EA013327B1 - Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств - Google Patents

Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств Download PDF

Info

Publication number
EA013327B1
EA013327B1 EA200800657A EA200800657A EA013327B1 EA 013327 B1 EA013327 B1 EA 013327B1 EA 200800657 A EA200800657 A EA 200800657A EA 200800657 A EA200800657 A EA 200800657A EA 013327 B1 EA013327 B1 EA 013327B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
chromatography
mixture
cytotoxic agent
antibodies
Prior art date
Application number
EA200800657A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800657A1 (ru
Inventor
Юн Дай
Юн ВАН
Шэнцзинь Цзинь
Дебора Х. Мешулам
Годфри В. Эмфлетт
Original Assignee
Иммуноджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37666423&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA013327(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Иммуноджен, Инк. filed Critical Иммуноджен, Инк.
Publication of EA200800657A1 publication Critical patent/EA200800657A1/ru
Publication of EA013327B1 publication Critical patent/EA013327B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения связывающегося с клетками агента, химически связанного с лекарственным средством. Способ включает ковалентное присоединение линкера к связывающемуся с клетками агенту, стадию очистки, конъюгацию лекарственного средства со связывающимся с клетками агентом и последующую стадию очистки.

Description

Изобретение относится к способу приготовления конъюгатов высокой чистоты и стабильности, где конъюгаты представляют собой связывающий клетки агент, химически присоединенный к лекарственному средству.
Уровень техники изобретения
Методы лечения рака быстро прогрессируют с появлением фармацевтических препаратов, которые более эффективно уничтожают раковые клетки. Так, поверхностные клеточные рецепторы и антигены, избирательно экспрессируемые раковыми клетками, были использованы для создания лекарственных средств на основе антител, которые связывают опухолеспецифичные или опухолеассоциированные антигены. Для этого цитотоксичные молекулы, такие как бактериальные и растительные токсины, радионуклиды и некоторые химиотерапевтические лекарственные средства, были химически сшиты с моноклональными антителами, которые способны связывать опухолеспецифичные или опухолеассоциированные антигены (см., например, международные заявки на патенты XVО 00/02587, 02/060955 и 02/092127, патенты США 5475092, 6340701 и 6171586, публикацию заявки на патент США № 2003/0004210 А1 и СНеНе с1 а1., 1. 1ттипо1. МеШойз, 112: 267-277 (1988)). Такие соединения обычно называют конъюгатами токсинов, радионуклидов и лекарственных средств соответственно. Часто они называются также иммуноконъюгатами, радиоиммуноконъюгатами и иммунотоксинами. При связывании лекарственного конъюгата с опухолевой клеткой и последующем высвобождении или/и активации цитотоксической активности лекарственного средства клетка погибает. Такие конъюгаты позволяют селективно воздействовать на опухолевые клетки, что сводит к минимуму токсичность лекарственного средства для нормальных клеток, тем самым улучшая переносимость лекарственного средства пациентом.
Способы конъюгации антител с сульфгидрилсодержащими цитотоксичными агентами, такими как майтансиноиды, были ранее описаны (см., например, патенты США 5208020, 5416064 и 6441163). Например, в патентах США 5208020 и 5416064 сообщается о процессе приготовления конъюгата антителомайтансиноид, в котором антитело вначале модифицируется гетеробифункциональным реагентом, как описано в патентах США 4149003, 4563304 и публикации заявки на патент США № 2004/0241174 А1. В патентах США 5208020 и 5416064 далее описана конъюгация модифицированных антител с избытком сульфгидрилсодержащего цитотоксичного агента при рН 7, с дальнейшей очисткой на хроматографической колонке 8ерНайех С25. Очистка конъюгата антитело-лекарственное средство путем гельпроникающей хроматографии (ГПХ) также описана ранее (см., например, Ыи е1 а1., Ргос. №111. Асай. 8с1. (И8А), 93: 8618-8623 (1996) и Сйап е1 а1., Сапсег Кезеагсй, 52: 127-131 (1992)).
Способы приготовления конъюгата антитело-лекарственное средство, описанные ранее, сложны, поскольку содержат стадии, сложные для получения или приготовления иммуноконъюгатов, причем последние удается получить менее чистыми и менее стабильными, чем было бы желательно. Например, рН 6,0-6,5 не является оптимальным при проведении конъюгации для получения чистого и стабильного продукта. Кроме того, реакции, в которые вступают конъюгаты, протекают в этих условиях, в общем, медленно и неэффективно, что требует дополнительного расхода времени и материалов.
Было бы желательно модифицировать способ или исключить одну или более стадий приготовления без потерь качества продукта, таких как чистота и/или стабильность. Далее было бы желательно иметь дополнительные возможности очистки продукта, кроме тех, что уже предложены, поскольку с определенными комбинациями связывающих клетки реагентов, линкеров и лекарств будут эффективны различные методы.
Принимая во внимание вышеизложенное, в данной области существует необходимость в разработке улучшенных способов приготовления конъюгатов, связывающих с клетками агент-лекарственное средство, которые имели бы высокую чистоту и в то же время высокую стабильность. Данное изобретение предоставляет такую возможность. Эти и другие преимущества изобретения, равно как и дополнительные характеристики изобретения будут очевидны из описания изобретения, приводимого ниже.
Краткая сущность изобретения
Изобретение обеспечивает способ получения конъюгата высокой чистоты и стабильности, содержащего химически сшитые с лекарственным средством связывающиеся с клетками агенты. Способ включает приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:
(a) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;
(b) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением, адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры; (с) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (й) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбци
- 1 013327 онного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси.
В ещё одном варианте изобретение обеспечивает способ приготовления конъюгата антителоцитотоксический агент, включающий следующие стадии: (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (Ь) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, образованные на стадии (Ь), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (с) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом; при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии.
Подробное описание изобретения
Изобретение предоставляет собой способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент высокой чистоты и стабильности. Благодаря высокой чистоте и стабильности конъюгатов такие соединения могут быть использованы для лечения заболеваний. Составы, включающие связывающийся с клетками агент, такой как антитело, химически присоединенный к лекарственному средству, такому как майтансиноид, описаны, например, в публикации заявки на патент США № 2004/0241174 А1. В данном случае считается, что препарат обладает высокой чистотой, если (а) более 90%, а лучше более 95% частиц конъюгата присутствуют в виде мономеров и/или (Ь) количество свободного лекарственного средства в препарате конъюгата менее 2% (относительно общего количества лекарственного средства).
Таким образом, способ по изобретению включает (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (Ь) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением, адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры; (с) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (б) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси.
В ещё одном варианте способ по изобретению включает (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (Ь) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, образованные на стадии (Ь), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (с) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом; при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии.
На стадиях очистки предпочтительно использовать тангенциальную проточную фильтрацию (ТПФ, также известную как перекрестная проточная фильтрация, ультрафильтрация и диафильтрация) и/или смолы для адсорбционной хроматографии. Однако, если на первой стадии очистки (стадия Ь) используется ТПФ, то на стадии (с) конъюгацию проводят при рН 6,0-6,5, и смола для адсорбционной хроматографии используется на второй стадии очистки (стадия б), предпочтительно использовать неионобмен
- 2 013327 ную смолу для адсорбционной хроматографии. В других вариантах осуществления изобретения на каждой стадии очистки используется ТПФ или смолы для адсорбционной хроматографии. Возможно использование смолы для адсорбционной хроматографии на первой стадии очистки и ТПФ на второй стадии. Также на первой и второй стадиях возможно использование комбинации ТПФ и смолы для адсорбционной хроматографии.
Может быть использована любая подходящая система ТПФ, например система типа РеШеои (М1Шроге, ВШепса, МА), система 8аг!осоп Саккебе (8аг1опик АС., Ебде^ооб, ΝΥ), и система типа Сепбакебе (Ра11 Согр., Еак1 НШк, ΝΥ).
Может быть использована любая подходящая адсорбционная хроматография. Предпочтительно использовать гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (НС1С), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (Н1С), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла (1МАС), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и их комбинацию. Примеры подходящих гидроксиапатитных смол: керамический гидроксиапатит (СНТ Туре I апб Туре II, Вю-Раб 1аЬога!обек, Негси1ек, СА), НА И1боде1 бубгох1араб!е (Ра11 Согр., Бак! Н111к, ΝΥ), керамический фторапатит (СРТ Туре I апб Туре II, Вю-Раб 1аЬога!обек, Негси1ек, СА). Примером подходящей НОС смолы является МЕР Нурегсе1 (Ра11 Согр., Еак! НШк, ΝΥ). Примеры подходящих ШС смол включают бутилсефарозу, гексилсефарозу, фенилсефарозу и октилсефарозу (все от СЕ Неаббсаге, Р1кса!а^ау, N1), а также смолы макро-преп-метил и макро-преп-трет-бутил (ВюРаб ЬаЬогайопек, Негси1ек, СА). Примерами подходящих ионообменных смол являются смолы 8Р-сефароза, СМ-сефароза, Р-сефароза (все от СЕ Неаббсаге, Р1кса!а^ау, N1) и смола Ипокрбеге 8 (ВюРаб ЬаЬогайопек, Негси1ек, СА). Примеры подходящих смол смешанного типа включают смолу ВакегЬопб АВх (ЙТ Вакег, РЫШркЬигд, №). Примеры подходящих [МАС смол включают хелатированную смолу сефарозу (СЕ Неаббсаге, Р1кса!а^ау, Щ) и смолу Ргойийу ШАС (ВюРаб ЬаЬогаЮпек, Негси1ек, СА). Примеры подходящих смол для лиганда красителя включают сефарозу В1ие (СЕ Неаббсаге, Р1кса!а^ау, №) и аффигель В1ие (ВюРаб ЬаЬогаЮпек, Негси1ек, СА). Примеры подходящих смол для аффинной хроматографии включают А-белок сефарозу (например, МаЬ8е1ес!, СЕ Неаббсаге, Рбсайа^ау, ΝΤ), где связывающим клетки агентом является антитело, и лектин-аффинные смолы, например Ьепб1 Ьесбп сефароза (СЕ Неаббсаге, Р1кса1агау, N1), в которых связывающий клетки агент содержит подходящие сайты связывания лектина. Возможно также использование антител, специфичных к связывающему клетки агенту. Такие антитела могут быть иммобилизованы, например, на 8ербагоке 4 Еак! Е1о\г смоле (СЕ Неаббсаге, Р1кса!а^ау, N4). Примеры подходящих сорбентов для хроматографии с обращенной фазой включают смолы С4, С8 и С18 (Сгасе Уубас, Некрепа, СА).
В соответствии со способом по изобретению первая смесь включает антитела, несущие присоединенные к ним линкеры, а также исходные реагенты и побочные продукты. Отделение модифицированного антитела от других реагентов и побочных продуктов реакции производится путем проведения очистки первой смеси. На этой стадии первая смесь может быть очищена с использованием тангенциального проточного фильтрования (ТПФ), например мембранного тангенциального проточного фильтрования, адсорбционной хроматографии, адсорбционного фильтрования или селективного осаждения, или любого другого подходящего способа очистки, равно как и комбинации таковых. Данная первая стадия очистки позволяет получить очищенную первую смесь, т. е. увеличить концентрацию антитела, несущего связанные с ним линкеры, и снизить концентрацию непрореагировавшего бифункционального сшивающего агента в сравнении с содержанием их в первой смеси до очистки в соответствии с изобретением.
После очистки первой смеси с целью получения очищенной первой смеси антител, несущих связанные с ними линкеры, лекарственное средство, представляющее собой цитотоксический агент, конъюгируют антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой очищенной смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ним линкеры, с лекарственным средством в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5, с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное с цитотоксическим агентом через линкеры, (б) свободное лекарственное средство и (ίίί) побочные продукты реакции. Процесс конъюгации проводится при рН от примерно 4 до примерно 9, реакцию лучше проводить при рН примерно 6 или ниже, либо при рН примерно 6,5 или выше, наиболее предпочтительно при рН от примерно 4 до примерно 6 или от примерно 6,5 до примерно 9 и особенно при значениях рН от 4 до менее чем 6 или от свыше 6,5 до 9. Пока стадия конъюгации проводится при рН 6,5 или выше, некоторые сульфгидрилсодержащие лекарственные средства могут подвергаться димеризации с образованием дисульфидных связей. Для эффективного проведения реакции в этих условиях может потребоваться удаление следов металла и/или кислорода из реакционной смеси, а также необязательно дополнительное введение в реакцию антиоксидантов или использование линкеров с более реакционноспособными уходящими группами, или добавление лекарственного средства в количестве более одной аликвоты.
Необязательно стадия очистки модифицированного антитела может быть опущена. В таком случае лекарственное средство, представляющее собой цитотоксический агент, может быть добавлено одновременно со сшивающим реагентом или несколько позже, например 1, 2, 3 или более часов спустя, после добавления сшивающего реагента к антителу.
- 3 013327
Способ по изобретению может необязательно включать добавление сахарозы на стадии конъюгации, использованной в данном методе для повышения растворимости и выхода конъюгатов лекарственного средства с атителом. Желательно добавлять сахарозу в количестве от примерно 0,1 до примерно 20% (вес./об.) (например, примерно 0,1, 1, 5, 10, 15 или 20% (вес./об.)). Предпочтительно вводить сахарозу в концентрациях от примерно 1 до примерно 10% (вес./об.) (например, примерно 2, примерно 4, примерно 6 или примерно 8% вес./об.). Кроме того, реакция конъюгирования может включать добавление буферного агента. Может быть введен любой известный подходящий буферный агент. Такими агентами, например, являются цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер.
После конъюгации вторая смесь подвергается очистке. В данном случае вторая смесь может быть очищена с использованием тангенциального проточного фильтрования (ТПФ), например мембранного тангенциального проточного фильтрования, адсорбционной хроматографии, абсорбционного фильтрования, селективного осаждения или любого другого подходящего процесса очистки, равно как и комбинации таковых. После второй стадии очистки получается очищенная вторая смесь, то есть связывающийся с клетками агент, химически связанный через линкер с лекарственным средством, в более высокой концентрации и остальные компоненты второй смеси в более низкой концентрации в сравнении с содержанием их во второй смеси до очистки в соответствии с изобретением.
Термин «антитело», используемый в данном описании, обозначает любой иммуноглобулин, любой фрагмент иммуноглобулина, такой как РаЬ, Р(аЬ')2, άδΡν, κΡν, диатела, триатела или химерные иммуноглобулины, которые могут связываться с антигеном на поверхности клетки (например, содержащие гипервариабельный участок (СЭЯ)). В качестве связывающегося с клетками агента могут быть использованы любые подходящие антитела. Выбор антител зависит от типа популяции целевых клеток. В этом отношении, тип и количество молекул на поверхности клетки, селективно экспрессируемых конкретной клеточной популяцией (т.е. антигенов) - обычно и предпочтительнее пораженной клеточной популяцией будет определять выбор подходящего антитела для использования в настоящем изобретении. Профиль экспрессии на поверхность клеток известен для широкого круга типов клеток, включая раковые клетки, или, если он не известен, то может быть определен с использованием обычных методов молекулярной биологии и гистохимии.
Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, но предпочтительно использовать моноклональные антитела. Как используется в настоящем описании, под термином «поликлональные» антитела понимаются гетерогенные популяции молекул антител, обычно содержащиеся в сыворотке иммунизированных животных. Термин «моноклональные» антитела относится к гомогенной популяции молекул антител, специфичной к конкретному антигену. Моноклональные антитела обычно продуцируются единственным клоном В-лимфоцитов («В-клеток»). Моноклональные антитела могут быть получены с использованием различных методик, включая стандартную гибридомную технологию (см., например, КбЫег аиб Μίΐδίοίη. Еиг. 1. 1ттипо1., 5: 511-519 (1976), Η;πΊο\ν аиб Ьапе (ебк.), ЛпОЬоб1С5: А ЬаЬога1огу Маииа1, С8Н Ргекк (1988) и С.А. 1апе\уау е1 а1. (ебк.), 1ттииоЬю1оду, 54Ь Еб., Саг1аиб РиЬИкЫид, №\ν Уогк, ΝΥ (2001)). Вкратце, стандартный гибридомный метод получения моноклональных антител обычно включает инъекцию любого подходящего животного, обычно и более предпочтительно мыши, антигеном (т.е. «иммуногеном»). Затем животное умерщвляют, и В-клетки, выделенные из его селезенки, смешивают с клетками человеческой миеломы. Полученные гибридные клетки (т.е. «гибридома»), которые пролиферируют неограниченно и непрерывно секретируют высокий титр антител с желаемой специфичностью ίη νίΙΐΌ. Для идентификации клеток гибридомы, продуцирующих антитела требуемой специфичности, может быть использован любой подходящий метод, известный в данной области. Например, такими методами могут являться твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), анализ с помощью вестерн-блота и радиоиммунологический анализ. Популяция гибридом скринируется для изоляции индивидуальных клонов, каждый из которых секретирует единственный тип антител к данному антигену. Поскольку каждая гибридома является производным единственной В-клетки, все получаемые молекулы антител идентичны по структуре, включая изотип и сайт связывания антигена. Моноклональные антитела также могут быть получены с использованием другого подходящего метода, включая метод ЕВУ-гибридом (см., например, Наккагб аиб Агсйег, 1. 1ттиио1. Ме1йобк, 74(2): 361-67 (1984) и Яобег е1 а1., Мебюбк Ен/утоЕ 121: 140-67 (1986)), системы экспрессии на основе бактериофагов (см., например, Нике е1 а1., 8с1еисе, 246: 1275-81 (1989)) или библиотеки фаговых дисплеев, включающие фрагменты антител, такие как РаЬ и 8сΡν (одноцепочечный вариабельный участок) (см., например, патент США 5885793 и 5969108 и международные патентные заявки \ЕО 92/01047 и 99/06587).
Моноклональные антитела могут быть выделены или продуцированы в организме любого подходящего животного, но предпочтительно получать их в организме млекопитающих, предпочтительно мыши или человека, а наиболее предпочтительно человека. Методы получения антител в организме мыши хорошо известны и описаны в настоящем описании. Что касается человеческих антител, в данной области известно, что поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки, полученной из человеческого организма, вакцинированного или иммунизированного соответствующим антигеном. Другой метод позволяет получить человеческие антитела с применением известных методов продукции человеческих антител в нечеловеческих организмах, например в мыши (см., например, патенты США
- 4 013327
5545806, 5569825 и 5714352 и публикацию заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Человеческие антитела и особенно человеческие моноклональные антитела обычно получить сложнее, чем мышиные моноклональные антитела, хотя они являются идеальным объектом для терапевтического применения на людях. Мышиные моноклональные антитела, однако, будучи введены человеку, вызывают быстрый иммунный ответ у хозяина, что может снижать терапевтический и диагностический потенциал конъюгата антитело-лекарственное средство. Чтобы избежать вышеуказанного осложнения, использовались те моноклональные антитела, которые обычно не воспринимаются как «чужие» иммунной системой человека.
С этой точки зрения для производства антител может быть использован фаговый дисплей. В данном случае фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены молекулы иммуноглобулина, могут быть получены стандартными молекулярно-биологическими методами и методами рекомбинантных ДНК (см., например, 8ашЬтоок е! а1., (ебк.), Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота!огу Мапиа1, 3б Ебйюп, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота!огу Ргекк, Ыете Уогк (2001)). Фаги, кодирующие вариабельный участок желаемой специфичности, выбираются для специфического связывания желаемого антигена, и воспроизводится полная молекула человеческого иммуноглобулина, включающая выбранный вариабельный фрагмент. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая выбранное антитело, вводится в подходящую клеточную линию, такую как клетки миеломы, используемые для продукции гибридом, так что клеткой секретируются человеческие антитела, имеющие свойства моноклональных антител (см., например, 1апетеау е! а1. выше, Нике е! а1. выше и патент США 6265150). Возможно также получение молоклональных антител из мышей, трансгенных по специфическим человеческим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такой метод известен и описан, например, в патентах США 5545806 и 5569825 и 1аиетеау е! а1. выше.
Более предпочтительно использовать гуманизированные антитела. В настоящем описании использованы «гуманизированные» антитела, в которых гипервариабельные участки (СЭЯ) мышиных моноклональных антител, которые образуют антигенсвязывающую петлю антитела, встроены в структуру молекулы человеческого иммуноглобулина. Благодаря сходству мышиных и человеческих иммуноглобулинов, в общем, считается, что этот подход позволяет получить моноклональные антитела, которые антигенно идентичны человеческим иммуноглобулинам, но связывают тот же антиген, что и мышиные антитела, из которых были получены последовательности СОЯ. Методы получения гуманизированных антител хорошо известны и детально описаны в 1апетеау е! а1. выше, патентах США 5225539, 5585089 и 5693761. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием метода восстановления антител, описанного в патенте США 5639641 и Ребегкеп е! а1., 1. Мо1. Вю1., 235: 959-973 (1994). Если антитела, использованные в конъюгате патентоспособной композиции, предпочтительно являются гуманизированными моноклональными, вышеописанные человеческие и мышиные моноклональные антитела также находятся в рамках изобретения.
Фрагменты антител, имеющие по крайней мере один антигенсвязывающий сайт и, следовательно, узнающие по крайней мере один антиген или рецептор, присутствующий на поверхности целевой клетки, также находятся в рамках изобретения. В этом отношении, протеолитическое расщепление интактной молекулы иммуноглобулина может приводить к получению ряда фрагментов, каждый из которых сохраняет способность узнавать и связывать антиген. Например, ограниченный гидролиз молекулы иммуноглобулина под действием протеазы папаина обычно ведет к образованию трех фрагментов, два из которых идентичны и относятся к ЕаЬ фрагментам, поскольку они сохраняют способность связывать антиген, присущую исходной молекуле иммуноглобулина. Расщепление иммуноглобулина ферментом трипсином обычно приводит к образованию двух фрагментов антитела, один из которых содержит обе антигенсвязывающие области исходной молекулы, и потому относится к Е(аЬ')2 фрагменту. Восстановление Е(аЬ')2 фрагмента дитиотреитолом или меркаптоэтиламином приводит к образованию фрагмента, являющегося ЕаЬ' фрагментом. Фрагмент κΕν, являющийся частью одноцепочечного вариабельного участка, который состоит из усеченного ЕаЬ фрагмента, включающего вариабельный (V) домен тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, связанного с V доменом легкой цепи через синтетический пептид, может быть получен использованием стандартной технологии рекомбинантной ДНК (см., например, 1апетеау е! а1. выше). Сходно, дисульфидно-стабилизированные фрагменты вариабельного участка (6κΕν) могут быть получены с применением метода рекомбинантных ДНК (см., например, Яейет е! а1., Рто!еш Епдшеетшд, 7: 697704 (1994)). В контексте данного изобретения, однако, фрагменты иммуноглобулинов не ограничиваются описанными типами фрагментов молекул. В данном случае может быть использован любой подходящий фрагмент молекулы иммуноглобулина, который узнается и связывается с желаемым рецептором на поверхности клетки. Далее фрагменты антител описаны, например, в Ратйаш., 1. 1шшипо1., 131: 2895-2902 (1983), 8ртшд е! а1., 1. 1шшипо1., 113: 470-478 (1974) и МкопоГГ е! а1., Атсй. Вюсйеш. Вюрйук., 89: 230-244 (1960). Связывание антитело-антиген может быть детектировано с использованием любого подходящего метода, известного в данной области, например радиоиммунологического анализа (Я1А), ЕЫ8А, вестернблота, иммунопреципитации и метода конкурентного ингибирования (см., например, 1апетеау е! а1. выше, публикацию заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Помимо этого, антитело может представлять собой химерную молекулу иммуноглобулина или ан
- 5 013327 тигенсвязывающего фрагмента. Понятие «химерный» в данном случае означает, что молекула иммуноглобулина состоит по крайней мере из двух различных молекул иммуноглобулинов или их фрагментов, полученных или выделенных из по крайней мере двух различных видов животных (два разных иммуноглобулина, например вариабельный фрагмент молекулы человеческого иммуноглобулина и константный фрагмент мышиного). Антитело также может являться доменспецифичным антителом (бАЬ) или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как, например, верблюжьи антитела (см., например, ЬектуЗег е! а1., №1игс 8!тис!. ΒίοΙ. 3: 752 (1996)) или антитела акулы, такие как, например, новый антигенный рецептор (1дЫАК.) (см., например, СтеепЬетд е! а1., Ыа1иге, 374: 168 (1995), 81апйе1б е! а1., 8с1епсе, 305: 17701773 (2004)).
Любое подходящее антитело может быть использовано в контексте изобретения. Например, моноклональные антитела 15 являются мышиными антителами 1дС2а, которые специфичны к антигенному маркеру острого лимфобластного лейкоза (САЬЬА) (ΡίΙζ е! а1., ЫаШге, 283: 583-585 (1980)) и могут быть использованы с целевыми клетками, экспрессирующими САЬЬА (например, клетки острой лимфобластной лейкемии).
Моноклональные антитела ΜΥ9 являются мышиными 1дС1 антителами, которые специфично связывают ΟΌ33 антиген (СпГПп е! а1., Ьеикет1а Век., 8: 521 (1984)), и могут быть использованы с целевыми клетками, которые экспрессируют ΟΌ33 (например, клетки острой миелогенной лейкемии (АМЬ)).
Аналогично, моноклональные антитела анти-В4 (также называемые В4) являются мышиными 1дС1 антителами, которые связываются с 0Ό19 рецептором на В-клетках (Ыаб1ет е! а1., 1. 1ттипо1., 131: 244250 (1983)) и могут быть использованы для работы с В клетками или клетками, которые экспрессируют 0Ό19 (например, клетки лимфомы не-Ходжкина или хронической лимфобластной лейкемии). N901 мышиные моноклональные антитела, которые связывают ΟΌ56 (молекула адгезии нейронных клеток) антиген, найденный на поверхности клеток нейроэндокринного происхождения, включая мелкоклеточную опухоль легких, который может быть использован для направления конъюгата целевых лекарственных средств к клеткам нейроэндокринного происхождения. 15, Му9 и В4 антитела предпочтительно восстанавливают поврежденную поверхность или гуманизируются прежде, чем входят в состав конъюгата. Восстановление и изменение антител описаны, например, в Водикка е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск, И8А, 91: 969-73 (1994).
Кроме того, моноклональное антитело С242 связывается с СапАд антигеном (см., например, патент США 5552293) и может быть использовано для направления конъюгата на СапАд экспрессирующие опухоли. Такими являются колоректальная, панкреатическая, немелкоклеточная карцинома легкого и гастральные раковые опухоли. НиС242 является гуманизированной формой моноклонального антитела С242 (см., например, патент США 5552293). Гибридома, из которой образуются НиС242, зарегистрирована в ЕСАСС под идентификационным номером 90012601. НиС242 могут быть получены с использованием технологии СЭВ-привития (см. патент США 5585089, 5593761 и 5693762) или технологии восстановления поврежденной поверхности (см., например, патент США 5639641). НиС242 могут быть использованы для направления конъюгата к опухолевым клеткам, экспрессирующим СапАд антиген, таким как, например, колоректальная, панкреатическая, немелкоклеточная карцинома легкого и гастральные раковые клетки.
Анти-МиС1 антитела могут быть использованы при работе с клетками опухолей яичников и простаты в качестве связывающего клетки агента в составе конъюгата. Анти-МиС1 антитела включают, например, анти-НМЕС-2 (см., например, Тау1от-Рараб1т1!тюи е! а1., 1п!. 1. Сапсег, 28: 17-21 (1981)), 11СТМ01 (см., например, Уап НоГ е! а1., Сапсег Век., 56: 5179-5185 (1996)) и Ό86. Раковые клетки простаты также могут быть атакованы конъюгатом антипростатспецифичного мембранного антигена (Р8МА) как агента, связывающего клетки, такие как 1591 (см., например, Ьш е! а1., Сапсег Век., 57: 3629-3634 (1997)). Кроме того, раковые клетки, экспрессирующие Нег2 антиген, такие как рак молочной железы, простаты и яичников, могут быть атакованы антителами трастузумаба. Анти-ЮЕ-1В антитела, которые связывают рецептор инсулинподобного фактора роста, также могут быть использованы для создания конъюгата.
Особенно предпочтительными антителами являются гуманизированные моноклональные антитела, примерами которых являются 1110901, НиМу9-6, 1иВ4, 1иС242, трастузумаб, биватузумаб, сибротузумаб, ритуксимаб (см., например, патенты США 5639641 и 5665357, предварительную заявку на патент США 60/424332 (которая связана с публикацией заявки на патент США № 2005/0118183 А1), международную заявку на патент \УО 02/16401, Ребегкеп е! а1. выше, Водикка е! а1. выше, Ьш е! а1. выше, №б1ег е! а1. выше, Со1отег е! а1., Сапсег 1пуек!., 19: 49-56 (2001), Не1бег е! а1., Еиг. 1. Сапсег, 31А: 2385-2391 (1995), №е1! е! а1., 1. С1ш. Опсо1., 12: 1193-1203 (1994) и Ма1опеу е! а1., В1ооб, 90: 2188-2195 (1997)). Наиболее предпочтительно использование гуманизированных моноклональных антител 111.0901 или 1иМу9-6. Другие предпочтительные антитела включают С№ТО95, ЬиО86, 1шВ4 и 1шС242. Другие гуманизированные моноклональные антитела также известны в рамках изобретения и могут быть использованы в связи с изобретением.
Хотя связывающимся с клетками агентом предпочтительно является иммуноглобулин, неиммуноглобулины также могут быть использованы. Подходящими молекулами-неиммуноглобулинами являются, например, интерфероны (например, альфа-, бета- или гамма-интерферон), лимфокины (например, интер
- 6 013327 лейкин-2 (1Ь-2, 1Ь-3, 1Й-4 или 1Ь-6), гормоны (например, инсулин), факторы роста (например, ЕСЕ, ТСЕ-α, ЕСЕ и УЕСЕ). колониестимулирующие факторы (например, С-С8Е, М-С8Е, СМ-С8Е (см., например, Вигдезз, 1ттипо1оду Тобау, 5: 155-158, 1984)), соматостатин и трансферрин (см., например, О'КееГе е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 260: 932-937 (1985)). Например, СЕ-С8Е, который связывается миелоидными клетками, может быть использован как связывающийся с клетками агент при атаке клеток острой миелогенной лейкемии. Кроме того, 1Ь-2, который связывается с активированными Т-клетками, может быть использован для предотвращения отторжения трансплантата для терапии и профилактики заболеваний «трансплантатпротив-хозяина» и для лечения острой Т-клеточной лейкемии. Эпидермальный фактор роста (ЕЕС) может быть применен для атаки сквамозных клеток, таких как при раке легких, раке головы и шеи. Соматостатин может быть использован для терапии клеток нейробластомы и других типов опухолевых клеток.
Конъюгат может включать любое подходящее лекарственное средство, обычно цитотоксичный агент. В данном случае термин «цитотоксичный агент» относится к любому соединению, которое вызывает гибель клетки, индуцирует гибель клетки или снижает ее жизнеспособность. Подходящими цитотоксичными агентами являются, например, майтансиноиды и аналоги майтансиноидов, таксоиды, СС-1065 и аналоги СС-1065, доластатин и аналоги доластатина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения цитотоксичным агентом является майтансиноид, включая майтансинол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды - соединения, ингибирующие образование микротрубочек и потому высокотоксичные для клеток млекопитающих. Примерами подходящих аналогов майтансинола являются такие, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, а также имеющие модификации в других положениях. Такие майтансиноиды описаны, например, в патентах США 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4424219, 4371533, 4450254, 5475092, 5585499, 5846545 и 6333410.
Примерами аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом являются (1) С-19дехлоро (патент США 4256746) (получаемый ЬАН восстановлением анзамитоцина Р2), (2) С-20-гидрокси (или С-20 деметил) ±С-19-дехлоро (патент США 4361650 и 4307016) (получаемый деметилированием с использованием 81гер1ошусе8 или Асбпошусез или дехлорированием с использованием ЬАН) и (3) С-20-деметокси, С-20ацилокси (-ОСОК) ±дехлоро (патент США 4294757) (получаемый ацилированием с использованием ацилхлоридов).
Примерами аналогов майтансинола, имеющими модификации в других положениях, являются (1) С-9-8Н (патент США 4424219) (получаемый обработкой майтансинола Н28 или Р285), (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОК) (патент США 4331598), (3) С-14-гидроксиметил или -ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (патент США 4450254), (получаемый из №сатб1а), (4) С-15 гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (образующийся при конверсии майтансинола 81тер1отусез), (5) С-15 метокси (патенты США 4313946 и 4315929) (выделяемый из Тге\\за пибШога), (6) С-18-Ы-деметил (получаемый деметилированием майтансинола 81тер1отусез) (патент США 4362663 и 4322348), (7) 4,5-деокси (патент США 4371533) (получаемый восстановлением майтансинола трихлорид титана/ЬАН). В предпочтительном варианте осуществления изобретения в составе конъюгата используется тиолсодержащий майтансиноид ΌΜ1, также известный как Н2-деацетил-Ы2-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансин, как цитотоксичный агент. Структура ΌΜ1 представлена формулой (I)
ЗН
М<
(I)
- 7 013327
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат включает тиолсодержащий майтансиноид ΌΜ4, также известный как М2-деацетил-М2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансин, как цитотоксичный агент. Структура ΌΜ4 представлена формулой (II)
Другие майтансины также могут быть использованы в рамках данного изобретения, например тиоли дисульфидсодержащие майтансиноиды, имеющие моно- или диалкилзамещения у атома углерода, связанного с атомом серы. Особенно целесообразным является использование майтансиноида, имеющего в С-3 положении:
(a) С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 десметилгруппы и (b) ацилированную аминокислотную группу в боковой цепи с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, где углеродный атом ацильной группы, несущий тиольную функцию, имеет один или два заместителя, такие как СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно, где один из заместителей может представлять собой атом Н и где ацильная группа содержит линейную цепь длиной по меньшей мере 3 атома углерода между карбонильной группой и атомом серы.
Дополнительно в рамках данного изобретения могут быть использованы майтансины, включающие соединения, представленные формулой (III)
где Υ' представляет собой (СК7К8)1(СК9=СК10)рС=СчЛг(СК5К6)тПи(СКц=СК12)г(С=С)8Вг(СК3К4)пСВ1В282;
где Κι и И2, каждый независимо, представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и где, кроме того, И2 может быть также атомом Н;
где А, В, Ό представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7, Κ.8. Κ9, Иц и Κ.|2. каждый независимо, представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где 1, т, п, о, р, ц, г, 8 и ΐ представляют собой, каждый независимо, 0 или целое число от 1 до 5, при условии, что по крайней мере два индекса из 1, т, п, о, р, ц, г, 8 и ί не равны нулю одновременно, и где Ζ представляет собой Н, 8Κ или СОИ, где И представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы.
В предпочтительном варианте соединения формулы (III) включают соединения общей формулы
- 8 013327 (III), где (а) Κι представляет собой Н, Я2 представляет собой метил и Ζ представляет собой Н, (Ь) Κι и Я2 представляют собой метил и Ζ представляет собой Н, (с) Я! представляет собой Н, Я2 представляет собой метил и Ζ представляет собой -8СН3, (й) Я! и Я2 представляют собой метил и Ζ представляет собой -8СН3.
Такие майтансины также включают соединения, представленные формулой (ГУ-Ь), (ГУ-Ό) или (1У-П,Ь)
Мау
αν-ο (ΐν-ϋ) (Γν-ϋΛ) где Υ представляет собой (ί'’Κ-Κ8)ι(ί'’Κ5Κ6)ηι(ί'’Κ3Κ.·ι)ιΕ’Κ|Κ;8Ζ;
где Я1 и Я2, каждый независимо, представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и где Я2 также может быть Н;
где Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8, каждый независимо, представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где 1, т и п, каждый независимо, являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, п может быть равно 0;
где Ζ представляет собой Н, 8Я или СОЯ, где Я представляет собой линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и где Мау представляет собой майтансиноид, который имеет в боковой цепи гидроксиметил в С-3 и С-14 положениях, С-15 гидрокси или С-20 десметил.
Предпочтительные варианты формул (ГУ-Ь), (ГУ-Э) и (ГУ-Э,Ь) включают соединения формул (ГУ-Ь), (ГУ-Ό) и (ГУ-Э,Ь), где (а) Я1 представляет собой Н, Я2 представляет собой метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляют собой Н, каждый 1 и т равен 1, п равно 0 и Ζ представляет собой Н, (Ь) Я1 и Я2 представляют собой метил, каждый Я5, Я<5, Я7 и Я8 представляют собой Н, 1 и т равны 1, п равно 0, Ζ представляет собой Н, (с) Я1 представляет собой Н, Я2 представляет собой метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляют собой Н, каждый 1 и т равен 1, п равно 0, Ζ представляет собой -8СН3 или (й) Я1 и Я2 представляют собой метил, каждый Я5, Я<5, Я7 и Я8 представляют собой Н, 1 и т равны 1, п равно 0, Ζ представляет собой -8СН3.
Предпочтительный в рамках данного изобретения цитотоксичный агент представлен общей формулой (ГУ-Ь).
Дополнительные предпочтительные майтансины представлены формулой (У)
О
(V) где Υ представляет собой (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)ηСЯ1Я28Ζ;
где Яь Я2, каждый независимо, представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, кроме того, Я2 может быть атомом Н;
где Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 представляют собой, каждый независимо, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,
- 9 013327 содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где 1, т и п, каждый независимо, являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, η может быть равно 0 и где Ζ представляет собой Н, 8Я или СОЯ и Я представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы.
Предпочтительные варианты формулы (V) включают соединения общей формулы (V), где (а) Я1 представляет собой Н, Я2 представляет собой метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я представляют собой Н; каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ представляет собой Н, (Ь) Я1 и Я2 представляют собой метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляют собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ представляет собой Н, (с) Я1 представляет собой Н, Я2 представляет собой метил, каждый Я5, Я, Я7 и Я8 представляют собой Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ представляет собой -8СН3, или (б) Я! и Я2 представляют собой метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляют собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0, Ζ представляет собой -8СН3.
Другие предпочтительные майтансины включают соединения, представленные общей формулой (νΐ-Ь), (νΐ-ϋ) или (νΤ-ϋΛ)
(νΐ-Ь) (νί-О) (УМ>Д), где Υ2 представляет собой (СЯЯ)|(СЯЯ,)т(СЯЯ|)||С’ЯЯ^2;
где Я1 и Я2, каждый независимо, представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, кроме того, Я2 может быть атомом Н;
где Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8, каждый независимо, представляют собой Н, СН3, С2Н5, линейный циклический алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где 1, т и η независимо являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, η может быть равно 0;
где Ζ2 представляет собой 8Я или СОЯ и Я представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, где Мау представляет собой майтансиноид.
Другие предпочтительные майтансины включают соединения, представленные общей формулой (VII)
где Υ2· представляет собой (СЯ7Я8)1(СЯ9=СЯ1ο)ρ(СΞС)^Αг(СЯ5Я6)т^и(СЯ11=СЯ12)г(СΞС)8Β1(СЯзЯ4)ηС ЯЯ^2, где Я! и Я2 представляют собой, каждый независимо, СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и, кроме того, Я2 может быть атомом Н;
А, В и Ό представляют собой, каждый независимо, циклоалкил или циклоалкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я, Я9, Яп и Я12 представляют собой, каждый независимо, Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил
- 10 013327 или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы;
где 1, т, п, о, р, с.|. г, 5 и I являются, каждый независимо, 0 или целым числом от 1 до 5, при условии, что по крайней мере два индекса из 1, т, п, о, р, ср г, 5 и I не равны нулю одновременно и где Ζ2 представляет собой БЯ или -СОЯ, где Я представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединения формулы (VII) включают соединения, где Я1 представляет собой Н, Я2 представляет собой метил.
В дополнение к майтансиноидам цитотоксичный агент, используемый при приготовлении конъюгата, может являться таксаном или его производным. Таксаны - семейство соединений, которое включает паклитаксел (Тахо1®), цитотоксичное природное соединение и доцетаксел (Тахо!еге®), полусинтетическое производное, которые широко применяются при лечении рака. Таксаны - яды митотического веретена, ингибирующие деполимеризацию тубулина, что приводит к гибели клетки. Доцетаксел и паклитаксел являются полезными препаратами при лечении раковых заболевания, их антиопухолевая активность ограничена, поскольку они обладают также неспецифичной токсичностью к нормальным клеткам. Кроме того, соединения, подобные паклитакселу и доцетакселу, сами по себе недостаточно активны для использования в конъюгатах агентов, связывающих клетки.
Предпочтительный таксан для приготовления цитотоксичного конъюгата представляет собой таксан формулы (VIII)
Методы синтеза таксанов, которые могут быть использованы в контексте изобретения, вместе с методами конъюгации таксанов с клеточносвязывающими агентами, такими как антитела, описаны в патентах США 5416064, 5475092, 6340701, 6372738, 6436931, 6596757, 6706708 и 6716821 и в публикации заявки на патент США № 2004/0024049 А1.
Цитотоксичными также могут быть СС-1065 или его производные. СС-1065 - эффективный антиопухолевый антибиотик, выделенный из культуры $1гер1отусе$ хе1е$ш$ в жидкой среде. СС-1065 примерно в 1000 раз более эффективен ίη νίίτο, чем обычно применяемые антираковые препараты, такие как доксорубицин, метотрексат и винкристин (Вйиуап еί а1., Сапсег Яе5., 42: 3532-3537 (1982)). СС-1065 и его аналоги были раскрыты в патентах США 5585499, 5846545, 6340701 и 6372738. Цитотоксичные свойства СС-1065 корреллируют с его алкилирующей активностью и его ДНК-связывающей и ДНК-интеркалирующей активностью. Две эти активности относятся к разным частям молекулы. В этом отношении алкилирующая активность сосредоточена в циклопропапирролоиндольной (СМ) субъединице, а ДНК-связывающая активность сосредоточена в двух пирролоиндольных субъединицах СС-1065.
Несколько аналогов СС-1065 известны в данной области и могут быть использованы в конъюгате в качестве цитотоксического агента (см., например, \Уагре1ю$к| еί а1., I. Меб. С1ет., 31: 590-603 (1988)). Был получен ряд аналогов СС-1065, в которых СМ фрагмент был замещен циклопропабензиндолфрагментом (СВЦ (Водег еί а1., I. Огд. С1ет., 55: 5823-5833 (1990) и Водег еί а1., Вюогд. Меб. С1ет. Ьей., 1: 115-120 (1991)). Эти аналоги СС-1065 сохраняют ш уйго активность исходного лекарственного средства, но не вызывают у мышей запаздывающей токсичности. Как и СС-1065, эти соединения являются алкилирующими агентами, которые ковалентно связываются с малой бороздкой ДНК и таким образом вызывают гибель клетки.
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть значительно улучшена изменением его внутриклеточного распределения ш νί\Ό путем направленного транспорта к опухолевому центру, что привело к снижению токсичности по отношению к нераковым тканям и, таким образом, более низкой системической токсичности. С этой целью были получены конъюгаты аналогов и производных СС-1065 с клеточносвязывающими агентами, которые специфически воздействуют на раковые клетки (см., например, патенты США 5475092, 5585499 и 5846545). Эти конъюгаты обычно демонстрируют высокую специфическую цитотоксичность ш уйго и антиопухолевую активность в модельных ксенотрансплантатных человеческих опухолях в мышах (см., например, Сйап еί а1., Сапсег Яе5., 55: 4079-4084 (1995)).
- 11 013327
Методы синтеза аналогов СС-1065 детально описаны в патентах США 5475092, 5585499, 5846545, 6534660, 6586618 и 6756397 и публикации заявки на патент США № 2003/0195365 А1.
Такие лекарственные средства, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, калихеамицин, тубулизин и аналоги тубулизина, дуокармицин и аналоги дуокармицина, доластатин и аналоги доластатина могут быть использованы в рамках изобретения. Соединения доксарубицин и даунорубицин (см., например, патент США 6630579) могут быть также использованы в качестве лекарственных средств.
Конъюгаты лекарственных средств могут быть получены методами ίη νίίτο. Для того чтобы связать лекарственное средство или пролекарство с антителом, используется связывающая группа. Подходящими связывающими группами, хорошо известными в данной области, являются дисульфидные группы, лабильные кислые группы, фотолабильные группы, пептидные лабильные группы и эфирные лабильные группы. Предпочтительными связывающими группами являются дисульфидные. Например, конъюгаты могут быть образованы с использованием реакции дисульфидного обмена между антителом и лекарственным средством или пролекарством. Молекулы лекарственного средства также могут быть связаны со связывающим клетки агентом через промежуточную линкерную молекулу, например сывороточный альбумин.
В соответствии с изобретением связывающийся с клетками агент модифицируется путем взаимодействия бифункционального сшивающего реагента со связывающимся с клетками агентом с образованием ковалентной связи между линкерной молекулой и связывающимся с клетками агентом. Использованный в настоящем описании термин «бифункциональный сшивающий агент» представляет собой любую химическую частицу, которая ковалентно связывает агент, связывающийся с клетками, с лекарственным средством, таким как лекарственные средства, описанные в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения часть связующего фрагмента предоставляется лекарственным средством. В этом отношении лекарственное средство включает связывающий фрагмент, который является частью большой линкерной молекулы, которая используется для присоединения связывающегося с клетками агента к лекарственному средству. Например, для образования майтансиноида ΌΜ1 боковая цепь в С-3 положении гидроксильной группы майтансина модифицируется с образованием свободной сульфидрильной группы (8Н). Эта тиольная форма майтансиноида может реагировать с модифицированным связывающимся с клетками агентом с образованием конъюгата. Поэтому полученный линкер состоит из двух компонентов, один из которых представляет собой сшивающий агент, а другой - боковую цепь ΌΜ1.
Любой подходящий бифункциональный сшивающий агент может быть использован в связи с изобретением, поскольку линкерный агент предусматривает сохранение терапевтической активности, например цитотоксичности, и направляющих свойств лекарственного средства и связывающегося с клетками агента соответственно. Предпочтительно, чтобы линкерная молекула присоединяла лекарственное средство к агенту, связывающемуся с клетками, через химические связи (как описано выше), так что лекарственное средство и связывающийся с клетками агент будут связаны друг с другом химически (т.е. ковалентно). Предпочтительно, чтобы связывающий агент являлся расщепляемым линкером. Более предпочтительно, чтобы линкер расщеплялся в мягких условиях, например в условиях, соответствующих внутриклеточному состоянию, чтобы лекарственное средство не было затронуто. Примерами подходящих линкерных молекул являются дисульфидные линкеры, кислотные лабильные линкеры, фотолабильные линкеры, пептидазные лабильные линкеры и сложноэфирные лабильные линкеры. Дисульфидсодержащие линкеры представляют собой линкеры, расщепляемые через дисульфидный обмен, который может происходить в физиологических условиях. Кислотные линкеры представляют собой линкеры, расщепляемые при кислых рН. Например, некоторые внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют кислые рН (рН 4-5) и обеспечивают подходящие условия для расщепления кислотных линкеров. Фотолабильные линкеры полезны для использования на поверхности тела и в полостях тела, доступных для проникновения света. Кроме того, инфракрасный свет может проникать в ткани. Пептидазные лабильные линкеры могут быть использованы для расщепления определенных пептидов внутри или снаружи клетки (см., например, Тгоие! с( а1., Ргос. Ναΐΐ. Асаб. δει. И8А, 79: 626-629 (1982) и ИшешоФ е( а1., Ιηΐ. 1. Сапсег, 43: 677-684 (1989)).
Предпочтительно, чтобы лекарственное средство было связано со связывающим клетки агентом через дисульфидные связи. Линкерная молекула содержит активную химическую группу, которая может взаимодействовать со связывающим клетки агентом. Предпочтительно активной химической группой в данной реакции с агентом, связывающимся с клетками, являются Ν-сукцинимидильные сложные эфиры и Ν-сульфосукцинимидильные сложные эфиры. Кроме того, линкерная молекула содержит активную химическую группу, предпочтительно дитиопиридильную группу, которая может взаимодействовать с лекарственным средством с образованием дисульфидной связи. В частности, предпочтительными линкерными молекулами являются, например, Ν-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ) (см., например, Сатккоп е( а1., ВФсйеш. ί. 173: 723-737 (1978)), Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (8ΡΌΒ) (см., например, патент США 4563304), Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат (δΡΡ) (см., например, СА8 регистрационный номер 341498-08-6) и другие активные линкерные молекулы, опи- 12 013327 санные в патенте США 6913748.
Хотя в изобретении предпочтительно использование расщепляемых линкеров, нерасщепляемые линкеры также могут быть использованы для получения вышеописанных конъюгатов.
Нерасщепляемые линкеры представляют собой любые химические компоненты, способные к связыванию лекарственного средства, такого как майтансиноид, таксан или аналог СС-1065 со связывающим клетки агентом стабильным ковалентным образом. Так, нерасщепляемые линкеры весьма устойчивы к кислотному расщеплению, световому расщеплению, пептидазному расщеплению, сложноэфирному расщеплению и расщеплению дисульфидной связи, в условиях, когда лекарственное средство и связывающий клетки агент сохраняют свою активность.
Подходящие сшивающие агенты, которые образуют нерасщепляемые линкеры между лекарственным средством и связывающимся с клетками агентом, хорошо известны в рамках изобретения. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, содержащие Ν-сукцинимидильный сложный эфир или Ν-сульфосукцинимидильную эфирную группу для реакции со связывающим клетки агентом, а также малеимидо- или галогенацетил-фрагмент для реакции с лекарственным средством. Сшивающий агент, содержащий малеимидный фрагмент, включает Ν-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (8МСС), Ν-сукцинимидил4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является длинноцепочечным аналогом 8МСС (ЬС-8МСС), Ν-сукцинимидильный эфир κ-малеимидоундеканоевой кислоты (КМИА), Ν-сукцинимидильный эфир γ-малеимидобутировой кислоты (СМВ8), Ν-гидроксисукцинимидный эфир ε-малеимидокапроновой кислоты (ЕМ8С), т-малеимидобензоил-Н-гидроксисукцинимидный эфир (МВ8), №(а-малеимидоацетокси)сукцинимидный эфир (АМА8), сукцинимидил-6-(в-малеимидопропионамидо)гексаноат (8МРН), Ν-сукцинимидил 4-(парамалеимидофенил)бутират (8МРВ) и №(парамалеимидофенил)изоцианат (РМР1). Сшивающие агенты, содержащие галогенацетил-фрагмент, включают N-сукцинимцдил-4-(йодацетил)аминобензоат (81АВ), Ν-сукцинимидил йодацетат (81А), Ν-сукцинимидил бромацетат (8ВА) и Ν-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (8ВАР).
Другие сшивающие агенты, не содержащие атома серы, образующего нерасщепляемые линкеры, также могут быть использованы в настоящем изобретении. Такие линкеры могут быть получены из фрагментов дикарбоксильной кислоты. Подходящие фрагменты дикарбоксильной кислоты включают, но не ограничиваются, α,ω-дикарбоксильными кислотами общей формулы (IX)
ΗΟΟΟ-Χι-Υη-Ζ,η-ΟΟΟΗ (IX) , где X представляет собой линейный или разветвленный алкил, алкенил или алкинил, имеющие от 2 до 20 атомов углерода, Υ представляет собой циклоалкильную или циклоалкенильную группы, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, Ζ представляет собой замещенную или незамещенную ароматическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, или замещенную или незамещенную гетероциклическую группу, где гетероатом выбирают из Ν, О или 8 и где каждый 1, т и и равен 0 или 1, при условии, что 1, т и и одновременно не равны нулю.
Многие из нерасщепляемых линкеров, описанных в настоящем описании, детально описаны в заявке на патент США № 10/960602, который соответствует публикации заявки на патент США № 2005/0169933 А1.
Кроме того, как описано в патенте США 6441163 В1, лекарственное средство может быть вначале модифицировано введением активной эфирной группы, подходящей для взаимодействия со связывающимся с клетками агентом. Реакция таких майтансиноидов, содержащих активированную линкерную часть, со связывающимся с клетками агентом представляет другой способ получения расщепляемого или нерасщепляемого конъюгата, связывающегося с клетками агента и майтансиноида.
Дополнительная информация касательно майтансиноидов, цитотоксических агентов, включая конъюгаты лекарственных средств и связанные с ними методы получения, описаны в заявке на патент США № 11/352121 и заявке на патент США № 10/849136, которая соответствует публикации заявки на патент США № 2004/0235840 А1.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, однако, безусловно, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его пределы.
Пример 1.
Данный пример демонстрирует очистку антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом с использованием ТРР.
Моноклональные антитела 1111Ν901 (конечная концентрация 8 мг/мл) были инкубированы с Νсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноатом (8РР, 5,6-кратный молярный избыток) в течение приблизительно 180 мин при 20°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ №С1, 2 мМ ЕЭТА и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена с использованием колонки со смолой 8ерйабех™ С25Р, уравновешенной и промытой 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 50 мМ №1С1 и 2 мМ ЕЭТА. Во второй группе реакционная смесь была очищена с использованием РеШсои ХЬ ТРР системы (М1Шроге, ВШепса, МА) и антитела были диафильтрованы (5 об.) в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 50 мМ №101 и 2 мМ ЕЭТА с использованием отрезной мембраны с молекулярным весом 10000 (ийгасе1™ регенерируемая целлюлозная мембрана М1Шроге, ВШепса, МА). Оба образца были конъюгированы с ЭМ1 (1,7-кратный молярный избыток по отношению
- 13 013327 к несвязанному линкеру) в течение 18 ч при рН 6,5 в калий-фосфатном буфере, содержащем 50 мМ ΕΌΤΑ и ΌΜΑ в конечной концентрации 3%.
В обеих группах выходы были определены спектрофотометрически (длина волны 280 нм) в целом для стадий модификации и очистки. Соотношения линкер/антитело были также определены обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1см-1 при 343 нМ. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически (длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Кроме того, очистка от 8РР-производных малых молекул было измерена с помощью Н18ер НРЬ8.
Таблица 1
Методы очистки для модифицированного 1111Ν901 с использованием С-25Р и ΤΕΡ
Смола ЗерИабех™ <325Р ТЕГ
Стадия очистки Выход стадии 94% 98%
Соотношение линкер/антитело 4,9 4,9
8РР-производные малые молекулы 0,2% 0,2%
Стадия конъюгации Соотношение лекарственное средство/антитело 3,7 3,7
Как видно из табл. 1, при использовании ΤΕΕ продукт (конъюгат лекарственного средства) образуется, по крайней мере, в эквивалентном качестве по сравнению с использованием неадсорбционной хроматографии (С25), в то время как сам процесс более удобный и гибкий.
Пример 2.
Данный пример демонстрирует метод очистки антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом с помощью адсорбционной хроматографии.
Антитела 1шВ4 были модифицированы Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (8РПВ, 5,4-кратный молярный избыток) в течение 120 мин при комнатной температуре в растворе 50 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), содержащем 50 мМ №С1, 2 мМ ΕΌΤΑ и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на колонке со смолой 8ерЬабех™ С25Е, как описано в примере 1. Во второй группе реакционную смесь пропускали через колонку с керамическим гидроксиапатитом (СНТ, ΒίοКаб ЬаЬога1ог1е8, Негси1е8, СА), которая была уравновешена 12,5 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5) и элюировалась 80 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5).
В обеих группах выход и соотношение линкер/антитело были определены так же, как описано в примере 1. В первой группе выход был равен 91% и соотношение линкер/антитело было равно 4,2. Во второй группе выход был равен 89% и соотношение линкер/антитело - 4,2.
Антитела ί.'ΝΤΟ95 (конечная концентрация 10 мг/мл) были модифицированы с помощью Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (8ΡΌΒ, 4,5-кратный молярный избыток) в течение 120 мин при 20°С в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 2,7% сахарозу и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на 8ерЬабех™ 625Е в 12,5 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6,6), содержащем 12,5 мМ №1С1 и 0,5 мМ ΕΌΤΑ. Во второй группе реакционную смесь пропускали через колонку с 8Р 8еркаго8е Ра81 Ρ1ο\ν (6Ε НеаНЬсаге, Р18са1а^ау, N1), которая была уравновешена 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,5) и элюировалась 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 50 мМ №С1.
В обеих группах выход и соотношение линкер/антитело были определены, как описано в примере 1. В первой группе выход был равен 96% и соотношение линкер/антитело составляло 4,0. Во второй группе выход был равен 97% и соотношение линкер/антитело составляло 4,1.
Данные, полученные в этом примере, показывают, что адсорбционная хроматография может быть использована для очистки антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом.
Пример 3.
Данный пример демонстрирует преимущества конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН свыше 6,5.
В первом опыте антитела ί.'ΝΤΟ95 были модифицированы и очищены, как описано в примере 2. Модифицированные антитела были затем разделены на две группы. В первой группе конъюгация проводилась в 12,5 мМ фосфате калия при рН 6,5, содержащем 12,5 мМ №С1, 0,5 мМ ΕΌΤΑ, 3% ΌΜΑ и 1,7-кратный молярный избыток лекарственного средства по отношению к линкеру при 20°С. Во второй группе реакцию конъюгирования проводили при рН 7,5. Конъюгированные антитела были очищены на колонке NΑΡ-10.
- 14 013327
Соотношение лекарственное средство/антитело было определено для обеих групп. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Соотношение лекарственное средство/антитело в реакции конъюгации при рН 6,5 и 7,5
Время реакции (ч) Соотношение лекарственное средство/антитело в реакции конъюгации при рН 6,5 Соотношение лекарственное средство/антитело в реакции конъюгации при рН 7,5
0,5 - 3,0
1 2,3 3,4
1,5 3,5
2 2,8 3,5
2,75 - 3,6
3,5 3,2 3,6
5 3,4 3,7
Как показывают данные, приведенные в табл. 2, процесс конъюгации при рН 7,5 протекает быстрее, чем при рН 6,5.
Во втором эксперименте гуманизированные моноклональные антитела 1шВ4 были модифицированы либо (а) 4,9-молярным избытком 8ΡΌΒ по отношению к антителам, или (Ь) 4,8-молярным избытком 8ΡΌΒ по отношению к антителам. В обоих случаях реакция проводилась в буфере, содержащем 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида калия и 2 мМ ΕΌΤΑ (рН 6,5) в 5% этаноле в течение 120 мин при комнатной температуре. Образец (а) был очищен на колонке 8ерЬайех™ 625Р, уравновешенной 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ ΕΌΤΑ при рН 6,5. Образец (Ь) был очищен аналогичным образом, но рН буфера был доведен до 7,5. Оба образца были конъюгированы с ΌΜ4 (1,7-кратный молярный избыток по отношению к связанному линкеру) в течение 18 ч при комнатной температуре до конечной концентрации диметилацетамида (ΌΜΑ) 3%.
Таким образом, образец (а) был конъюгирован при рН 6,5, а образец (Ь) при рН 7,5. Затем образцы были очищены на колонке 8ерЬайех™ 625Р, уравновешенной 9,6 мМ фосфата калия и 4,2 мМ хлорида натрия при рН 6,5. Оба образца были инкубированы при 4°С в течение 7 месяцев, в течение которых был несколько раз определен выход свободного лекарственного средства. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Высвобождение свободного лекарственного средства со временем из образцов, конъюгированных при рН 6,5 и 7,5
Время (месяцы) Конъюгация при рН б, 5 Конъюгация при рН 7,5
0 1,0 0,8
1,5 1,8 1,0
2,5 3,2 1,9
7 4,0 2,8
Как показывают данные, приведенные в табл. 3, высвобождение свободного лекарственного средства происходит заметно медленнее из образца (Ь), который был конъюгирован при рН 7,5 по отношению к образцу (а), который был конъюгирован при рН 6,5. Соответственно, конъюгат, полученный при рН 7,5, оказывался более стабильным по сравнению с конъюгатом, полученным при рН 6,5, судя по высвобождению свободного лекарственного средства со временем. Конъюгация при рН 7,5 также показала лучшее включение лекарственного средства, чем при рН 6,5, что означает, что для проведения реакции требуется меньшее количество лекарственного средства.
Пример 4.
Данный пример демонстрирует положительные стороны конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН ниже 6,0.
Моноклональное антитело 1111Ν901 (конечная концентрация 8 мг/мл) было инкубировано с Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноатом (8РР, 5,6-кратный молярный избыток) в течение примерно 180 мин при 20°С в растворе 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ №С1, 2мМ ΕΌΤΑ и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на колонке со смолой 8ерЬайех™ 625Р, уравновешенной 50 мМ буфером натрий-цитрата (рН 5,0), содержащего 50 мМ №С1, 2 мМ ΕΌΤΑ. Во второй группе реакционную смесь очищали на колонке со смолой 8ерЬайех™ 625Р, уравновешенной 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 50 мМ №С1, 2 мМ ΕΌΤΑ. Оба образца были конъюгированы с ΌΝ4 (1,7-кратный молярный избыток) в течение 3, 19, 25, 48 и 120 ч при
- 15 013327 комнатной температуре при конечной концентрации диметилацетамида (ОМА) 3%.
Так, первая группа образцов была конъюгирована в 50 мМ натрий-цитратном буфере (рН 5,0), содержащем 50 мМ №С1 и 2 мМ ЕЭТА, а вторая группа образцов была конъюгирована в 50 мМ натрийфосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 50 мМ ЫаС1 и 2 мМ ЕЭТА. Затем образцы очищали на колонке со смолой 8ерЕабех™ С25Е, уравновешенной и элюированной 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 50 мМ ЫаС1.
В обеих группах соотношение линкер/антитело было определено обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически (длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации.
В первой группе соотношение линкер/антитело оказалось равным 4,3. Во второй группе соотношение линкер/антитело оказалось равным 4,3.
Изменение соотношения лекарственное средство/антитело с течением времени для двух групп приведено в табл. 4
Таблица 4
Уровень включения ЭМ1 в 8РР-модифицированные 1111Ν901 в зависимости от рН реакции конъюгации
Время реакции Сч} Соотношение лекарственное средство/антитело (моль/моль)
Конъюгация при рН 5,0 Конъюгация при рН 6,5
3 2,43 2, 97
19 3,38 3,28
25 3,41 Не определялась
48 3,46 3,17
120 3,44 2,85
Как видно из данных, приведенных в табл. 4, при проведении конъюгации модифицированных антител с лекарственным средством при рН 5,0 уровень связанного лекарственного средства оказывается выше и достигает более стабильного уровня в процессе конъюгации, чем при проведении реакции при рН 6,5. Кроме повышенной стабильности, результаты показывают, что при рН 5,0 достигается более высокий уровень отношения лекарственное средство/антитело, чем при конъюгации того же количества лекарственного средства при рН 6,5, свидетельствуя, таким образом, о более эффективном протекании реакции при рН 5,0.
В обеих группах количество мономерного конъюгата было определено в зависимости от времени. Полученные данные приведены в табл. 5.
Таблица 5
Влияние рН конъюгации на уровень мономерного конъюгата при протекании конъюгации 8РР-модифицированных 1ιι.ιΝ901 с ЭМ1
Время реакции (ч) Количество мономерного конъюгата (%}
Конъюгация при рН 5,0 Конъюгация при рН 6,5
3 98,5 98,0
19 98,8 98,2
25 99, 1 Не определялась
48 99,2 98,3
120 99,2 97, 8
Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 5, конъюгат, полученный при реакции модифицированных антител с лекарственным средством при рН 5,0, имеет более высокий уровень конъюгированного мономера, чем при рН 6,5.
Пример 5.
Этот пример демонстрирует прочие преимущества конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН ниже 6,0.
Антитела В1\УА 4 были модифицированы 8РР (молярный избыток 8РР показан в табл. 6) в течение 120-140 мин при комнатной температуре в 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), содержащего 50 мМ №С1, 2 мМ ЕЭТА и 5% этанол. Аликвоты модифицированных антител были очищены на колонках NАР 25, уравновешенных буферами с различными значениями рН (рН 4,6-6,5). Буферы с рН 4,6-5,9 состояли из 35 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 2 мМ ЭДТА. Буфер с рН 6,5 представляет собой РВ8 с 2 мМ ЭДТА.
Модифицированные антитела при каждом значении рН были конъюгированы с ЭМ1 (1,7-кратный молярный избыток по отношению к линкеру) в диметилацетамиде (ОМА, конечная концентрация 3%).
- 16 013327
После инкубации в течение 17-18 ч при комнатной температуре образцы конъюгированных антител были очищены хроматографией на колонках ΝΑΡ35, уравновешенных РВ8 (рН 6,5). Соотношения линкер/антитело (Ь/А в табл. 6) были определены с помощью обработки дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически (длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Мономер конъюгата, высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты были определены 8ЕС-НРЙС на Т8КС30008^ХЬ колонках, уравновешенных и проявленных в 0,2 М калийфосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,2 М хлорида калия и 20% изопропанола.
Результаты анализа представлены в табл. 6.
Таблица 6
Характеристики продукта конъюгата лекарственного средства в зависимости от рН
Буфер Молярный избыток 5₽₽ Ь/А Ь/А Мономер (%) Высокомолекулярные компоненты {%} Низкомолекулярные компоненты (%) Выход стадии конъюгации <*)
рН 4,6 4,7 3,8 3,6 97,5 2,2 0,4 74
рН 5,1 4,4 4,7 3,6 97,6 1, 9 0,6 75
рН 5,6 5,0 4,9 3,6 97,7 1,5 0,8 85
рН 5.9 5,5 5,3 3,7 96,4 2,3 1,4 76
рН 6,5 6, 6 6,4 3,7 95,1 2,8 1.9 71
Данные, представленные в табл. 6, показывают, что конъюгация 8РР-модифицированных В1\УЛ 4 с ΌΜ1 протекала эффективно при рН ниже 6,0, по сравнению с конъюгацией при рН 6,5. Количество линкера и лекарственного средства, а именно 8РР линкера и ΌΜ1, требуемое для достижения итогового соотношения лекарственное средство/антитело, было меньше при более низких значениях рН. Кроме того, уровни мономерного конъюгата, высокомолекулярных компонентов и низкомолекулярных компонентов были оптимальны, и выход продукта увеличивался при низких значениях рН.
Пример 6.
Данный пример показывает, что стадия очистки модифицированных антител может по желанию быть опущена. Лекарственное средство может быть добавлено в реакционную смесь одновременно с бифункциональным модифицирующим реагентом или несколько позже.
В данном примере добавления лекарственного средства после модифицирующего реагента гуманизированные моноклональные антитела С№ГО95 в концентрации 20 мг/мл были модифицированы бифункциональным модифицирующим реагентом 8РЭВ при молярном избытке 8РЭВ по сравнению с антителами в 4,6 раза в течение 120 мин при 20°С. Модифицирующий буфер: 44 мМ фосфатный буфер (рН 7,5), содержащий 5,3% сахарозу и 5% этанол. Одна аликвота модифицированных антител была очищена на смоле 8ерйабех™ С25Е (стандартный 4-стадийный процесс), уравновешенной и промытой 12,5 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 12,5 мМ №С1, и затем конъюгирована с ΌΝ4 (1,7-кратный молярный избыток) до конечной концентрации модифицированных антител 10 мг/мл в 12,5 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержавшем 12,5 мМ №1С1 и 10% ΌΜΑ в течение 20 ч при комнатной температуре. Вторая аликвота модифицированных антител была введена в реакцию конъюгации немедленно по истечении 120 мин реакции модификации (3-стадийный процесс), без дальнейшей очистки.
Концентрации белка и буфера в реакционной смеси были подобраны с тем, чтобы обеспечить выход модифицированного белка 10 мг/мл. Состав буфера: 28 мМ фосфата калия (рН 7,5), содержащий 5,9 мМ №1С и 2,7% сахарозы. Затем в реакционную смесь был введен ΌΜ4 (1,7-кратный избыток по отношению к исходному 8РЭВ) и конечная концентрация ΌΜΑ была доведена до 10%. После 20 ч инкубации при комнатной температуре обе аликвоты конъюгированных антител были очищены на колонке со смолой 8ерйабех™ С25Е, уравновешенной 10 мМ гистидином и 10% сахарозой при рН 5,5.
Соотношения линкер/антитело (Ь/А) были определены обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело (Ό/А) было определено спектрофотометрически (длины волн 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Количество мономера было определено с помощью 8ЕС-НРЬС. Количество свободного лекарственного средства было определено с помощью 8ЕС-НРЬС на колонке Н1зер. Результаты приведены в табл. 7.
- 17 013327
Таблица 7
Возможность исключения стадии очистки для модифицированных антител
Параметры 4-стадийный процесс 3-стадийный процесс
Начало ЗРЦВ 4,6 X 4,6 х
Ь/А 4,1 Не определен
Т>/А 3,9 4,0
Выход 79% 91%
% мономера 95,8% 96,1%
% свободного лекарственного средства 2,4% 1,1%·
Как свидетельствуют результаты, приведенные в табл. 7, стадия очистки модифицированных антител может быть опущена в контексте изобретения.
Пример 7.
Данный пример демонстрирует улучшенный способ очистки антител, модифицированных бифункциональным модифицирующим реагентом и затем конъюгированных с майтансиноидом.
Антитела 1шN901. модифицированные 8РР (7-кратный молярный избыток) и очищенные на колонке со смолой 8ерИабех™ С25Е, как описано в примере 1, были конъюгированы с майтансиноидом ЭМ1 (1,7-кратный молярный избыток) по отношению к линкеру, растворенным в диметилацетамиде ЭМА в конечной концентрации 3%.
Первый образец конъюгата был очищен с использованием стандартной хроматографии на колонке со смолой 8ербабех™ С25Е, уравновешенной фосфатно-солевым буфером (РВ8, рН 6,5).
Второй образец конъюгата был очищен на РеШсоп ХЬ ТЕЕ (М1Шроге, ВШепса, МА), как описано в примере 1.
Третий образец конъюгата был очищен с использованием колонки МЕР Нурегсе11, уравновешенной 50 мМ Тпк (рН 8,0), и элюирован 50 мМ ацетатом натрия (рН 4,0).
Четвертый образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой υNΟкрЬе^е 8, уравновешенной 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5), и элюирован 0,2 М №1С1 и 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5).
Пятый образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой СНТ (Вю-Раб ЬаЬога1опек, Негси1ек, СА) уравновешенной 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5), и элюирован 0,3 М №1С1 и 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5).
Шестой образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой 8Р 8ербагоке, уравновешенной 35 мМ цитратом натрия, 10 мМ хлоридом натрия (рН 5,0), и элюирован 0,25 М №С1, 35 мМ цитратом натрия (рН 5,0).
Мономер конъюгата был детектирован с помощью 8ЕС-НРБС на колонке со смолой Т8КС30008УХЪ, уравновешенной 0,2 М калий-фосфатным буфером при рН 7,0, содержащим 0,2 М хлорида калия и 20% изопропанола. Выход стадии конъюгации был определен нормированием выхода конъюгированных антител на количество модифицированных антител, введенных в реакцию (определялось спектрофотометрически при длине волны 280 нм).
Результаты данного анализа представлены в табл. 8.
Таблица 8
Сравнение стадии очистки конъюгации
Образец конъюгата Стадия очистки конъюгации Мономер конъюгата, % Выход стадии, %
1 (контроль) Смола (325Р 93,2 86
2 (изобретение) тгр 92,8 85
3 (изобретение) Смола МЕР НурегсеИ 94,5 74
4 (изобретение) Смола ЦИОарЪеге 96,3 81
5 (изобретение) Смола СНТ 97,9 72
6 (изобретение) Смола ЗР БерИагозе 95,1 81
Результаты, приведенные в табл. 8, показывают, что методы очистки, предложенные в данном изобретении (группы 2-6), дают результаты, подобные полученным для контрольного образца (группа 1). Каждый хроматографический метод в данном изобретении давал улучшение в уровне мономерного конъюгата и может быть использован широкомасштабно.
Кроме СНТ (керамический гидроксиапатит), СЕТ (керамический фторапатит) также может быть использован в подобных хроматографических условиях. И СНТ, и СЕТ могут быть использованы в неадсорбционном методе, поскольку целевой продукт (в основном мономерный конъюгат) не удерживается смолой, в то время как высокомолекулярные компоненты смеси удерживаются, что приводит к отделе
- 18 013327 нию целевого продукта.
Хотя стандартный буфер/растворитель для конъюгата содержит 3% ΌΜΑ, 50 мМ фосфата калия, 50 мМ ΝΑΟ и 3 мМ ЭДТА при рН 6,5 (как показано в примере 1), есть более совместимые с некоторыми из хроматографических процедур, описанных в настоящем описании, составы, и они имеют некоторые преимущества по сравнению со стандартными. Например, конъюгация может быть осуществлена в 3% ΌΜΑ, 12,5 мМ фосфате калия, 12,5 мМ ΝαΟ и 0,5 мМ ЭДТА при рН 6,5. В этих условиях количество включенного ΌΜ4 по сравнению с количеством линкера, включенного в 1шВ4 антитела, было примерно на 10% выше, чем в стандартных условиях. Кроме того, эти условия больше подходят для нанесения на смолу, такую как СНТ или катионообменные смолы.
Все ссылки, включая публикации, патентные применения и патенты, цитируются в настоящем описании и таким образом включены посредством ссылок в равной степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и специфично приведена в данном документе.
Термины включающий, обладающий, содержащий в себе должны быть истолкованы как неограниченные (т.е. подразумевающие «включая, но не ограничиваясь»), если не указано обратное. Перечисление диапазонов значений используют для краткого обозначения конкретных индивидуальных значений. Все описанные в настоящем описании методы могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если другое не указано здесь или не опровергается напрямую в тексте. Вышеприведенные рамки использования терминов представляют собой не более чем методологические указания для каждого объекта, находящего в пределах списка объектов, если не указано другое. Все описанные методы могут быть использованы в любом порядке, если не указано другое. Использование любых грамматических конструкций, ссылающихся на конкретные примеры (например «такой как»), приведенные в тексте, ставит целью исключительно иллюстрацию изобретения и не ограничивает рамки использования изобретения, если не указано другое. Ничто в описании изобретения не должно быть рассмотрено как указание на какой-либо не описанный здесь элемент, необходимый для использования изобретения.
Предпочтительные способы реализации изобретения приведены ниже, включая способ, оптимальный с точки зрения авторов. В процессе ознакомления с вышеприведенным описанием варианты предпочтительных способов реализации могут быть очевидны для специалистов в данной области. Авторы предполагают, что в случае необходимости практикующие специалисты применят указанные способы реализации; в целом же изобретение предполагается использовать в соответствии с представленным в данном патенте методом. Соответственно, изобретение включает все варианты и эквиваленты объекта изобретения, изложенные в формуле изобретения, прилагаемой ниже, в соответствии с законодательством. Кроме того, любые комбинации вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охватываются изобретением, если иное не указано или не следует со всей очевидностью из контекста.

Claims (26)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:
    (a) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;
    (b) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением, адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры;
    (c) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (б) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси.
  2. 2. Способ по п.1, в котором адсорбционная хроматография выбрана из группы, включающей гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (НС1С), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (Н1С), ионнообменную хроматографию, ионнообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла (1МАС), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и комбинацию этих методов.
  3. 3. Способ по п.1, в котором тангенциальное проточное фильтрование используют на стадиях (Ь) и (б).
  4. 4. Способ по п.1 или 2, в котором адсорбционную хроматографию используют на стадиях (Ь) и (б).
    - 19 013327
  5. 5. Способ по п.1 или 2, в котором если тангенциальное проточное фильтрование используют на стадии (Ь), то адсорбционную хроматографию не используют на стадии (б).
  6. 6. Способ по п.1 или 2, в котором адсорбционную хроматографию используют на стадии (Ь) и тангенциальное проточное фильтрование используют на стадии (б).
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором раствор на стадии (с) имеет рН от примерно 4 до менее 6.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-6, в котором раствор на стадии (с) имеет рН от более 6,5 до примерно 9.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором раствор на стадии (с) содержит сахарозу.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором раствор на стадии (с) дополнительно содержит буферные агент, выбранный из группы, включающей цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер.
  11. 11. Способ приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:
    (a) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;
    (b) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (ί) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ίί) свободный цитотоксический агент и (ίίί) побочные продукты реакции, образованные на стадии (Ь), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС1065; и (c) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом;
    при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии.
  12. 12. Способ по п.11, где первую смесь не подвергают очистке.
  13. 13. Способ по п.11 или 12, в котором адсорбционная хроматография выбрана из группы, включающей гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (НОС), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (Н1С), ионнообменную хроматографию, ионнообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла (1МАС), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и комбинацию этих методов.
  14. 14. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (Ь) имеет рН от примерно 4 до примерно 6.
  15. 15. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (Ь) имеет рН от примерно 6,5 до примерно 9.
  16. 16. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (Ь) имеет рН менее 6 или более 6,5.
  17. 17. Способ по любому из пп.11-16, в котором раствор на стадии (с) содержит сахарозу.
  18. 18. Способ по любому из пп.11-17, в котором раствор на стадии (Ь) дополнительно содержит буферный агент, выбранный из группы, включающей цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер.
  19. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором антителом является моноклональное антитело.
  20. 20. Способ по п.19, в котором антителом является гуманизированное моноклональное антитело.
  21. 21. Способ по п.20, в котором антитело выбирают из группы, состоящей из 1ιιιΝ901, ЬиМу9-6, йиБ4, йиС242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, СЭТО95, йиО86 и ритуксимаба.
  22. 22. Способ по любому из пп.1-21, в котором цитотоксическим агентом является майтансиноид.
  23. 23. Способ по п.22, в котором майтансиноид содержит тиольную группу.
  24. 24. Способ по п.23, в котором майтансиноид представляет собой ΌΜ1.
  25. 25. Способ по п.23, в котором майтансиноид представляет собой ΌΜ4.
  26. 26. Способ по любому из пп.1-25, в котором антитело химически связано с цитотоксическим агентом через химические связи, выбранные из группы, включающей дисульфидные связи, кислотные лабильные связи, фотолабильные связи, пептидазные лабильные связи, простые тиоэфирные связи и сложноэфирные лабильные связи.
EA200800657A 2005-08-24 2006-08-14 Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств EA013327B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71085805P 2005-08-24 2005-08-24
US79771306P 2006-05-04 2006-05-04
PCT/US2006/031653 WO2007024536A2 (en) 2005-08-24 2006-08-14 Process for preparing maytansinoid antibody conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800657A1 EA200800657A1 (ru) 2008-08-29
EA013327B1 true EA013327B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=37666423

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800657A EA013327B1 (ru) 2005-08-24 2006-08-14 Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств

Country Status (25)

Country Link
US (6) US7811572B2 (ru)
EP (4) EP2399609B1 (ru)
JP (3) JP5350792B2 (ru)
KR (1) KR101301011B1 (ru)
CN (2) CN102989000B (ru)
AU (1) AU2006283726C1 (ru)
BR (1) BRPI0615049B1 (ru)
CA (5) CA2893252C (ru)
CR (2) CR9742A (ru)
CY (1) CY1113206T1 (ru)
DK (1) DK1928503T3 (ru)
EA (1) EA013327B1 (ru)
EC (1) ECSP088212A (ru)
ES (2) ES2533992T3 (ru)
HK (2) HK1120407A1 (ru)
HR (1) HRP20120794T1 (ru)
IL (6) IL282138B2 (ru)
MX (1) MX2008002597A (ru)
NZ (4) NZ716641A (ru)
PL (1) PL1928503T3 (ru)
PT (1) PT1928503E (ru)
RS (1) RS52470B (ru)
SI (1) SI1928503T1 (ru)
WO (1) WO2007024536A2 (ru)
ZA (1) ZA200801564B (ru)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
ES2552281T3 (es) 2001-05-11 2015-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específica y usos de las mismas
WO2006012527A1 (en) 2004-07-23 2006-02-02 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
AU2006283726C1 (en) * 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
US9090693B2 (en) * 2007-01-25 2015-07-28 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-EGFR antibodies in treatment of EGFR mutant mediated disease
EP2481427A1 (en) 2007-03-14 2012-08-01 Endocyte, Inc. Folate-Tubulysin conjugates
MX2009009782A (es) 2007-03-15 2010-09-10 Ludwig Inst Cancer Res Metodo de tratamiento que utiliza anticuerpos egfr e inhibidores de src y formulaciones relacionadas.
RU2523909C2 (ru) 2007-06-25 2014-07-27 Эндосайт, Инк. Конъюгаты, содержащие гидрофильные спейсеры линкеров
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
WO2009023265A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
US20100092495A1 (en) * 2008-04-30 2010-04-15 Immunogen Inc. Potent cell-binding agent drug conjugates
US8236319B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
JP5863640B2 (ja) * 2009-04-29 2016-02-16 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 免疫複合体の精製
ES2726945T3 (es) * 2009-06-03 2019-10-10 Immunogen Inc Métodos de conjugación
US20110076232A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
TW201117814A (en) * 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
CN102933231B (zh) 2010-02-10 2015-07-29 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
SI2646470T1 (sl) 2010-11-30 2017-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti receptorjem antitransferina in njihova uporaba za prenos terapevtskega enoverižnega variabilnega fragmenta (scfv) prek krvno-možganske pregrade
MX346635B (es) 2011-02-15 2017-03-27 Immunogen Inc Derivados citotoxicos de la benzodiazepina.
KR20140019415A (ko) * 2011-03-29 2014-02-14 이뮤노젠 아이엔씨 향상된 균질성의 접합체를 제조하기 위한 방법
ME03353B (me) * 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
WO2012143499A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
WO2012177837A2 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
SG10201604747WA (en) * 2011-12-13 2016-08-30 Immunogen Inc Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
KR20150003251A (ko) * 2012-04-04 2015-01-08 가부시키가이샤 페르세우스 프로테오믹스 항 cdh3(p-카드헤린) 항체의 약물 콘쥬게이트
EP2887965A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2014055842A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
IN2015DN03203A (ru) * 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014058947A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Sanofi Compositions and methods for treating cancer using pi3k inhibitor and anti-cd19 maytansinoid immunoconjugate
EA201590622A1 (ru) 2012-10-16 2015-10-30 Эндосайт, Инк. Конъюгаты для доставки лекарственного средства, содержащие не встречающиеся в природе аминокислоты, и способы применения
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
JP6494533B2 (ja) 2013-02-28 2019-04-03 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤としてのマイタンシノイドを含む複合体
JP6423804B2 (ja) 2013-02-28 2018-11-14 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤を含む複合体
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MY183572A (en) * 2013-03-15 2021-02-26 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
CN105007950B (zh) 2013-03-15 2019-01-15 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物
EP2994164B1 (en) * 2013-05-08 2020-08-05 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
MX2016003256A (es) 2013-09-12 2016-06-07 Halozyme Inc Anticuerpos modificados del receptor de factor de crecimiento anti-epidermico y metodos de uso de los mismos.
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
SG11201604758PA (en) 2013-12-23 2016-07-28 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp)
EP3160513B1 (en) 2014-06-30 2020-02-12 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
KR102062025B1 (ko) 2014-06-30 2020-01-03 타베다 세라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화된 콘주게이트 및 입자 및 그것의 제형
TN2016000577A1 (en) 2014-08-12 2018-04-04 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates
KR102626976B1 (ko) * 2014-09-02 2024-01-18 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법
ES2815353T3 (es) 2014-09-03 2021-03-29 Immunogen Inc Derivados de benzodiazepina citotóxicos
JP2017527562A (ja) 2014-09-03 2017-09-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体
CN104208719B (zh) * 2014-09-24 2017-05-03 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法
EP4183806A3 (en) 2014-11-12 2023-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
EP3217962A4 (en) * 2014-11-13 2018-06-27 The Curators of the University of Missouri Multiple human antibody-nanoparticle conjugates and methods of formation
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
WO2016203432A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MX2017017172A (es) 2015-06-22 2018-02-23 Bayer Pharma AG Conjugados de ligador-principio activo (adcs) y conjugados de ligador-profarmaco (apdcs) con grupos enzimaticamente escindibles.
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
CA3001712A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Tarveda Therapeutics, Inc. Sstr-targeted conjugates and particles and formulations thereof
IL258768B2 (en) 2015-11-12 2023-11-01 Siamab Therapeutics Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
FR3045058B1 (fr) * 2015-12-11 2017-12-29 Ifp Energies Now Nouvelles polyamines, leur procede de synthese et leur utilisation pour l'elimination selective de l'h2s d'un effluent gazeux comprenant du co2
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
SG11201808167VA (en) 2016-03-24 2018-10-30 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
CN110312533B (zh) 2016-12-21 2023-11-03 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
MA47812A (fr) 2017-03-03 2021-04-14 Seagen Inc Composés interagissant avec le glycane et méthodes d'utilisation
BR112019020174A2 (pt) * 2017-03-30 2020-06-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Método para preparar conjugado anticorpo-fármaco
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
WO2018195243A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
US20180311375A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Cadila Healthcare Limited Process of preparing antibody-drug conjugate
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2019105835A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Bayer Consumer Care Ag Combinations of copanlisib and anetumab ravtansine
WO2019133652A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Immunogen, Inc. Benzodiazepine derivatives
AU2019206587A1 (en) * 2018-01-12 2020-08-06 Immunogen, Inc. Methods for antibody drug conjugation, purification, and formulation
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
AU2019311557A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
TWI824043B (zh) 2018-10-25 2023-12-01 西班牙商瑪製藥股份有限公司 藥物抗體共軛物
CN113661172A (zh) 2019-03-29 2021-11-16 伊缪诺金公司 用于抑制异常细胞生长或治疗增生性疾病的细胞毒性双苯并二氮杂䓬衍生物及其与细胞结合剂的缀合物
LT3958977T (lt) 2019-04-26 2023-12-27 Immunogen, Inc. Kamptotecino dariniai
WO2020234114A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Bayer Aktiengesellschaft A novel stable high concentration formulation for anetumab ravtansine
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
CR20220057A (es) 2019-07-10 2022-07-19 Cybrexa 3 Inc Conjugados peptídicos de agentes dirigidos a microtúbulos como terapéuticos
PE20220563A1 (es) 2019-07-10 2022-04-13 Cybrexa 2 Inc Conjugados peptidicos de citotoxinas como terapeuticos
JP2022548530A (ja) 2019-09-05 2022-11-21 ファルマ、マール、ソシエダード、アノニマ 薬物抗体コンジュゲート
CN116859051A (zh) * 2019-12-31 2023-10-10 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 一种白介素6的均相检测试剂盒及其应用
AR121894A1 (es) 2020-04-21 2022-07-20 Pharma Mar Sa Conjugados de anticuerpos de fármacos
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001024763A2 (en) * 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2002094325A2 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic cd44 antibody immunoconjugates
WO2002098897A2 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2003057163A2 (en) * 2002-01-03 2003-07-17 Smithkline Beecham Corporation Methods for preparing immunoconjugates
WO2003102132A2 (en) * 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
WO2004103272A2 (en) * 2003-05-20 2004-12-02 Immunogen, Inc. Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids
WO2005077090A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-25 Seattle Genetics, Inc. Improved methods of producing antibody conjugates
WO2005094882A1 (en) * 2004-03-03 2005-10-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2005117986A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US552293A (en) * 1895-12-31 ktjhn
US585499A (en) * 1897-06-29 Oil-can
US585089A (en) * 1897-06-22 durey
SE430062B (sv) * 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) * 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) * 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) * 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
DE3587294T2 (de) 1985-01-22 1993-09-30 Saint Gobain Vitrage Verfahren zur Herstellung einer dünnen Metalloxidbeschichtung auf einem Substrat, insbesondere Glas und deren Verwendung als Verglasung.
GB8600582D0 (en) * 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4859449A (en) 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) * 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5024834A (en) * 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
CA2048078A1 (en) 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) * 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
DE19503164A1 (de) * 1994-02-04 1995-08-10 Siemens Comp Inc Optisch gekoppelte Datenanschalteanordnung und Gabelschaltung
US5580853A (en) * 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
AU5908296A (en) 1995-05-31 1996-12-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector m olecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
GB9610992D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Glaxo Group Ltd Concentrated antibody preparation
WO1998026747A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
DE69830326T2 (de) 1997-10-03 2006-02-02 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Iminbildende polysaccharide, deren herstellung und verwendung als zusatzmittel und immunstimulierende mittel
US6121236A (en) 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
US5963761A (en) * 1998-04-15 1999-10-05 Xerox Corporation Area coverage sensor calibration and algorithm for seam detection noise eliminator on a seamed photoreceptor
EP1073667A2 (en) 1998-04-28 2001-02-07 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US5981564A (en) 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
CA2331789C (en) 1998-07-13 2013-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
AU767394C (en) * 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US20020197266A1 (en) 2000-02-08 2002-12-26 Waldemar Debinski Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6632979B2 (en) 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
NZ523874A (en) 2000-07-24 2004-04-30 Microcell Corp Microcell electrochemical devices and assemblies, and method of making and using the same
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20060062786A1 (en) 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
WO2002060955A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
CA2436408A1 (en) 2001-02-07 2002-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified psma ligands and uses related thereto
US20030003048A1 (en) 2001-04-26 2003-01-02 Chun Li Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
EP1392361A4 (en) 2001-05-11 2009-08-05 Univ Texas THERAPY BASED ON ANTI-CD26 MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST DISORDERS ASSOCIATED WITH CELLS EXPRESSING CD26
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
TW593239B (en) 2001-06-04 2004-06-21 Kevin Dale Allen One-step production of 1,3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
EP1455817B1 (en) 2001-12-11 2008-12-31 Merck & Co., Inc. Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
US6716821B2 (en) * 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
HUE030806T2 (hu) 2002-05-02 2017-05-29 Wyeth Holdings Llc Calicheamicin származék-hordozó konjugátumok
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
CN1671741A (zh) 2002-06-21 2005-09-21 拜奥根Idec公司 浓缩抗体的缓冲剂制剂及其使用方法
US7390898B2 (en) * 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
EP1542723B1 (en) 2002-08-16 2011-02-23 ImmunoGen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
DE60323756D1 (de) 2002-10-08 2008-11-06 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
EP3299463B1 (en) 2002-10-30 2020-10-21 Nuevolution A/S Enzymatic encoding
MXPA05004712A (es) 2002-11-07 2005-11-23 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos.
KR101424624B1 (ko) * 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
BRPI0411852A (pt) 2003-06-27 2006-05-23 Abgenix Inc anticorpos dirigidos aos mutantes de deleção de receptor de fator de crescimento epidérmico e seu usos
US20050074425A1 (en) 2003-07-02 2005-04-07 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
WO2005044998A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Palingen, Inc. Enhanced b cell cytotoxicity of cdim binding antibody
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
WO2005115477A2 (en) 2004-04-13 2005-12-08 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
US20060073528A1 (en) 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
EP1747021B1 (en) 2004-05-19 2015-09-09 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Self-immolative linkers and drug conjugates
US7313946B2 (en) * 2004-07-15 2008-01-01 Matsuo Electric Co., Ltd. Moisture detector
AR052774A1 (es) 2004-10-08 2007-04-04 Wyeth Corp Inmunoterapia para trastornos autoinmunes
WO2006065533A2 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
US7408030B2 (en) * 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
AU2006213662B2 (en) 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
CN102603770A (zh) 2005-04-15 2012-07-25 免疫基因公司 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
DK2433653T3 (da) 2005-07-15 2019-08-19 Angiochem Inc Anvendelse af aprotininpolypeptider som bærere i farmaceutiske konjugater
NZ623901A (en) 2005-08-03 2015-10-30 Immunogen Inc Immunoconjugate formulations
AU2006283726C1 (en) 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
WO2007034495A2 (en) 2005-09-22 2007-03-29 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Dextran and arabinogalactan conjugates of therapeutically active compounds
CN101312748A (zh) 2005-09-26 2008-11-26 梅达莱克斯公司 抗体-药物轭合物和使用方法
WO2007059195A1 (en) 2005-11-14 2007-05-24 University Of Southern California Integrin-binding small molecules
US7964415B2 (en) 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
US7307016B1 (en) * 2006-06-07 2007-12-11 Grace Semiconductor Manufacturing Corporation Method of processing metal surface in dual damascene manufacturing
CN101622276B (zh) 2006-07-18 2015-04-22 赛诺菲-安万特 用于治疗癌症的抗epha2的拮抗抗体
US20080213349A1 (en) 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
SI2019104T1 (sl) 2007-07-19 2013-12-31 Sanofi Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
US8236319B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
WO2010057160A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
EP3360879A1 (en) 2009-02-05 2018-08-15 ImmunoGen, Inc. Benzodiazepine derivatives as cytotoxic agents
ES2726945T3 (es) 2009-06-03 2019-10-10 Immunogen Inc Métodos de conjugación
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
TW202348631A (zh) 2010-02-24 2023-12-16 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
US20120149732A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
MX346635B (es) 2011-02-15 2017-03-27 Immunogen Inc Derivados citotoxicos de la benzodiazepina.
KR20140019415A (ko) 2011-03-29 2014-02-14 이뮤노젠 아이엔씨 향상된 균질성의 접합체를 제조하기 위한 방법
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
HUE036172T2 (hu) 2011-04-01 2018-06-28 Immunogen Inc Eljárások a hatékonyság növelésére a FOLR1 rákkezelésénél
US20130071482A1 (en) 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
SG10201604747WA (en) 2011-12-13 2016-08-30 Immunogen Inc Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
WO2014055842A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
IN2015DN03203A (ru) 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
TR201905612T4 (tr) 2012-12-05 2019-05-21 Univ Heidelberg Ruprecht Karls Proteinlerin ve çok değerlikli, hücreye nüfuz eden peptitlerin konjugatları ve bunların kullanımları.

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001024763A2 (en) * 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2002094325A2 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic cd44 antibody immunoconjugates
WO2002098897A2 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2003057163A2 (en) * 2002-01-03 2003-07-17 Smithkline Beecham Corporation Methods for preparing immunoconjugates
WO2003102132A2 (en) * 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
WO2004103272A2 (en) * 2003-05-20 2004-12-02 Immunogen, Inc. Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids
WO2005077090A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-25 Seattle Genetics, Inc. Improved methods of producing antibody conjugates
WO2005094882A1 (en) * 2004-03-03 2005-10-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2005117986A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTY C. ET AL. High-performance tangential flow filtration: a highly selective membrane separation process, DESALINATION, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 144, no. 1-3, 10 September 2002 (2002-09-10), pages 133-136, XP004386208, ISSN: 0011-9164, see conclusions, abstract *
OKAMOTO K. ET AL. THERAPEUTIC EFFECT OF ANSAMITOCIN TARGETED TO TUMOR BY A BISPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY, JAPANESE JOURNAL OF CANCER RESEARCH, JAPANESE CANCER ASSOCIATION, TOKYO, JP, vol. 83, no. 7, July 1992 (1992-07), pages 761-768, XP008031957, ISSN: 0910-5050, abstract, see discussion, page 763, column 1, paragraph 3; fig. 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2390826T3 (es) 2012-11-16
WO2007024536A3 (en) 2007-07-05
IL226985A (en) 2016-10-31
IL248076A0 (en) 2016-11-30
CA3190867A1 (en) 2007-03-01
JP5738248B2 (ja) 2015-06-17
AU2006283726A1 (en) 2007-03-01
JP2014196307A (ja) 2014-10-16
PL1928503T3 (pl) 2012-12-31
IL282138A (en) 2021-05-31
JP6028001B2 (ja) 2016-11-16
HK1165329A1 (en) 2012-10-05
NZ609752A (en) 2014-08-29
NZ595430A (en) 2013-05-31
US20150182635A1 (en) 2015-07-02
JP2013014604A (ja) 2013-01-24
CN102989000B (zh) 2016-04-20
US11471536B2 (en) 2022-10-18
IL282138B1 (en) 2023-09-01
CA2893252A1 (en) 2007-03-01
EP2662096A1 (en) 2013-11-13
WO2007024536A2 (en) 2007-03-01
CR9742A (es) 2008-09-29
US9789204B2 (en) 2017-10-17
CR20150350A (es) 2015-08-20
KR20080034476A (ko) 2008-04-21
US8383122B2 (en) 2013-02-26
SI1928503T1 (sl) 2012-11-30
CA2893252C (en) 2018-05-29
CA2620343C (en) 2013-01-08
ECSP088212A (es) 2008-03-26
CN102989000A (zh) 2013-03-27
IL189461A0 (en) 2008-08-07
JP5350792B2 (ja) 2013-11-27
NZ565964A (en) 2011-11-25
HK1120407A1 (en) 2009-04-03
US20110021744A1 (en) 2011-01-27
US7811572B2 (en) 2010-10-12
KR101301011B1 (ko) 2013-08-30
PT1928503E (pt) 2012-10-19
CY1113206T1 (el) 2016-04-13
RS52470B (en) 2013-02-28
CN101267841B (zh) 2012-10-10
JP2009506032A (ja) 2009-02-12
CN101267841A (zh) 2008-09-17
CA2794554A1 (en) 2007-03-01
HRP20120794T1 (hr) 2012-11-30
US20070048314A1 (en) 2007-03-01
AU2006283726B2 (en) 2012-06-28
CA3000520A1 (en) 2007-03-01
US8933205B2 (en) 2015-01-13
EP1928503B1 (en) 2012-10-03
US20230158168A1 (en) 2023-05-25
EP3539572A1 (en) 2019-09-18
ZA200801564B (en) 2012-07-25
BRPI0615049A2 (pt) 2011-04-26
IL220816A (en) 2014-08-31
IL305084A (en) 2023-10-01
IL226985A0 (en) 2013-07-31
US20190030177A1 (en) 2019-01-31
IL189461A (en) 2013-07-31
ES2533992T3 (es) 2015-04-16
IL248076B (en) 2021-04-29
AU2006283726C1 (en) 2015-05-07
CA3000520C (en) 2023-04-04
EP2399609B1 (en) 2015-03-18
IL220816A0 (en) 2012-08-30
EA200800657A1 (ru) 2008-08-29
BRPI0615049B1 (pt) 2023-04-25
CA2620343A1 (en) 2007-03-01
EP1928503A2 (en) 2008-06-11
DK1928503T3 (da) 2012-10-15
MX2008002597A (es) 2008-03-14
CA2794554C (en) 2015-09-22
EP2399609A1 (en) 2011-12-28
IL282138B2 (en) 2024-01-01
NZ716641A (en) 2017-06-30
US20130281678A1 (en) 2013-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013327B1 (ru) Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств
JP2022068295A (ja) 非開裂リンカーを介して連結した細胞結合物質メイタンシノイド複合体を用いて特定の細胞集団を標的とする方法、前記複合体、および前記複合体の製造法
JP2009506032A5 (ru)
EP1853322A2 (en) Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
EA025786B1 (ru) Способ производства конъюгатов с улучшенной гомогенностью
AU2017218969B2 (en) Process for preparing maytansinoid antibody conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ MD TJ TM