び物理的方法が含まれるが、これらに限定されない。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書に開示される。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197を参照されたい。本開示の具体的な実施形態において、ヒトＰ－カドヘリン遺伝子を２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。

用語「ハイブリドーマ」及び用語「ハイブリドーマ細胞株」は、本明細書中で使用する場合、互換的に使用することができる。用語「ハイブリドーマ」及び用語「ハイブリドーマ細胞株」が言及される場合、それらはまた、ハイブリドーマのサブクローン及び子孫細胞を含む。

用語「ＳＰＲ」又は「表面プラズモン共鳴」は、本明細書中で使用される場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの生物特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、それを含む。詳細な説明については、実施例５及びJonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照されたい。

用語「蛍光活性化細胞選別」又は「ＦＡＣＳ」は、本明細書中で使用される場合、フローサイトメトリーの特殊なタイプを指す。それは、各細胞の特定の光散乱及び蛍光特性に基づいて、一度に、生物細胞の不均一混合物を、１つの細胞である２つ以上の容器に仕分ける方法を提供する（FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”Retrieved 2017-11-09）。ＦＡＣＳを実施するための器具は、当業者に公知であり、公衆に市販されている。そのような機器の例としては、ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））、Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ．））、及びＭｏＦｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏ．））が挙げられる。

本明細書で使用される「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、細胞傷害性の形態を指し、そこでは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を持つ標的細胞に特異的に結合させ、その後細胞毒で標的細胞を死滅させることができる。抗体は、細胞傷害性細胞を「アーム」し、そのような殺傷に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための一次細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又はさらに、関心分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。

用語「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物、好ましくはヒトを含む。

本明細書中で使用される「がん」という用語は、いずれかの、又は腫瘍、又は悪性細胞増殖、増殖又は転移媒介固形腫瘍、及び白血病などの非固形腫瘍を指し、医学的状態を開始する。

「治療」、「治療すること」、又は「治療された」という用語は、本明細書において状態を治療する文脈で使用される場合、一般に、ある所望の治療効果が達成されるヒト又は動物の治療及び治療に関し、例えば、状態の進行の抑制を含み、進行の速度の低下、進行の速度の停止、状態の退行、状態の改善、及び状態の治癒を含む。予防手段としての治療（すなわち、予防（prophylaxis）、予防（prevention））も含まれる。がんについて、「治療」とは、腫瘍又は悪性細胞の増殖、増殖、又は転移、又はそれらのいくつかの組み合わせを減衰又は遅延させることを指すことができる。腫瘍については、「治療」には、腫瘍の全部又は一部の切除、腫瘍増殖及び転移の阻害又は遅延、腫瘍の発生の予防又は遅延、又はそれらの組み合わせが含まれる。

本明細書中で使用される「有効量」という用語は、所望の治療レジメンに従って投与された場合に、合理的な利益／リスク比に相応する、いくつかの所望の治療効果を生成するのに有効な、活性化合物、又は活性化合物を含む材料、組成物又は投与形態の量に関する。例えば、「有効量」は、Ｐ－カドヘリン関連疾患又は状態の治療に関連して使用される場合、前記疾患又は状態を治療するのに有効な量又は濃度の抗体又はその抗原結合部分を指す。

用語「予防する」、「予防」又は「予防すること」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物における特定の疾患状態に関して、疾患の発症を予防もしくは遅延させ、又はその臨床症状もしくは不顕性症状の発現を予防することを指す。

本明細書中で使用される用語「薬学的に許容される」は、ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又はその塩が、化学的及び／又は物理的に、製剤中の他の成分と適合性であり、生理学的にレシピエントと適合性であることを意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」とは、担体及び／又は賦形剤と、対象及び活性剤と薬理学的及び／又は生理学的に適合性であり、当該分野で周知であり（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照されたい）、限定されないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度増強剤が含まれる。例えば、ｐＨ調節剤は、リン酸緩衝液を含み、界面活性剤は、限定されるものではないが、カチオン性、陰イオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含み、イオン強度増強剤は、限定されるものではないが、塩化ナトリウムを含む。

本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は、非特異的免疫増強剤を指し、これは、抗原に対する免疫応答を増強することができ、又は、抗原と共に生体に送達されるか、又は事前に生体に送達される場合、生体内の免疫応答のタイプを変化させることができる。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバント及びフロイントの不完全アジュバント）、コリンバクテリウム・パルブム、リポ多糖類、サイトカインなどを含むが、これらに限定されない様々なアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在、動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは臨床試験でより一般的に使用されている。

抗Ｐ－カドヘリン抗体
いくつかの態様において、本開示は、Ｐ－カドヘリンに対する単離された抗体又はその抗原結合部分を含む。

本出願の文脈において、「抗体」には、ポリクローナル抗体、多クローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、体内抗体、多特異抗体、二価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体（ミューテイン及びそれらの改変を含む）、及びそれらの誘導体（Ｆｃ融合及び他の改変を含む）、ならびにＰ－カドヘリンタンパク質との優先的な会合又は結合を示す限り、任意の他の免疫反応性分子が含まれ得る。さらに、文脈上の制約によって特に指示されない限り、用語は、抗体の全てのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）及び全てのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）をさらに含む。好ましい実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。より好ましい態様において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体又は完全ヒトモノクローナル抗体である。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はそれらのいくつかの組合せを含む、当技術分野で公知の広範な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、各々が参照により全体として本明細書に援用されるAn, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)により詳細に記載されるものなどのハイブリドーマ及び技術的に認識された生化学的及び遺伝子工学的技術を用いて製造することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される抗体は、ハイブリドーマ技術及び遺伝子操作されたＯｍｎｉＲａｔ（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＯＭＴ）Ｃｏｍｐａｎｙにより開発された）を利用することによって得られる。選択された結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、インビボでのその免疫原性を低下させ、多特異的抗体等を作製するために、さらに改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体もまた本開示の抗体であることが理解されるべきである。

好ましい実施形態において、抗ヒトＰ－カドヘリンモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製される。ハイブリドーマの生成は、当技術分野で周知である。例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。

この出願では、一連のスクリーニングプロセスが、陽性ハイブリドーマ細胞株を同定するために実施される。スクリーニングプロセスの目標は、抗体を構築するための候補ヒトＰ－カドヘリン高親和性結合剤を見出すことである。抗体の配列をさらに最適化して（例えば、ＰＴＭ除去及び／又はＦｃ修飾）、高い結合親和性及び適切な機能活性を有する抗体を得る。

本開示の抗体は、ヒト及びカニクイザルのＰ－カドヘリンの両方に高い親和性で結合することができる。本開示の抗体のＰ－カドヘリンへの結合は、当技術分野で十分に確立された１以上の技術、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて評価することができる。本開示の抗体の結合特異性はまた、Ｐ－カドヘリンタンパク質を発現する細胞、例えばフローサイトメトリーへの抗体の結合をモニターすることによって決定することができる。例えば、抗体を、その細胞表面にＰ－カドヘリンを発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞のような、ヒトＰ－カドヘリンを発現する細胞株と反応させるフローサイトメトリーアッセイによって試験することができる。さらに、又は代わりに、結合動態（例えば、Ｋｄ価）を含む抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて試験することができる。さらに他の適切な結合アッセイには、例えば組換えＰ－カドヘリンタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。例えば、本発明の抗体は、１×１０Ｍ－９以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンに結合し、５×１０Ｍ－１０以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンに結合し、２×１０Ｍ－１０以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンに結合し、１×１０Ｍ－１０以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンタンパク質に結合し、５×１０Ｍ－１１以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンタンパク質に結合し、３×１０^－１１Ｍ以下のＫＤを有するヒトＰ－カドヘリンタンパク質に結合し、又はＦＡＣＳアフィニティー試験で測定したＫＤが２×１０^－１１Ｍ以下のヒトＰ－カドヘリンタンパク質に結合する。

ＣＤＲ及びフレームワーク配列を含む抗Ｐ－カドヘリン抗体
いくつかの態様において、本明細書に開示される単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）以下からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３又はそのバリアント（例えば、配列番号８、９、１０、１１）；
（Ｂ）以下からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）：
（ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３；又は
（Ｃ）（Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲ及び（Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ。

抗体配列中の可変領域及びＣＤＲは、当該技術分野で開発された一般規則に従って（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴナンバリングシステムのような）、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることによって同定することができる。これらの領域を同定する方法は、Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)に記載されているように、www.bioinf.org.uk/abs（英国ロンドンの生化学・分子生物学大学ロンドン部のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎにより維持されている）の「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト、及びwww.vbase2.orgのＶＢＡＳＥ２ウェブサイトに記載されており、これらを通してアクセスすることができる。例えば、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合するＡｂｙｓｉｓデータベースを用いて分析することができる。Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547、ウェブサイト bioinforg.uk/absでも利用可能である)を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用することができるＣＤＲを同定するために開発された一般規則をさらに含む。同一のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲを有する２つの抗体は、それらのＣＤＲが、同じアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔアプローチ、Ｃｈｏｔｈｉａアプローチ、又は当該技術分野で公知のＩＭＧＴナンバリング）によって決定された場合、同一であることを意味する。本明細書に記載されるＣＤＲは、一般に、Ｋａｂａｔ及びＩＭＧＴ番号の結合に従って導出される。

ＣＤＲは抗原結合に関与することが知られているが、６つのＣＤＲのすべてが必須又は不変であるわけではないことが見出されている。換言すれば、本明細書に提供される１つ以上のＣＤＲを置換又は変更又は改変することが可能であるが、Ｐ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を実質的に保持することが可能である。

さらに、重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原結合部位の中央に位置し、従って、抗原と最も接触し、抗原に対する抗体の親和性に最も自由なエネルギーを提供すると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、長さ、アミノ酸組成、及び複数の多様化メカニズム（Tonegawa S. Nature. 302:575-81）によるコンホメーションに関して、抗原結合部位の最も多様なＣＤＲであると考えられている。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、ほとんどの抗体特異性（Xu JL, Davis MM. Immunity. 13:37-45）、ならびに所望の抗原結合親和性（Schier R, etc. J Mol Biol. 263:551-67）を生じさせるのに十分である。

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ３に含まれる配列番号６のバリアントは、２個以下のアミノ酸、好ましくは１個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換（好ましくは置換）によって配列番号６と異なる。例えば、配列番号６のバリアントは、２個以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号６と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号６のバリアントは、配列番号８、９、１０及び１１に示されるものであるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの特定の実施形態において、上述のＨＣＤＲ３は、配列番号６に記載される配列を含むか、又は配列から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、本明細書に開示されるＷ３１９５－１．５３．１－ｕＩｇＧ１Ｌ（すなわち、親抗体）、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ（又はＷ３１９５－ｐ１抗体と呼ばれる）、及びＷ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌ（又はＷ３１９５－ｐ３抗体と呼ばれる）を含む。

いくつかの特定の実施形態において、上述のＨＣＤＲ３は、配列番号８に記載される配列を含むか、又は配列から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、本明細書に開示されるＷ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（又はＷ３１９５－ｐ４－Ｖ３２０抗体と呼ばれる）を含む。接尾辞「Ｖ３２０」は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含むことを意味する。

いくつかの特定の実施形態において、上述のＨＣＤＲ３は、配列番号９に記載される配列を含むか、又は配列から構成されてもよい。ある態様において、そのような抗体は、本明細書に開示されるＷ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（又はＷ３１９５－ｐ５－Ｖ３２０抗体と呼ばれる）を含む。

いくつかの特定の実施形態において、上述のＨＣＤＲ３は、配列番号１０に記載される配列を含むか、又はそれから構成され得る。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、本明細書に開示されるＷ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（又はＷ３１９５－ｐ６－Ｖ３２０抗体と呼ばれる）を含む。

いくつかの特定の実施形態において、上述のＨＣＤＲ３は、配列番号１１に記載される配列を含むか、又は配列から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、本明細書に開示されるＷ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（又はＷ３１９５－ｐ７－Ｖ３２０抗体と呼ばれる）を含む。

いくつかの態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号６又は１０に記載のＨＣＤＲ３；及び
（Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３。

重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｐ－カドヘリン抗体
いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＶＨは、以下からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む：
（ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号６、８、９、１０又は１１を含むＨＣＤＲ３；並びに
ＶＬは、以下からなる群から選択される１以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む：
（ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
（ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＶＬ領域と組み合わされたＰ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；
（ｉｉｉ）配列番号２１に記載されるアミノ酸配列と比較して１個以上の（例えば、２個又は３個）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含む；及び／又は
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＶＬ領域と組み合わされたＰ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；又は
（ｉｉｉ）配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と比較して、１個以上の（例えば、２個又は３個）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつＶＬ領域と組み合わされたＰ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；又は
（ｉｉｉ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列と比較して１個以上の（例えば、２個又は３個）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含む；及び／又は
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＶＬ領域と組み合わされたＰ－カドヘリンに対する特異的結合親和性を保持する；又は
（ｉｉｉ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列と比較して、１個以上の（例えば、２個又は３個）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列を含む。

いくつかの特定の実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域、及び配列番号２６又は２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。

他の実施形態において、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり得る。

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重量残留テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用い、ギャップ重みが１６、１４、１２、１０、８、６又は４であり、長さ重みが１、２、３、４、５又は６である、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムによって決定することができる。

さらに、又は代替的に、本開示のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列を同定するために、公開データベースに対する検索を行うための「クレリー配列」として使用することができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて行い、開示の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴなど）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。

いくつかの実施形態において、ＶＨ又はＶＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換は、ＣＤＲ配列のいずれにおいてもなく、フレームワーク（ＦＲＷ）配列においてである。例えば、上記の単離された抗体又はその抗原結合部分は、例えば、フレームワーク配列中のアミノ酸の１つ以上の置換を含み得る。ＶＨ又はＶＬ領域のＦＲＷ１、ＦＲＷ２、ＦＲＷ３、及び／又はＦＲＷ４。

ある態様において、本明細書に提供されるその単離された抗体又は抗原結合部分は、抗原結合ドメインがＰ－カドヘリンに特異的に結合できる限り、任意の適切なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。

いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、
ＶＨは、以下からなる群から選択される１以上の重鎖ＦＲＷ（ＨＦＲＷ）を含む：
（ｉ）配列番号１を含むＨＦＲＷ１、又は配列番号１と比較して１つ以上の（例えば、１、２又は３）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号３を含むＨＦＲＷ２、又は配列番号３と比較して１つ以上の（例えば、１、２又は３）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号５を含むＨＦＲＷ３、又は配列番号５と比較して１個以上の（例えば、１個、２個又は３個）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列；及び
（ｉｖ）配列番号７を含むＨＦＲＷ４、又は配列番号７と比較して１つ以上の（例えば、１、２又は３）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列；ならびに
ＶＬは、以下からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＦＲＷ（ＬＦＲＷ）を含む：
（ｉ）配列番号１２、１９若しくは２０を含むＬＦＲＷ１、又は配列番号１２、１９若しくは２０と比較して１若しくはそれ以上の（例えば、１、２若しくは３）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１４を含むＬＦＲＷ２、又は配列番号１４と比較して１個以上の（例えば、１個、２個又は３個）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＬＦＲＷ３、又は配列番号１６と比較して１個以上の（例えば、１個、２個又は３個）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列；及び
（ｉｖ）配列番号１８を含むＬＦＲＷ４、又は配列番号１８と比較して１個以上の（例えば、１個、２個又は３個）のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を伴うアミノ酸配列。

いくつかの特定の実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＶＨは、以下からなる群から選択される１以上の重鎖ＦＲＷ（ＨＦＲＷ）を含む：
（ｉ）配列番号１を含むＨＦＲＷ１；
（ｉｉ）配列番号３を含むＨＦＲＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号５を含むＨＦＲＷ３；及び
（ｉｖ）配列番号７を含むＨＦＲＷ４；ならびに
ＶＬは、以下からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＦＲＷ（ＬＦＲＷ）を含む：
（ｉ）配列番号１２、１９又は２０を含むＬＦＲＷ１；
（ｉｉ）配列番号１４を含むＬＦＲＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＬＦＲＷ３；及び
（ｉｖ）配列番号１８を含むＬＦＲＷ４。

「ＰＴＭ部位」又は「翻訳後修飾部位」とは、本明細書中で使用される場合、種々の修飾を引き起こしやすく、したがってインビボでの抗体の生物学的活性及び治療効果に影響を与える抗体配列中のアミノ酸又はモチーフを指す。ＰＴＭは、Ｎ及びＯ結合グリコシル化、グリコシル化、システイニル化及び硫酸化のような鎖付加；Ｃ－末端リジンクリッピングのような鎖トリミング；環化（Ｎ－末端ピログルタミン酸への）、脱アミド化、酸化、異性化及びカルバミル化のようなアミノ酸修飾から；ヒンジ領域ジスルフィド結合のジスルフィドスクランブリングまで様々である。ＰＴＭの典型的な部位は、当技術分野で公知であり、例えば、異性化のためのＤＧ、脱アミノ化のためのＮＧ、グリコシル化のためのＮ＊Ｔ／Ｓ（＊はＰ又はＤを除く他のアミノ酸を表す）、及び酸化のためのＭ又はＣなどである。
本明細書に例示されるように、一旦、ＰＴＭ部位が抗体配列、特にＣＤＲ３のようなキー領域に見出されると、ＰＴＭ修飾の潜在的リスクを回避するために、ＰＴＭ除去が実施される。ＰＴＭ除去はしばしば保存的置換によって達成される。

上記のように、単離された抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び／又は軽鎖の可変領域中の１つ以上のアミノ酸の修飾を含んでもよく、好ましくは、修飾は保存的置換である。当技術分野では、抗原結合を除去しない一定の保存的配列修飾を行うことができることが理解される。例えば、Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864- 26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6、及びBeers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43を参照されたい。

上述のように、用語「保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的特性に不利に影響を及ぼさない、又は変化しないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当技術分野で公知の標準的技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的又は機能的に類似の残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的性質など）で対応するアミノ酸残基と置換される置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸ファミリーは、当該技術分野において定義されており、アルカリ側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。従って、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該分野で周知である（例えば、参照により本明細書に援用されるBrummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)を参照されたい）。

いくつかの特定の実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２６、２７又は２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

上述のＶＨ及びＶＬ領域を含むＰ－カドヘリン抗体の抗原結合ドメインは、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）などの種々のフォーマットを採用することができる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、強固な非共有結合相互作用によって互いに保持された別々の鎖において上述したように、ＶＨ領域及びＶＬ領域からなるＦｖ断片である。

Ｆｃ領域を含むＩｇＧ定常ドメイン
本明細書で提供される抗Ｐ－カドヘリン抗体及び抗原結合断片は、Ｆｃ領域及び任意選択的にヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ定常ドメインをさらに含む。ヒトＩｇＧ定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常ドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１定常ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域は、例えば、野生型Ｆｃ領域であってもよく、又は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は他のエフェクター機能を変化させる１個以上のアミノ酸の修飾（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ又はＬＡＬＡ）を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、Ｆｃ修飾は、ＫａｂａｔらにおけるようなＥＵナンバリングによるＬＡ突然変異、すなわちＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を含む。ＬＡＬＡ突然変異は、おそらく、抗体エフェクター機能を破壊するために最も一般的に使用される突然変異であり、例えば、特異的ＦｃγＲへのＦｃ結合を排除し、ＰＢＭＣ及び単球によって媒介されるＡＤＣＣ活性を低下させる。Ｆｃ修飾の非限定的な例には、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域が関与する場合、例えば、アミノ酸配列の２２８位でのセリン（「Ｓ」）からプロリン（「Ｐ」）への突然変異が含まれる。Ｓ２２８Ｐ突然変異は、ＩｇＧ４分子のコアヒンジ内のジスルフィドを安定化することによってＦａｂアーム交換を減少させ、従って、半抗体形成を妨げるＩｇＧ４安定化突然変異に属する。

Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、可変ドメイン内の残基（軽鎖の約１～１０７残基及び重鎖の１～１１３残基）を参照する場合に一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、免疫学的関心の配列、第５版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｋａｂａｔら、前出で報告されたＥＵインデックス）中の残基を指す場合に使用される。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵナンバリング」又は「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書に別段の記載がない限り、抗体の定常ドメインにおける残基数への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。

特定の特性を有する抗Ｐ－カドヘリン抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴又は特性によって特徴付けられる。抗体のインビトロ機能特性及び薬理活性は、標的に対する作用メカニズムに従って、分子レベル及び細胞レベルで十分に評価されている。いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下の特性の１つ以上を有する：
（ａ）ＦＡＣＳによって測定した場合、ｎＭグレードのＥＣ５０（例えば、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下）を有するヒトＰ－カドヘリン又はカニクイザルの細胞表面Ｐ－カドヘリンに結合する；より具体的には、ｎＭグレードのＥＣ５０（例えば、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下）を有するヒトＰ－カドヘリンＥＣＤのドメイン３（アミノ酸３４９－４６１）に特異的に結合することができる；
（ｂ）ＦＡＣＳ親和性試験によって測定した場合、ＫＤが０．１ｎＭ以下（例えば、０．０８ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０４ｎＭ以下、０．０３ｎＭ以下）のヒト細胞表面Ｐ－カドヘリンに結合する；
（ｃ）ヒトＥ－カドヘリン又はＮ－カドヘリンに対して交差反応性を示さない；
（ｄ）ベンチマーク抗体に匹敵する良好な内在化能を有する；
（ｅ）ベンチマーク抗体よりも有意に優れたＡＤＣＣ効果を有する；
（ｆ）ｎＭグレードのＥＣ５０を有するヒトＰ－カドヘリン発現細胞の凝集を阻害する；
（ｇ）非特異的結合効果を示さない；
（ｈ）血清中で少なくとも１４日間安定である；
（ｉ）Ｗ３１９５－１．５３．１－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ５－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ６－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０、およびＷ３１９５－１．５３．１－ｐ７－ｕＩｇＧ１Ｖ３２０からなる群から選択される抗体とＰ－カドヘリン（例えば、ヒトＰ－カドヘリンのアミノ酸３４９－４６１）との結合について競合する。

本開示の抗体をコードする核酸分子
いくつかの態様において、本開示は、本明細書中に開示されるように、単離された抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。

本開示の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマによって発現される抗体（例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）については、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体（例えば、ファージディスプレイ技術を用いる）については、そのような抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。

ＶＨ領域をコードする単離された核酸は、ＶＨをコードする核酸を重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域、例えばＩｇＧ１定常領域であり得る。

ＶＬ領域をコードする単離された核酸は、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、前述参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域はカッパ又はラムダ定常領域であり得る。

ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、さらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可撓性リンカーのような別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される「機能的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味することを意図する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示されているように、単離された抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。

いくつかの特定の実施形態において、単離された核酸分子は、単離された抗体の重鎖可変領域をコードし、以下からなる群より選択される核酸配列を含む：
（Ａ）配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に示される重鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）Ａ）の核酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する核酸配列；及び
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（Ａ）の核酸配列の相補鎖とハイブリダイズする核酸配列。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されているように、単離された抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。

いくつかの特定の実施形態において、単離された核酸分子は、単離された抗体の軽鎖可変領域をコードし、以下からなる群より選択される核酸配列を含む：
（Ａ）配列番号２６、２７、又は２８に示される軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）（Ａ）の核酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する核酸配列；及び
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下で（Ａ）の核酸配列の相補鎖とハイブリダイズした核酸配列。

いくつかの特定の実施態様において、同一性のパーセンテージは、遺伝暗号の縮重に由来し、コードされたタンパク質配列は変化しないままである。

例示的な高ストリンジェンシー条件は、５× ＳＳＰＥ及び４５％ホルムアミド中４５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中６５℃での最終洗浄を含む。等価なストリンジェンシーの条件は、Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10に記載される温度及び緩衝液、又は塩濃度の変動によって達成することができることが当技術分野で理解されている。ハイブリダイゼーション条件における修飾は、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さ及びパーセンテージに基づいて経験的に決定され得るか、又は正確に計算され得る。ハイブリダイゼーション条件はSambrook, et al, (Eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51に記載されているように計算することができる。

宿主細胞
本開示に開示されている宿主細胞は、本開示の抗体を発現するのに適した任意の細胞、例えば、細菌、酵母、真菌、植物又は動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり得る。本開示の抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220に記載されるｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞、例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーを用いて使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養するか、又は宿主細胞が増殖される培養培地中に抗体を分泌することによって、抗体を産生する。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。

医薬組成物
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。

組成物の成分
医薬組成物は、任意に、１つ以上の追加の医薬活性成分、例えば別の抗体又は薬物を含有することができる。本開示の医薬組成物はまた、抗Ｐ－カドヘリン抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば、別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、又はワクチンとの併用療法で投与することもできる。薬学的に許容される担体は、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル又は固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は非毒性補助物質、当技術分野で公知の成分の種々の組み合わせ又はそれ以上を含むことができる。

適切な成分としては、例えば、酸化防止剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、潤滑剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤又は安定剤、例えば糖及びシクロデキストリンが挙げられる。適切な酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及び／又はプロピルガラクトが挙げられる。本開示に開示されているように、抗体又は本開示の抗原結合断片を含む溶媒中に、組成物は、メチオニンのような１以上の抗酸化剤を含み、その還元抗体又は抗原結合断片を酸化することができる。酸化還元は、結合親和性の減少を妨げ、又は減少させ、それによって抗体の安定性を高め、貯蔵寿命を延ばすことができる。従って、いくつかの態様において、本開示は、１以上の抗体又はその抗原結合断片、及び１以上の抗酸化剤、例えばメチオニンを含む組成物を提供する。本開示は、さらに、抗体又はその抗原結合断片が、それらの貯蔵寿命及び／又は増大した活性を延長するために、その抗体又は抗原結合断片が酸化を防止できるように、メチオニンのような１以上の抗酸化剤と混合される、種々の方法を提供する。

さらに例示すると、薬学的に許容される担体としては、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張ブドウ糖注射、滅菌水注射、又はデキストロース注射、又は乳酸リンゲル注射のような水性ビヒクル、植物由来の固定油のような非水性ビヒクル、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、又は落花生油のような非水性ビヒクル、静菌剤、塩化ナトリウム又はデキストロースのような静菌剤、リン酸又はクエン酸緩衝液のような等張剤、硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤、塩酸プロカインのような局所麻酔剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのような懸濁剤及び分散剤、又はポリビニルピロリドンが挙げられ、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤又はキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸又は乳酸が含まれ得る。担体として利用される抗菌剤は、フェノール又はクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む複数回投与容器中の医薬組成物に添加され得る。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールが挙げられる。適切な無毒性の補助物質としては、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増強剤、又は酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、又はシクロデキストリンのような剤が挙げられる。

用法及び用量
本開示の医薬組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、種々の経路、例えば、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、心室内、気管内、頬内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内、又は他の方法で移植又は吸入により投与することができる。本組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、座薬、浣腸剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾルを含むが、これらに限定されない、固体、半固体、液体、又は気体形態の製剤に処方することができる。適切な処方及び投与経路は、意図された用途及び治療レジメンに従って選択され得る。

経腸投与に適した製剤には、硬質又は軟質ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（コーティング錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤又は吸入剤を含む）、及びそれらの制御放出形態が含まれる。

非経口投与（例えば、注射による）に適した製剤には、活性成分が溶解、懸濁、又は他の方法で提供される（例えば、リポソーム又は他の微粒子中）水性又は非水性、等張性、発熱物質を含まない滅菌液体（例えば、溶液、懸濁液）が含まれる。そのような液体は、他の薬学的に許容される成分、例えば抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液（又は他の関連する体液）と等張にする溶質を含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤に使用するための適切な等張性担体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸リンゲル注射液が挙げられる。同様に、用量、タイミング及び反復を含む特定の投与法は、特定の個体及びその個体の病歴、ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的考察に依存するであろう。

投与の頻度は、治療の経過にわたって決定及び調整され得、そして増殖性又は腫瘍形成性細胞の数を減少させ、そのような腫瘍性細胞の減少を維持し、腫瘍性細胞の増殖を減少させ、又は転移の発生を遅らせることに基づいている。いくつかの実施形態において、投与される投与量は、潜在的な副作用及び／又は毒性を管理するために調整又は減弱され得る。あるいは、本治療組成物の持続放出性製剤が適切であり得る。

当業者には、適切な投与量が患者毎に変化し得ることが理解されるであろう。最適な投与量を決定することは、一般に、あらゆるリスク又は有害な副作用に対する治療上の利益のレベルのバランスを取ることを含む。選択された投与量レベルは、限定されるものではないが、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、状態の重症度、及び患者の種、性別、年齢、体重、状態、全身健康、及び過去の病歴を含む種々の要因に依存する。化合物の量及び投与経路は、最終的には、医師、獣医師、又は臨床医の裁量であるが、一般に、用量は、実質的な有害又は有害な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する作用部位で局所濃度を達成するように選択されるであろう。

一般に、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、種々の範囲で投与することができる。これらには、約５μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約５０μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重／用量；約１００μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／用量が含まれる。他の範囲としては、約１００μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量、及び約０．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重／用量が挙げられる。ある実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。

いずれにせよ、開示の抗体又はその抗原結合部分は、それを必要とする対象に必要に応じて投与されることが好ましい。投与頻度の決定は、治療される状態、治療される対象の年齢、治療される対象の状態の重症度、治療される対象の健康の一般状態などの考慮に基づいて、主治医などの当業者によってなされ得る。

特定の好ましい態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分を含む治療コースは、数週間又は数ヵ月にわたる選択された薬物製剤の複数回投与を含む。より具体的には、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、毎日、２日毎、４日毎、毎週、１０日毎、２週間毎、３週間毎、毎月、６週間毎、２ヵ月毎、１０週間毎、又は３ヵ月毎に投与することができる。この点に関し、用量を変更することができ、又は患者の反応及び臨床的実践に基づいて間隔を調整することができることが理解されるであろう。

また、１回以上の投与を受けた個体において開示された治療用組成物について、投与量及びレジメンを経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書に記載されるように生成される治療組成物の増分投与量を投与することができる。選択された状況において、用量は、経験的に決定された、又は観察された副作用又は毒性に基づいて、それぞれ、徐々に増減され得るか、又は減弱され得る。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを、前述のように追跡することができる。がんについては、これらには、触診又は視覚観察による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線又は他の画像技術による腫瘍サイズの間接的測定；腫瘍試料の直接的な腫瘍生検及び顕微鏡検査により評価される改善；本明細書に記載される方法に従って同定される間接的腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんのＰＳＡ）又は腫瘍形成性抗原の測定、疼痛又は麻痺の減少；腫瘍に関連する言語、視覚、呼吸又は他の障害の改善；食欲の増加；又は生存の容認された検査又は延長により測定されるＱＯＬの増加が含まれる。投与量は、個体、腫瘍性状態のタイプ、腫瘍性状態のステージ、腫瘍性状態が個体の他の位置に転移し始めたかどうか、及び使用されている過去及び同時治療に依存して変化することが当業者には明らかであろう。

非経口投与（例えば、静脈内注射）のための適合性製剤は、約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で本明細書に開示されている抗体又はその抗原結合部分を含む。特定の選択された実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌを含む。他の好ましい態様において、抗体又はその抗原結合部分の濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ又は１００ｍｇ／ｍｌを含む。

本開示の適用
本開示の抗体、抗体組成物及び方法は、例えば、Ｐ－カドヘリンの検出又は免疫応答の増強を含む多数のインビトロ及びインビボ有用性を有する。例えば、これらの分子は、培養細胞、インビトロもしくはエクスビボ、又はヒト対象、例えばインビボに投与して、様々な状況における免疫を増強することができる。免疫応答は、例えば、増強され、刺激され、又はアップレギュレートされ得る。

例えば、対象には、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が含まれる。本方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答）を増強することによって治療することができる障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。特定の実施形態では、本方法は、インビボでのがんの治療に特に適している。抗原特異的な免疫増強を達成するために、抗Ｐ－カドヘリン抗体を、対象の抗原と共に投与することができ、又は、抗原が、治療される対象（例えば、腫瘍担持又はウイルス担持対象）中に既に存在し得る。Ｐ－カドヘリンに対する抗体を別の薬剤と共に投与する場合、この２つを順番に、又は同時に投与することができる。

本開示はさらに、試料中のヒトＰ－カドヘリン抗原の存在を検出する方法、又はヒトＰ－カドヘリン抗原の量を測定する方法を提供し、ヒトＰ－カドヘリンと抗体又はその一部とヒトＰ－カドヘリンとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＰ－カドヘリンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分と試料及び対照試料とを接触させることを含む。次に、複合体の形成が検出され、ここで、対照試料と比較した試料間の差異複合体形成は、試料中のヒトＰ－カドヘリン抗原の存在を示す。さらに、本開示の抗Ｐ－カドヘリン抗体を用いて、免疫親和性精製を介してヒトＰ－カドヘリンを精製することができる。

がんなどの疾患の治療
いくつかの態様において、本開示は、哺乳動物における障害又は疾患を治療する方法を提供し、これは、本明細書に開示されているように、治療上有効な量の抗体又はその抗原結合部分を、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む。
疾患又は疾患はがんの可能性がある。

Ｐ－カドヘリンが関与する種々のがんは、悪性であろうと良性であろうと、原発性であろうと二次性であろうと、開示によって提供される方法によって治療され得るか、又は予防され得る。がんは固形がん又は血液悪性腫瘍である。このようながんの例には、肺がん、例えば、気管支原性癌腫（例えば、非小細胞肺がん、扁平上皮癌腫、小細胞癌腫、大細胞癌腫、腺癌腫）、肺胞細胞癌腫、気管支腺腫、軟骨腫性過誤腫（非がん性）、および肉腫（がん性）；心臓がん、例えば、粘液腫、線維腫、及び横紋筋腫；骨がん、例えば、骨軟骨腫、コンドローマ、軟骨芽腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、および網状細胞肉腫；脳がん、例えば、神経膠腫（例えば、多形神経膠芽腫）、未分化星状細胞腫、星細胞腫、稀突起神経膠腫、髄芽腫、脊索腫、神経鞘腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚細胞腫、奇形腫、皮様腫嚢胞、血管腫；消化器系のがん、例えば、結腸がん、平滑筋腫、類表皮癌腫、腺がん、平滑筋肉腫、胃腺がん、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸ポリープ、及び結腸直腸がん；肝臓がん、例えば、肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞がん、線維層状がん、胆管がん、肝芽腫、および血管肉腫；腎臓がん、例えば、腎腺癌腫、腎細胞癌腫、過腎腫、及び腎盂の移行上皮がん；膀胱がん；血液がん；例えば、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性（骨髄的、骨髄性、骨髄芽球性、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、セザリー症候群およびヘアリー細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄的、骨髄性、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉症、及び骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、骨髄線維症、血小板血症、慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患を含む）；皮膚がん、例えば、基底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、黒色腫、カポジ肉腫、及びパジェット病；頭頸部がん；眼関連がん、例えば、網膜芽細胞腫及び眼内黒色がん；男性生殖器系がん、例えば、前立腺肥大症、前立腺がん、及び精巣がん（例えば、精上皮腫、奇形腫、胎児性癌腫、及び絨毛癌腫）；乳がん；女性の生殖器系がん、例えば、子宮がん（子宮内膜癌腫）、子宮頸がん（子宮頸癌腫）、卵巣がん（卵巣癌腫）、外陰癌腫、膣癌腫、卵管がん、および胞状奇胎；甲状腺がん（乳頭がん、濾胞がん、未分化がん、または髄様がんを含む）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非がん性増殖；膵臓がん；血液がん、例えば、白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、及びホジキンリンパ腫が含まれる。ある態様において、がんは、Ｐ－カドヘリン陽性固形腫瘍である。いくつかの具体的な実施形態において、がんは大腸がんである。いくつかの他の実施形態において、がんは、乳がん、前立腺がん又はＮＳＣＬＣである。

いくつかの実施形態において、がんの例としては、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度拡散ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度非切断型細胞ＮＨＬ；巨細胞性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストロームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに水晶体腫に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫など）、Ｂ細胞増殖性疾患、メイグス症候群が挙げられる。より具体的な例としては、限定されないが、再発性または難治性のＮＨＬ、最前線の低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＨＬ、化学療法抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病および／またはリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病および／または前リンパ球性白血病および／または小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫および／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、節外辺縁帯ＭＡＬＴリンパ腫、結節辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質細胞腫および／または形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中等度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度のびまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、進行性のＮＨＬ（進行性の最前線ＮＨＬおよび進行性の再発性ＮＨＬを含む）、自家幹細胞移植後に再発した、または自家幹細胞移植に抵抗性のＮＨＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ、巨大疾患ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（末梢）大型顆粒状リンパ性白血病、菌状息肉症および／またはセザリー症候群、皮膚（皮膚）リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫が挙げられる。

いくつかの実施形態において、がんの例は、さらに、限定されないが、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ球性白血病を含むＢ細胞増殖性障害を含む。このようなリンパ腫およびリンパ性白血病には、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切断細胞リンパ腫／バーキットリンパ腫（風土性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫および脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ヴァルデンシュトレームのマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、および／またはｊ）ホジキン病が含まれる。

免疫応答の刺激
ある態様では、本開示はまた、対象における免疫応答が増強されるように、本開示の抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を増強する（例えば、刺激する）方法を提供する。例えば、対象は哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。

用語「免疫応答を増強する」又はその文法的変異は、哺乳動物の免疫系のいずれかの応答を刺激し、誘発し、増強し、改善し、又は増強することを意味する。免疫応答は、細胞応答（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介性などの細胞媒介性）又は体液性応答（すなわち、抗体媒介性応答）であってもよく、一次又は二次免疫応答であってもよい。免疫応答の増強の例には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性の増加及び細胞溶解性Ｔ細胞の生成が含まれる。免疫応答の増強は、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えば、ＩＬ－２産生又はＩＦＮ－γ産生）、腫瘍の退縮、担がん動物の生存、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、及び細胞傷害性を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の多数のインビトロ又はインビボ測定を用いて評価することができる。典型的には、本開示の方法は、本明細書に開示された方法を用いて処理されていない哺乳動物又は哺乳動物による免疫応答と比較した場合、哺乳動物による免疫応答を増強する。

抗体又はその抗原結合部分は、単独療法として単独で使用することができ、又は化学療法、放射線療法、標的療法又は細胞免疫療法などと組み合わせて使用することができる。

化学療法との併用
抗体又はその抗原結合部分は、抗がん剤、細胞毒性剤又は化学療法剤と組み合わせて使用することができる。

用語「抗がん剤」又は「抗増殖剤」は、がんのような細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を意味し、限定されるものではないが、細胞毒性剤、細胞増殖剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線治療剤、標的抗がん剤、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤ならびに免疫治療剤を含む。上述したような選択された態様において、そのような抗がん剤は、結合体を含み、投与前に開示された部位特異的抗体と結合し得ることが理解されるであろう。より具体的には、特定の実施形態では、選択された抗がん剤は、本明細書に記載されるように操作された抗体の非対合システインに連結され、操作されたコンジュゲートを提供する。従って、このような操作されたコンジュゲートは、本開示の範囲内にあると明示的に考えられる。他の態様において、開示された抗がん剤は、上記のような異なる治療剤を含む部位特異的結合体と組み合わせて投与されるであろう。

本明細書中で使用される場合、用語「細胞毒性剤」は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を減少又は阻害し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。ある態様において、物質は、生きている生物に由来する天然分子である。細胞傷害性物質の例としては、限定されるものではないが、細菌（例えば、ディプテリア毒素、シュードモナス・エンドトキシン及び酵素活性毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、植物（例えば、アブリシン、モデクミン、ポケウィッド抗ウイルスタンパク質、サポリン、モモリジン、トリコサンチン、オオオムギ毒素、アレイライト・フォルディタンパク質、ジアントラ・メリカナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰ－Ｓ）、モルディカ抗シャラ阻害剤、クロチン、サポナリア・オフィシン阻害剤、ゲロニン、ミテゲロシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン（例えば、細胞傷害性ＲＮａｓｅ）が挙げられる。例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ（その断片及び／又は変種を含む）。

本開示の目的のために、「化学療法剤」は、がん細胞（例えば、細胞傷害性又は細胞増殖抑制剤）の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に減少又は阻害する化学化合物を含む。このような化学剤は、しばしば、細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスに向けられ、従って、一般に急速に成長及び分裂するがん性細胞に対して特に効果的である。たとえば、ビンクリスチンは微小管を脱重合し、細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。一般に、化学療法剤は、がん性細胞、又はがん性となる可能性が高い細胞、又は腫瘍形成性子孫（例えば、ＴＩＣ）を阻害する、又は阻害するように設計された任意の化学剤を含むことができる。
このような薬物はしばしば投与され、例えばＣＨＯＰ又はＦＯＬＦＩＲＩのようなレジメンにおいて、併用で最も効果的であることが多い。

本開示の部位特異的構築物と組み合わせて（部位特異的コンジュゲートの成分として、または非コンジュゲート状態で）使用され得る抗がん剤の例としては、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」））；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルロルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を減少させるＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が例示される。また、この定義には、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター、副腎におけるエストロゲン産生を調節するアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が含まれる。

放射線療法との併用
本開示はまた、抗体又はその抗原結合部分と放射線療法との組み合わせ（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子放射等のような腫瘍細胞内のＤＮＡ損傷を局所的に誘導する任意の機構）を提供する。腫瘍細胞への放射性同位元素の指向性送達を使用する組合せ療法も企図され、開示された抗体は、標的化抗がん剤又は他のターゲティング手段と関連して使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１～約２週間の期間にわたってパルス状に投与される。放射線療法は、頭頸部がんを有する対象に約６～７週間投与することができる。任意に、放射線療法は、単回線量として、又は複数の連続線量として投与され得る。

診断
本開示は、増殖性障害を検出、診断又はモニタリングするためのインビトロ及びインビボの方法、ならびに腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための患者由来の細胞をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、治療又はがんの進行をモニターするためにがんを有する個体を同定するステップであって、本明細書に記載されるように、患者又は患者から（インビボ又はインビトロのいずれかで）得られた試料を抗体と接触させるステップと、試料中の結合標的分子又は遊離標的分子に対する抗体の存在又は不在、又は会合のレベルを検出するステップとを含む。ある態様において、抗体は、本明細書に記載されるように、検出可能な標識又はレポーター分子を含むであろう。

ある態様において、試料中の特定の細胞との抗体の会合は、試料が腫瘍形成性細胞を含んでもよく、それによって、がんを有する個体が本明細書に記載されるように抗体で効果的に処理され得ることを示すことができる。

試料は、多数のアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウエスタンブロット分析及びフローサイトメトリーアッセイによって分析することができる。適合性のインビボ熱診断アッセイ又は診断アッセイは、技術的に認識されたイメージング又はモニタリング技術、例えば、当業者には知られているように、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子断層撮影法（例えば、ＰＥＴスキャン）、放射線撮影、超音波等を含むことができる。

医薬品パック及びキット製造業
１つ以上の用量の抗体又はその抗原結合部分を含む、１つ以上の容器を含む薬学的パック及びキットもまた提供される。特定の実施形態では、単位投与量は、１つ以上の追加剤を伴う又は伴わない、例えば、その抗体又は抗原結合部分を含む組成物の所定量を含む、単位投与量が提供される。他の実施形態では、そのような単位投与量は、注射のための単回使用予め充填された注射器で供給される。さらに他の実施形態では、単位投与量に含まれる組成物は、生理食塩水、スクロースなど；リン酸塩などの緩衝液；及び／又は安定で有効なｐＨ範囲内に製剤化することができる。あるいは、ある態様において、組成物は、適切な液体、例えば、滅菌水又は生理食塩水溶液を添加することによって再構成することができる凍結乾燥粉末として提供されてもよい。特定の好ましい態様において、組成物は、スクロース及びアルギニンを含むが、これらに限定されない、タンパク質凝集を阻害する１以上の物質を含む。容器上の、又は容器に関連するいかなるラベルも、封入された抗体が選択される腫瘍性疾患の状態を治療するために使用されることを示す。

また、本開示は、抗体の単回投与又は複数回投与単位、及び任意に１種以上の他の抗がん剤を産生するためのキットを提供する。キットは、容器と、容器上に、又は容器に関連するラベル又はパッケージ挿入物とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックのような種々の材料から形成することができ、コンジュゲート又は非コンジュゲート形態で開示された抗体の薬学的に有効な量を含有する。他の好ましい態様において、容器は、無菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。このようなキットは、一般に、適切な容器中に、抗体の薬学的に許容される製剤、及び任意に、同一又は異なる容器中の１種以上の抗がん剤を含有するであろう。キットはまた、診断用又は併用療法用のいずれかで、他の薬学的に許容される製剤を含んでもよい。例えば、開示の抗体又はその抗原結合部分に加えて、このようなキットは、化学療法剤又は放射線治療剤；抗血管新生剤；抗転移剤；標的抗がん剤；細胞毒性剤；及び／又は他の抗がん剤のような一種又は複数種の抗がん剤を含有することができる。

より具体的には、キットは、開示された抗体又はその抗原結合部分を含有する単一の容器を有することができ、さらなる成分の有無を問わず、又は、それらは、各所望の作用物質について異なる容器を有することができる。複合治療薬が接合のために提供される場合、単一の溶液は、モル同等の組み合わせで、又は他の成分を超える１つの成分とのいずれかで、予め混合され得る。あるいは、抗体及び任意のキットの抗がん剤は、患者に投与する前に、別個の容器内に別々に維持することができる。キットはまた、注射用静菌水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液のような、無菌の、薬学的に許容される緩衝液又は他の希釈剤を含有するための第２／第３の容器手段を含んでもよい。

キットの成分が１つ以上の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は好ましくは水溶液であり、無菌の水溶液又は生理食塩水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として提供することができる。試薬又は成分を乾燥粉末として提供する場合、粉末は、適切な溶媒を加えることによって再構成することができる。溶媒は、他の容器にも提供され得ることが想定される。

簡単に上述したように、キットはまた、抗体又はその抗原結合部分、及び任意の成分を患者に投与するための手段、例えば、１つ以上の針、Ｉ．Ｖ．バッグ又はシリンジ、又は点眼薬、ピペット、又は他の同様の装置を含み、これらから製剤を動物に注射又は導入し、又は体の罹患領域に適用することができる。本開示のキットはまた、典型的には、バイアルなどを収容するための手段、及び所望のバイアル及び他の装置が入れられ保持される射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器などの商業的販売のために密閉された他の構成要素を含むであろう。

配列表の概要
本開示に例示されるような７つの抗体のＣＤＲ、フレームワーク領域、定常領域配列は、下記の表にリストされる。

したがって、本開示は、一般的に説明されているが、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、本開示を限定することを意図したものではない。実施例は、以下の実験が実施された全て又は唯一の実験であることを表すことを意図したものではない。

実施例１
材料、抗原、ベンチマーク抗体及び細胞株の調製
１．１ 材料の調製
実施例で使用した市販の材料に関する情報を表１Ａに示す。

１．２ 可溶性抗原の発現ベクターの構築
ヒトＰ－カドヘリンの細胞外ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２２２２３、ａａ１０８－６５４）、ドメイン１（ａａ１０８－２３６）、ドメイン１＆２（ａａ１０８－３４８）、ドメイン１＆２＆３（１０８－４６１）及びドメイン１＆２＆３＆４（１０８－５５０）をコードするアミノ酸配列を、それぞれ、哺乳類発現のために最適化され、次にＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｕＺｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）によって合成された。次に、ＤＮＡセグメントを、Ｃ末端に６×Ｈｉｓを有するｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター中にサブクローニングした。ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＰ－カドヘリンのタンパク質試料もＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した。

１．３ ＢＭＫ抗体の発現ベクターの構築
以下の実験において、ベンチマーク抗体（ＷＢＰ３１９－ＢＭＫ１、ＷＢＰ３１９－ＢＭＫ２及びＷＢＰ３１９－ＢＭＫ４）として使用される抗Ｐ－カドヘリン抗体の可変ドメインをコードするアミノ酸配列を、まず、哺乳動物発現のために最適化され、次に、ＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｕＺｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）によって合成された。次に、ＤＡセグメントを、ヒトＩｇＧ１の定常領域を有するｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにサブクローニングした。

１．４ タンパク質の小規模発現
ＶＨ及びＶＬ遺伝子を含むプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ａ１４６３５）に同時トランスフェクトした。この細胞を、製造業者が提案したプロトコールに従って５日間培養した。上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。

ＶＨ及びＶＬ遺伝子を含むプラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ａ２９１３３）に同時トランスフェクトした。この細胞を、製造業者が提案したプロトコールに従って１０日間培養した。上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。

１．５ Ｆｃ標識タンパク質の精製
Ｅｘｐｉ２９３細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞発現標的タンパク質の上清を集め、いずれかのプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ １７５４３８）又はプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ，170618））を用いて精製のために濾過した。精製したＦｃ標識タンパク質の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。サイズ及び純度は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣにより試験し、次に－８０℃で保存した。

１．５ 細胞プール／細胞株の生成
標的発現細胞プールの生成
ヒトＰ－カドヘリン発現細胞プールを作製した。簡単に述べると、ＣＨＯ－Ｋ１を、製造業者のプロトコールに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－１１６６８０２７）を用いて、Ｐ－カドヘリンの全長を含有するｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後４８～７２時間で、細胞を選択培地中でＴ１２５フラスコに継代培養した。選択の２又は３継代後、安定な細胞プールを得、抗Ｐ－カドヘリン抗体を用いてＦＡＣＳにより発現レベルを測定した。

標的発現細胞株の作製
リポフェクタミン２０００を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、完全長ヒトＰ－カドヘリンをコードする遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な選択圧を含む培地中で培養した。ヒトＰ－カドヘリン高発現安定細胞株（Ｗ３１９－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．ＦＬ．Ｓ１１４）を、限定希釈により得た。

実施例２
抗体ハイブリドーマの生成、スクリーニング及び最適化
２．１ 予防接種
ＯｍｎｉＲａｔは、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を保有するＯｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙが開発したトランスジェニックラットである。６～８週齢の４匹のＯＭＴラットを、４０～６０μｇのヒトＰ－カドヘリンＥＣＤタンパク質及び２００～６００μｇのプラスミドＤＮＡ抗原／動物で免疫化した。アジュバント混合物は、Ａｄｊｕｄ－Ｐｈｏｓ、ＣｐＧ－ＯＤＮ及びＴｉｔｅｒ－Ｍａｘを含む。動物に、足パッド、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内経路を介して、計９回の注射を隔週に１回行った。血清力価はＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより測定した。血清力価が十分に高かった場合（≧１：２４，３００）、抗体価が最も高い動物に、アジュバントを添加せずに滅菌ＰＢＳ中のタンパク質による最終追加免疫を与えた。３日後（７２時間）、動物を安楽死させ、リンパ節及び脾臓を抽出し、細胞融合に使用した。

２．２ 血清力価検出
細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、与えられた抗原に対する血清抗体力価を測定した。簡単に説明すると、Ｐ－カドヘリンでトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞系（Ｗ３１９－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．ＦＬ．Ｓ１１４）を９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）に５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中に一晩保持し、次に、室温で１時間ブロッキングバッファー（１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）／５％牛乳）でブロックした。次に、プレートを洗浄し、ハイブリドーマ上清と共に室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、次に、二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（ベチル）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌにより停止した。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて読み取った。血清力価は３倍バックグラウンドで測定した。

４匹のＯＭＴラットは、ｈＰｒｏ１に対する１：７２９００－１：２１８７００の血清力価で強い免疫応答を示した。血清力価データを図１Ａに示した。

２．３ ハイブリドーマ世代
免疫した動物のリンパ節をホモジナイズし、濾過して血液凝固物及び細胞片を除去した。
対数増殖におけるＳｐ２／０骨髄腫細胞を収集し、遠心単離した。Ｂ細胞及びＳｐ２／０骨髄腫細胞を別々にプロナーゼ溶液で処理し、反応をＦＢＳにより停止した。細胞を洗浄し、計数した。Ｂ細胞を、一般的な電気融合法に従って電気融合溶液中で１：１の割合でＳｐ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を、２０％ＦＢＳ及び１Ｘ ＨＡＴを補充したＤＭＥＭ培地に再懸濁し、次に９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）に移した。融合した細胞を３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で１０～１４日間保持した。

２．４ 抗体スクリーニング及びサブクローニング
ハイブリドーマ上清のｈＰｒｏ１抗原への結合を試験するための最初のスクリーニング方法として、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用し、フローサイトメトリー分析を、Ｐ－カドヘリントランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１細胞系（Ｗ３１９－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．ＦＬ．Ｓ１１４）、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞系、抗原を発現する腫瘍細胞、及び抗原を発現しない腫瘍細胞について実施し、ハイブリドーマ上清のｈＰｒｏ１抗原への結合及びカウンタースクリーニングを確認し、従来のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ハイブリドーマ上清のマウスＰ－カドヘリン及びシアノＰ－カドヘリン抗原への結合を試験した。

一連の包括的スクリーニングプロセスの後、陽性ハイブリドーマが１つ同定され、サブクローニングされた。対数増殖中のハイブリドーマ細胞を計数し、２００細胞を１．５ｍｌ半固体ＨＡＴ培地に添加した。細胞を５～１０秒間ボルテックス発振器中で穏やかに混合し、次に６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）中に播種した。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で７～８日間保持した。各目視可能な単一コロニーを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地を用いて９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）に選んだ。２～３日後、細胞上清を採取し、スクリーニングした。サブクローニング後、数十個の単一クローンを得た。

ハイブリドーマ細胞試料の全ＲＮＡを、ＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ抽出キットの指示に従って、最初に抽出する。次に、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。次に、ＶＨ及びＶＬドメインＤＮＡ配列を、３０サイクルのＰＣＲでｃＤＮＡから増幅し、各々は９４℃で３０秒間変性させ、６０℃で３０秒間アニールし、次に７２℃で３０秒間伸長させた。次に、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターにサブクローニングし、次に、配列決定のためにＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｕＺｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）に送る。配列決定データがハイブリドーマ細胞試料のモノクローナル性を確認すると、ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を、哺乳動物発現のためにコドンを最適化し、次にＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｕＺｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）によって合成した。次に、ＤＮＡセグメントを、ヒトＩｇＧ１の定常領域を有するｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにサブクローニングした。

２．５ 抗体の最適化
２．５．１ ＩｇＧ変換
配列決定データがハイブリドーマ細胞試料のモノクローナル性を確認すると、ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を、哺乳動物発現のためにコドンを最適化し、次にＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｕＺｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）によって合成した。次に、ＤＮＡセグメントを、ヒトＩｇＧ１の定常領域を有するｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにサブクローニングした。得られた抗体をＷ３１９５－１．５３．１－ｕＩｇＧ１Ｌと命名し、さらなる最適化のための親抗体として使用した。

２．５．２ ＰＴＭ除去
一般に、ＰＴＭ修飾は、主に、抗体発見における異性化、脱アミノ化、グリコシル化及び酸化を含み、これらはすべて、異性化のためのＤＧ、脱アミノ化のためのＮＧ、グリコシル化のためのＮ＊Ｔ／Ｓ（＊Ｐ又はＤを除く他のアミノ酸を表す）、及び酸化のためのＭ又はＣなどの典型的な部位を有する。ＰＴＭ部位が我々の抗体配列、特にＣＤＲ３のような重要な領域に見つかると、ＰＴＭ修飾の潜在的リスクを回避するためにＰＴＭ除去が必要となる。

以下のＰＴＭ除去抗体、すなわち、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ５－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ６－ｕＩｇＧ１Ｌ及びＷ３１９５－１．５３．１－ｐ７－ｕＩｇＧ１Ｌを得た。Ｎ１９Ｑ（ＶＬドメイン）突然変異はＷ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１ＬのＰＴＭ部位を除去するために選択された。

さらに、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換をＷ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ５－ｕＩｇＧ１Ｌ、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ６－ｕＩｇＧ１Ｌ及びＷ３１９５－１．５３．１－ｐ７－ｕＩｇＧ１ＬのＩｇＧ１定常領域に導入して、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ５－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ６－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０及びＷ３１９５－１．５３．１－ｐ７－ｕＩｇＧ１ＬＶ３２０を得た。

ＰＴＭ除去後、ＤＵ－１４５を発現するｈＰｒｏ１上のＦＡＣＳ結合アッセイを行い、最終リードを決定した。Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ ｍＡｂはｈＰｒｏ１発現ＤＵ－１４５細胞への良好な結合を示し、ＥＣ５０は０．０７ｎＭで、ＰＴＭ除去前の親ｍＡｂと同等であった。

実施例３
抗体のインビトロ特性評価
３．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）
Ｎｕ ＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓミニゲル４～１２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎｕ ＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。試料をローディング緩衝液と混合し、７５℃で１０分間加熱し、ゲル上にロードし、一定電圧（２００Ｖ）で３５分間実行した。ゲルを水で１０分間すすぎ、３回繰り返し、次に染色緩衝液で１時間染色し、水で１時間脱色し、３回繰り返した。

抗体の純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを用いたＳＥＣ－ＨＰＬＣアッセイにより試験した。簡単に述べると、５０μＬの抗体溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０をランニング緩衝液として用いて、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム上に注入した。実行時間は２０分であった。カラム上のピーク保持時間を２８０ｎｍでモニターした。データは、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ２．９９．２．０）を用いて分析した。

非還元バンド及び還元バンドはゲル上で観察された（図１Ｂ）。試料の純度は９４．９２％であった（図１Ｃ）。７．８分付近の保持時間はタンパク質単量体であることを示している。

３．２ Ｐ－カドヘリンに対する親和性（ＦＡＣＳ）
ＤＵ－１４５（ＨＴＢ－８１）細胞を９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）に５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。被験抗体を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で連続希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。プレートを遠心単離し、上清を廃棄した。次に、細胞を、Ａｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を１００μＬの１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）により測定し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。蛍光強度は、定量ビーズ標準曲線（ＱｕａｎｔｕｍＴＭ ＭＥＳＦ Ｋｉｔｓ，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に基づいて結合分子／細胞に変換した。ＫＤはグラフパッドＰｒｉｓｍ５により算出した。

結果を表４及び図２に示す。Ｗ３１９５－ｐ１抗体は３．４Ｅ－１１ ＭのＫＤでＤＵ－１４５細胞を発現するｈＰｒｏ１に対して良好な親和性効果を示し、Ｗ３１９－ＢＭＫ４－ｕＩｇＧ１Ｋ（１．２Ｅ－１０Ｍ）より良好であった。

３．３ 標的結合（ＦＡＣＳ）
細胞上に発現されたＰ－カドヘリンに対する試験抗体の結合を、フローサイトメトリー分析により測定した。簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ１６５０（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－５８８３）、ＨＣＴ－１１６（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ－２４７）及びＤＵ－１４５（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－８１）細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５０４００６６）で回収し、１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｏｇｅｎ、＃ＢＳＡＳ）／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０－１１７）中で１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。１×１０５細胞／ウェル（１００μＬ）を、９６ウェルＵプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３７９９）の各ウェルに添加し、１５００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃５８１０Ｒ）で５分間遠心単離した後、上清を除去した。１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で連続希釈した抗体を１００μＬ／ウェルでペレット化細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。非関連ｈＩｇＧ１抗体をアイソタイプ対照として使用した。細胞を１８０μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で２回、１５００ｒｐｍで４℃で５分間遠心単離することにより洗浄し、ペレット化細胞を、暗所で４℃で３０分間、１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で希釈した１００μＬ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９－６０５－０９８）１：５００に再懸濁した。次に、細胞を上記のように２回洗浄した。最終洗浄後、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）に再懸濁し、蛍光値をＦＡＣＳ Ｃａｎ ｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。細胞表面結合抗Ｐ－カドヘリン抗体の量は、平均蛍光（ＭＦＩ）を測定することにより評価した。ＦＡＣＳ生データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析し、抗体又は二次抗体のみを含有するウェルを用いてバックグラウンド蛍光を確立した。結合ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いた４パラメータ非線形回帰分析により得た。

表５Ａ－Ｃ及び図３Ａ－Ｃに示されるように、Ｗ３１９５－１．５３－ｐ１．１－ｕＩｇＧ１Ｌ ｍＡｂは、ｈＰｒｏ１を発現するＤＵ－１４５細胞への良好な結合を示し、ＥＣ５０は０．０７ｎＭであり、ＰＴＭ除去前の親ｍＡｂと同等であり、Ｗ３１９－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ１Ｋよりも良好であった；ＥＣ５０は０．２２ｎＭであり、Ｗ３１９－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ１Ｋ（０．３３ｎＭ）と同等であり、ｈＰｒｏ１を発現するＨＣＴ－１１６細胞への結合を示し、ＥＣ５０は０．２１ｎＭであり、Ｗ３１９－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ１Ｋ（０．３３ｎＭ）よりも良好であった。Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌ ｍＡｂはｈＰｒｏ１発現ＤＵ－１４５細胞への良好な結合を示し、ＥＣ５０は０．０５ｎＭで、ＰＴＭ除去前の親ｍＡｂと同等であった。

３．４ 種間結合（ＦＡＣＳ）
細胞上に発現されたカニクイザルＰ－カドヘリンに対する試験抗体の結合を、フローサイトメトリー分析により測定した。この方法は、ｃｙｎｏＰ－カドヘリン過剰発現ＣＨＯＫ１細胞（一過性にトランスフェクトされたＷ３１９－ＣＨＯＫ１．ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＦＬ）が使用された以外は、上記と同じであった。

表６及び図４に示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ ｍＡｂは、０．０９５ｎＭのＥＣ５０でＷ３１９－ＣＨＯＫ１．ｃｙｎｏ１．ＦＬ細胞を発現するｃｙｎｏＰｒｏ１に結合し、これはＷ３１９－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ１Ｋ（０．０８８ｎＭ）と同等であった。

３．５ パラログ／特異性結合（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＥ－カドヘリン．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ－８５０５－ＮＣ－０５０、ＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ））及びヒトＮ－カドヘリン．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ－１３８８－ＮＣ－０５０、ＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ３．ＥＣＤ．ｈＦｃＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ））に対する抗体の結合を捕捉タンパク質結合ＥＬＩＳＡにより試験した。９６ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃：４４２４０４）を、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３， １８０ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ＝９．２）中、１μｇ／ｍＬ捕捉抗体（ＴＨＥＴＭ Ｈｉｓ Ｔａｇ ｍＡｂ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃａｔ＃：Ａ００１８６）で４℃で一晩コーティングした。全てのウェルを、３００μＬ／ウェルのＰＢＳ／０．５℃ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄し、アッセイにおける以下のすべての洗浄工程を同じように行った。
次に、ウェルを３％ミルク（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｄｉｎｇｕｏ－ＤＨ２２０）／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０－１１７）で１時間ブロックし、３回洗浄し、次に、３％ミルク／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）中の１μｇ／ｍＬ抗原を室温で１時間結合させ、その後３回洗浄した。一次抗体結合のために、３％ミルク／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）中で連続希釈したＢＭＫ及び著者らの鉛抗体を含む試験抗体を関連ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＷＢＰ３１９－ｃＡｂ２（Ｒ＆Ｄ）及びＷＢＰ３１９－ｃＡｂ４を、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎへの結合について別々に陽性対照として含めた。プレートを１００μＬの二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（ベチル、Ｃａｔ＃：Ａ８０－３０４Ｐ、５０００倍希釈）、抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ（ベチル、Ｃａｔ＃：Ａ９０－２３１Ｐ、１００００倍希釈）及びヤギ抗ラットＩｇＧ交差吸収Ｆｃ－ＨＲＰ（ベチル、Ｃａｔ＃：Ａ１１０－２３６Ｐ、５０００倍希釈）を３％牛乳／１×ＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）中に添加する前に３回洗浄した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次に上記のように６回洗浄した。

結合検出のために、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃：００２０００２３）を、１００μＬの２Ｍ ＨＣｌとの反応を停止する前に、１０分間、全てのウェルに添加した。ＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ）及びＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ３．ＥＣＤ．ｈＦｃＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ）に結合する試験抗体の程度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０吸光度を測定することにより測定した。適宜、結合ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いた４パラメータ非線形回帰分析により得た。

表７及び図５Ａ－Ｂに示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１ＬはＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ２及びＷＢＰ３１９－ｈＰｒｏ３に対して非特異的結合を示さず、ＥＣ５０は＞１００ｎＭであった。

３．６ ドメイン測定結合（ＥＬＩＳＡ）
Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２３．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２３４．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）（２．５）及びＷ３１９－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）－Ｐ３に対する抗体の結合を直接タンパク質結合ＥＬＩＳＡにより試験した。９６ウェル高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃：４４２４０４）を、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３，１８０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，ｐＨ＝９．２）中の１μｇ／ｍＬ抗原で４℃で一晩コーティングした。全てのウェルを、３００μＬ／ウェルのＰＢＳ／０．５℃ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄し、アッセイにおける以下のすべての洗浄工程を同じように行った。次に、ウェルを２％ＢＳＡ（ボウゲン、Ｃａｔ＃：ＢＳＡＳ）／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）（Ｇｉｂｃｏ、＃１４０４０－１１７）で１時間ブロックし、３回洗浄した。一次抗体結合のために、２％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）中で連続希釈されたＢＭＫ及び我々の抗体を含む試験抗体を関連ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、１００μＬの二次抗体ヤギ抗ヒト－ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃａｔ＃：１０９－０３５－０９７）５０００倍希釈２％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）を添加する前に３回洗浄した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次に上記のように６回洗浄した。

結合検出のために、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃：００２０００２３）を、１００μＬの２Ｍ ＨＣｌとの反応を停止する前に、１０分間、全てのウェルに添加した。Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２３．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）、Ｗ３１９－ｈＰｒｏ１．Ｄ１２３４．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）及びＷ３１９－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＷＴ）－Ｐ３に結合する試験抗体の程度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０吸光度を測定することにより測定した。適宜、結合ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いた４パラメータ非線形回帰分析により得た。

表８及び図６Ａ－Ｅに示されるように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、０．０８０ｎＭのＥＣ５０でドメイン３に結合した。その結合エピトープはＢＭＫとは異なる。

３．７ 抗体媒介インターナリゼーションアッセイ（Ｆａｂ－ＺＡＰ）
Ｆａｂ－ＺＡＰは、ヤギ抗ヒト一価抗体及びリボソーム不活性化タンパク質サポリンの化学結合体である。ヒト抗体のインターナリゼーションを測定するために使用されたＦａｂ－ＺＡＰ抗体は、ヒトＩｇＧの重鎖及び軽鎖の両方に対する親和性精製ポリクローナル抗体であった。Ｆａｂ－ＺＡＰは、内在化についてのヒトＩｇＧ抗体のスクリーニングに使用される。アッセイ日の１日前に、ＨＣＣ－１９５４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３３８）細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００８４．０３）を含有する５０μＬのＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ、＃２２４００－０８９）中で、９６ウェルクリアボトムブラックプレート（Ｇｒｅｉｎｉｅｒ、＃６５５０９０）中に、ウェル当たり４０００個の細胞でプレートした。１日目に、精製された抗体及びＦａｂ－Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＴ－５１）をＦａｂ－Ｚａｐ：Ａｂ＝３：１（単位：ｍｏｌ／Ｌ）の比率で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした後、Ａｂ－Ｆａｂ－Ｚａｐ複合体をアッセイ培地で連続希釈し、９６ウェルプレート中のＨＣＣ－１９５４細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で別の４日間保持した後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７５７３）を用いて細胞生存率を評価した。５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ溶液を各ウェルに添加し、１０分間穏やかに振盪しながら室温でインキュベートした。発光量はＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。各抗体で得られた細胞毒性効果は、Ｃｅｌｌのみの対照ウェルで得られたルミネセンス値を比較することによって計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて抗体内在化のＩＣ５０値を得るために、４パラメータ非線形回帰分析を用いた。

表９及び図７Ａに示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ及びＷ３１９５－１．５３．１－ｐ３－ｕＩｇＧ１Ｌは、Ｆａｂ－ＺＡＰ ＣＴＧアッセイによりそれぞれ０．０２０ｎＭ及び０．０２０ｎＭのＩＣ５０で良好な内在化能を示し、これはＢＭＫ４（０．０７６ｎＭ）よりも良好であった。

３．８ 抗体媒介内在化アッセイ（高含量スクリーニング、ＨＣＳ）
Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）は、高速及び高感度で試料の画像を収集及び分析することができる高含有量の画像化及び分析システムである。アッセイ日の１日前に、ポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）をＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００２８．０３）中で８μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルを９６ウェル透明底ブラックプレート（Ｇｒｅｉｎｉｅｒ、＃６５５０９０）に添加した。次に、ＰＤＬコーティングプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、上清を廃棄した。ＨＣＣ－１９５４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３３８）細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００８４．０３）を含有する１００μＬ ＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ、＃２２４００－０８９）中で、ＰＤＬコーティングプレート中に、ウェル当たり１８０００細胞でプレートした。１日目に、プレート中の上清を捨て、抗体を１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）中で連続希釈し、１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で２時間インキュベートした。非関連ｈＩｇＧ１抗体をアイソタイプ対照として使用した。細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）でマルチチャネルピペッテス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により洗浄し、次に、１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で希釈した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９－１１５－０９８）１：１５０のＰＥ抱合ヤギに暗所で４℃で１時間再懸濁した。次に、上記のように細胞を１回洗浄し、１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）に２時間、３７℃で再懸濁し、上清を捨て、１００μＬ／ウェルクエンチ緩衝液（０．１Ｍグリシン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨを２．５に調整）を添加し、４℃で５分間インキュベートした。次に、上記のように細胞を１回洗浄し、ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００２８．０３）中で希釈したＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｈ３５７０）１：５０００に、室温で１５分間再懸濁した。上記のようにＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，＃ＳＨ３００２８．０３）で洗浄した後、細胞を４％ＰＦＡに再懸濁し、４℃で保存し、画像を収集し、オペレッタＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により分析した。細胞当たりの平均蛍光（ＭＦＩ）を測定することにより、取り込まれた抗Ｐ－カドヘリン抗体の量を評価し、抗体を含まないウェル又は二次抗体のみを用いてバックグラウンド蛍光を確立した。内在化ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いた４パラメータ非線形回帰分析により得た。

表１０及び図７Ｂに示されるように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、ＨＣＳアッセイを用いて、ＥＣ５０が０．０２９ｎＭ、Ｔｏｐ ＭＦＩが１６０５（ＢＭＫ４よりも高い）で、良好な内在化能を示した。

３．９ レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
抗Ｐ－カドヘリン抗体のＡＤＣＣ能力をレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を用いて測定した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６．Ａ５細胞株を、核因子活性化Ｔ細胞（ＮＡＦＴ）応答エレメントの制御下で、ＣＤ１６－Ｖ１５８タンパク質及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現することにより、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ、＃ＴＩＢ－１５２）細胞を用いて操作した。簡単に説明すると、ＡＤＣＣ当日、ＨＣＴ－１１６を発現するＰ－カドヘリン細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ－２４７、８ｅ４細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３９０３）中にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６．Ａ５細胞（４ｅ４細胞／ウェル）でプレーティングし、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００２８．０３）を含有する１００μＬ ＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ、＃２２４００－０８９）中で抗体又はｈＩｇＧアイソタイプ対照の連続希釈を行った。３７℃でほぼ４時間インキュベートした後、５０μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）試薬を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって読み取り、ルミネセンス信号を測定した。抗体のＡＤＣＣ活性を、抗体添加なしで対照ウェルと得られたルミネセンスを比較することにより、折りたたみ変化として発現させた。次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて、４パラメータ非線形回帰分析によりＥＣ５０値を算出した。

表１１及び図８に示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を用いてＨＣＴ－１１６細胞を発現するｈＰｒｏ１に対して強力なＡＤＣＣ効果を示し、ＥＣ５０は０．０５２ｎＭであり、Ｗ３１９－ＢＭＫ１、Ｗ３１９－ＢＭＫ２及びＷ３１９－ＢＭＫ４（２．５２、０．２３及び８．０５ｎＭ）よりはるかに良好であった。

３．１０ 細胞凝集アッセイ
Ｐ－カドヘリン依存性細胞凝集を妨害する抗体の能力を、細胞凝集アッセイを用いて測定した。簡単に説明すると、ＤＵ－１４５（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－８１）細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５０４００６６）で単離し、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，＃ＳＨ３００２８．０３）を含む完全培地ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，＃２２４００－０８９）に再懸濁し、１００μＬ培地中で抗体又はｈＩｇＧアイソタイプ対照の連続希釈を用いて９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６０５５３３０）に１ｅ４細胞／ウェルで播種した。３７℃で４８時間インキュベートした後、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてプレートを走査し、細胞凝集の面積を測定した。各抗体で得られた細胞凝集破壊の程度を、抗体添加なしで対照ウェルと得られた凝集細胞の面積を比較することにより、折りたたみ変化として定量した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いた４パラメータ非線形回帰分析により算出した。

表１２及び図９Ａ－Ｂに示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、ＤＵ－１４５細胞を発現するｈＰｒｏ１の凝集に対して、０．３９ｎＭのＥＣ５０である程度の効果を示し、Ｗ３１９－ＢＭＫ１及びＷ３１９－ＢＭＫ４（１．３７及び６．７９ｎＭ）よりも良好であり、Ｗ３１９－ＢＭＫ２（０．２６ｎＭ）と同等であった。

３．１１ 非特異的結合（ＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡアッセイの両方を用いて、抗体が他のヒトタンパク質に結合するかどうかを試験した。

ＥＬＩＳＡによるタンパク質ベースの非特異的結合
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）にヒトタンパク質を２μｇ／ｍＬで４℃で一晩コーティングし、ブロッキング及び洗浄後、１０μｇ／ｍＬの抗体試料をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、次にヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰ（ベチル）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌにより停止した。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて読み取った。

ＦＡＣＳによる細胞ベースの非特異的結合
ヒト細胞株を９６ウェルプレート（ＢＤ）に１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。１０μｇ／ｍｌ抗体試料を細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートし、洗浄後、細胞を再懸濁し、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と３０分間インキュベートした。洗浄及び再懸濁後、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）により測定し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。

Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、タンパク質及び細胞に基づくアッセイを用いた非特異的結合効果を示さなかった。

３．１２ ＤＳＦによる熱安定性
抗体のＴｍを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調べた。１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５Ｘ ＳＹＰＲＯオレンジ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。プレートを０．９℃／分の速度で２６℃から９５℃に加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の誘導体を計算し、最大値を融解温度Ｔｍとして定義した。一つのタンパクに複数のアンフォールディング遷移がある場合、最初の２つのＴｍが報告され、Ｔｍ１とＴｍ２と命名された。データ収集とＴｍ計算は、オペレーションソフトウェアにより自動的に行われた。

表１３に示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１ＬはＤＳＦ試験により６５．１℃のＴｍ１を示した。

３．１３ 血清安定性
ヒト血清中の抗体安定性をＦＡＣＳにより試験した。簡単に説明すると、新鮮血液を４０００ｒｐｍで２回１０分間遠心単離することにより、ヒト血清を新鮮に単離した。抗体を新たに単離したヒト血清（血清含有率＞９５％）と混合し、３７℃でそれぞれ０、１、４、７及び１４日間インキュベートした後、試料を液体窒素又はドライアイス／エタノール浴中で急速凍結し、使用まで８０℃で保存した。対照として、抗体血清混合物を３７℃のインキュベーションなしで直ちに凍結した。ＦＡＣＳ解析では、異なる時点の試料を４℃で同時に自由解凍し、解凍した抗体を段階希釈し、１×１０５／ウェル ＨＣＴ－１１６（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ－２４７）細胞に加え、４℃で１時間インキュベートし、１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で２回洗浄した。１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋）で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９－６０５－０９８）１：５００抱合ヤギを細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を同じ緩衝液中で２回洗浄し、染色細胞の平均蛍光（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。抗体又は二次抗体のみを含まないウェルを用いてバックグラウンド蛍光を確立した。４パラメータの非線形回帰分析を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて細胞結合のＥＣ５０値を得た。

表１４及び図１０に示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌは、ヒト血清（３７℃）中で１４日間インキュベートした後、同等のＦＡＣＳ結合により測定したとき、良好な安定性を示した。

３．１４ ＰＴＭ除去及びＦｃ修飾後の機能分析
細胞上に発現されたヒトＰ－カドヘリンに対する抗体の結合を、フローサイトメトリー分析により測定した。ＰＴＭ除去及びＦｃ修飾後、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３－ｐ５－ｕＩｇＧＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．１－ｐ６－ｕＩｇＧＬＶ３２０及びＷ３１９５．１．５３－１．１－ｐ７－ｕＩｇＧＬ３２０は、ＨＣＴ－１１６細胞を発現するｈＰｒｏ１に対して、それぞれＥＣ５０ ０．１４、０．１７、０．１４及び０．１４ｎＭで良好な結合能を示し、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ（０．１５ｎＭ）と同等であった（図１１Ａ）。

下記の表及び図１１Ｂに示されるように、それらはまた、ＥＣ５０ ０．１２、０．１２、０．１０及び０．０９ｎＭで、ＤＵ－１４５細胞を発現するｈＰｒｏ１に対して良好な結合能力を示し、これはＷ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ（０．１０ｎＭ）と同等であった。

図１１Ｃに示すように、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ４－ｕＩｇＧＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ５－ｕＩｇＧＬＶ３２０、Ｗ３１９５－１．１－ｐ６－ｕＩｇＧＬＶ３２０及びＷ３１９５．１．５３－１．１－ｐ７－ｕＩｇＧＬ３２０は、ＨＣＣ－１９５４細胞を発現するｈＰｒｏ１に対して、それぞれＥＣ５０ ０．０６３、０．０５８、０．０６３及び０．０５９ｎＭで良好な内在化能を示し、Ｗ３１９５－１．５３．１－ｐ１－ｕＩｇＧ１Ｌ（０．０６９ｎＭ）と同等であった。

当業者であれば、本開示は、その精神又は中心的属性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができることをさらに理解するであろう。本開示の前述の説明は、その例示的な実施形態のみを開示しているので、他の変形が本開示の範囲内にあると考えられることを理解されたい。従って、本開示は、本明細書で詳細に説明した特定の実施形態に限定されない。むしろ、開示の範囲及び内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。

Claims (25)

1. 単離された抗体又はその抗原結合部分であって、単離された抗体又はその抗原結合部分が、
   （Ａ）（ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
   （ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
   （ｉｉｉ）配列番号６、８、９、１０又は１１を含むＨＣＤＲ３
   からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）；
   （Ｂ）（ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
   （ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
   （ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３
   からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）；又は
   （Ｃ）（Ａ）の１つ以上のＨＣＤＲ及び（Ｂ）の１つ以上のＬＣＤＲ
   を含む、上記単離された抗体又はその抗原結合部分。
2. 単離された抗体又はその抗原結合部分が、
   （Ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４に記載のＨＣＤＲ２；及び配列番号６に記載のＨＣＤＲ３；ならびに
   （Ｂ）配列番号１３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のＬＣＤＲ２；及び配列番号１７に記載のＬＣＤＲ３
   を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
3. 単離された抗体又はその抗原結合部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、
   （ｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１；
   （ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ２；及び
   （ｉｉｉ）配列番号６、８、９、１０又は１１を含むＨＣＤＲ３
   からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含み；
   ＶＬは、
   （ｉ）配列番号１３を含むＬＣＤＲ１；
   （ｉｉ）配列番号１５を含むＬＣＤＲ２；及び
   （ｉｉｉ）配列番号１７を含むＬＣＤＲ３
   からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
4. 単離された抗体又はその抗原結合部分が、
   （Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）は、
   （ｉ）配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含み；
   （ｉｉ）Ｐ－カドヘリンに対する特異的結合親和性をなおも保持する、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列を含み；
   （ｉｉｉ）配列番号２１に記載されるアミノ酸配列と比較して１つ以上の（例えば、１、２又は３個の）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含む；及び／又は
   （Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
   （ｉ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含み；
   （ｉｉ）Ｐ－カドヘリンに対する特異的結合親和性をなおも保持する、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；又は
   （ｉｉｉ）配列番号２７に記載されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上の（例えば、１、２又は３個の）アミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
5. フレームワーク配列、例えば、ＶＨ又はＶＬ領域のＦＲＷ１、ＦＲＷ２、ＦＲＷ３、及び／又はＦＲＷ４中のアミノ酸の１つ以上の置換を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
6. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
   ＶＨは、
   （ｉ）配列番号１を含むＨＦＲＷ１；
   （ｉｉ）配列番号３を含むＨＦＲＷ２；
   （ｉｉｉ）配列番号５を含むＨＦＲＷ３；及び
   （ｉｖ）配列番号７を含むＨＦＲＷ４
   からなる群から選択される１つ以上の重鎖ＦＲＷ（ＨＦＲＷ）を含み；及び
   ＶＬは、
   （ｉ）配列番号１２、１９又は２０を含むＬＦＲＷ１；
   （ｉｉ）配列番号１４を含むＬＦＲＷ２；
   （ｉｉｉ）配列番号１６を含むＬＦＲＷ３；及び
   （ｉｖ）配列番号１８を含むＬＦＲＷ４
   からなる群から選択される１つ以上の軽鎖ＦＲＷ（ＬＦＲＷ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
7. 単離された抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２６、２７又は２８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
8. 単離された抗体又はその抗原結合部分が、ヒトＩｇＧ定常ドメインをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
9. ヒトＩｇＧ定常ドメインがヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常ドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１定常ドメイン又はそのバリアント、例えば、ＥＵ番号付けによるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むバリアントである、請求項８に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
10. 以下の特性：
    （ａ）ＦＡＣＳによって測定した場合、ｎＭグレードのＥＣ５０（例えば、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下）で細胞表面のヒトＰ－カドヘリン又はカニクイザルＰ－カドヘリンに結合すること；
    （ｂ）ＦＡＣＳ親和性試験によって測定した場合、ＫＤが０．１ｎＭ以下（例えば、０．０８ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０４ｎＭ以下、０．０３ｎＭ以下）で細胞表面のＰ－カドヘリンに結合すること；
    （ｃ）ヒトＥ－カドヘリン又はＮ－カドヘリンに対して交差反応性を示さないこと；
    （ｄ）ベンチマーク抗体に匹敵する良好な内在化能を有すること；
    （ｅ）ベンチマーク抗体よりも有意に優れたＡＤＣＣ効果を有すること；
    （ｆ）ｎＭグレードのＥＣ５０でヒトＰ－カドヘリン発現細胞の凝集を阻害すること；
    （ｇ）非特異的結合効果を示さないこと；及び
    （ｈ）血清中で少なくとも１４日間安定であること
    のうちの１つ以上を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分と同一のエピトープに対して競合する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
12. 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
13. （ａ）抗体の重鎖が、配列番号２１、２２、２３、２４又は２５に記載される重鎖可変領域、及び配列番号２９又は３１に記載される重鎖定常領域を含み；ならびに
    （ｂ）抗体の軽鎖が、配列番号２６、２７又は２８に記載される軽鎖可変領域、及び配列番号３０に記載される軽鎖定常領域を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
15. 請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
16. 請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
17. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
18. 適切な条件下で抗体又はその抗原結合部分をコードするベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養する工程；及び
    培養上清から抗体又はその抗原結合部分を単離する工程を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分を産生する方法。
19. 対象におけるＰ－カドヘリン関連免疫応答を調節する方法であって、対象において免疫応答が調節されるように、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は請求項１７に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
20. 対象におけるＰ－カドヘリン陽性がんを治療又は予防する方法であって、有効量の請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は請求項１７に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
21. がんは、胆管がん、食道がん、口腔がん、甲状腺腫瘍、頭頸部がん、乳がん、肺がん、NSCLC、SCLC、悪性中皮腫、結腸がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、黒色腫、皮膚がん、膀胱がん、肝臓がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、肉腫、骨肉腫、及び骨がんから選択される、請求項２０に記載の方法。
22. がんが、乳がん、ＮＳＣＬＣ、前立腺がん又は大腸がんである、請求項２１に記載の方法。
23. Ｐ－カドヘリン陽性がんを診断、予防又は治療するための医薬の製造における、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分の使用。
24. Ｐ－カドヘリン陽性がんの治療又は予防に使用するための請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
25. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む容器を含む、がんを治療又は診断するためのキット。

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