KR20030091978A - 변형된 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20030091978A
KR20030091978A KR10-2003-7010029A KR20037010029A KR20030091978A KR 20030091978 A KR20030091978 A KR 20030091978A KR 20037010029 A KR20037010029 A KR 20037010029A KR 20030091978 A KR20030091978 A KR 20030091978A
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antibody
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antibodies
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KR10-2003-7010029A
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브라슬로우스키게리알.
한나네이빌
친폴
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아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션
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Abstract

변형된 항체를 포함하여 이루어지는 신규한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 개시된 변형 항체는, 개선된 표적 국소화 및 신속한 혈액 제거와 같은 유리한 물리적 특성을 부여하기 위해 변형되거나 고갈된 하나 이상의 불변 영역 도메인을 갖는 항체를 포함하여 이루어진다. 개시된 화합물은 특히 골수억제 환자에서 종양 질환의 치료에 유용하다.

Description

변형된 항체 및 사용 방법{MODIFIED ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
[관련출원의 교차인용]
본 출원은, 2001년 1월 29일자로 출원된 미합중국 가출원 제 60/264,318호의 일부 계속 출원이며, 2001년 11월 16일자로 출원된 미합중국 가출원 제 60/331,481호에 대해 우선권을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조병합되어 있다.
지난 수십년에 걸쳐 암치료법이 진보함에 따라 비교적 다양한 악성종양 환자들이 혜택을 받았다. 불행하게도, 현대 치료법은 실질적으로 회복율이 증가하고 생존기간을 연장시키지만, 대부분의 환자들은 계속하여 그들의 병에 결국 굴복한다. 최적 세포독성투여를 제한하고 때로는 현행 치료법을 면역저하되거나 쇠약하거나보다 나이 든 환자들에게 사용할 수 없게 하는 이용가능한 치료법의 허용할 수 없는 독성(예를 들면, 골수독성)과 종양세포저항성 등이 보다 인상적인 결과를 얻는데 장애가 된다. 이들 제한은 이전에 치료를 받았거나 재발된 환자에 대한 치료를 시도할 때 특히 명백하다. 따라서, 독성이 적지만 보다 효과적이고 표적화된 치료법을 개발할 필요성이 있다.
그러한 치료의 유효성을 증진시키기 위한 한가지 시도에는 하나 이상의 세포독성제의 종양세포 국부화를 증가시키고 바람직하지 않은 교차반응성을 감소시키기 위하여 치료용 항체를 사용하는 것이 포함된다. 종양질환을 치료하는데 사용하기 위하여 항체를 보충하는 아이디어는 적어도 항체가 종양세포를 특이적으로 표적화하는데 사용될 수 있는 것으로 확인된 1953년까지 거슬러 올라간다. 그러나, 정해진 항원을 특이적으로 표적화하는 모노클로날항체의 연속공급을 가능하게 한 하이브리도마 기술에서의 코흘러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)의 독창적인 작업이 있었다. 1979년까지, 모노클로날항체(MAbs)는 인간환자의 악성종양질환을 치료하는데 사용되어 왔다. 보다 최근에 3가지 비접합 모노클로날항체인 Rituxan®, Campath®및 Herceptin®이 각각 비호지킨 림프종, CLL 및 유방암의 치료에 승인되었다. 현재, 다양한 세포독성제(예를 들면, 방사성 동위원소 또는 단백질 독소)에 접합된 많은 모노클로날항체는 다양한 악성종양질환의 치료와 관련된 임상시험 중에 있다. 지난 십년 동안, 항체를 약물, 독소, 방사성 핵종 또는 다른 약제에 접합시키고 환자에게 상기 접합체를 투여하는 방법들로서, 매우 다양한 종양특이적 항체와 항체단편이 개발되었다. 이러한 노력은 유망한 것으로 나타났으나, 크게 예상치 못한 다양한 문제점들이 일부 시약의 진단 및 치료적 유용성을 제한하고 따라서 추가 개발을 제한하였다.
가장 처리하기 어려운 문제점은 외부항원으로서 표적화 접합체에 반응할 수 있는 인간 면역시스템 그 자체에 의해 유발되는 것이다. 예를 들면, (인간에 대해 가장 흔히 사용되는 표적화항체인) 쥐의 모노클로날항체와 복합체를 형성한 약물 또는 방사성 핵종으로 치료된 환자들은 순환성 인간 항-마우스 항체(HAMAs)와 접합체의 항체 잔기에 대한 일반화된 즉석 타입-III 과민성반응을 나타낸다. 또한 (예를 들면, 단일투여에서와 같이) 부작용이 최소일 때에도, 순환성 HAMAs는 환자에서 표적화약제의 유효농도를 감소시키고 따라서 진단제 또는 치료제가 표적화부위에 도달하는 것을 제한한다.
다양한 문제점들은 RIT의 임상적 유용성을 계속 제한한다. 가장 일반적으로, 방사선표지된 MAb 면역치료(RIT)의 투여는 적색골수 내에 존재하는 정상 혈액세포에 대한 순환성 방사선표지된 면역접합체(IC)의 노출로 인한 골수독성에 의해 제한된다. 이전에 전통적 화학요법을 시행했던 환자는 긴 사전 약물치료로 인하여 적색골수 비축량이 감소되었기 때문에 특히 공격받기 쉽다. 이것은 세포독성약물과의 조합에서 RIT를 사용하는 것을 제한하는데, 많은 세포독성약물이 방사선조사된 종양세포의 항종양반응과 상승작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 독소루비신과 조합된131I 표지된 항-CEA MAb의 투여가 폐 암종의 쥐 이종이식편 모델에서 개별적인 약제의 치료효과를 증가시키는 것이 확인되었다. 그러나, 상기 조합은 별도로 투여된 각 성분보다 독성이 강하였다. 유사한 결과가 시스플라틴과 조합한 RIT의 사용에서 얻어졌다. RIT와 상승작용을 나타내는 다른 약물에는 이에 제한되지는 않으나 토포이소머라제 저해제(포도하이로톡신, 예를 들면, 에토포시드)를 포함하는 대사성 효소저해제(예를 들면, MTX, Tomudex), 항-대사산물(예를 들면, 플루오로우라실), 포르피린(가도리니움-텍사피린) 또는 DNA 인터킬레이트(예를 들면, 안트라사이클린, 캄프토테신 등)가 포함된다.
또한 심한 골수전이를 가진 암환자들은 방사선표지된 IC에 의해 표적화된 이웃 종양세포를 통한 적색골수의 추가 방사선조사로 인해 특히 위험하다. 한 예로서, 심각한 골수전이를 가진, 이트륨표지된 제발린(Zevalin) 또는131I 표지된 벡사르(Bexxar)로 치료된 비호지킨 림프종(NHL)환자와 Lym-1으로 치료된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자는 골수침습없는 환자보다 투여량제한 독성을 훨씬 나타내기 쉽다. 따라서, 세포독성약물치료와 조합하여 사용될 때 이들 환자집단에서 골수독성의 위험이 더 증가된다.
RIT의 치료적 유효성을 증가시키기 위한 한 방법은 투여되는 RIT의 투여량을 증가시킴으로써 종양에 대한 MAb를 통하여 전달되거나 표적화된 동위원소의 양을 증가시키는 것이다. 이전 연구는 표적화된 암세포에 고친화성 결합을 보유하고 혈액에서 골수까지 더 낮은 독성으로 신속하게 제거되는 효소적으로 분해되거나 유적적으로 조작된 MAb 단편을 사용하였다. 1가(예를 들면, scFv와 Fab 단편)와 다가(예를 들면, F(ab')2, 전환된 F(ab')2및 이중가닥 Fv 단편) 항체단편이 그 예에 포함된다. 이들 구조체는 전통적인 IC와 비교할 때 쥐의 동물모델과 인간 임상시험 모두에서 혈액으로부터 신속하게 제거되는 것으로 확인되었다. 신속한 혈액 제거는 감소된 적색골수 방사선노출과 더 낮은 수준의 독성을 수반하였다. 불행히도, 그러한 구조체는 전통적인 완전한 MAb보다 더 신속하게 종양으로부터 제거되었고 종양집단에 대해 동위원소를 표적화하는 능력에서는 덜 효과적이었다. 따라서, 항암약물과의 조합치료를 위한 MAb 단편의 보다 신속한 혈액제거속도와 보다 낮은 독성의 잠재적 잇점은 종양부위에 동위원소를 효과적으로 표적화하는 능력이 없는 것에 의해 상쇄되었다.
넓은 의미에서, 본 발명은 종양질환의 치료를 위한 변형된 면역글로불린을 포함하여 이루어지는 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 악성종양의 면역치료적 치료를 위한 우수한 생리학적 프로파일과 개선된 종양국부화를 나타내는 변형된 면역글로불린의 용도를 포함하여 이루어진다. 개시된 방법과 조성물은 화학요법제, 외부방사선 조사 또는 방사선면역요법제에 노출되어 골수저하된 암환자의 치료에 특히 유용하다.
도 1a와 1b는 각각 C2B8 중쇄의 아미노산서열과 CH2 도메인이 결실된 유도 도메인 결실 C2B8 구조체의 아미노산서열을 나타낸다;
도 2a와 2b는 각각 C2B8 중쇄의 뉴클레오티드서열과 CH2 도메인이 결실된 유도 도메인 결실 C2B8 구조체의 뉴클레오티드서열을 나타낸다;
도 3a와 3b는 각각 C2B8 경쇄의 뉴클레오티드서열과 동일한 경쇄의 대응하는 아미노산서열을 나타낸다;
도 4a와 4b는 각각 CH2 도메인이 결실된 huCC49 도메인결실 중쇄의 아미노산서열과 동일한 중쇄에 대한 대응하는 뉴클레오티드서열을 나타낸다;
도 5a와 5b는 각각 huCC49 경쇄의 아미노산서열과 동일한 경쇄의 대응하는 뉴클레오티드서열을 나타낸다;
도 6a와 6b는 각각 완전한 C5E10 중쇄의 아미노산서열과 CH2 도메인이 결실된 유도 도메인 결실 C5E10 구조체의 아미노산서열을 나타낸다;
도 7a와 7b는 각각 완전한 C5E10 중쇄의 뉴클레오티드서열과 CH2 도메인이 결실된 유도 도메인 결실 C5E10 구조체의 뉴클레오티드서열을 나타낸다;
도 8a와 8b는 각각 C5E10 경쇄의 뉴클레오티드서열과 동일한 경쇄의 대응하는 아미노산서열을 나타낸다;
도 9는 LS147T 종양을 가진 마우스에서 다양한 방사성 동위원소로 표지된 완전한 huCC49와 huCC49.ΔCH2의 혈액 제거속도를 나타내는 그래프이다;
도 10a, 10b 및 10c는 각각 다우디(Daudi)(CD20+) 종양 쥐 이종이식편 모델에서 확인된 바와 같은 방사선표지된 완전한 C2B8, C2B8.F(ab')2 및 C2B8.ΔCH2의 혈액 제거 및 종양국부화 속도를 나타낸다;
도 11은 개별적으로 항종양제의 사용과 비교하여 방사선표지된 huCC49.ΔCH2와 에토포시드의 조합에 의해 제공되는 상승특성을 나타낸다.
이와 같이, 본 발명은 종양세포를 표적화하는데 사용될 수 있는 저독성 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골수억제된 환자를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
이들 및 다른 목적은 넓은 개념에서 종양질환의 치료에 사용될 수 있는 방법, 화합물 및 조성물에 대한 것인 본 발명에 의해 제공된다. 그 목적을 위하여 본 발명은 다양한 암에 걸린 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 변형된 항체를 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 변형된 항체 또는 면역글로불린은 놀랍게도 이들을 골수억제된 환자의 치료에 특히 유용하도록 하는 생화학적 특성을 나타내는 것으로확인되었다. 보다 구체적으로는, 예상치 못하게 본 명세서에 기재된 변형된 항체는 효과적인 종양 국부화를 제공하면서 혈액으로부터 신속하게 제거되는 것으로 확인되었다. 이와 같이, 개시된 화합물은 종양부위에서 여전히 치료적 유효수준의 선택된 세포독소를 제공하면서 통상적인 면역접합체의 비특이적 전이와 관련된 독성을 실질적으로 감소시키는데 사용될 수 있다. 이것은 변형된 항체가 방사선면역접합체로서 사용될 때 특히 사실이다.
따라서, 본 발명의 한가지 중요한 점은 종양질환을 치료하기 위한 방사선면역접합체로서 변형된 항체를 사용하는 것을 포함한다. 즉, 변형된 항체는90Y 또는131I와 같은 치료용 방사성 동위원소와 결합되어 많은 암 중 어느 하나에 걸린 환자에게 투여될 수 있다. 개시된 화합물의 놀라운 특성(즉, 신속한 혈액 제거 및 효과적인 종양국부화)은 종양에 직접적으로 치료적 유효 투여량을 전달하면서 건강한 기관(특히 골수)에 대한 결합독성을 실질적으로 감소시킨다. 이 골수독성에서 나타난 이러한 감소는 본 발명이 면역억제되거나 면역저하된 환자의 치료에 특히 유효하도록 한다.
상당히 자주, 면역억제는 방사선과 같은 화학요법치료 또는 독성제의 투여의 부작용으로 나타난다. 이와 같이 본 발명의 다른 중요한 점은 부가 화학요법 또는 방사선조사와 함께 (결합된 방사성 동위원소가 있거나 없는) 개시된 화합물을 사용하는 것이다. 이것은 재발되거나 이전 화학요법을 통해 골수억제상태가 된 환자에 특히 유용하다. 그러한 환자(및 종종 비교적 건강한 환자)에서 방사선표지된 항체의 투여제한독성은 정상 골수세포에 대한 순환성 방사성 동위원소의 노출로 인한 골수독성이다. 본 발명은 이러한 노출과 대응하는 독성을 감소시킴으로써 보다 효능있고 보다 높은 투여량이 투여되도록 한다. 그러나, 독성을 감소시키는 종래기술의 화합물과 달리, 본 발명의 변형된 항체는 여전히 유효한 종양국부화를 나타내고 따라서 환자의 이익을 증가시킨다.
이들 동일한 특성은 본 발명의 화합물과 조성물이 종양의 방사선이미지화와 같은 진단절차에 특히 적합하게 한다는 것을 잘 알 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 변형된 항체는 진단용 방사성 동위원소(즉,111In)과 결합되어 종양 또는 다른 질환의 진단 또는 조사에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 비결합 변형된 항체의 신속한 제거와 높고 신속한 종양국부화는 통상적인 방사선이미지화제를 사용하여 얻어지는 것보다 실질적으로 우수한 신호 대 노이즈비율을 가지는 강화된 이미지를 제공할 것이다. 물론, 당업자는 어떤 형태의 이미지화(예를 들면, MRI, 방사선이미지화, 초음파 등) 및 어떤 특정 이미지화제가 본 명세서에 개시된 화합물과 함께 효과적으로 사용될 수 있는지 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 하기 이의 바람직한 실시형태의 하기 상세한 설명을 고려하여 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명은 많은 다른 형태로 구체화될 수 있지만, 본 명세서에서는 본 발명의 원리의 예가 되는 그 특정 실시형태가 개시된다. 하기 특정 실시형태에 본 발명이 제한되지 않는 것을 강조한다.
본 발명은 적어도 일부는 골수억제된 환자에 대한 치료용 프로토콜에서 사용될 때 종양세포와 결합된 항원과 면역반응하는 항체가 변형되거나 변화되어 증진된 생화학적 특성과 개선된 효능을 제공할 수 있다는 사실에 의해 예상된다. 바람직하게는, 변형된 항체는 방사성 핵종 또는 항종양제와 같은 세포독성제와 결합될 것이다. 이와 관련하여, 놀랍게도 본 발명에 따른 변형된 항체가 감소된 적색골수 비축량을 가지는 환자에 대한 방사선면역치료를 제공하는데 유리하게 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 보다 상세하게는, 본 발명의 변형된 항체는 동일한 결합특이성을 가진 전체 항체에 비해 더 짧은 혈청 반감기와 더 효과적인 종양국부화를 나타내는 것으로 나타난다. 이와 같이, 이들은 건강한 세포(예를 들면, 혈액세포)에 대한 원하지 않는 노출을 최소화하면서 악성종양세포 또는 종양에 대해 방사성 핵종과 같은 세포독소를 표적화하는데 특히 유용하다. 이러한 증가된 효능은 화학요법을 실시했거나 실시중인 환자들과 같이 골수억제된 환자의 악성종양을 보다 공격적으로 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "변형된 항체"라는 용어는 하나 이상의 불변영역 도메인의 적어도 일부가 결실되거나 대략 동일한 결합특이성을 가진 전체의 변화되지 않은 항체와 비교할 때 증가된 종양국부화 또는 감소된 혈청 반감기와 같은 원하는 생화학적 특성을 제공하도록 변화되고 종양결합항원과 면역반응하는 임의의 항체, 또는 이의 결합단편 또는 재조합단편을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 불변도메인 중 하나의 적어도 일부가 결실된다. 본 개시내용으 목적을 위하여, 그러한 구조체는 "도메인결실"이라고 명명된다. 바람직하게는, 변형된 항체의 불변영역 중 하나의 전체 도메인이 결실될 것이고, 보다 더 바람직하게는 전체 CH2 도메인이 결실될 것이다. 하기에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 공지된 기술을 사용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 원하는 각 변형체를 쉽게 제조 또는 구성할 수 있다.
당업자는 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법이 종양결합항원을 나타내는 임의의 종양질환, 종양 또는 악성종양을 치료하는데 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체는 하나 이상의 종양결합항원과 면역반응한다. 즉, 개시된 변형된 항체의 항원결합부분(즉, 가변영역 또는 이으 면역반응단편 또는 재조합체)은 악성종양부위에서 선택된 종양결합항원에 결합한다. 보고된 종양결합항원의 수와 관련항체의 수를 생각하면, 당업자는 본 발명에서 개시된 변형된 항체가 많은 전체 항체 중 임의의 하나로부터 유래될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 보다 일반적으로, 본 발명에서 유용한 변형된 항체는 종양결합항원과 반응하는 임의의 항체(문헌에서 이미 보고된 것을 포함)로부터 얻어지거나 유래할 수 있다. 또한 개시된 변형된 항체를 생성하는데 사용된 모 또는 전구체 항체 또는 이의 단편은 쥐, 인간, 키메라, 인간화, 비인간영장류 또는 영장류화일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 불변도메인을 가지는 (본 명세서에 참조병합된 미국특허 제5,892,019호에 개시된 것과 같은) 단일사슬 항체구조체를 포함할 수 있다. 결과적으로 본 명세서의 교시에 따라 변형된 이러한 형태의 항체들 중 임의의 항체는본 발명에 적합하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "종양결합항원"은 일반적으로 종양세포와 결합하는, 즉 정상세포와 비교해 동일하거나 더 많은 정도로 발생하는 임의의 항원을 의미한다. 보다 일반적으로, 종양결합항원은 비악성세포 상에서의 이의 발현과 무관한 종양세포에서 면역반응항체의 국부화를 제공하는 임의의 항원을 포함할 수 있다. 그러한 항원은 악성세포의 표면에 대한 이의 발현에서 제한적이고 비교적 종양특이적이거나 비악성조직과 비교할 때 악성집단에서의 세포표면발현을 증가시킬 수 있다. CEA, MUC-1 및 TAG-72와 반응하는 MAbs를 예로 들 수 있다. 선택적으로, 그러한 항원은 악성 및 비악성세포 모두에서 지속적으로 발현될 수 있다. 예를 들면, CD20은 비호지킨 림프종의 치료를 위한 면역치료용 항체에 대한 매우 효과적인 표적인 것으로 입증된 악성 및 비악성 B세포 모두의 표면에서 발견되는 팬(pan) B 항원이다. 이와 관련하여 CD2, CD3, CD5, CD6 및 CD7와 같은 팬 T세포 항원도 본 발명에서 의미하는 종양결합항원을 포함한다. 다른 예시적인 종양결합항원은 MAGE-1, MAGE-3, HPV 16, HPV E6 & E7, L6-항원, CD19, CD22, CD37, HLA-DR, EGF 수용체 및 HER2 수용체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 많은 경우, 이들 항원 각각에 대한 면역반응항체는 문헌에 보고되어 있다. 당업자는 이들 항체 각각이 본 발명에 따른 변형된 항체에 대한 전구체 역할을 할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 변형된 항체는 상기 종양결합항원과 결합하고 종양결합항원에 결합되는 것이 바람직하다. 따라서, 하기 일부 설명되는 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체는 종양결합항원과 반응하는 많은 항체들 중 임의의 하나로부터 유래하거나생성되거나 제조될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체는 통상적인 유전자조작기술을 사용하여 유도될 수 있고, 따라서 하나 이상의 불변영역 도메인의 적어도 일부는 감소된 혈청반감기와 같은 원하는 생화학적 특성을 제공하도록 결실되거나 변형될 수 있다. 보다 상세하게는, 하기 예시되는 바와 같이, 당업자는 본 항체의 가변 및/또는 불변영역에 대응하는 유전자서열을 쉽게 분리하고 적합한 뉴클레오티드를 결실하거나 변형하여 본 발명의 변형된 항체를 제공할 수 있다. 또한 변형된 항체는 잘 확립된 프로토콜을 사용하여 임상적 또는 상업적 규모로 발현되고 생산될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
선택된 실시형태에서, 본 발명에 유용한 변형된 항체는 종양결합항원에 대한 공지된 항체로부터 유도될 것이다. 이것은 모항체의 뉴클레오티드나 아미노산서열을 얻고 본 명세서에 기재된 변형을 조작함으로써 쉽게 달성될 수 있다. 다른 실시형태에 대하여, 공지된 항체의 항원결합영역(가변영역 또는 보체결정영역)을 사용하여 변형된 불변영역과 이들을 조합하여 원하는 변형된 항체를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 단일사슬 구조체가 유사한 방식으로 생성될 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 항체는 당해 기술분야에서 통상적인 바와 같이 친화성을 개선하거나 면역원성을 감소시키기 위해 조작될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 변형된 항체는 인간화되거나 키메라화된 항체로부터 유래되거나 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명과 일치하는 변형된 항체는 자연발생한 쥐, 영장류(인간을 포함) 또는 다른 포유동물 모노클로날항체, 키메라항체, 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 이특이적 항체 또는 단일사슬 항체구조체 및 각 형태의 면역반응성 단편을 포함하거나 및/또는 이로부터 유도될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 종양결합항원과 반응하는 이미 보고된 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형되어 본 발명의 변형된 항체를 제공할 수 있다. 개시된 변형된 항체를 생성하거나 유도하는 항원결합영역을 제공하는데 사용될 수 있는 항체의 예로는 Y2B8과 C2B8(ZevalinTM& Rixutan®, IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego) Lym1과 Lym 2(Techniclone), LL2(Immunomedics Corp., New Jersey), HER2(Herceptin®, Genentech Inc., South San Francisco), B1(Bexxar®, Coulter Pharm., San Francisco), MB1, BH3, B4, B72.3(Cytogen Corp.), CC49(National Cancer Institute) 및 5E10(University of Iowa)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 상기 열거된 항체와 동일한 종양결합항원에 결합할 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체는 Y2B8, C2B8, CC49 및 5E10와 동일한 항원으로부터 유도되거나 결합할 것이고, 보다 구체적으로는 도메인결실항체(즉, ΔCH2 항체)를 포함할 것이다. 하기 설명 및 실시예로 부터 알 수 있는 바와 같이, 그러한 변형된 항체는 골수억제된 환자의 치료 또는 화학치료와 함께 사용하기에 특히 유용하다.
바람직한 제1실시형태에서, 변형된 항체는 Rixutan®과 동일한 종양결합항원에 결합할 것이다. Rixutan(Rituximab, IDEC-C2B8 및 C2B8으로도 알려짐)은 인간 B-세포 림프종의 치료를 위한 최초의 FDA-승인된 모노클로날항체였다(각각이 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제5,843,439호, 제5,776,456호 및 제5,736,137호 참조). Y2B8은 C2B8의 쥐 모체이다. Rixutan은 시험관 내에서 화학요법제에 의한 세포자멸사에 대한 어떤 림프종 세포주의 성장을 저해하고 감작하는 것으로 보고된 키메라 항-CD20 모노클로날 항체(MAb)이다. 상기 항체는 인간보체에 효과적으로 결합하고, 강한 FcR 결합을 가지고, 보체의존성(CDC) 및 항체의존성(ADCC) 메카니즘 모두를 통하여 시험관 내에서 인간 림프구를 효과적으로 사멸시킬 수 있다(Reffet al., Blood83: 435-445(1994)). 당업자는 본 개시내용에 따라 변형된 C2B8 또는 Y2B8의 변형체가 CD20+ 악성을 나타내는 환자를 효과적으로 치료하기 위하여 접합 또는 비접합 형태로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 보다 일반적으로, 본 명세서에 개시된 변형된 항체는 많은 종양질환 중 어느 하나를 효과적으로 치료하기 위하여 "노출" 또는 비접합상태로 또는 세포독성제에 접합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체는 CC49와 같은 종양결합항체로부터 유래하거나 이에 결합할 수 있을 것이다. 이전에 언급한 바와 같이, CC49는 인간유래의 어떤 종양세포, 특히 LS174T 종양세포주의 표면에 결합하는 인간종양결합항원 TAG-72와 결합한다. LS174T[American Type Culture Collection(이하 ATCC라 함) No. CL 188]는 LS180(ATCC No. CL 187) 결장 아데노암종주의 변형체이다.
TAG-72에 대한 결합특이성을 가진 다양한 쥐 모노클로날항체가 개발된 것을 알 수 있을 것이다. B72.3이라 명명된 이들 모노클로날항체 중 하나는 하이브리도마 B72.3(ATCC No. HB-8108)에 의해 생산된 쥐 IgG1이다. B72.3은 면역원으로 인간유방암종 추출물을 사용하여 개발된 제1세대 모노클로날항체이다(Colcheret al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 78:3199-3203(1981); 및 각각 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제4,522,918호와 제4,612,282호 참조). TAG-72에 대한 다른 모노클로날 항체는 "CC"(결장암에 대한)로 명명된다. 미국특허 제5,512,443호(Schlomet al. 본 명세서에 참조병합됨)에 기재된 바와 같이, CC 모노클로날항체는 B72.3로 정제된 TAG-72를 사용하여 제조된 제2세대 쥐 모노클로날 항체의 한 종류이다. TAG-72에 대한 이들의 비교적 우수한 결합친화성때문에, 하기 CC 항체는 제한된 접근이 요구되면서 ATCC에 기탁되었다: CC49(ATCC No. HB 9459); CC83(ATCC No. HB 9453); CC46(ATCC No. HB 9458); CC92(ATCC No. HB 9454); CC30(ATCC No. HB 9457); CC11(ATCC No. HB 9455); 및 CC15(ATCC No. HB 9460). 미국특허 제5,512,443호는 개시된 항체를 당해 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술에 의하여, 예를 들면 마우스 불변영역 대신 인간 불변영역(Fc)을 치환함으로써 이들의 키메라형태로 변형시킬 수 있다고 교시한다. 쥐와 키메라 항-TAG-72 항체를 개시하는 외에도, Schlom 등은 PCT/US99/25552에 개시된 바와 같은 인간화된 CC49항체의 변형체와 미국특허 제5,892,019호에 개시된 단일사슬구조체를 생산하였다(각각 본 명세서에 참조병합됨). 당업자는 상기 항체, 구조체 또는 재조합체 및 이의 변형들 각각이 본 발명에 따라 변형되고 사용될 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
상기 항-TAG-72 항체 외에도, 다양한 그룹이 도메인결실 CC49와 B72.3 항체의 구조와 일부 특성을 보고하였다(예를 들면, Calvoet al., Cancer Biotherapy,8(1):95-109(1993), Slavin-Chioriniet al., Int. J. Cancer53:97-103(1993) 및 Slavin-Chioriniet al., Cancer Res. 55:5957-5967(1995)). 개시된 구조체는 본 발명의 방법 및 조성물에 적합한 변형된 항체를 제공하는 것으로 이해된다. 인용된 참조문헌들은 전체 모항체와 비교할 때 도메인결실구조체의 제거시간이 가속화된다는 것을 보여주었지만, 개시된 구조체들이 본 출원에 의해 교시된 바와 같이 화학요법을 실시하였거나 실시중인 골수억제된 환자를 치료하는데 특히 효과적이라는 것을 입증하지 못했다. 오히려 이들 참조문헌은 구조체의 신속한 제거가 이들을 본 발명에서 제공되는 바와 같은 조합된 치료방법보다 진단절차에서 특히 유용할 것이라고 제시하는 것으로 보인다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시형태는 C5E10과 같은 종양결합항원으로부터 유도되거나 이에 결합하는 변형된 항체를 포함한다. 공동출원된 미국특허 제6,207,805호에 개시된 바와 같이, C5E10은 전립선종양세포주(예를 들면, DU145, PC3 또는 ND1)에 특이적인 것으로 나타난 대략 115kDa의 당단백질결정기를 인식하는 항체이다. 따라서, 본 발명과 함께, C5E10 항체에 의해 인식되는 동일한 종양결합항원에 특이적으로 결합하는 변형된 항체(예를 들면 CH2 도메인결실 항체)는 종양질환의 치료를 위하여 접합 또는 비접합형태로 생산되어 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체는 ATTCC 허가 제PTA-865호인 하이브리도마세포주로부터 분비되는 바와 같은 C5E10 항체의 항원결합영역을 전부 또는 일부 포함하거나 이로부터 유래될 것이다. 그리고 나서 생성된 변형된 항체는 하기 기재된 바와 같은 방사성 핵종에 접합되어 본 명세서의 방법에 따라 전립선암 환자에게 투여될 수 있다.
상기 항체외에도, 통상적인 면역학적 기술과 결합된 면역화를 사용하여 생성된 신규한 항체의 항원결합영역을 포함하거나 이로부터 유도되는 변형된 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 당해 기술분야에서 인정된 프로토콜을 사용하여, 관련항원(예를 들면, 정제된 종양결합항원 또는 그러한 항원을 포하하는 세포 또는 세포추출물) 및 보조제의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에서 항체를 자극하는 것이 바람직하다. 이러한 면역화는 일반적으로 활성화된 비세포 또는 림프구로부터 항원반응 항체를 생산하는 것을 포함하는 면역반응을 유도한다. 생성된 항체를 동물의 혈청에서 모아 폴리클로날 표본을 제공할 수 있지만, 때로는 비장, 림프절 또는 말초혈액으로부터 개별적인 림프구를 분리하여 모노클로날항체(MAbs)의 균질표본을 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 림프구는 비장으로부터 얻어진다.
이러한 공지된 방법(Kohleret al., Nature, 256:495(1975))에서, 항원이 주입된 포유동물의 비교적 단기생존, 또는 치사 림프구를 불멸 종양세포주(예를 들면, 골수종 세포주)와 융합하여 불멸이고 B세포의 유전적으로 암호화된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생산한다. 생성된 하이브리드는 선택, 희석 및 단일항체의 형성을 위해 특이적 유전자를 포함하는 각 개별 균주로 재성장시켜 단일 유전적 균주로 분리된다. 따라서, 이들은 원하는 항원에 대해 균질한 항체를 생산하고 이들의 순수한 유전적 유래와 관련하여 "모노클로날"이라 명명한다.
따라서 제조된 하이브리도마 세포를 비융합 모체 골수종세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양배지에 접종하여 성장시킨다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지를 많은 공급원에서 시판하고 있고 표준화된 프로토콜이 잘 정립되어 있다는 것을 잘 알 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양배지는 원하는 항원에 대한 모노클로날항체를 생산하기 위하여 분석된다. 바람직하게는 하이브리도마세포에 의해 생산된 모노클로날항체의 결합특이성은 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소결합 면역흡수분석(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)와 같은 시험관 내 분석에 의하여 또는 면역침전에 의하여 확인된다. 하이브리도마세포가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 것을 확인한 후, 제한희석절차에 의해 서브클로닝하고 표준방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp59-103(Academic Press, 1986)). 서브클론에 의해 분비된 모노클로날항체는 예를 들면 단백질-A, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상적인 정제절차에 의해 배양배지, 복수 또는 혈청으로부터 분리될 수 있다.
다른 적합한 실시형태에서, 원하는 모노크로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들면, 쥐 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 분리되고 서열확인될 수 있다. 다른 분리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 일단 분리되면, DNA를 발현벡터 속에 넣은 후, 그렇지 않으면 면역글로불린을 생산하지 않는 대장균세포, 유인원 COS 세포, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 골수종세포와 같은 원핵 또는 진핵 숙주세포속으로 트랜스펙션시킬 수 있다. 보다 상세하게는, (본 명세서에서 기재된 바와 같이 변형될 수 있는) 분리된 DNA는 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제5,658,570호(Newmanet al.)에 기재된 바와 같이 제조항체에 대하여 불변 및 가변영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 필수적으로, 이것은 선택된 세포로부터 RNA를 추출하고 cDNA로 전환하고 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 이를 증폭시키는 과정을 수반한다. 하기 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 원하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급을 위하여 비교적 대량으로 성장시킬 수 있다.
당업자는 항체 또는 항체단편을 암호화하는 DNA가 예를 들면, 본 명세서에 참조병합된 EP 368 684 B1과 미국특허 제5,969,108호에 개시된 바와 같은 항체파지 라이브러리로부터 유래할 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 여러가지 간행물(예를 들면, Markset al., Bio/Technology10:779-783)에 큰 파지라이브러리를 구성하기 위한 방법으로서 조합감염과 생체 내 재조합 뿐 아니라 사슬 재편성에 의하여 고친화성 인간항체를 생산하는 것이 기재되어 있다. 그러한 절차는 모노클로날항체를 분리하고 이어서 클로닝하기 위한 전통적인 하이브리도마기술에 대한 실행가능한 대안을 제공하고 따라서 명백히 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 또다른 실시형태는 내인성 면역글로불린 생산을 할 수 있는 유전자도입동물(예를 들면, 마우스)에서 실질적으로 인간항체를 생성하는 것을 포함한다(예를 들면, 각각 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제6,075,181호, 제5,939,598호, 제5,591,669호 및 제5,589,369호 참조). 예를 들면, 키메라 및 배아 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄결합영역을 동질접합 결실이 내인성 항체생산을 완전히 저해하는 것이 기재되어 있다. 그러한 배아 돌연변이 마우스 내에 인간 면역글로불린 유전자 배열을 전이시키면 항원 면역성검사에 대해 인간항체를 생산할 것이다. SCID 마우스를 이용하여 인간항체를 생성하는 다른 바람직한 수단은 본 명세서에 참조병합된 공동소유, 공동출원된 미국특허 제5,811,524호에 개시되어 있다. 이들 인간항체와 결합된 유전물질이 본 명세서에 기재된 바와 같이 분리되고 조작될 수 있음을 잘 알 것이다.
재조합 항체를 생성하는 또다른 매우 효율적인 수단은 문헌(Newman,Biotechnology, 10:1455-1460(1992))에 개시되어 있다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변도메인과 인간 불변서열을 함유하는 영장류화된 항체를 생성한다. 이 참조문헌은 그 전체가 본명세서에 참조병합된다. 또한 이 기술은 본 명세서에 각각 참조병합된 공동양도된 미국특허 제5,658,570호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호에도 기재되어 있다.
본 명세서로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체를 생산하는데 유용한 유전자서열은 많은 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 설명한 바와 같이, 다양한 인간항체유전자를 공개적으로 접근가능한 기탁물의 형태로이용할 수 있다. 항체와 항체암호화유전자의 많은 서열은 공개되어 있고 적합한 항체유전자는 상기 설명한 바와 같이 많은 이들 서열로부터 합성할 수 있다. 선택적으로 항체생산 세포주는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 선택되고 배양될 수 있다. 그러한 기술은 다양한 실험매뉴얼과 주요간행물에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기재되는 본 발명의 용도에 적합한 기술은 부록을 포함하여 그 전체가 본 명세서에 참조병합되는 문헌(Current Protocols in Immunology,Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991))에 기재되어 있다.
본 발명의 범위는 본 명세서에 기재된 DNA서열의 모든 대립유전자, 변형체 및 돌연변이를 포함하는 것을 잘 알 것이다.
잘 알려진 바와 같이, RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출과 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피와 같은 표준기술에 의해 원 하이브리도마세포로부터 또는 다른 형질전환된 세포로부터 분리될 수 있다. 바람직한 경우, mRNA는 올리고T 셀룰로오즈 상의 크로마토그래피와 같은 표준기술에 의해 총 RNA로부터 분리될 수 있다. 이들 목적에 적합한 기술은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고 상기 참조문헌에 기재되어 있다.
항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 cDNA는 공지된 방법에 따라 역전사효소와 DNA 중합효소를 사용하여, 동시에 또는 개별적으로 만들어질 수 있다. 공표된 중쇄와 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 보다 특이적인 프라이머에 의하여 또는 컨센서스 불변영역 프라이머에 의하여 개시될 수 있다. 상기와 같이, PCR도 항체 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 이 경우 라이브러리는 마우스 불변영역 탐침과 같은 컨센서스 프라이머 또는 더 큰 동종 탐침에 의해 스크리닝할 수 있다.
DNA, 일반적으로 플라스미드 DNA는 재조합 DNA 기술과 관련하여 상기 참조문헌에 상세하게 개시된 표준, 공지 기술에 따라 제한지도작성되고 서열확인된, 본 명세서에 기재된 세포로부터 분리될 수 있다. 물론, DNA는 분리방법 또는 이후 분석과정 동안 임의의 시점에서 본 발명에 따라 변형될 수 있다.
바람직한 항원서열이 본 명세서에 개시되어 있다. 본 발명의 이러한 점에 적합한 올리고뉴클레오티드 합성기술은 당업자에게 공지되어 있고 여러가지 시판되는 자동화된 합성기 중 어느 것을 사용하여 행할 수 있다. 또한 본 명세서에 개시된 여러 가지 형태의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA 서열은 시판 DNA 합성벡터의 공급을 통해 얻어질 수 있다. 상기 방법 중 어느 것을 사용하여 얻어진 유전물질은 그 다음에 변화되거나 변형되어 본 발명에 적합한 항체를 제공할 수 있다.
다양한 다른 형태의 항체가 본 발명에 따라 얻어지고 변형될 수 있지만, 본 발명의 변형된 항체는 다양한 공통적인 특징을 공유할 것이다. 그 한도까지, "면역글로불린"이라는 용어는 어떤 관련된 특이적 면역반응성을 가지고 있든 아니든 테트라머(2 중쇄와 2경쇄) 또는 그 집합체를 말하는 것으로 간주해야 한다. "항체"는 경쇄와 중쇄 사이에 공유결합이 있든 없든 경쇄와 중쇄를 포함하고, 항원(예를 들면 종양결합항원)에 대한 상당한 공지의 특이적 면역반응활성을 가지는 그러한 어셈블리를 말한다. 상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 "변형된 항체"는 하나 이상의불변영역 도메인의 적어도 일부가 결실되거나 대략 동일한 면역원성의 전체, 변화되지 않은 항체와 비교할 때 증가된 종양국부화 또는 감소된 혈청반감기와 같은 원하는 생화학적 특성을 제공하도록 변화된, 항체, 또는 이의 면역원성 단편이나 재조합체를 의미하는 것으로 간주된다. 본 출원의 목적을 위하여, 불변영역 도메인이 변화되거나 생략된 면역반응성 단일사슬 항체구조체는 변형된 항체로 간주될 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 변형된 항체는 불변도메인 중 하나의 적어도 일부가 결실된다. 보다 바람직하게는 변형된 항체의 불변영역의 하나의 전체 도메인이 결실되고, 보다 더 바람직하게는 전체 CH2 도메인이 결실될 것이다.
척추동물계에서 기본적인 면역글로불린구조는 비교적 잘 알려져 있다. 아래에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 유전적 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 5가지 구분된 클래스의 항체를 포함한다. 5클래스는 모두 명백히 본 발명의 범위 내에 있지만, 하기 설명은 일반적으로 IgG 분자의 클래스에 대한 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 대약 23,000Dalton의 분자량을 가진 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드와 53,000-70,000의 분자량을 가진 2개의 동일한 중쇄를 포함하여 이루어진다. 4개의 사슬은 "Y" 구조 내에 디설파이드결합에 의해 결합되고, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변영역을 통해 연속되는 중쇄를 지지한다.
보다 구체적으로, 경쇄와 중쇄는 구조적 및 기능적 동종성을 가진 영역으로 구분된다. "불변" 및 "가변"이라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여,경쇄(VL)와 중쇄(VH) 모두의 가변도메인은 항원인식과 특이성을 결정하는 것으로 알려져 있다. 반대로, 경쇄(CL)와 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체결합, 보체결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 통상적으로, 불변영역도메인의 넘버링은 이들이 항체의 아미노말단 또는 항원결합부위로부터 더 멀어지기 때문에 증가된다. 따라서, CH3와 CL도메인은 각각 중쇄와 경쇄의 카르복시말단을 실질적으로 포함한다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄와 중쇄는 서로 공유결합되고, 2개의 중쇄의 "꼬리"부분은 면역글로불린이 하이브리도마 B세포 또는 유전자조작된 숙주세포에 의해 생성될 때 공유 디설파이드결합에 의해 서로 결합된다. 그러나, 사슬의 비공유 결합이 바른 기하학적 배열 내에서 달성된다면, 비-디설파이드-결합 사슬의 집합체는 여전히 항원과 반응할 수 있을 것이다. 중쇄에서, 아미노서열은 Y 구조의 분지된 말단의 N-말단으로부터 각 사슬의 바닥의 C-말단까지 간다. N-말단이 가변영역이고 C-말단이 불변영역이다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(ν, μ, α, δ, ε)으로 분류되고 그중 일부는 서브클래스를 가진다. 항체의 "클래스"를 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM으로 결정하는 것이 이 사슬의 특징이다. 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1등과 같은 면역글로불린 서브클래스(아이소타입)는 특징이 잘 밝혀져 있고 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 아이소타입 각각에 대한 변형된 변형체는 본 개시내용을 고려하여 당업자가 쉽게 알 수 있고 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변영역은 항체가 면역반응성 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL도메인과 VH도메인은 조합되어 3차원 항원결합부위를 정의하는 가변영역을 형성한다. 이 4개로 된 항체구조는 Y의 각 암의 말단에 존재하는 항원결합부위를 제공한다. 보다 구체적으로, 항원결합부위는 VL과 VH사슬 각각 상의 3개의 보체결합영역(CDRs)에 의해 정해진다.
6개의 CDRs는 항체가 수성환경에서 이의 3차원구조를 가지기 때문에 항원결합부위를 형성하기 위하여 특이적으로 배치된 아미노산의 짧은 비인접 서열이다. 중쇄 가변도메인과 경쇄 가변도메인의 나머지는 아미노산서열에서 분자간 다양성이 적은 것으로 나타나고 골격영역이라 불린다. 골격영역은 대부분 β-시트 구조를 가지고 CDRs는 β-시트 구조를 연결하거나 일부 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이들 골격영역은 6개의 CDRs이 사슬간, 비공유 상호작용에 의하여 올바른 방향으로 배치되도록 하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 어떠한 경우에도, 배치된 CDRs에 의해 형성된 항원결합부위는 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이 상보적 표면은 항체가 면역반응성 항원 에피토프에 비공유결합하는 것을 촉진한다.
본 발명의 목적을 위하여, 개시된 변형된 항체는 선택된 종양결합항원과 항체의 결합을 제공하는 임의의 형태의 가변영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여,가변영역은 원하는 종양결합항원에 대한 면역글로불린을 생성하고 체액반응을 개시하도록 유도될 수 있는 임의의 형태의 포유동물로부터 유래하거나 포함할 수 있다. 그와 같이, 변형된 항체의 가변영역은 예를 들면, 인간, 쥐, 비인간영장류(예를 들면, 사이노몰거스원숭이, 마카크 등) 또는 이리 유래일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변형된 면역글로불린의 가변 및 불변영역은 모두 인간이다. 다른 선택된 실시형태에서, (일반적으로 비인간 공급원으로부터 유래된) 적합한 항원의 가변영역은 조작되거나 특이적으로 맞추어져 분자의 결합특성을 개선하거나 면역원성을 감소시킬 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 유용한 가변영역은 인간화되거나 중요한 아미노산 서열을 포함하여 변형될 수 있다.
"인간화된 항체"는 모항체의 항원결합특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만 인간에서 덜 면역원적인, 비인간 공급원으로부터 유래된 항체, 일반적으로 쥐의 항체를 의미한다. 이것은 (a) 전체 비인간 가변도메인을 인간 불변영역으로 이식하여 키메라항체를 생성하는 방법; (b) 하나 이상의 비인간 보체결정영역(CDRs)의 적어도 일부를 결정적 골격잔기를 보유하거나 하지 않은 인간 골격 및 불변영역으로 이식하는 방법; 또는 (c) 전체 비인간 가변영역으로 이식하되 표면잔기를 대체함으로써 이들을 인간형 부위로 은폐하는 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 그러한 방법은 문헌(Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci.81:6851-5(1984); Morrisonet al.,Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyenet al., Science239: 1534-1536 (1988); Padlan,Molec. Immun.28: 489-498(1991); 31: Padlan,Molec. Immun.169-217(1994) 및 미국특허 제5,585,089호,제5,693,761호 및 제5,693,762호; 모두 본 명세서에 참조병합됨)에 개시되어 있다.
당업자는 상기 선택 (a)에 개시된 기술이 "고전적" 케메라항체를 생산할 것임을 잘 알 것이다. 본 출원의 내용에서, "키메라항체"라는 용어는 면역반응성 영역 또는 부위는 첫번째 종에서 얻거나 유래하고 불변영역(완전하거나, 부분이거나 본 발명에 따라 변형될 수 있음)은 두번째 종으로부터 얻은 임의의 항체를 의미하는 것으로 간주해야 할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 항원결합영역 또는 부위는 비인간 공급원(예를 들면, 마우스)에서 올 것이고, 불변영역은 인간이다. 가변영역의 면역원 특이성은 그 공급원에 의해 영향을 받지 않는 것이 일반적이지만, 인간 불변영역은 비인간 공급원으로부터의 불변영역보다 인간환자에게서 면역반응을 덜 이끌어낸다.
바람직하게 중쇄와 경쇄 모두의 가변도메인은 하나 이상의 CDRs의 적어도 일부 대체에 의해 및 필요하다면 일부 골격영역 대체 및 서열변화에 의해 변형된다. CDRs은 골격영역이 유래되는 항체와 동일 클래스 또는 심지어 서브클래스의 항체로부터 유래할 수 있지만, CDRs이 다른 클래스의 항체로부터 및 바람직하게는 다른 종의 항체로부터 유래할 수 있다고 생각된다. 한 가변도메인으로부터 다른 것으로 항원결합능력을 전이시키기 위하여 모든 CDRs을 공여자 가변영역으로부터의 완전한 CDRs로 대체할 필요는 없다는 것이 강조되어야 한다. 오히려, 항원결합부위의 활성을 유지하는데 필요한 그들 잔기를 전이하는 것만이 필요할 수 있다. 미국특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호에 개시된 설명을 생각하면, 감소된 면역원성을 가진 기능적 항체를 얻기 위하여 시행착오 시험에 의하거나 일상적인 실험을 행함으로써 당업자가 잘 실시할 수 있을 것이다.
가변영역에 대한 변화에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 변형된 항체가 불변영역 도메인 중 하나 이상의 적어도 일부가 결실되거나 천연 또는 미변화 불변영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성을 가지는 항체와 비교할 때 증가된 종양 국부와 또는 감소된 혈청 반감기와 같은 원하는 생화학적 특성을 제공하도록 변화될 수 있는, 항체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체의 불변영역은 인간 불변영역을 포함할 것이다. 본 발명에 적합한 불변영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환이 포함된다. 즉, 본 명세서에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상에 대한 및/또는 중쇄 불변도메인(CL)에 대한 변화 또는 변형을 포함할 수 있다. 아래에 보다 상세하게 설명하고 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시형태는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실된 변형된 불변영역을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인결실 구조체 또는 변형체(ΔCH2 구조체)를 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서 생략된 불변영역 도메인은 부재한 불변영역에 의해 일반적으로 주어지는 분자 가요성 중 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예를 들면, 10잔기)에 의해 대체될 것이다.
앞에서 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변영역의 3차원적 구조와 서브유닛 구조는 공지되어 있다. 예를 들면, 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 일반적으로 통상적인 넘버링 방법을 사용하여 대략 잔기 231부터 잔기 340까지 연장된다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-결합 분지 탄수화물 사슬이 완전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. CH3 도메인이 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단으로 연장되고 약 108잔기를 포함하는 반면, IgG 분자의 힌지(hinge)영역은 CH2 도메인을 CH1 도메인과 결합시키는 것은 문헌에 잘 기재되어 있다. 이 힌지영역은 유사한 25잔기를 포함하고 가요성이어서, 2개의 N-말단 항원결합영역이 독립적으로 움직이도록 한다.
이들 구조 외에도, 불변영역이 여러 개의 효과기 기능을 매개한다는 것이 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 보체의 C1 성분의 항체에 대한 결합이 보체시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포병원균의 용해와 옵소닌화에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증반응을 자극하고 자가면역 과민반응에 관여할 수도 있다. 또한 항체는 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체와 함께, Fc 영역을 통해 세포에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 포함하는 다른 클래스의 항체에 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포표면의 Fc 수용체에 항체가 결합하면 항체코팅 입자의 침몰과 파괴, 면역복합체의 제거, 킬러세포에 의한 항체코팅 표적세포의 용해(항체의존성 세포매개 세포독성, 또는 ADCC라고 함), 염증매개자의 배출, 태반이동 및 면역글로불린 생산의 제어를 포함하는 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응이 개시된다. 다양한 Fc 수용체와 수용체 부위가 어느 정도까지 연구되었지만 여전히 많은 부분이 그들의 위치, 구조 및 기능에 대해 알려져 있지 않다.
본 발명의 범위를 제한하지 않고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 불변영역을 포함하는 항체가 교대로 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미치는 변화된 효과기 기능을 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들면, (점돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환성 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 국부화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우 본 발명과 일치하는 불변영역 변형이 보체결합을 완화시키고 따라서 접합된 세포독소의 비특이적 결합과 혈청 반감기를 감소시킬 수 있다. 불변영역의 또다른 변형은 증가된 항원특이성 또는 항체가요성으로 인하여 국부화를 증진시키는 올리고사카라이드 잔기 또는 디설파이드 결합을 제거하는데 사용될 수 있다. 보다 일반적으로 당업자는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 변형된 항체는 인식될 수 있거나 인식되지 않을 수 있는 많은 미묘한 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 생성된 생리학적 프로파일, 생체이용가능성 및 종양국부화와 혈청반감기와 같은 변형의 다른 생화학적 효과는 과도한 실험없이 공지된 면역학 기술을 사용하여 쉽게 측정되고 정량될 수 있다.
이와 유사하게, 본 발명에 따른 불변영역에 대한 변형은 당업자의 범위 내에서 공지된 생화학 또는 분자조작기술을 사용하여 쉽게 이루어질 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에 첨부된 실시예는 본 발명에 따라 변형된 불변영역을 가지는다양한 구조체를 제공한다. 보다 구체적으로, 예시된 구조체는 CH2 도메인이 결실되도록 조작된 인간 불변영역을 가지는 키메라 및 인간화된 항체를 포함한다. 당업자는 그러한 구조체가 항체의 대사율에 대한 CH2 도메인의 조절특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 잘 알 것이다.
실시예 및 도면에서 설명하는 ΔCH2 도메인 결실 항체는 CD20 팬 B 세포 항원에 대해 면역특이적인 키메라 C2B8 항체 및 TAG 72 항원에 대해 특이적인 인간화된 CC49 항체에서 유래한다. 이하에 더 상세히 설명하므로, 두가지 도메인 결실 구성체 모두 IgG1 인간 불변 도메인을 암호화하는 독점 벡터(IDEC Pharmaceuticals, San Diego)에서 유래한다. 필수적으로, 이 벡터는 ΔCH2 도메인을 결실시키도록 유전자조작되었고, 도메인 결실 IgG1 불변 영역을 발현하는 변형된 벡터를 제공한다. 이어서, 쥐의 C2B8 항체의 가변 영역 또는 인간화된 CC49 항체의 가변 영역을 암호화하는 유전자를 변형된 벡터에 삽입하고 클로닝하였다. 형질전환된 세포에서 발현되는 경우, 이들 벡터는 huCC49.ΔCH2 또는 C2B8.ΔCH2 를 각각 제공한다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, 이들 구성체는 골수억제된 암 환자 또는 잠재적으로 골수억제 부가적 치료를 받는 암 환자에 사용하기 위한 특히 매력적인 후보가 될 수 있는 다수의 성질을 나타낸다.
CH3 도메인을 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 융합시도록 상기 전형적인 구성체를 유전자조작하였다는 것이 주목할만 하다. 다른 구성체에서, 힌지영역 및 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 간에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남아있는 CH3 도메인(변형 또는 비변형)이 5-20 아미노산 스페이서를 갖는 힌지 영역에 결합되는 양립가능한 구성체가 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직한 한 스페이서는 아미노산 서열 IGKTISKKAK(Seq. ID No. 1)을 갖는다. 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소가 자유롭고 접근가능하도록 남아있도록 하기 위하여, 또는 힌지 영역이 가용성으로 남아있도록 하기 위하여 이러한 스페이서가 첨가될 수 있다. 그러나, 몇가지 경우, 아미노산 스페이서가 면역원성으로 판명되어 구성체에 대한 원하지 않는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 것을 주목해야 한다. 따라서, 구성체에 첨가된 어떤 스페이서는 비교적 비-면역원성이거나, 더 바람직하게는, 변형된 항체의 원하는 생화학적 특성이 유지될 수 있다면, 함께 생략되는 것이 바람직하다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 외에, 몇개 또는 하나의 아미노산의 일부 결질 또는 치환에 의하여 본 발명의 항체가 제공될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시키기에 충분하며, 이를 통해 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 유사하게, 효과기 작용(예를 들어 상보 CLQ 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인 중 일부를 조정되도록 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은, 대상이 되는 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능을 그대로 남겨두면서도, 항체의 선택된 특성(혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 얻어지는 구성체의 프로파일을 개선하는 하나 이상의 아미노산을 돌연변이 또는 치환하여 개시된 항체의 불변 영역을 변형시킬 수 있다. 이와 관련하여, 실질적으로 변형된 항체의 구성 및 면역 프로파일을 유지하면서, 보존된 결합(예를 들어 Fc 결합) 부위에 의해 제공되는 활성을 파괴할 수 있다. 그러나, 다른 바람직한 실시형태는, 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여, 효과기 작용과 같은 바람직한 특성을 개선하거나, 세포독소 또는 탄수화물 부착을 보다 더 제공하는 것을 포함하여 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래하는 특이적 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
상기된 바와 같은 변형된 항체를 제공하기 위하여 분리된 유전자 물질을 조작한 후, 원하는 양의 변형된 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있는 숙주 세포 내에 도입하기 위하여 유전자를 일반적으로 발현 벡터 내에 삽입한다.
본 명세서에서 "벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는, 세포 내 원하는 유전자에 도입하고 발현하기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 나타내기 위하여 상세한 설명 및 특허청구범위에 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 그룹에서 이러한 벡터를 쉽게 선택할 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 양립가능한 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하는 적당한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에 들어가거나 및/또는 복제하는 능력을 포함하여 이루어진다.
이러한 본 발명의 목적을 위해, 다수의 발현 벡터계를 사용할 수 있다. 예를 들어 한 종류의 벡터는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래하는 DNA 요소를 사용한다. 다른 것은 내부 리보솜 결합 부위와 함께 폴리시스트론계의 사용을 포함한다. 추가적으로, 트랜스펙션된 숙주 세포의 선택이 가능하도록 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 이의 염색체 속으로 DNA를 통합한 세포를 선택할 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 대한 독립영양, 살생물 내성(예를 들어 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공한다. 선택가능한 마커 유전자는 발현되는 DNA 서열에 직접 결합되거나 공동형질전환을 통해 동일 세포 내에 도입될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위하여 추가적인 요소가 필요할 수도 있다. 이러한 요소는 스플라이스 신호 및 전사 프로모터, 인헨서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 상기된 바와 같이 변형된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자(바람직하게는 인간)와 함께 클로닝된 가변 영역 유전자를 발현 벡터 내에 삽입한다. 바람직하게는, 이는 NEOSPLA라 하는 IDEC사의 독점 발현 벡터를 사용하여 실시된다. 이 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인헨서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, 복제의 SV40 개시점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 포함한다. 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 이 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자 투입, CHO 유전자에 트랜스펙션 후, G418 함유 매질에서 선택 및 메소트렉세이트 증폭 시에 매우 높은 수준의 항체 발현이 가능한것으로 밝혀졌다. 이 벡터계는 실질적으로 공동 양도된 미합중국 특허 제 5,736,137호 및 5,658,570호에 개시되어 있으며, 이들은 각각 본 명세서에 전반적으로 참조 병합되어 있다. 이 계는 높은 발현 수준, 즉 >30 pg/세포/일을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변형된 항체는 공동출원중인, 2001년 11월 16일자로 출원되고 본 명세서에 전반적으로 참조병합된 미합중국 가출원 제 60/331,481호에 개시된 것과 같은 폴리시스트론 변형체를 사용하여 발현될 수 있다. 이들 신규 발현계에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 관심의 대상이 되는 다중 유전자 산물을 단일 폴리시스트론 구성체로부터 생산할 수 있다. 이들 계는 유리하게는 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)를 사용하여 진핵 숙주 세포에 비교적 높은 수준의 변형된 항체를 제공한다. 양립가능한 IRES 서열이 본 명세서에 참조병합되어 있는 U.S.P.N. 6,193,980호에 개시되어 있다. 이러한 발현계를 사용하여 본 출원에 개시된 변형된 항체의 전 범위를 효과적으로 생산할 수 있음이 당업자에게 명백하다.
더 일반적으로, 일단 변형된 항체를 포함하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 즉, 숙주 세포가 형질전환될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 기술로 플라스미드를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 이들에는 트란스펙션(전기영동 및 일렉트로포레이션), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 외피 DNA와의 세포 융합, 미세주입 및 손상되지 않은 바이러스 감염이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 문헌[Ridgway, A.A.G. "MammalianExpression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-572 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)]을 참조한다. 일렉트로포레이션을 통한 숙주 내로의 플라스미드 도입이 가장 바람직하다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적당한 조건 하에서 성장시키며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성을 위해 어세이된다. 전형적인 어세이 기술에는 효소-결합된 면역흡착 어세이(ELISA), 방사선면역어세이(RIA), 또는 형광-활성화된 세포 소터 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "형질전환"이라는 용어는, 유전자형을 변화시키고 결과적으로 수령 세포에 변화를 일으키는, 수령 숙주 세포 안으로의 DNA의 도입을 나타내기 위해 광범위하게 사용된다.
동일선상에서, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성되고 하나 이상의 이종구조 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 형질전환된 세포를 나타낸다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 이의 변형체는 이러한 형질전환에 기인한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하는 공정의 설명에서, "세포" 및 "세포 배양액"이라는 용어는 교환가능하게 사용되어, 달리 명확하게 구체화되어 있지 않은 경우에는 항체의 공급원을 나타낸다. 다시 말해, "세포"로부터 항체의 회수는, 스펀 다운(spun down) 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포를 모두 포함하는 세포 배양액으로부터의 회수를 의미할 수 있다.
단백질 발현에 사용된 숙주 세포 라인은 가장 바람직하게는 포유류 개시점이며, 당업자는 선택적으로 여기서 발현되는 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포 라인을 결정할 수 있다.
전형적인 숙주 세포 라인에는 DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 라인, DHFR 제외), HELA(인간 경부암), CVI(원숭이 신장 라인), COS(SV40 T 항원을 사용한 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 라인), SP2/O (마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소의 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포 라인은 일반적으로 상업적 서비스, ATCC(American Tissue Culture Collection) 또는 공개문헌으로부터 입수가능하다.
세포외 생산을 통해 다량의 원하는 항체를 얻도록 정률증가가 가능하다. 조직 배양 조건 하에서의 포유류 세포 배양 기술이 이 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서의 균질 현탁 배양, 또는 예를 들어 공동 섬유, 마이크로캡슐에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포획된 세포 배양이 포함된다. 변형된 항체를 분리하기 위하여, 배양 상등액의 면역글로불린을 예를 들어 황산암모늄으로 침전시키고, PEG와 같은 흡습성 물질에 대해 투석하고, 선택적인 막을 통해 여과하는 등으로 우선 농축시킨다. 필요하거나 및/또는 원한다면, 농축된 항체를 예를 들어 겔여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 또는 (면역-)친화 크로마토그래피 상에서의 크로마토그래피를 통하여 통상적인 크로마토그래피법으로 정제한다.
변형된 면역글로불린 유전자는 또한 박테리아 또는 효모와 같은 비-포유류 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아와 같은 다양한 단일세포 비-포유류 유기체, 즉 배양 또는 발아로 성장가능한 것들도 형질전환될 수 있는 것으로 생각된다. 에스케리키아 콜리와 같은 장내세균; 살로멜라; 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스; 뉴모코커스; 스트렙토코커스 및 해모필러스 인플루엔자 류를 포함하는 형질전환되기 쉬운 박테리아에 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 일반적으로 함유체의 일부가 되는 것으로 또한 생각된다. 이 때 사슬을 분리하고, 정제한 후, 기능성 면역글로불린 분자로 통합해야 한다. 원핵생물에 추가하여, 진핵 미생물을 사용할 수도 있다. 다수의 다른 균주를 이용할 수 있다고는 하나, 사카로마이세즈 세레비시에, 또는 일반적으로 빵을 구울때의 효모가 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다.
사카로마이세즈에서 발현시키기 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:1414(1979); Tschemper et al., Gene. 10:157(1980))이 일반적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미 트립토판에서 성장능력이 부족한 효모 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics, 85:12(1977))에 선택 마커를 제공하는 trpl 유전자를 함유한다. 이 때 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trpl 손상의 존재는, 트립토판 부재시의 성장을 통해 형질전환을 검출하기 효과적인 환경을 제공한다.
임상적으로 유용한 양을 얻어내는 방법과 무관하게, 본 발명의 변형된 항체를 다수의 접합체(즉, 면역접합체) 또는 미접합된 형태 중 하나로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 방사성동위원소와 같은 세포독소, 치료제, 세포활동억제제, 생물학적 독소 또는 약물전구체에 접합될 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 변형된 항체를, 악성종양 세포를 제거하기 위한 상보-의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC)를 포함하는 대상의 자연 방어 메카니즘을 억제하기 위하여 비접합체 또는 "네이키드(naked)" 형태로 사용할 수 있다. 특히 바람직한 형태로, 다수의 주지된 킬레이터 또는 직접적인 표지 중 어느 것을 사용하여90Y,125I,131I,123I,105Rh,153Sm,67Cu,67Ga,166Ho,177Lu,186Re 및188Re와 같은 방사성동위원소에 변형 항체를 접합시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 개시된 조성물은 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 및 인터페론과 같은 림포카인 등의 약물, 약물전구체 또는 생물학적 반응 변형제에 커플링된 변형된 항체를 포함하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 또다른 실시형태는 리신 또는 디프테리아 독소와 같은 특이적 생체독소에 접합된 변형된 항체의 사용을 포함하여 이루어진다. 또다른 실시형태에서, 변형된 항체는, 얻어지는 분자가 종양 세포 및 T세포와 같은 효과기 세포 모두에 결합하는 다른 면역 활성 리간드(예를 들어 항체 또는 이의 단편)와 착물을 이룰 수 있다. 사용되는 접합 또는 미접합된 변형된 항체의 선택은 암의 종류 및 단계, 부가적 치료의 사용(즉 화학요법 또는 외부 방사선) 및 환자의 상태에 따라 결정된다. 당업자는 여기에 교시된 바에 따라 쉽게 선택가능한 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "세포독소 또는 세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 방해하고, 이에 노출되는 경우에 악성종양을 감소시키거나 저해하거나 파괴할 수 있는 어떤 물질을 의미한다. 세포독소의 예로는, 방사성핵종, 생체독소, 세포활성 억제 또는 세포독성 치료제, 약물전구체, 면역 활성 리간드 및 사이토카인과 같은 생물학적 반응 변형제가 포함되며 이에 제한되지 않는다. 이하 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 방사성핵종 세포독소가 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다. 그러나, 악성종양 세포의 성장을 지연 또는 완화시키거나 악성종양 세포를 제거하고, 본 명세서에 개시된 변형된 항체와 연관될 수 있는 세포독소도 본 발명의 범위에 속한다.
앞의 연구에서, 동위원소로 표지된 항-종양 항체를 사용하여 성공적으로 고형 종양 및 림프종/백혈병 세포를 동물모델 및 경우에 따라 인간에서 파괴한 것으로 생각된다. 방사성핵종은 핵 DNA에서 다중 가닥의 파괴를 일으키는 이온화 방사를 통해 세포 사멸을 일으킨다. 치료 접합에 사용되는 동위원소는 일반적으로 치료에 효과적인 경로 길이를 갖는 고에너지 α-, γ- 또는 β-입자를 생성한다. 이러한 방사성핵종은 이들이 근접하는 세포, 예를 들어 접합체가 부착되거나 들어가는 종양 세포를 사멸한다. 이들은 일반적으로 비-국소화된 세포에 효과가 거의 없거나 전혀 없다. 방사성핵종은 반드시 비-면역원성이다.
본 발명과 접합된 방사성표지 접합체의 사용과 관련하여, 변형된 항체를 직접 표지화하거나(요오드화 등을 통해) 킬레이트제를 사용하여 간접적으로 표지화할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 어구 "간접적인 표지화" 및 "간접적인 표지화 접근"은 모두, 킬레이트제가 공유적으로 항체에 부착하고 하나 이상의 방사성핵종이 킬레이트제와 관련된다는 것을 의미한다. 이러한 킬레이트제는, 이들이 폴리펩티드 및 방사성동위원소 모두에 결합하므로 일반적으로 이작용성 킬레이트제라 한다. 특히 바람직한 킬레이트제는 1-이소티오시크마토벤질-3-메틸디오텔렌 트리아민펜타아세트산("MX-DTPA") 및 사이클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산("CHX-DTPA") 유도체를 포함하여 이루어진다. 다른 킬레이트제는 D-DOPA 및 EDTA 유도체를 포함하여 이루어진다. 특히 직접적인 라벨링을 위한 바람직한 방사성핵종에는111In 및90Y가 포함된다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 어구 "직접적인 표지" 및 "직접적인 표지 접근"은 모두, 방사성핵종이 항체에 직접적으로 공유부착된다는 것(일반적으로 아미노산 잔기를 통하여)을 의미한다. 더 구체적으로, 이러한 결합 기술에는 무작위 표지 및 부위-지시 표지가 포함된다. 후자의 경우, 표지가 접합체의 Fc 부분 상에만 존재하는 N-연결된 당류 잔기와 같은 다이머 또는 테트라머 상의 특정 부위에서 지시된다. 또한 다양한 직접 표지화 기술 및 프로토콜이 본 발명과 양립가능하다. 예를 들어, 테크네튬-99m 표지된 항체는 리간드 교환법을 사용하거나, 주석 이온 용액으로 퍼테크네이트(TcO4 -)를 환원시키거나, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상에 킬레이트하고 항체를 이 칼럼에 적용하거나, 배치 표지 기술, 예를 들어 퍼테트네이트, SnCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트-용액과 같은 완충용액 및 항체를 배양함으로써 제조될 수 있다. 어떤 경우, 항체를 직접적으로 표지하는 바람직한 방사성핵종은 티로신 잔기를 통해 공유 부착된131I이다. 본 발명에 따라 변형된 항체는 예를 들어 방사성 요오드화 나트륨 또는 칼륨 및 하이포클로라이트,클로라민 T 등의 화학적 산화제, 또는 락토퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 및 글루코스와 같은 효소 산화제를 사용하여 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해, 간접 표지 접근이 특히 바람직하다.
킬레이터 및 킬레이터 접합체 관련 특허는 이 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어 미합중국 특허 제 4,831,175호(Gansow)는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 이를 함유하는 단백질 접합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 미합중국 특허 제 5,099,069호, 5,246,692호, 5,286,850호, 5,434,287호 및 5,124,471호(Gansow)는 또한 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 다른 양립가능한 금속 킬레이터의 예로는 이텔린디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥소-4,7,12,15-테트라아자펩타데칸-테트라아세트산 등이 있다. 사이클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하며 이후 자세히 설명한다. 여기 나타낸 것을 포함하여 다른 양립가능한 킬레이터를 당업자는 쉽게 알 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 속하는 것이 명백하다.
공동-출원중인 출원 제 08/475,813호, 08/475,815호, 및 08/478,967호에서 킬레이트화를 용이하게 하기 위하여 사용된 특이적 킬레이터를 포함하는 양립가능한 킬레이터는, 삼가 금속에 대해 높은 친화도를 제공하고, 증가된 종양-대-비종양 비율 및 감소된 뼈 흡수 및 표적 부위(즉, B-세포 림프종 종양 부위)에서의 방사성핵종의 증가된 생체 내 보유를 나타내도록 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 특성 모두를 갖거자 갖지 않을 수 있는 다른 이작용성 킬레이터가 이 기술분야에 공지되어 있으며, 종양 치료에 유리할 수도 있다.
여기 교시된 바에 따라, 변형된 항체는 진단 및 치료 목적으로 다른 방사성표지에 접합될 수 있는 것으로 또한 생각된다. 이러한 목적으로, 본 명세서에 전반적으로 참조병합되어 있는 상기 공동-출원중인 출원에는 치료 항체를 투여하기 전에 종양을 진단 "이미지화(imaging)"하기 위한 방사성표지된 치료 접합체가 개시되어 있다. "In2B8" 접합체는 인간의 CD20 항원에 특이적인 쥐의 모노클로날 항체, 2B8을 포함하여 이루어진다. 이것은 이작용성 킬레이터, 즉 MX-DTPA(디에틸렌트리아민펩타아세트산)를 통해111In에 부착되며, 이는 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸-DTPA 및 1-메틸-3-이소티오시아나토벤질-DTPA의 1:1 혼합물을 포함하여 이루어진다. 약 1 내지 10mCi가 검출가능한 독성 없이 안전하게 투여될 수 있으므로, 진단 방사성핵종으로서111In이 특히 바람직하며, 이미지화 데이터를 통해 일반적으로 연속90Y-표지 항체 분포가 예견된다. 대부분의 이미지화 연구에 5mCi111In-표지된 항체가 이용되는데, 이 조사량이 안전하고, 낮은 조사량에 비해 이미지화 효율이 증가하며, 항체 투여 3 내지 6일 후 이미지화가 최적화되기 때문이다. 예를 들어 문헌(Murray, J. Nuc. Med. 26:3328(1985) 및 Carraguillo et al., J Nuc. Med. 26:67(1985))을 참조한다.
상기 지시된 바와 같이, 다양한 방사성핵종이 본 발명에 이용가능하고, 당업자는 다양한 환경하에서 어느 방사성핵종이 가장 적합한지를 쉽게 확인할 수 있다.예를 들어131I는 표적화된 면역요법에 사용되는 주지된 방사성핵종이다. 그러나, 8일의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위 모두에서의 요오드화된 항체의 탈할로겐화; 및 종양 안의 국소화된 투여량 부착을 위해서 최적 이하가 될 수 있는 방사특성(예를 들어 많은 감마 성분)을 포함하는 몇가지 요인에 의해131I의 임상적 유용성이 제한될 수 있다. 더 나은 킬레이트제가 나타남에 따라, 금속 킬레이트기를 단백질에 부착시키는 기회는111In 및90Y와 같은 다른 방사성 핵종을 사용할 기회를 증가시켰다.90Y은 방사성면역요법의 사용에 몇가지 잇점을 제공한다:90Y의 64시간의 반감기는 예를 들어131I와 달리 종양에 의한 항체 축척이 가능하도록 길고,90Y은 100 내지 1,000의 세포 직경의 조직 범위를 갖는, 수십년간 감마 조사를 수반하지 않는 고에너지의 순수한 베타 방사체이다. 또한, 최소량의 투과 방사선으로 인해90Y-표지된 항체를 외래환자에게 투여할 수 있다. 또한, 세포 사멸을 위해 표지화된 항체의 내부화가 요구되지 않고, 이온화 방사선의 국부 방사가 표적 항원이 부족한 부가적 종양 세포에 치명적이어야 한다.
90Y-표지된 변형된 항체의 효과적인 단일 치료 투여량(즉, 치료에 효과적인 양)은 약 5 내지 약 75mCi, 더 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi 이다.131I-표지된 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 제거가능한 투여량은 약 5 내지 약 70mCi,더 바람직하게는 약 5 내지 약 40mCi이다.131I-표지된 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 제거가능한 투여량(즉, 자가조직 골수 이식이 필요할 수 있다)은 약 30 내지 약 600mCi, 더 바람직하게는 약 50 내지 약 500mCi이다. 키메라 항체에 관하여, 쥐의 항체에 대한 긴 순환 반감기 때문에, 요오드-131 표지된 키메라 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 제거가능한 투여량은 약 5 내지 약 40mCi, 더 바람직하게는 약 30mCi 이하이다. 예를 들어111In 표지의 이미지화 기준은 일반적으로 약 5mCi 이하이다.
131I 및90Y 를 사용하여 상당량의 임상 실험이 실시되었으나, 다른 방사성표지가 본 기술분야에 공지되어 있으며 유사한 목적으로 사용되어 왔다. 이미지화를 위하여 다른 방사성동위원소도 사용된다. 예를 들어 본 발명의 범위와 양립가능한 추가의 방사성 동위원소는123I,125I,32P,57Co,64Cu,77Br,81Rb,81Kr,87Sr,113In,127Cs,129Cs,132I,197Hg,203Pb,206Bi,177Lu,186Re,212Pb,212Bi,47Sc,105Rh,109Pd,153Sm,188Re,199Au,225Ac,221At211At, 및213Bi가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 알파, 감마 및 베타 방사체는 모두 본 발명에 양립가능하다. 또한, 본 개시 내용의 견지에서, 당업자는 부적절한 실험 없이 어느 방사성핵종이 선택된 치료 과정과 양립가능한지를 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 목적으로, 임상 진단에 이미 사용된 추가의 방사성핵종에는125I,123I,99Tc,43K,52Fe,67Ga,68Ga 및111In이포함된다. 항체는 또한 표적화된 면역요법(Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65:111-125 (1987))에 잠재적으로 사용하기 위하여 다양한 방사성핵족으로 표지되었다. 이들 방사성핵종은188Re 및186Re와199Au 및67Cu를 더 낮은 함량으로 포함한다. 미합중국 특허 제 5,460,785호는 이러한 방사성핵종에 관한 추가의 데이터를 제공하며, 본 명세서에 참조 병합되어 있다.
방사성핵종에 추가하여, 본 발명의 변형된 항체는 다수의 생물학적 반응 변형체, 약제학적 제제, 독소 또는 면역학적 활성 리간드 중 어느 하나에 접합되거나 관련될 수 있다. 선택된 세포독소에 따라 다양한 기술을 사용하여 이들 비-방사성 접합체를 조합할 수 있는 것은 당업자에게 명백하다. 예를 들어, 비오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 같은 비오틴의 활성화된 에스테르와 변형된 항체를 반응시켜 비오틴을 갖는 접합체를 제조한다. 유사하게, 상기 열거한 것과 같은 커플링제의 존재하에, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네이트와 반응시켜, 형광 마커를 갖는 접합체를 제조할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 세포활동 억제/세포독성 물질 및 금속 킬레이트와의 접합체를 유사한 방법으로 제조한다.
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 약물은 세포독성 약물, 바람직하게는 암 치료에 사용되는 약물이다. 이러한 약물에는 일반적으로 세포활동 억제제, 알킬화제, 항대사산물, 항-증식제, 튜뷸린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 등이 포함된다. 본 발명과 양립가능한 전형적인 세포활동 억제제에는 메클로레타민, 트리에틸렌포스포아미드, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜파란 또는 트리아지쿠온과 같은 알킬화 물질, 또한 카르무스틴, 로무스틴 또는 세무스틴과 같은 니트로소우레아 화합물이 포함된다. 다른 바람직한 세포독성제 류에는 예를 들어 안트라사이클린계 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘계 약물, 디넨스(diynenes) 및 포도필로톡신이 포함된다. 특히 유용한 종류로는, 예를 들어 아드리아마이신, 카르미노마이신, 다우노루비신(다우노마이신), 독소루비신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메톱테린, 미트라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 악시노마이신 D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 프토라푸르, 6-머캅토푸린, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 포도필로톡신 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트, 멜팔란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 레우로시딘, 빈데신, 레우로신 등이 포함된다. 본 명세서에 교시된 내용과 양립가능한 다른 세포독소에는 탁솔, 탁산, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 테노포시드, 콜키신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 프로게스틴, 예를 들어 하이드록시프로게스테론 또는 메드로프로게스테론, 에스트로겐, 예를 들어 디에틸스틸베스트롤, 안티에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 안드로겐, 예를 들어 테스토스테론 및 아로마타제 저해제, 예를 들어 아미노글루테티미드와 같은 호르몬 및 호르몬 길항제도 본 명세서에 교시된 것과 양립가능하다. 앞에서 논의된 바와같이, 당업자는 원하는 화합물을 화학적으로 변형시켜, 이 화합물을 본 발명의 접합체를 제조할 목적으로 더 편리하게 반응시킬 수 있다.
특히 바람직한 세포독소의 일례에는 칼리케아미신, 에스페라마미신 또는 디네미신을 포함하는 에네딘(edndiyne) 계의 항-종양 항생물질 류 또는 유도체가 포함된다. 이들 독소는 극도로 잠재력있으며, 핵 DNA를 쪼갬으로써 작용하여 세포 사멸을 일으킨다. 생체 내에서 쪼개져 많은 불활성화된 면역원 폴리펩티드 단편을 생성할 수 있는 단백질 독소와 달리, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 다른 에네딘과 같은 독소는 필수적으로 비-면역원인 소형 분자이다. 이들 비-펩티드 독소는 모노클로날 항체 및 다른 분자를 표지하기 위해 전에 사용되었던 기술에 의해 화학적으로 다이머 또는 테트라머에 결합된다. 이들 결합 기술에는 접합체의 Fc 부분에만 존재하는 N-결합된 당류 잔기를 통한 부위-특이적 결합이 포함된다. 이러한 부위-지시된 결합법은, 접합체의 결합 특성에 미치는 가능한 결합 효과를 감소시키는 장점을 갖는다.
앞서 언급된 바와 같이, 양립가능한 세포독소는 약물전구체를 포함하여 이루어질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약물전구체(prodrug)"라는 용어는 모약물에 비해 종양 세포에 세포독성이 낮고 효소에 의해 활성화되거나 더 활성인 모형태로 전환될 수 있는, 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 본 발명에 양립가능한 약물전구체에는 포스페이트-함유 약물전구체, 티오포스페이트-함유 약물전구체, 술페이트 함유 약물전구체, 펩티드 함유 약물전구체, β-락탐-함유 약물 전구체, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 약물전구체 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 약물전구체, 5-플루오로시토신 및 더 활성인 세포독성이 없는 약물로 전환가능한 다른 5-플루오우리딘 약물전구체가 포함되며 이에 제한되지 않는다.
세포독소 가운데, 항체는 또한 리신 서브유닛 A, 아브린, 디프테리아 독소, 보툴리늄, 시안기노신, 삭시토신, 시가톡신, 테타누스, 테트로도톡신, 트리클로로세신, 베루콜로겐과 같은 생체독소 또는 독성 효소와 관련될 수 있는 것으로 생각된다. 바람직하게는, 이러한 구조체는 항체-독소 구조체를 직접적으로 발현시킬 수 있는 유전공학 기술로 만든다. 본 발명의 변형된 항체와 관련될 수 있는 다른 생물학적 반응 변형체는 림포킨 및 인터페론과 같은 사이토카인을 포함하여 이루어진다. 또한, 상기된 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체와 면역학적 활성 리간드(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)를 관련시키기 위하여 유사한 구조체를 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이들 면역학적 활성 리간드는 면역활성 효과기 세포 표면의 항원에 지시된다. 이러한 경우, 종양 관련 항원을 갖는 종양 세포의 아주 가까이에 T 세포 또는 NK 세포와 같은 효과기 세포를 가져와 원하는 면역 반응을 일으키기 위하여 구조체를 사용할 수 있다. 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 통상적인 기술로 이러한 구조체를 쉽게 형성할 수 있다.
개시된 변형된 항체와 함께 사용가능한 다른 양립가능한 세포독소류로, 종양 세포에 효과적으로 지시될 수 있는 방사선 민감화 약물이 있다. 이러한 약물은 이온화 방사선에 대한 민감성을 개선하여 방사선요법의 효능을 증대시킨다. 종양 세포에 의해 내면화된 항체 접합체는 방사선감작물질을 방사선민감성이 최대인 핵의근처로 전달한다. 속박되지 않은, 방사선감작물질 결합된 변형된 항체를 혈액으로부터 신속히 제거하고, 남아있는 방사선감작물질을 표적 종양에 국소화하고, 정상 조직에 최소 흡수되도록 한다. 혈액으로부터 신속한 클리어란스 후, 부가적 방사선요법을 세가지 방법: 1) 종양에 특이적으로 지시되는 외부 빔 방사선 2) 종양에 직접 적용되는 방사능 3) 동일한 표적화 항체를 사용하는 전신성 방사성면역요법 중 하나로 시행한다. 이러한 접근의 잠재적으로 관심을 끄는 변형법은, 방사선민감화된 면역접합체에 치료적 방사성동위원소를 부착하여, 환자에게 단일 약물을 적용하는 편리성을 제공하는 것이다.
개시된 항체가 접합되거나 접합되지 않은 형태로 사용되던지 사용되지 않던지 간에, 본 발명의 주 장점은 이들 항체를 골수억제된 환자, 특히 방사선요법 또는 화학요법과 같은 부가적 치료 중이거나 치료를 받은 환자에게 사용할 수 있다는 것으로 생각된다. 즉, 변형된 항체의 유리한 전달 프로파일(즉, 비교적 짧은 혈청 거주 시간 및 개선된 국소화)로 인해, 이들은 특히 적색 골수 비축물이 감소되고 미엘로독성에 대하여 민감성인 환자의 치료에 유용하다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 독특한 전달 프로파일로 인해, 이들은 골수억제된 암 환자에 대한 방사성표지된 접합체의 투여에 매우 효과적이다. 이처럼, 변형된 항체는 접합 또는 접합되지 않은 형태로, 이전에 외부 빔 방사선조사 또는 화학요법과 같은 부가적 치료를 받은 환자에게 유용하다. 다른 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체(접합 또는 접합되지 않은 형태로 다시)를 화학요법제와 함께 조합 치료 섭생법에 사용할 수 있다. 당업자에게, 이러한 치료적 섭생법이, 개시된 항체 및 하나 이상의 화학요법제를 순차적으로, 동시에, 함께 또는 동일시간에 투여하는 것을 포함하여 이루어질 수 있는 것이 명백하다. 본 발명의 이러한 점에서의 특히 바람직한 실시형태는 방사성표지된 항체의 투여를 포함하여 이루어진다.
변형된 항체는 바로 앞에 기재된 바와 같이 투여할 수 있으나, 다른 실시형태에서 접합 및 접합되지 않은 변형된 항체를 암이라는 것 외에는 건강한 환자에게 일차적 치료법으로서 투여하는 것이 강조되어야 한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 항체는 정상 또는 평균의 적색 골수 비축물을 갖는 환자 및/또는 외부 빔 방사선조사 또는 화학요법과 같은 부가적 치료를 받지 않았거나 받지 않는 환자에게 투여할 수 있다.
그러나, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 선택된 실시형태는 골수억제된 환자에게 변형된 항체를 투여하거나, 하나 이상의 부가적 치료법(즉, 조합된 치료 섭생법)과 조합 또는 결합시키는 것을 포함하여 이루어진다. 여기서 사용된 것과 같이, 부가적 치료와 결합 또는 조합하여 변형된 항체를 투여하는 것은, 치료 및 개시된 항체를 순차적, 동시, 동일시간, 함께, 부대적, 또는 동시대 투여 또는 적용하는 것을 의미한다. 당업자에게, 조합된 치료 섭생법의 다양한 성분의 투여 또는 적용은, 치료의 전체적인 유용성을 개선하기 위해 시간 조절될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 화학요법제를 표준의, 주지된 과정의 치료법으로 투여한 후 수주 내에 본 발명의 방사성면역접합체를 적용할 수 있다. 반대로, 세포독소 관련 변형된 항체를 정맥내 투여한 후 종양 국소화된 내부 빔 방사선조사를 적용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형된 항체를 하나 이상의 선택된 화학요법제와 함께한번에 투여할 수 있다. 당업자(예를 들어, 암연구가)는 선택된 부가적 치료 및 본 명세서의 교시내용에 기초하여, 부적절한 실험 없이 효과적인 결합된 치료 섭생법을 쉽게 알 수 있다.
이와 관련하여, 변형된 항체(세포독소가 있거나 없이) 및 화학요법제를 조합하여 환자에게 치료적 잇점을 제공하는 시간 프레임 내에 어떤 순서로든 투여할 수 있는 것으로 생각된다. 즉, 화학요법제 및 변형된 항체는 어떤 순서로든 또는 동시에 투여할 수 있다. 선택된 실시형태에서, 본 바령의 변형된 항체는 전에 화학요법을 거친 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 변형된 항체 및 화학요법 치료는 실질적으로 동시 또는 함께 수행된다. 예를 들어, 화학요법 과정을 수행하면서, 변형된 항체를 환자에게 투여할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체를 어떤 화학요법제 또는 치료 1년 내에 투여한다. 바람직한 다른 실시형태에서, 변형된 항체를 어떤 화학요법제 또는 치료 10, 8, 6, 4 또는 2달 내에 투여한다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체를 어떤 화학요법제 또는 치료 4, 3, 2 또는 1주 내에 투여한다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 변형된 항체를 선택된 화학요법제 또는 치료 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에 투여한다. 두가지 약제 또는 치료가 수시간 또는 수분 내에(즉, 실질적으로 동시에) 환자에게 적용될 수 있는 것으로 또한 생각된다.
또한, 본 발명에 따르면, 골수억제된 환자는 혈구수가 낮아진 어떤 환자를 의미한다. 골수억제의 임상 지시자로서 통상 사용되는 몇가지 혈구수 파라미터가 있으며, 환자에게 골수억제가 발생되는 정도를 쉽게 측정할 수 있는 것은 당업자에게 명백하다. 이 기술분야에서 허용된 골수억제 척도의 예로는 Absolute Neutrophil Count(ANC) 또는 혈소판 수가 있다. 이러한 골수억제 또는 부분적 미엘로머블레이션은 다양한 생화학적 질환 또는 질병에 따른 결과가 될 수 있으며, 아마도 이전의 화학요법 또는 방사선요법의 결과로서 일어날 수 있다. 이와 관련하여, 전통적인 화학요법을 받은 환자는 일반적으로 적색 골수 비축물이 감소된다는 것이 당업자에게 명백하다. 상기된 바와 같이, 이러한 대상은, 사망률 및 질병률이 증가하게 되는 빈혈증 또는 면역강하와 같은 허용될 수 없는 부작용 때문에, 최적화 수준의 세포독소(즉, 방사성핵종)를 사용하여 치료될 수 없는 경우가 많다.
더 구체적으로, 본 발명의 접합 또는 접합되지 않은 변형된 항체를 사용하여 약 2000/mm3이하의 ANCs 또는 약 150,000/mm3이하의 혈소판 수를 갖는 환자를 효과적으로 치료할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 변형된 항체는 약 1500/mm3이하, 약 1000/mm3이하 또는 더 바람직하게는 약 500/mm3이하의 ANCs를 갖는 환자를 치료하기 위하여 사용할 수 있다. 유사하게, 약 75,000/mm3이하, 또는 더 바람직하게는 50,000/mm3이하, 약 10,000/mm3이하까지의 혈소판 수를 갖는 환자를 치료하기 위하여 본 발명에 따른 변형된 항체를 사용할 수 있다. 일반적으로, 당업자는 정부 시행 가이드라인 및 방법을 사용하여 환자가 골수억제되는 시기를 쉽게 확인할 것이다.
상기된 바와 같이, 많은 골수억제된 환자는 화학요법, 임플란트 방사선용법또는 외부 빔 방사선요법을 포함하는 치료 과정을 거친다. 후자의 경우, 외부 방사선 공급원이 악성종양의 국소 조사를 위해 필요하다. 방사선요법 이식법을 위하여, 방사성 약제를 수술시 악성종양 내에 위치시킴으로써, 질병부위를 선택적으로 조사한다. 어떤 경우, 개시된 변형된 항체를, 원인에 상관없이 골수억제를 보이는 환자의 종양 질환을 치료하기 위하여 사용할 수 있으며, 특히 외부 빔 조사 또는 임플란트 방사선요법과 결합하여 사용하여 할 수 있다.
이와 관련하여, 본발명의 변형된 항체를, 생체내에서 종양 세포의 성장을 조절하거나 저해하거나 감소시키거나 없애는 어떤 화학요법제 또는 약제 또는 섭생법(예를 들어 조합된 치료 섭생법을 제공하기 위하여)과 조합하거나 결합하여 사용할 수 있는 것으로도 생각된다. 논의된 바와 같이, 이러한 약제는 적색 골수 비축물을 감소시키는 경우가 많다. 이러한 환자의 종양을 유리하게 적극적으로 치료할 수 있는 본 발명의 화합물의 미엘로독성 감소에 의해, 이러한 감소는 전체적으로 또는 일부 상쇄될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 여기 개시되어 있는 방사성표지된 면역접합체는 방사성핵종에 대한 종양세포의 감수성을 증가시키는 방사선감작물질과 함께 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사선감수성 화합물은, 방사성표지된 변형된 항체가 혈류로부터 크게 제거된 후 투여될 수 있으며, 종양의 부위에 치료 유효 수준으로 남아있다.
본 발명의 이러한 면과 관련하여, 본 발명과 양립가능한 전형적인 화학요법제에는 알킬화제, 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라시틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트 및 프레드니손이 포함된다. 네-약물 조합 MOPP(메클레타민(질소 머스타드), 빈크리스틴(온코빈), 프로카르바진 및 프레드니손)이 다양한 종류의 림프종 치료에 매우 효과적이며, 본 발명의 바람직한 실시형태를 포함하여 이루어진다. MOPP-내성 환자에게, ABVD(예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChIVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), CABS(로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP 및 ABVD, MOPP 및 ABV(독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 조합을 사용할 수 있다. 표준 투여 및 스케쥴에 대해서는 문헌(Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788(Kurt J. lsselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) 및 V. T. DeVita et al., (1997)) 및 여기 인용된 문헌을 참고한다. 이들 치료법은 변화시키지 않거나 특정 환자에게 필요한 대로 변경시켜, 상기 설명된 바와 같은 하나 이상의 변경된 항체와 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상황에 유용한 추가 섭생법에는, 사이클로포스파미드 또는 클로람부실과 같은 단일 알킬화제를 사용하거나, CVP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP(CVP 및 독소루비신), C-MOPP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP(CHOP+프로카르바진 및 플레오마이신), m-BACOD(CHOP+메토트렉세이트, 블레오마이신 및 류코보린), ProMACE-MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드 및 류코보린 + 표준 MOPP), ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 류코보린) 및MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 고정 투여량 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)와 같은 조합을 사용하는 것이 포함된다. 당업자는 이들 섭생법 각각에 대한 표준 투여량 및 스케쥴을 쉽게 확인할 수 있다. CHOP는 또한 블레오마이신, 메토트렉세이트, 프로카르바진, 니트로젠 머스타드, 시토신 아라비노시드 및 에토포시드와 결합되었다. 다른 양립가능한 화학요법제에는 2-클로로데옥시아데노신(2-CDA), 2'-데옥시코포르마이신 및 플루다라빈이 포함되며 이에 제한되지 않는다.
완화되지 않거나 재발된 중급 및 고급 NHL 환자에 대하여, 구제(salvage) 요법이 사용된다. 구제 요법은 사이토신 아라비노시드, 시스플라틴, 에토포시드 및 이포스파미드와 같은 약물을 단독 또는 조합하여 사용한다. 재발되거나 공격 형태의 특정 종양 질환에서, 다음 프로토콜이 자주 사용된다: IMVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드), MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드), DHAP(덱사메타손, 고투여량의 시타라빈 및 시스플라틴), ESHAP(에토포시드, 메틸프레디솔론, HD 시타라빈, 시스플라틴), CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신) 및 CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손)을 주지된 투여속도 및 스케쥴로 각각.
본 발명의 변형된 항체와 조합하여 사용되는 치료요법제의 양은 대상에 따라 변화될 수 있거나, 본 기술분야에서 주지된 바에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어 문헌(Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287(Joel G. Hardman et al., eds.,9th ed. 1996))을 참조한다.
앞서 논의된 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체, 면역반응성 단편 또는 이의 재조합체를 포유류 악성종양의 생체내 치료를 위해 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 개시된 항체를 조성한다. 바람직하게는, 본 발명은 약리학적 식염수, 비독성 완충액, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 비-독성의, 멸균 담체를 포함하여 이루어진다. 본 출원의 목적을 위해, 치료제에 접합되거나 접합되지 않은 변형된 항체, 이의 면역반응성 단편 및 제조합체의 약제학적 유효량은, 종양 세포 상에서 선택된 면역반응성 항원과의 효과적 결합을 달성하고 이들 세포의 사멸을 증가시키기에 유효한 양을 의미한다. 물론, 본 발명의 약제학적 조성물은 일회 또는 수회 투여로 투여되어 약제학적 유효량의 변형된 항체를 제공할 수 있다.
더 구체적으로, 개시된 항체 및 방법은 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 저해하고, 및/또는 종양을 가진 동물의 생존 기간을 연장하기에 유용해야 한다. 따라서, 본 발명은 또한, 이러한 인간 또는 동물에 변형된 항체를 유효하고 비독성인 양으로 투여함으로써 인간 또는 다른 동물의 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 통상의 실험법을 통해, 악성종양을 치료할 목적으로 변형된 항체의 유효하고 비독성인 양이 무엇인지를 확인할 수 있다. 예를 들어, 변형된 항체의 치료 활성 양은, 환자의 질병 단계(예를 들어, 단계 I 대 단계 IV), 나이, 성별, 의약 합병증(예를 들어, 면역저하된 상태 또는 질병) 및 체중, 및 환자에게서 원하는 반응을 도출하는 항체의 능력와 같은 요인에 따라 결정될 수 있다. 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 투여 섭생법을 조정할 수 있다. 예를 들어, 몇몇으로 나눈 투여량을 매일 투여할 수 있으며, 또는 투여량을 치료 상태의 요건으로 지시되는 바에 따라 비례적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 일반적으로 유효량은 체중 킬로그람당 약 0.05 내지 100 밀리그람으로 매일, 더 바람직하게는 체중 킬로그람당 약 0.5 내지 10 밀리그람으로 매일 투여한다.
본 개시내용의 범위를 유지하면서, 본 발명의 변형된 항체를 인간 또는 다른 동물에게, 상기된 치료방법에 따라 치료 또는 예방하는 정도로 이러한 효과를 나타내기에 충분한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체를 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 공지기술에 따른 희석제와 함께 조합하여 제조되는 통상적인 투여형태로, 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은, 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 주지된 변수에 의해 지시된다는 것이 당업자에게 명백하다. 본 발명에 따른 하나 이상의 모노클로날 항체 종을 포함하여 이루어지는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 판명될 수 있다.
항체 접합체, 면역반응성 단편 또는 이의 재조합체, 및 치료제를 제조 및 투여하는 방법이 당업자에게 주지되어 있거나 쉽게 확인된다. 본 발명의 항체(또는 이의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소가 될 수 있다. 여기서 사용되는 비경구라는 용어는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내, 동맥내, 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 이들 모든 투여 형태가 명백히 본 발명의 범위에 속하는 것으로생각되지만, 바람직한 투여형태는 주입용 용액, 특히 정맥내 또는 동맥내 주입 또는 점적용 용액이다. 일반적으로, 적당한 주입용 약제학적 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 상등액(예를 들어 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어 인간 알부민) 등을 포함하여 이루어질수 있다. 그러나, 여기 교시된 내용과 양립가능한 다른 방법에서, 변형된 항체를 악성종양 부위에 직접 전달함으로써 종양 조직의 치료제에 대한 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여용 제제에는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주입가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체에는 염수 및 완충 매질을 포함하는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 있다. 본 발명에서, 약제학적으로 허용가능한 담체에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.01 내지 0.1M 및 바람직하게는 0.05M 인산 완충액 또는 0.8% 염수가 포함된다. 다른 통상적인 비경구용 비히클에는 인산나트륨 용액, 링거(Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 불휘발성 오일(fixed oil)이 포함된다. 정맥 내 비히클에는 링거 덱스트로스를 기본으로 한 보충제와 같은 유액 및 영양소 보충제, 전해질 보충제 등이 포함된다. 방부제 및 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 다른 첨가제가 존재할 수도 있다.
보다 특별하게, 주사용으로 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 주사 용액 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성) 또는 분산제 및 멸균 분말이 포함된다. 이러한 경우, 조성물을 멸균되어야 하며 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며 바람직하게 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질, 및 이의 적합한 혼합물이 될 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우, 조성물 내에 예를 들어, 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제를 조성물 내에 포함시켜 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
임의의 경우, 본 명세서에 열거된 성분 하나 또는 조합물과 함께 활성 화합물(예를 들어, 변형된 항체 단독으로 또는 다른 활성제와 함께)을 필요한 양만큼 적절한 용매에 넣고, 필요한 경우, 멸균 여과하여 멸균 주사 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기에 나열된 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 넣어 분산제를 제조할 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며, 이는 활성 성분과 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 임의의 바람직한 추가 성분을 생성한다. 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 컨테이너에 충전시키고, 해당 기술 분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉하여 주사용 제제를 가공한다. 또한, 상기 제제는 포장되어, 각각 본 명세서에 참조병합되는 공동-출원중인 U.S.S.N. 09/259,337 및 U.S.S.N. 09/259,338에 기재된 바와 같은 키트의 형태로 시판될 수 있다. 이러한 제조 물품은 바람직하게, 관련 조성물이 암, 악성종양 도는 종양 질환으로 고생하거나 이에 걸린 환자를 치료하는 데 사용됨을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 것이다.
상기에 상세히 논의한 바와 같이, 본 발명은 치료가 요구되는 포유류 환자에서 종양 질환의 치료를 위한 화합물, 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 상기 환자는 인간이 바람직하다. 종양 질환(예를 들어, 암 및 악성 종양)은 골수종 또는 임파종 및 백혈병과 같은 혈액의 악성종양 뿐만 아니라 흑색종, 신경교종, 육종, 및 암종과 같은 고형 종양을 포함하여 이루어질 수 있다. 일반적으로, 개시된 발명은 예방 또는 치료적으로, 변형된 항체에 의해 암세포를 표적화시키는 항원의 마커를 포함하여 이루어지는 임의의 종양을 치료한다. 치료될 수 있는 예시적임 암에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 전립선암, 결장암, 피부암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암이 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 선택된 본 발명의 변형 항체(예를 들어, CC49ㅿCH2)는 췌장암 또는 다른 위암을 진단 또는 치료하는 데 사용될 것이다.보다 특별하게, 본 발명의 항체는 카포시육종, CNS 종양(모세혈관종, 수막종 및 뇌전이), 흑색종, 위육종 또는 신장육종, 횡문근육종, 교아종(바람직하게는 다형성교아종), 평활근육종, 망막아종, 난소의 유두상낭선종, 빌름스종 또는 소세포폐암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용을 고려하여 부당한 실험을 하지 않고도 상기한 각 종양과 관련된 종양 관련 항원에 대해 적절한 항체를 유도해낼 수 있을 것으로 생각된다.
개시된 발명으로 치료될 수 있는 예시적인 혈액의 악성종양에는, 백혈병 뿐만 아니라, ALL-L3(버키트형 백혈병), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 단핵구 세포 백혈병을 포함하는 호지킨 및 비호지킨 림프종이 포함된다. 본 발명의 화합물 및 방법은, 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL), 세포 림프종(FCC), 외피 세포 림프종(MCL), 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 소림프구성(SL) NHL, 중급 미만성 NHL, 고급 림프아구성 NHL, 고급 소형 비-분해 세포 NHL, 거대 질환(bulky disease) NHL 및 발덴스트룀 마크로글로불린혈증을 포함하는 다양한 B-세포 림프종의 치료에 특히 효과적인 것으로 생각될 것이다. 이러한 림프종 및 백혈병은 분류 시스템의 변화로 인해 종종 서로 다른 명칭을 가지며 서로 다른 명칭 하에 분류된 혈액의 악성종양에 걸린 환자는 본 발명의 조합 치료법으로부터 혜택을 받을 수도 있을 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 상기한 종양 질환 뿐만 아니라, 개시된 발명은 양립가능한 종양 관련 항원을 갖는 추가적인 악성종양을 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
상기 기재내용은 하기의 실시예를 참조하여 완전히 이해될 것이다. 그러나,이러한 실시예는 본 발명을 실시하는 바람직한 방법의 예증이며 본 발명의 범위 또는 본 명세서에 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
C2B8.ㅿC H 2 면역글로불린의 구조체 및 발현
키메라 항체 C2B8(IDEC Pharmaceuticals)를 변형시켜 인간의 감마 1 불변 영역 내에 CH2 도메인이 결여된 도메인 고갈 변형체(version)를 생성하였다. 인간의 감마 1 불변 영역 뿐만 아니라 인간의 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 "텅빈(empty)" 벡터인 C2B8 및 플라스미드 N5KG1는, 각각 본 명세서에 참조병합되는 미국 특허 제 5,647,267호 및 5,736,137호에 기재되어 있다. PCR 변이유발을 중복함으로써 도메인 고갈 변형체를 생성한다.
감마 1 불변 도메인은, 면역글로불린 서열을 갖는 번역 판독 구조체 내에 있는 플라스미드 암호화 Nhe 1 부위에서 시작한다. 5' PCR 프라이머는 바로 하류의 서열 뿐만 아니라 Nhe 1 부위를 암호화하도록 구성되었다. 3' PCR 프라이머 짝(mate)은 3' 말단에서 면역글로불린 힌지(hinge) 영역으로 어닐링하고 프레임 내에서 감마 1 CH3 도메인의 첫번째의 몇몇 아미노산을 암호화하도록 구성되었다. 두번째 PCR 프라이머 쌍은 CH2 도메인 내의 BsrG I 제한 구역을 연결하는 유전자 좌(locus)에서 어닐링하는 5' 프라이머 및 3' 프라이머와 같이 첫번째 쌍(상기의)으로부터 3' PCR 프라이머의 역(reverse) 보체로 구성되었다. 각각 PCR 증폭한 후, 생성된 산물을 각각의 프라이머인 Nhe I 및 BsrG I 5' 및 3'을 갖는 주형(template)으로 사용하였다. 그리고 나서 증폭된 생성물을 다시 N5KG1으로 클로닝하여 플라스미드 N5KG1ㅿCH2를 생성하였다. 이 구조체는 손상되지 않은 CH3 도메인을 바로 하류 및 손상되지 않은 힌지 영역을 갖는 프레임 내에 놓는다. 이는 "텅빈" 벡터이기 때문에, 그리고 나서 CWB8 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 적절한 클로닝 부위에 삽입하였다.
면역글로불린 코딩 영역의 서열을 확인한 후, 이 발현 구조체를 CHO DG44 세포 내로 트랜스펙션하고 G418 내성에 대해 선택하였다(벡터 암호화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 주어짐). 그리고 나서 내성이 있는 세포 분리물을 HuCC49 면역글로불린 발현에 대해 분석하였다. 생성된 구조체의 서열은 도 1-3에 나타나 있다.
실시예 2
huCC49.ㅿC H 2 면역글로불린의 구조체 및 발현
National Cancer Institue사로부터 CC49 항체(ATCC No. HB 9459)의 인간화 변형체를 입수하였다. pLNCX Ⅱ HuCC49 HuK라 불리우는 플라스미드 내에서 경쇄를 암호화하였다. pLNCX Ⅱ HuCC49G1.ㅿCH2라 불리우는 플라스미드 내에서 중쇄를 암호화하였다.
PCR 증폭에 의해 이 플라스미드로부터 경쇄 및 중쇄 가변 도메인만을 분리해냈다. 이어서 제한 엔도뉴클레아제 부위가 IDEC제 발현 벡터인 N5KG1.ㅿCH2로 서브클로닝할 수 있도록 PCR 프라이머를 구성하였다.
경쇄 제한 효소는 5' 말단(NCI 플라스미드에 의해 암호화된 천연 리더(leader) 펩티드에 대한 번역 개시 코돈의 바로 상부) 및 3' 말단(IDEC사의 벡터 암호화 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 갖는 번역 판독 프레임 내)에 있는 Bgl Ⅱ였다. 경쇄 가변 도메인 내의 아미노산을 NCI 서열로부터 변화시키지 않았다.
중쇄 제한 효소는 5' 말단에 있는 Mlu였다(프레임 내에서 IDEC사의 발현 벡터에 의해 암호화된 "합성" 면역글로불린 중쇄 신호 펩티드의 아미노산 잔사 -5 및 -4-를 암호화함). PCR 프라이머는 또한 중쇄 가변 도메인의 시작에 관해 잔사 -3, -2 및 -1-을 암호화하였다. 3' 중쇄 PCR 프라이머는 IDEC사의 감마 1 도메인 고갈 중쇄 불변 영역을 갖는 프레임 내에서 코딩하는 제한 효소 Nhe 1을 암호화하였다. 최종 결과는 하기의 성분을 갖는 HuCC49 도메인 고갈 항체를 암호화하는 발현 구조체이다. 중쇄 가변 도메인 내의 아미노산을 NCI로부터 변화시키지 않았다.
경쇄: 천연 경쇄 리더-NCI 가변 도메인-IDEC사의 인간 카파 불변 도메인.
중쇄: IDEC사의 합성 중쇄 리더-NCI 가변 도메인-IDEC사의 CH2 도메인 고갈 감마 중쇄 불변 도메인.
면역글로불린 코딩 영역의 서열을 확인한 후, 이 발현 구조체를 CHO DG44 세포로 트랜스펙션하고 G418 내성에 대해 선택하였다(벡터 암호화 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 주어짐). 내성이 있는 세포 분리물을 HuCC49 면역글로불린 발현에 대해 분석하였다. huCC49.ㅿCH2 중쇄 및 경쇄에 대한 서열은 도 4 및 5에 나타나 있다.
실시예 3
C5E10.ㅿC H 2 면역글로불린의 구조체 및 발현
Iowa 주립 대학으로부터 마우스의 C5E10 발현 하이브리도마 세포를 받았다. 상기 세포로부터 RNA를 제조하고 나서 올리고 dT를 사용하여 이 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 일련의 마우스 카파 밀 중쇄 가변 영역 프라이머를 사용하여 cDNA를 PCR 증폭하엿다. PCR 생성물을 아가로스 겔 상에 유지하였다. 공지된 기술을 사용하여, 프라이머를 분리해내고 아가로스 내의 밴드(band)로 경쇄 및 중쇄를 확인하였다. 상기 밴드를 분리해내고, 제한 효소로 절단하고 실질적으로 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 경쇄 가변 영역을 Neospla N5KG1 벡터로 클로닝하였다. 그리고 나서 CH2 도메인이 없는 항체를 생성하기 위해 중쇄 가변 영역을 Neospla ㅿCH2 벡터로 클로닝하였다(또한 실질적으로 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이). 모항체의중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 도메인 고갈 구조체의 DNA 및 아미노산 서열을 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이 시퀀싱하였다. 공지된 기술을 사용하여 상기 벡터를 CHO 세포로 일렉트로포레이션(electroporation)하여 안정한 세포주 발생을 제공한다. CHO 세포가 성장하고 생성물이 발현된 후, 변형된 항체를 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한다.
실시예 4
111 In 및 90 Y 방사능표지화된 구조체
하기한 바와 같이 생체 내 생분포 및 생체이용가능성 연구를 위해, 실시예 1 내지 3으로부터의 변형된 항체 구조체 또는 실질적 동등물 및 적절한 대조구를 방사성 인듐 및 이트륨으로 표지화하였다. 상기 논의한 바와 같이, 일반적으로111In 및90Y과 같은 방사성 금속을 단백질에 직접 삽입하는 것은 효과적이지 않다. 그 자체로, 킬레이터는 일반적으로 이러한 동위원소를 항체에 연결하여 원하는 방사성 면역접합체를 제공하는 데 사용된다. 본 명세서에 기재된 연구에 대해,111In 및90Y를 삽입하기 위해 MX-DTPA 킬레이터를 사용하였다.
MAb의 2B8, 2B8.F(ab')2 및 C2B.ㅿCH2를 컨쥬게이션하기 전에, 염수를 함유하는 저금속(low metal)(0.5M 붕산을 사용하여 pH를 8.6으로 조절한 LMC-Saline) 내로 투여과(diafiltration)하였다. 미리-세척된(pre-washed) Centricon 30 필터(2회, 제조 설명서에 따라), A280(1 mg/㎖=1.7 AU)으로 측정한 Mab 농도를 사용하여Mabs를 투여과하고 LMC-Saline(pH 8.6)을 사용하여 약 10.0 mg/㎖로 희석하였다. 4:1 몰비(킬레이트 대 MAB)로 14 내지 16시간 동안 실온에서 Mab를 MX-DTPA와 반응시켰다. 배양 후, Centricon 30 필터, A280에 의해 확인된 단백질 농도를 사용하여 반응시키지 않은 킬레이트로부터 접합체를 정화하고(3회) LMC-Saline을 사용하여 최종 농도를 2.0 g/㎖로 조절한다.
항-CD20 MAbs에 대해 4:1의 몰비를 사용하는 대신 2:1의 몰비(킬레이터 대 MAb)를 사용하는 것을 제외하고는, 동일한 프로토콜에 의해 CC49 및 CC49.ㅿCH2를 MX-DTPA에 컨쥬게이션한다. CC49 및 CC49.ㅿCH2에 대한 항체 농도를 A280(1 mg/㎖=1.0)로 확인하였다.
컨쥬게이션한 후, 도메인 고갈 구조체 및 대조구 항체 및 단편을111In 및90Y으로 방사능표지화했다. 1 내지 3 mCi/mg 단백질의 특정 활성에서111In를 표지화했다. 50 mM 아세트산나트륨을 사용하여 묽은 HCl(Nycomed Amersham 또는 Cyclotron Products Inc.) 중의 염화인듐-[111]을 pH 4로 조절하였다. 면역글로불린 접합체를 첨가하고 상기 혼합물을 상온에서 배양하였다. 30분 후, 7.5% 인간 혈청 알부민(HAS) 1mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)를 함유하는 pH 7.2의 1XPBS(조성물 완충액)을 사용하여, 상기 혼합물을 0.2 mg/mL의 최종 항체 농도로 희석시켰다.
또한 상기 구조체 및 대조구도 10 내지 19 mCi/mg 단백질의 특정 활성에서90Y로 방사능표지화하였다. 50 mM 아세트산나트륨을 사용하여 묽은 HCl(Nycomed Amersham 또는 NEN Dupont사) 중의 염화인듐-[111]을 pH 4로 조절하였다. 항체 접합체를 첨가하고 상기 혼합물을 상온에서 배양하였다. 5분 후, 7.5% 인간 혈청 알부민(HAS) 1mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)를 함유하는 pH 7.2의 1XPBS(조성물 완충액)을 사용하여, 상기 혼합물을 0.2 mg/mL의 최종 항체 농도로 희석시켰다.
실시예 5
125 I 방사능표지화된 구조체의 제조
또한 하기의 생체분포 및 생체활성 연구에 사용하기 위해 실시예 1 내지 3으로부터의 구조체 및 적절한 대조구를 방사성 요오드로 표지화하였다. 보다 상세하게는, 제조사의 일반 안내서에 따라 Iodo-Beads(BioRad Industries사)를 사용하여 상기 구조체 및 대조구를 방사능표지화하였다. 하나의 Iodo-Beads를 사용하여 2 mCi의 Na125I를 pH 7.0의 100 mM 인산나트륨 중에 5분 동안 전-배양하였다(pre-incubated). 약 0.2 mg의 면역글로불린을 첨가하고 반응 혼합물을 2분 동안 배양하였다. Sephadex G-25(Pharmacia PD-10 컬럼)에서 1XPBS로 탈염하여 삽입되지 않은 요오드를 제거하였다.
실시예 6
방사능표지화된 huCC49.ㅿC H 2의 혈액 제거 속도
도 9는 마우스에서111In,90Y 및125I 표지화된 도메인 고갈 huCC49의 혈액 제거 속도를111In 또는125I 표지화된 모항체 CC49에 대해 비교한다. 실시예 1 내지 5에 기재한 바와 같이 도메인 고갈 구조체 또는 이의 실질적 동등물 및 전체 항체를 제조하였다. 정상적인 마우스 또는 LS174T BABL/c nu/nu 종양을 갖는 마우스에서 표지화된 CC49 구조체를 평가하였다. LS174T는 인간 결장암으로부터 유래된 TAG-72 양성 종양이다. 1x106의 세척된 조직 배양 세포를 마우스에 피하 주사하여 종양 이종이식편을 성립시키고 증식시킨다. 도 9에 나타난 바와 같이, 다양한 동위원소로 표지화된 모든 도메인 고갈 구조체는 종양을 갖거나 갖지 않은 마우스 둘 다에서 유사한 혈액 제거 속도를 나타냈다. 실질적으로, 주사한지 24시간 후에 표지화된 도메인 고갈 구조체의 99% 이상이 혈액으로부터 제거되었다. 상기에 심층적으로 논의한 바와 같이, 투여한 방사능표지화된 화합물의 연장된 순환 및 비특이적 증착은 상당한 골수독성을 야기할 수 있으며, 많은 경우, 실제로 투여될 수 있는 방사성접합체(radioconjugate)의 양을 제한할 수 있다. 방사성접합체의 신속히 제거하면 이러한 골수독성을 매우 감소시킬 수 있다. 따라서, 이 실시예는, 원치 않은 부작용을 감소시키고 투여될 수 있는 종양파괴성 약물의 투여량을 잠재적으로 증가시킨다는 본 발명의 이점을 생생히 나타낸다.
실시예 7
혈액 제거 속도 및 종양 국소화(localization)의 비교
마우스의 항체 2B8 및 이의 키메라 변형체 C2B8은 모두 인간의 CD20 항원과반응한다. 종양을 갖고 있는 마우스에서, 모두111In으로 표지화된 2B8, C2B8.ㅿCH2 및 2B8.F(ab')2를 사용하여 혈청 제거 및 종양 국부화의 약물동력학을 검사했다.
암컷 BALB/c nu/nu 마우스에 1x106세척된 조직 배양 세포에 피하 주사하여 다우디(Daudi) 종양(CD20 양성)을 증식시켰다. 종양 부피가 약 50 내지 100 ㎜3의 크기에 도달할 때까지, 방사능표지화된 Mabs 또는 구조체를 정맥 내 주사하였다. 다양한 구조체의 생체분포 및 종양 위치에 대해, 동물을 죽여 지정된 시간에 출혈시켰다. 이 점에 있어서, 동물로부터 종양을 제거하고, PBS로 헹구고 무게를 쟀다. 표준화된 혈액 시료를 간단히 제거하고 분석할 때까지 저장하였다. 공지된 기술을 사용하여, 감마 계수기(counter)를 사용하여 종양 및 혈액 내의 방사능을 정량하고 물리적 붕괴에 대해 보정하였다. 결과는 시점(time point) 당 세 마리 동물의 평균을 나타내며 도 10에 도시되어 있다. 보다 구체적으로, 도 10A는 손상되지 않은 C2B8에 대한 혈액 제거 및 종양 국소화 속도를 나타내고, 도 10b 및 도 10c는 각각 표지화된 F(ab')2구조체 및 도메인 고갈 변형체에 대한 동일한 측정치를 나타낸다.
곡선은111In 표지화된 C2B8.F(ab')2(도 10b) 또는 C2B8.ㅿCH2(도 10c) 구조체 중 어느 하나를 사용하여 주입한 지 24시간 후에 순환하고 있는 투입 방사능이 거의 없음을 나타낸다. 이와는 반대로, 주입한지 24시간 후에 높은 수준의111In-2B8.IgG가 혈청에 남아 있었다(도 10A). 따라서, 실질적으로 도메인 고갈 및F(ab')2 구조체의 혈액 제거 속도는 손상되지 않은 IgG 분자보다 빠르다. 보다 특별하게는, 혈액 제거 속도로부터 계산된 유효 반감기는, 손상되지 않은 2B8 IgG 분자에 대해 38시간인 것에 비해 C2B8.ㅿCH2에 대해 5.7시간이고 2B8.F(ab')2 단편에 대해서는 12.9시간이었다. 도메인 고갈 구조체에 대해 실질적으로 더 빠른 혈액 제거 속도는 골수로 전달되는 방사능 투여량을 실질적으로 감소시킬 수 있는 본 발명의 능력을 재입증한다.
역으로, 본 발명의 변형된 항체는 그 자체로 치료적 유효량의 방사능을 종양 전달하는 데에 능숙하다. 이 점에서,111In 표지화된 구조체의 종양 국소화는 또한 도 10에 나타나 있다. 도 10A에서111In-2B8.IgG는 주입한 지 24내지 48시간 후에 최대 종양 국소화를 나타냈다. 이와 대조적으로, 도 10b 및 10c에서 2B8.F(ab')2또는 C2B8.ㅿCH2 구조체는 둘 다 주입한지 6시간 후에 각각 최대 국소화를 나타냈다. 그러나, 다른 구조체에 비해 주입된 투여량/gm 비율의 상당한 감소를 나타낸 2B8.F(ab')2는 다르게, C2B8.ㅿCH2는111In-2B8을 사용하여 얻어진 양에 필적하는 종양 국소화 패턴을 나타냈다(도 10a & 10c). 이 실시예에서, 2B8.F(ab')2을 사용하여 6시간에서의 조직 gm 당 주입된 투여량 %(%ID/gm)으로 표현된 최대 종양 국소화는 6.2인 반면, 6시간에서의 도메인 고갈 변형체는 17.1%였다. 이와는 대조적으로, 6시간에서 2B8.IgG의 4%만이 종양에 국소화되었다. 2B8.IgG에 대한 가장 높은 최대 국소화는 24시간에서 19.4%였다.
따라서, 본 발명의 변형된 항체만이 상대적으로 빠른 혈액 제거와 함께 높은 종양 국소화의 바람직한 특징을 나타낸다. 보다 일반적으로, 손상되지 않은 항체는 상대적으로 높은 종양 국소화를 제공하는 것으로 보이지만(연장된 기간 후일지라도) 연장된 혈액 반감기로 인해 매우 골수독성이 있다. 역으로, F(ab')2 구조체는 상대적으로 빠른 혈액 제거를 나타내지만 극히 빈약한 종양 국소화를 나타낸다. 놀랍게도 이러한 제한들은 본 명세서에 개시된 변형된 항체에 의해 극복되는 것으로 평가될 것이다.
실시예 8
혈액 제거 속도 및 종양 국소화의 검사
혈액 제거 데이타로부터 구조체의 유효 반감기 및 골수에 대한 MRD 투여량 평가 방사능을 계산하여 하기의 표 1에 나타내었다. 면역접합체의 종양 국소화 데이타는 표 2에 나타나 있다. 보고된 투여량을 적절한 종양을 나타내는 BALB/c nu/nu 마우스(즉, 실시예 6 및 7로부터의 다우디 또는 LS174T 마우스)에 정맥 내 주사하고 미리선택된 시점에 혈액을 수집하였다.
당업자는 주입 후 1 내지 72 시간의 시점에 채취한 시료를 사용하여 조직 gm 당 퍼센트-접종 투여량으로부터 골수에 대한 MIRD(흡수된 방사능) 투여량 평가를 계산하고 표 1에 보고하는 것을 인식할 것이다.
Y2B8(IgG 및 F(ab)2)에 대한 투여량 관련 파라미터 및 정상 조직(혈액 및 적색 골수)에 대한 CH2 도메인 고갈 구조체의 비교
Mab 형태 표지 주입된투여량 유효반감기 거류(residence) 시간 MIRD 투여량인자-IgG 비
(ug) (시간) (uCi-hr/uCi) (rad/mCi)
CC49 ㅿCH2 111In 5 5.7 0.25 0.6 -3.7
CC49 ㅿCH2 111In 10 6.5 0.27 0.61 -3.7
2B8 F(ab)2 111In 10 12.9 0.31 0.71 -3.1
2B8 IgG 111In 10 38 0.97 2.2 1.0
표 1의 검사는 도메인 고갈 구조체가 상당히 더 짧은 반감기 및 따라서 골수에 대한 더 낮은 방사능 투여량을 제공함을 재확인시켜준다. 보다 구체적으로, 표 1은 F(ab')2 C2B8 구조체 및 소상되지 않은 IgG가 각각 12.9 시간 및 38시간의 반감기를 가짐을 나타낸다. 매우 대조적으로, 도메인 고갈 CC49 구조체는 동일한 투여량에서 단지 6.5시간의 반감기를 가진다(즉, 손상되지 않은 IgG의 5분의 1이다). 실질적으로, 이러한 짧은 반감기는 혈액 및 적색 골수를 원치않은 방사성 에서지에 실질적으로 더 적게 노출시킨다. MIRD 수준의 개관(본질적으로는 골수에 전달된 방사성 에너지)은 손상되지 않은 C2B8 IgG가 동일한 투여량의 도메인 고갈 CC49(즉, 2.2 rad/mCi 대 0.61 rad/mCi)에 의해 제공된 것에 비해 거의 4배의 투여량을 제공함을 나타낸다. 골수 노출에 있어서의 이러한 감소는, 암 치료를 위한 치료법의 개발에 중요한 인자인 상당히 더 적은 골수독성을 야기할 것임이 강조되어야 한다.
상기한 바와 같이, 표 2는 방사성핵종의 높은 종양 국소화를 제공한다는 본 발명의 이점을 나타내고 있다. 이러한 개선된 국소화는, 상기에 입증된 빠른 혈액 제거와 함께 특히 방사성 또는 세포독성 화합물을 종양 세포 부위에 효과적으로 투여할 수 있게 한다.
종양을 갖고 있는 누드 마우스 이종이식편에서 huCC49ㅿCH2에 대한 Y2B8[IgG 및 F(ab)2]의 비교 약량측정(종양 국소화)
Mab 형태 표지 주입된투여량 최대 종양 국소화 거류 시간 종양 투여량 인자 투여량인자-IgG 비
(ug) (%ID/gm) (uCi-hr/uCi) (rad/mCi)
CC49 ㅿCH2 125I 2 16.2% 0.92 3095 2.3
CC49 ㅿCH2 111In 5 17.8% 1.15 3637 2.7
2B8 F(ab)2 111In 10 5.5% 0.65 618 -2.1
2B8 IgG 111In 10 18.5% 0.95 1331 1.0
도 2에 나타난 바와 같이,111In-2B8;111In-huCC49.ㅿCH2 및125I-huCC49.ㅿCH2는 유사한 종양 거류 시간(각각 0.95, 1.15 및 0.92 uCi-hr/uCi)을 나타냈다. 또한111In-huCC49.ㅿCH2,125I-huCC49.ㅿCH2 및111In-2B8의 최대 국소화(각각 18.5, 16.2 및 17. 8% ID/gm)도 유사하였으나, 손상되지 않은 2B8에 대해 접종한지 24시간 후에 최대가 된 것에 비해 고갈 구조체는 주입한지 6시간 후에 최대가 되었다. 도메인 고갈 구조체의 보다 이른 국소화(111In 또는125I 표지화된 단편을 사용함)는 종양에 대한 방사능 투여에 있어 손상되지 않은 모 MAb, 2B8에 비해 약 3배(3 fold) 증가되었다(즉, 367 rad/mCi 대 1331 rad/mCi).
또한, 보다 빠른 혈액 제거 및 증가된 종양 표적화는, 도메인 고갈 구조체를 사용하여 증명된 최대 종양 국소화 또는 종양 보유 시간을 변화시키지 않고 조합약물 요법을 사용한 임상적 프로토콜에 상당한 이점을 나타낸다는 것을 강조해야 한다.
실시예 9
변형된 항체의 상승효과 특성
40마리의 무흉선(athymic) 암컷 마우스를 2x106LS174T 세포 0.2 mL로 피하 주사하였다. TAG-72+ 종양을 150 - 200 mm3의 팰러블(palable) 크기로 성장시켰다. 이 때, 마우스를 각각 10마리씩 갖는 네 개의 그룹으로 분리하였다. 네 개의 그룹을 하기와 같이 처리하였다:
1. 에토포시드 단독
2.90Y-huCC49.ㅿCH2 단독
3.90Y-huCC49.ㅿCH2 + 에토포시드
4. 희석액 대조구(PBS/DMSO).
보다 특별하게, 에토포시드 저장 용액을 DMSO 중에 100 mg/mL로 제조하였다. 그리고 나서 이를 PBS 중에 6.88 mg/mL로 희석시켰다. 그룹 1에서, 마우스에 에토포시드 1.72 mg을 주사하고, 4일에 한 번씩 반복하여 총 3회 주사하였다. 그룹 2에서, CHx-DTPA 킬레이터를 사용하여 마우스에90Y-huCC49.ㅿCH2 0.05 mCi를 주사하여 방사성동위원소를 부착하였다. 그룹 3에서, 동일한 방사능표지화된 변형 항체 0.05mCi 및 에토포시드 1.72 mg을 마우스에 주사한 후 에토포시드 1.72 mg을 두 번 더 주사하였다. 대조구 마우스(4)에 PBS/DMSO(DMSO 농도 6.9%D로)를 4일에 한 번씩 반복하여 총 3회 주사하였다. 일주일에 2회 또는 3회 종양을 측정하고 이를 도 11에 도시하였다.
도 11은, 상기 약제 둘 중 하나를 단독으로 사용하는 것보다 도메인 고갈 방사능표지화된 CC49 항체와 에토포시드의 조합물이 종양 크기의 성장을 지연시킴을 나타낸다. 이러한 상승효과의 결과는 특히 상기 약제의 조합 사용을 통해,90Y-huCC49.ㅿCH2 또는 에토포시드 처리된 마우스 중 하나에 비해 종양 존재량이 반으로 감소되는 25일째에 명백히 나타난다.
또한 당업자는 본 발명이 이의 정신 및 중심적인 특성을 벗어나지 않고 다른 특정 형태로도 구체화될 수 있음을 이해할 것이다. 상기의 기재 내용은 본 발명을 단지 이의 실시형태로 개시하는 것이며, 이는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 상세히 기재된 특정 실시형태에 제한되는 것이 아니다. 또한, 본 발명의 범위 및 내용에 대해 첨부된 특허청구범위를 참조한다.

Claims (60)

  1. 도 4a에 개시된 바와 같은 아미노산서열을 실질적으로 가지는 중쇄를 포함하는, TAG-72와 반응하는 도메인결실 CC49 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 세포독성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인결실 CC49 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포독성제가 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 도메인결실 CC49 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이131I와90Y로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 도메인결실 CC49 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y인 것을 특징으로 하는 도메인결실 CC49 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 아미노산 스페이서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인결실 CC49 항체.
  7. 하나 이상의 이작용성 킬레이터에 공유결합된 도 4a에 개시된 바와 같은 중쇄 아미노산서열을 실질적으로 가지는 도메인결실 CC49 항체를 포함하고, 상기 하나 이상의 이작용성 킬레이터는90Y와 결합된 것을 특징으로 하는 종양질환 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 이작용성 킬레이터가 MX-DTPA 및 CHX-DTPA로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 도 1b에 개시된 바와 같은 아미노산서열을 실질적으로 가지는 중쇄를 포함하는, CD20과 반응하는 도메인결실 C2B8항체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체가 세포독성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인결실 C2B8항체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포독성제가 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 도메인결실 C2B8항체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이131I와90Y로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 도메인결실 C2B8항체.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y인 것을 특징으로 하는 도메인결실 C2B8항체.
  14. 이미지화제와 결합되고 종양결합항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 변형된 항체를 환자에게 투여하는 단계; 및
    상기 환자가 종양을 나타내도록 이미지화하는 단계를 포함하여 이루어지는, 필요로 하는 환자에서 종양결합항원을 포함하는 종양을 이미지화하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 이미지화제가 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이 이작용성 킬레이터를 통해 변형된 항체와 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이131I와90Y로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 치료적 유효량의 변형된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 종양질환에 걸린 골수억제된 환자의 치료방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 도메인 결실 항체를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 도메인결실 항체가 CH2 도메인이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 도메인결실 항체가 아미노산 스페이서를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 종양결합항원과 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6, HPV E7, TAG-72, CEA, L6-항원, CD19, CD20, CD22, CD37, HLA-DR, EGF 수용체 및 HER2 수용체로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 CD20을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 TAG-72를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제17항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 세포독성제와 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 세포독성제가 방사성 핵종을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y,125I,131I,123I,111In,105Rh,153Sm,67Cu,67Ga,166Ho,177Lu,186Re 및188Re로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제18항에 있어서,
    상기 종양질환이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제18항에 있어서,
    상기 골수억제된 환자가 약 1500/㎣ 이하의 ANC를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 골수억제된 환자가 약 1000/㎣ 이하의 백혈구수를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 치료적 유효량의 하나 이상의 화학요법제를 환자에게 투여하는 단계; 및
    치료적 유효량의 하나 이상의 변형된 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 화학요법제와 상기 변형된 항체는 임의의 순서 또는 동시에 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 종양질환을 나타내는 환자의 치료방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 도메인결실 항체를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 도메인결실항체가 CH2 도메인이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 도메인결실 항체가 스페이서를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 종양결합항원과 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6, HPV E7, TAG-72, CEA, L6-항원, CD19, CD20, CD22, CD37, HLA-DR, EGF 수용체 및 HER2 수용체로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 CD20을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 종양결합항원이 TAG-72를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제33항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 세포독성제와 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 세포독성제가 방사성 핵종을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y,125I,131I,123I,111In,105Rh,153Sm,67Cu,67Ga,166Ho,177Lu,186Re 및188Re로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 방사성 핵종이90Y를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제33항에 있어서,
    상기 종양질환이 혈액종양인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제33항에 있어서,
    상기 골수억제된 환자가 약 1500/㎣ 이하의 ANC를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제33항에 있어서,
    상기 골수억제된 환자가 약 1000/㎣ 이하의 백혈구수를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제33항에 있어서,
    상기 화학요법제가 상기 변형된 항체 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 상기 화학요법제의 1개월 내에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48항에 있어서,
    상기 변형된 항체가 상기 화학요법제의 2주 내에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법,
  51. 치료적 유효량의 변형된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 현재 화학요법 과정에 있는 환자의 종양질환 치료방법.
  52. 치료적 유효량의 변형된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 혈액종양 환자의 치료방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 변형된 항체는 도메인결실 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 도메인결실항체를 CH2 도메인이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 도메인결실 항체는 CD20과 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 도메인결실 항체가 도 1b에 개시된 바와 같은 아미노산서열을 실질적으로 가지는 중쇄를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 혈액종양은 비호지킨 림프종을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 치료적 유효량의 변형된 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지,는 종양질환을 나타내는 재발환자의 치료방법.
  59. 치료적 유효량의 huCC49.ΔCH2를 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 결장암환자의 치료방법.
  60. 치료적 유효량의 C2H8.ΔCH2를 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 혈액악성종양환자의 치료방법.
KR10-2003-7010029A 2001-01-29 2002-01-29 변형된 항체 및 사용 방법 KR20030091978A (ko)

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