CN105007950B - 抗体药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗cKIT抗体、抗体片段、抗体药物缀合物和它们治疗癌症的用途。

Description

抗体药物缀合物
发明领域
本公开涉及抗cKIT抗体、抗体片段、抗体药物缀合物和它们治疗癌症的用途。
发明背景
cKIT是一种结合配体干细胞因子(SCF)的单次跨膜受体酪氨酸激酶。SCF诱导cKIT的同型二聚化，所述同型二聚化激活其酪氨酸激酶活性并通过PI3-AKT途径和MAPK途径发送信号(Kindblom等人,Am J.Path.1998152(5):1259)。作为猫逆转录病毒表达的截短形式，起初将cKIT作为一种癌基因发现(Besmer等人,J Virol.1986；60(1):194–203)。克隆相应的人基因显示cKIT是III型受体酪氨酸激酶的成员，其中认为FLT3、CSF-1受体和PDGF受体属于本家族成员。
为cKIT的突变体的小鼠已经显示，造血细胞、生殖细胞、肥大细胞和黑素细胞的发育需要cKIT。在人类中，cKIT功能丧失可能导致耳聋和皮肤和毛发的去色素沉着。已经在多种癌症中描述了cKIT的众多获得功能的突变。这类癌症包括胃肠道间质肿瘤(GIST)、急性髓样白血病(AML)、小细胞肺癌(SCLC)、肥大细胞白血病(MCL)和胰腺癌(Hirota等人,Science1998(279):577；Esposito等人,Lab.Invets.200282(11):1481)。
因为cKIT是癌基因的这些初步提示，产生了一种抗体，所述抗体将cKIT鉴定为急性髓性白血病的标志物(Gadd等人,Leuk.Res.1985(9):1329)。通过使用来自人类患者的白血病母细胞和结合型cKIT，产生这种鼠单克隆抗体，称作YB5.B8，所述结合型cKIT在急性髓性白血病细胞的表面上大量表达，但是未检测到正常血液或骨髓细胞上的cKIT(Gadd等人，上文)。产生了阻断SCF与cKIT结合并且因此阻断cKIT信号传导的第二种cKIT抗体(SR-1)(Broudy等人,Blood 199279(2):338)。SR-1抗体的生物学效果是抑制BFU-E和CFU-GM生长，并且基于这种证据，建议使用它在造血或肿瘤细胞生长方面进一步研究(Broudy等人，上文)。
在其他的癌症研究中，研究者发现用伊马替尼(cKIT的小分子抑制剂)治疗将显著减少GIST细胞系增殖。但是，伊马替尼处理的细胞随时间推移而变得耐药，原因在于cKIT中的二次突变(Edris等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,提早在线版2013)。然而，如果将GIST细胞用SR-1抗体作为第二治疗药处理，则存在细胞增殖的显著减少及细胞表面上cKIT表达的下降(Edris等人，上文)。因此，裸露的SR-1抗体有效解决了人GIST系中的伊马替尼耐药性问题，提示伊马替尼/抗cKIT抗体组合可能是有用的。
抗体药物缀合物
抗体药物缀合物(“ADCs”)已经用于治疗癌症中细胞毒性药物的局部递送(参见例如，Lambert,Curr.Opinion In Pharmacology 5:543-549,2005)。ADC允许定向递送药物部分，其中可以实现最大效力，同时毒性最小。由于更多的ADC显示有前景的临床结果，因此开发新治疗药用于癌疗法的需求增加。
发明简述
本公开是涉及通式Ab-(L-(D)m)n的抗体药物缀合物或其可药用盐；其中Ab是与人cKIT的表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段；L是接头；D是药物部分；m是从1至8的整数；并且n是从1至10的整数。
抗体药物缀合物，其中所述n是0或1。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合cKIT的胞外结构域(SEQ ID NO.160)。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段在结构域1-3处(SEQ ID NO.155)与人cKIT的表位特异性结合。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO.161和SEQ IDNO.162处特异性结合人cKIT。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO.163和SEQ IDNO.164处特异性结合人cKIT。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:76的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:77的HCDR2、(c)SEQ ID NO:78的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:85的LCDR1、(e)SEQ ID NO:86的LCDR2和(f)SEQ ID NO:87的LCDR3；
(ii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:22的HCDR1、(b)SEQ ID NO:23的HCDR2、(c)SEQ ID NO:24的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:31的LCDR1、(e)SEQ ID NO:32的LCDR2和(f)SEQ ID NO:33的LCDR3；
(iii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:130的HCDR1、(b)SEQ IDNO:131的HCDR2、(c)SEQ ID NO:132的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:139的LCDR1、(e)SEQ ID NO:140的LCDR2和(f)SEQ ID NO:141的LCDR3；
(iv)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:58的HCDR1、(b)SEQ IDNO:59的HCDR2、(c)SEQ ID NO:60的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:67的LCDR1、(e)SEQ ID NO:68的LCDR2和(f)SEQ ID NO:69的LCDR3；
(v)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:40的HCDR1、(b)SEQ ID NO:41的HCDR2、(c)SEQ ID NO:42的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:49的LCDR1、(e)SEQ ID NO:50的LCDR2和(f)SEQ ID NO:51的LCDR3；
(vi)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:94的HCDR1、(b)SEQ IDNO:95的HCDR2、(c)SEQ ID NO:96的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:103的LCDR1、(e)SEQ ID NO:104的LCDR2和(f)SEQ ID NO:105的LCDR3；
(vii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:112的HCDR1、(b)SEQ IDNO:113的HCDR2、(c)SEQ ID NO:114的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:121的LCDR1、(e)SEQ ID NO:122的LCDR2和(f)SEQ ID NO:123的LCDR3；或
(viii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:3的HCDR1、(b)SEQ IDNO:4的HCDR2、(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:12的LCDR1、(e)SEQ ID NO:13的LCDR2和(f)SEQ ID NO:14的LCDR3。
抗体药物缀合物，其中CDR内部的至少一个氨基酸由表1的另一种抗cKIT抗体的相应CDR的相应残基取代。
抗体药物缀合物，其中已经修饰、缺失或取代CDR内部的一个或两个氨基酸。
抗体药物缀合物，其在轻链可变区或重链可变区范围内保留至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
抗体药物缀合物，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
抗体药物缀合物，其中所述接头(L)选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。
抗体药物缀合物，其中接头衍生自选自以下的交联试剂：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧杂吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
抗体药物缀合物，其中所述接头衍生自交联试剂N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。
抗体药物缀合物，其中所述药物部分(D)选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
抗体药物缀合物，其中药物部分是类美登素。
抗体药物缀合物，其中类美登素是N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(DM1)或N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM4)。
抗体药物缀合物，其与另一种治疗剂组合。
抗体药物缀合物，其与表16中列出的治疗剂组合。
式的抗体药物缀合物
或其可药用盐；其中Ab是与人cKIT特异性结合的抗体或其抗原结合片段，并且至 少n个数目的伯胺；并且n是从1至10的整数。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段在结构域1-3处(SEQ ID NO.155)与人cKIT的表位特异性结合。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO.161和SEQ IDNO.162处特异性结合人cKIT。
抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO.163和SEQ IDNO.164处特异性结合人cKIT。
抗体药物缀合物，其中所述Ab是一种包含以下的抗体或其抗原结合片段：(i)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:76的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:77的HCDR2、(c)SEQ ID NO:78的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:85的LCDR1、(e)SEQ ID NO:86的LCDR2和(f)SEQ ID NO:87的LCDR3；
(ii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:22的HCDR1、(b)SEQ ID NO:23的HCDR2、(c)SEQ ID NO:24的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:31的LCDR1、(e)SEQ ID NO:32的LCDR2和(f)SEQ ID NO:33的LCDR3；
(iii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:130的HCDR1、(b)SEQ IDNO:131的HCDR2、(c)SEQ ID NO:132的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:139的LCDR1、(e)SEQ ID NO:140的LCDR2和(f)SEQ ID NO:141的LCDR3；
(iv)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:58的HCDR1、(b)SEQ IDNO:59的HCDR2、(c)SEQ ID NO:60的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:67的LCDR1、(e)SEQ ID NO:68的LCDR2和(f)SEQ ID NO:69的LCDR3；
(v)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:40的HCDR1、(b)SEQ ID NO:41的HCDR2、(c)SEQ ID NO:42的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:49的LCDR1、(e)SEQ ID NO:50的LCDR2和(f)SEQ ID NO:51的LCDR3；
(vi)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:94的HCDR1、(b)SEQ IDNO:95的HCDR2、(c)SEQ ID NO:96的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:103的LCDR1、(e)SEQ ID NO:104的LCDR2和(f)SEQ ID NO:105的LCDR3；
(vii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:112的HCDR1、(b)SEQ IDNO:113的HCDR2、(c)SEQ ID NO:114的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:121的LCDR1、(e)SEQ ID NO:122的LCDR2和(f)SEQ ID NO:123的LCDR3；或
(viii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:3的HCDR1、(b)SEQ IDNO:4的HCDR2、(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:12的LCDR1、(e)SEQ ID NO:13的LCDR2和(f)SEQ ID NO:14的LCDR3。
抗体药物缀合物，其中CDR内部的至少一个氨基酸由表1的另一种抗cKIT抗体的相应CDR的相应残基取代。
抗体药物缀合物，其中已经修饰、缺失或取代CDR内部的一个或两个氨基酸。
抗体药物缀合物，其在轻链可变区或重链可变区范围内保留至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
抗体药物缀合物，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、人抗体、单链抗体或抗体片段。
抗体药物缀合物，其中所述n是从2至8的整数。
抗体药物缀合物，其中所述n是从3至4的整数。
抗体药物缀合物，其与另一种治疗剂组合。
抗体药物缀合物，其与表16中列出的治疗剂组合。
药物组合物，包含该抗体药物缀合物和可药用载体。
药物组合物，其中所述组合物作为冷冻干燥物制备。
药物组合物，其中所述冷冻干燥物包含抗体药物缀合物、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20。
治疗有需要的患者中cKIT阳性癌的方法，包括向所述患者施用该抗体药物缀合物或该药物组合物。
治疗方法，其中所述癌选自胃肠道间质肿瘤(GIST)、小细胞肺癌(SCLC)、急性髓样白血病(AML)、黑素瘤、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞增多症、神经纤维瘤病、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。
方法，其中抗体药物缀合物或药物组合物与另一种治疗剂组合施用。
方法，其中抗体药物缀合物或药物组合物与表16中所列的治疗剂组合施用。
用作药物的抗体药物缀合物。
用于治疗cKIT阳性癌的抗体药物缀合物或药物组合物。
抗体药物缀合物，其与另一种治疗剂组合施用。
抗体药物缀合物，其与表16中列出的治疗剂组合施用。
编码该抗体或抗原结合片段的核酸。
包含该核酸的载体。
包含该载体的宿主细胞。
用于产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培育该宿主细胞并从培养物回收抗体。
用于产生抗cKIT抗体药物缀合物的方法，所述方法包括：(a)通过化学方法将SMCC与药物部分DM-1连接；(b)使所述接头-药物与从细胞培养物回收的抗体缀合；和(c)纯化抗体药物缀合物。
抗体药物缀合物，其具有用紫外分光光度计测量的约3.5的类美登素对抗体比平均值(MAR)。
抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:76的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:77的HCDR2、(c)SEQ ID NO:78的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:85的LCDR1、(e)SEQ ID NO:86的LCDR2和(f)SEQ ID NO:87的LCDR3；
(ii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:22的HCDR1、(b)SEQ ID NO:23的HCDR2、(c)SEQ ID NO:24的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:31的LCDR1、(e)SEQ ID NO:32的LCDR2和(f)SEQ ID NO:33的LCDR3；
(iii)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:130的HCDR1、(b)SEQ IDNO:131的HCDR2、(c)SEQ ID NO:132的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:139的LCDR1、(e)SEQ ID NO:140的LCDR2和(f)SEQ ID NO:141的LCDR3；
(iv)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:58的HCDR1、(b)SEQ IDNO:59的HCDR2、(c)SEQ ID NO:60的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:67的LCDR1、(e)SEQ ID NO:68的LCDR2和(f)SEQ ID NO:69的LCDR3；
(v)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:40的HCDR1、(b)SEQ ID NO:41的HCDR2、(c)SEQ ID NO:42的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:49的LCDR1、(e)SEQ ID NO:50的LCDR2和(f)SEQ ID NO:51的LCDR3；
(vi)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:94的HCDR1、(b)SEQ IDNO:95的HCDR2、(c)SEQ ID NO:96的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:103的LCDR1、(e)SEQ ID NO:104的LCDR2和(f)SEQ ID NO:105的LCDR3；
(vii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:112的HCDR1、(b)SEQ IDNO:113的HCDR2、(c)SEQ ID NO:114的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQID NO:121的LCDR1、(e)SEQ ID NO:122的LCDR2和(f)SEQ ID NO:123的LCDR3；或
(viii)重链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:3的HCDR1、(b)SEQ IDNO:4的HCDR2、(c)SEQ ID NO:5的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:12的LCDR1、(e)SEQ ID NO:13的LCDR2和(f)SEQ ID NO:14的LCDR3。
诊断试剂，包含经标记的所述抗体或其抗原结合片段。
诊断试剂，其中标记物选自放射标记物、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
术语“烷基”指具有指定碳原子数目的单价饱和烃链。例如，C1-6烷基指具有1个至6个碳原子的烷基。烷基可以是直链或支链的。代表性支链烷基具有一个、两个或三个分支。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、和叔-丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)和己基。
如本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽，所述多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的四聚体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定域由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补性决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基端至羧基端排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补系统的第一组分(C1q))结合。
术语“抗体”包括，但不限于，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明公开抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
“互补性决定结构域”或“互补决定区(“CDR”)可互换地指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，其携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15-20％的可变结构域。CDR可以按其区域和顺序提到。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”均指重链可变区的第一CDR。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余片段(所谓的构架区)显示出较小的氨基酸序列变异性(Kuby,Immunology,第4版,第4章,W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。
CDR和构架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定，例如，Kabat、Chothia和AbM(参见，例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia andLesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic AcidsRes.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268–9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121–153(1991)；和Rees等人,引自Sternberg M.J.E.(编著),Protein StructurePrediction,Oxford University Press,Oxford,141–172(1996)。
轻链和重链均分成具有结构同源性和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”以功能方式使用。在这个方面，将可以理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物学特性如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合作用等。按常规，恒定区结构域的编号随着它们变得距抗体的抗原结合位点或氨基端更远而增加。N端是可变区并且在C端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端结构域。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。结合片段的例子包括但不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；由VH域组成的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。
另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等人,Science242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988。术语“抗原结合片段”也意在涵盖这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗原结合片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。
也可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单体抗体)。
可以将抗原结合片段掺入单链分子中，其中所述单链分子包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,ProteinEng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本上相同的氨基酸序列或从相同遗传源衍生的多肽，包括抗体和抗原结合片段等。这个术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制备物。一种单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中构架和CDR区均从人源序列衍生。另外，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这类人序列，例如，人种系序列、或者突变形式的人种系序列或含有从人构架序列分析导出的共有构架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。
本公开的人抗体可以包括人序列不编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变，或促进稳定性或制造的保守性取代)。
如本文所用的术语“识别”指发现其表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”指抗原上与本公开的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般丧失。表位一般包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，X射线结晶学和2-二维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris编著(1996))。“互补位”是识别抗原表位的抗体部分。
在描述抗原(例如，蛋白质)和抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”指确定抗原在蛋白质异质群体和其他生物制品中例如在生物样品(例如，血液、血清、血浆或组织样品)中存在的结合反应。因此，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少两倍于背景并且所述抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在一个方面，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少10倍于背景并且所述抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在这类条件下与抗体或结合剂特异性结合可能需要已经就其针对选择特定蛋白质的特异性选择抗体或结合剂。根据需要或适宜的，可以通过扣除与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体，实现这种选择。备选地，在一些方面，选择与某些所需分子交叉反应的抗体或抗体片段。
如本文所用的术语“亲和力”指抗体和抗原之间在单一抗原性位点处相互作用的强度。在每个抗原位点内部、抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
因此，术语“分离的抗体”指一种抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，与一种抗原特异性结合的分离抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。另外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“相应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，其中与人种系免疫球蛋白可变区序列编码的其他全部其他已知可变区氨基酸序列相比，所述人可变区氨基酸序列或子序列与参比可变区氨基酸序列或子序列共有确定的最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参比可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是构架区、仅是互补决定区、是构架区和互补决定区、可变区段(如上文定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列，确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参比可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
多种免疫测定法可以用来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规地用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。一般，特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更一般高于背景至少10至100倍的信号
术语“平衡解离常数(KD(M)”指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域的任何已知方法，测量平衡解离常数。本公开的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”指施用至患者的药物的给定量的全身性利用率(即，血液/血浆水平)。生物利用率是一个绝对术语，其表示从所施用剂型到达总循环的药物时间(速率)和总量(程度)的度量。
如本文所用，短语“基本上由……组成”指方法或组合物中所包含的活性药用物质以及对该方法或组合物的预期目的而言无活性任何赋形剂的类属或物种。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本公开的抗体药物缀合物之外的一种或多种额外活性物质。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本公开的抗体药物缀合物和第二共同施用的物质之外的一种或多种额外活性物质。
术语“氨基酸”指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后经修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。
术语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列，保守性修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任何给出的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因而，在其中丙氨酸由某个密码子指定的每个位置，可以将该密码子变成任一个所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默性变异”，它们是一个种类的保守性修饰变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每种可能沉默变异。技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(例外是AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默性变异内含于每个描述的序列中。
对于多肽序列，“保守性修饰的变体”包括对多肽序列的各个取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性取代表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排除它们。以下8个组含有彼此互为保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton,Proteins(1984))。在一些方面中，术语“保守性序列修饰”用来指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用的术语“优化”指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列经工程化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的起始氨基酸序列，也称作“亲本”序列。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，术语“相同百分数”或“同一性百分数”指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在正在比较的区域范围内具有相同的氨基酸序列或核苷酸序列，则它们是“相同的”。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于具有至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内，或更优选地存在于具有100个至500个或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。
对于序列比较，一般地一个序列充当检验序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，根据需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。
如本文所用，“比较窗口”包括涉及一段任意的连续位置数，所述的连续位置数选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中一个序列可以与具有相同连续位置数的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(见，例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology，2003)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过查询序列中长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字命中充当种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述字命中在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的报酬评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值跌落达量X；累积评分因积累一个或更多负评分残基比对而达到或低于零；或抵达两个序列中任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915)、比对(B)50、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则将认为核酸相似于参考序列。
还可以使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
除上文所示的序列同一性的百分数之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫杂交反应，如下文描述。因此，在两种肽仅因保守性取代而不同的情况下，一个多肽一般与第二多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指标是这两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两个核酸序列基本上相同的又一个指标是相同的引物可以用来扩增该序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用并且指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链形式或双链形式的聚合物。本术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰型主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似参考核苷酸的方式代谢。这类类似物的例子包括而不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，实现简并密码子取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
术语“有效连接”在核酸的语境下指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。一般，它指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列有效连接。通常，与已转录的序列有效连接的启动子转录调节序列物理地与已转录的序列连续，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要物理上与它们增强其转录的编码序列连续或与之紧邻。
术语“多肽”和“蛋白质”在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，特定多肽序列还内在包括其保守性修饰的变体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”指抗体或其抗原结合片段与另一种药物如化疗药、毒素、免疫治疗剂、成像探针等连接。该连接可以是共价键或非共价相互作用，如借助静电力。可以使用本领域已知的多种接头以形成免疫缀合物。额外地，可以将免疫缀合物以可以是从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”指通过连接最初编码分离的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。术语“非人其动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、绵羊、犬、牛、鸡、两栖类和爬行类。除非指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“毒素”、“细胞毒素”或“细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何物质。
如本文所用，术语“抗癌剂”指可以用来治疗细胞增殖性疾病如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放疗法和放疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
如本文所用，术语“药物部分”或“有效载荷”指与抗体或抗原结合片段缀合的化学部分，并且可以包括任何治疗剂或诊断剂，例如，抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病剂药)或麻醉剂。在某些方面，药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。用于将这些药物中每种药物连接至与本公开抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。参见，例如，Singh等人,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols,第525卷,445-457。此外，有效载荷可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记物、红外探针、亲和力探针、螯合剂、分光探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记物，DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖。
术语“类美登素(maytansinoid)药物部分”意指具有类美登素化合物结构的抗体-药物缀合物的亚结构。美坦辛首次从非洲灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。已经报道合成性美登醇和美登醇类似物。参见美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663和4,371,533，和Kawai等人(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451)，所述文献各自明确地通过引用的方式并入。可用于缀合的类美登素的具体例子包括DM1、DM3和DM4。
“肿瘤”指肿瘤细胞生长和增殖，无论为恶性或良性，以及全部癌前和癌性细胞及组织。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖速率、生存力或转移活性降低。一种显示抗肿瘤活性的可能方式是显示肿瘤细胞生长速率下降、肿瘤尺寸停滞或肿瘤尺寸减小。可以使用接受的体外或体内肿瘤模型评估这种活性，所述肿瘤模型包括但不限于异种移植模型、异体移植模型，MMTV模型和本领域已知研究抗肿瘤活性的其他已知模型。
术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调节或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞已经不移行至受试者身体中除原始肿瘤部位之外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞移行至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。
术语“cKIT”指一种作为受体酪氨酸激酶III家族成员的酪氨酸激酶受体。cKIT的核酸序列和氨基酸序列是已知的，并且已经以Genbank登录号X06182.1、EU826594.1、GU983671.1、HM015525.1、HM015526.1、AK304031.1和BC071593.1公开。关于人cKIT cDNA序列，还参见SEQ ID NO:1，并且关于人cKIT蛋白序列，还参见SEQ ID NO.2。在结构上，cKIT受体是一种I型跨膜蛋白并且含有一个信号肽、5个在胞外结构域中的Ig样C2结构域并其胞内结构域中具有一个蛋白激酶结构域以及在其全长范围内与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在结构上，cKIT核酸序列在其全长范围内与SEQ ID NO 1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
术语“表达cKIT的癌”或“cKIT阳性癌”指在癌细胞表面上表达cKIT和/或突变形式cKIT的癌。
如本文所用，术语对任何疾病或病症的“治疗”或“治疗”在一个方面指改善该疾病或病症(即，延缓或停滞或减少疾病或其至少一个临床症状的形成)。在另一个方面，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指缓和或改善至少一个身体参数，包括患者可能不可察觉的那些身体参数。在又一个方面，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指在身体上(例如，稳定可察觉症状)、生理上(例如，稳定身体参数)或这两方面或生理上调节疾病或病症。在又一个方面，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指防止或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所需结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些方面，治疗可接受量不引起或不造成不利副作用。可以通过首先施用低剂量并且随后递增增加该剂量直至实现所需效果，确定治疗可接受量。本公开分子的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状发作或导致疾病症状的严重程度下降，所述疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“共同施用”指个体的血液中同时存在两种活性药物。共同施用的活性药物可以同时或依次递送。
附图简述
图1显示cKIT-MCC-DM1ADC在癌细胞系子集中的活性。
图2描述了f9P3-MCC-DM1、9P3-SPDB-DM4和9P3-CX1-1-DM1在癌细胞系子集中的活性。
图3显示9P3-MCC-DM1在一组具有不定cKIT表面受体表达水平的急性髓性白血病、GIST、黑素瘤和SCLC细胞系中的活性。
图4显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制GIST-T1(伊马替尼敏感)细胞增殖的能力。
图5显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制GIST 430(伊马替尼耐药)细胞增殖的能力。
图6显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制NCI-H526(cKIT表达较高的SCLC)细胞增殖的能力。
图7显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制NCI-H1048(cKIT表达较低的SCLC)细胞增殖的能力。
图8显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制CMK11-5(cKIT高表达的AML)细胞增殖的能力。
图9显示cKIT-MCC-DM1ADC抑制Uke-1(cKIT表达较低的AML)细胞增殖的能力。
图10是作为针对测量中标准误修正的差异而作图的HDx-MS原始数据。更大的负值表示当9P3与cKIT抗原结合时免受氘交换的更大保护作用。保护作用最明显的两个区域显示为区域1和区域2。
图11显示使用表面填充法定位了HDx-MS保护区域：区域1(黑色)和区域2(深灰色)。SCF结合位点显示为位点I(浅灰色球状体)、位点II(中等灰色球状体)和位点III(更暗的灰色球状体)。
图12是显示SCF、NEG085-MCC-DM1、NEG024-MCC-DM1和20376-MCC-DM1在15分钟后调节野生型cKIT细胞系Mo7e(图12(A))或突变cKIT细胞系GIST-T1(图12(B))中cKIT磷酸化的能力的蛋白质印迹。
图13显示NEG085抗体和20376抗体介导在GIST-T1细胞(A)上和人骨髓细胞(B)上的表面cKIT快速内化。
图14是显示SCF或NEG085-MCC-DM1加速cKIT在突变cKIT细胞系GIST-T1(图14A)和野生型cKIT细胞系NCI-H526(图14B)中某个时程范围内降解的能力的蛋白质印迹。
图15显示NEG085、NEG024、20376，NEG085-MCC-DM1抑制Mo7e细胞的SCF依赖性增殖的能力。
图16显示NEG085和NEG085-MCC-DM1抑制Mo7e细胞的SCF非依赖性增殖的能力。
图17显示对Campath(抗CD52Ab)、NEG085或20376抗体在Uke-1细胞中不体外诱导ADCC的能力的评定。
图18显示NEG085和20376不介导原代人肥大细胞凋亡。
图19显示NEG085和20376不介导原代人肥大细胞脱粒。
图20显示GIST T1异种移植模型中IgG1和NEG027-MCC-DM1的有丝分裂抑制的共定位。
图21显示在cKIT ADC单次给药后有丝分裂停滞(p-组蛋白H3)和凋亡(胱天蛋白酶3)的组织切片。
图22以图形方式显示cKIT ADC单次给药后8天的有丝分裂抑制和凋亡诱导。
图23显示(A)GIST T1小鼠异种移植物中的剂量反应效力和(B)处理过程期间体重的变化。
图24以图形方式描述(A)GIST T1异种移植模型中给药后的抗DM1ELISA和(B)GISTT1异种移植模型中给药后的抗人IgG1ELISA。
图25是GIST T1异种移植物小鼠模型中NEG027-MCC-DM1剂量反应的表。
图26是GIST T1中NEG027-MCC-DM1剂量反应效力的组织学切片。(A)是组4合并的肿瘤，(B)是组5合并的肿瘤。
图27描述(A)GIST T1异种移植物小鼠模型中采用0.625mg/kg时的效力，(B)肿瘤体积相对于对照的变化(％T/C)和(C)处理过程期间体重的变化。
图28显示向GIST T1异种移植物小鼠施用单次剂量抗cKIT ADC后第41日的聚类。
图29是GIST T1异种移植模型中低有效剂量时cKIT ADC效力的表。
图30显示(A)GIST T1异种移植物小鼠模型中的抗cKIT PK(左小图是抗DM1ELISA)(B)右小图是抗人IgG1ELISA。
图31A-C显示(A)SCLC模型中的NEG085-MCC-DM1，NEG024MCC-DM1和NEG086-MCC-DM1活性、(B)处理过程期间体重的变化和(C)肿瘤样品上cKIT的表达。
图32是NCI-H1048SCLC中抗cKIT-ADC效力研究的表。
图33A-B显示(A)NCI-H1048(SCLC)异种移植模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应，(B)处理过程期间体重的变化。
图34是显示NCI-1048(SCLC)异种移植物小鼠模型中NEG085-MCC-DM1效力研究的表。
图35A-C显示(A)NCI-H526(SCLC)异种移植物小鼠模型中20376和NEG024的效力，(B)给药后的抗体血清浓度和(C)cKIT IHC显示H526肿瘤上cKIT表达水平。
图36显示小细胞肺癌(SCLC)异种移植模型中的抗cKIT ADC。
图37显示AML异种移植模型(Kasumi-1)中的抗cKIT ADC效力。
图38显示HMC-1肥大细胞增多症异种移植物小鼠模型中的抗cKIT ADC效力。
图39A/B显示小鼠交叉反应性20376-MCC-DM1在GIST T1异种移植物小鼠模型中的效力，(A)剂量和肿瘤体积及(B)处理过程期间体重的变化。
图40A/B显示(A)GIST T1异种移植物小鼠模型中小鼠交叉反应性20376-MCC-DM1的效力–PK和(B)给药后抗体血清浓度。
图41显示GIST T1SCID-beige小鼠中的剂量反应效力研究。
图42A/B显示(A)GIST T1异种移植物小鼠模型中的效力(未缀合时无效力)和(B)处理过程期间体重的变化。
图43是在GIST T1小鼠异种移植模型中效力的比较(未标记的/MCC-DM1/SPDB-DM4)。
图44A/B显示(A)在比较SPDB-DM4和MCC-DM1的GIST 430异种移植模型中的效力和(B)处理过程期间体重的变化
图45显示GIST 430SCID-beige小鼠模型中的效力。
图46是NEG085-MCC-DM1处理后p-组蛋白H3免疫染色的照片。
图47是在施用NEG085-MCC-DM1后通过p-组蛋白H3染色显示的有丝分裂抑制的图。
图48A显示GIST T1肿瘤的cKIT染色，图48B显示GIST T1异种移植模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应，图48C显示用NEG085-MCC-DM1处理的小鼠的体重变化。
图49A显示GIST 430肿瘤的cKIT染色，图49B显示GIST 430异种移植模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应，图49C显示用NEG085-MCC-DM1处理的小鼠的体重变化。
图50A显示NCI-H526肿瘤(小细胞肺癌(SCLC)的cKIT染色，图50B显示NCI-H526异种移植模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应，图50C显示用NEG085-MCC-DM1处理的小鼠的体重变化。
图51A显示在NCI-H526异种移植模型中NEG085-MCC-DM1给药后IgG1的量，图51B是用NEG085-MCC-DM1给药后NCI-H526异种移植模型中抗DM1ELISA的图。
图52A是显示NEG085-MCC-DM1在原发性AML异种移植物小鼠模型中效力的图，图52B显示用NEG085-MCC-DM1处理的小鼠的体重变化。
图53是与cKIT结构域1和2复合的NEG085Fab的晶体结构的示意图。Fab重链为深灰色，Fab轻链为白色并且cKIT结构域为浅灰色。表位和互补位为黑色。
详细描述
本公开提供与cKIT结合的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物。特别地，本公开涉及与cKIT结合并一旦结合则内化的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。本公开的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)可以用于产生抗体药物缀合物。另外，本公开提供抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物具有所希望的药代动力学特征和其他所需属性，并且因此可以用于治疗表达cKIT的癌，而不限于例如胃肠道间质肿瘤(GIST)、小细胞肺癌(SCLC)、急性髓样白血病(AML)、黑素瘤、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞增多症、神经纤维瘤病、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。本公开进一步提供包含抗体药物缀合物的药物组合物，以及制造这类药物组合物及使用它们治疗癌症的方法。
抗体药物缀合物
本公开提供抗体药物缀合物，其中与cKIT特异性结合的抗体、抗原结合片段或其功能等同物与药物部分连接。在一个方面，通过接头借助共价连接，抗体、抗原结合片段或它们的功能等同物连接至作为抗癌剂的药物部分。抗体药物缀合物可以选择性地递送有效剂量的抗癌剂(例如，细胞毒性剂)至表达cKIT的肿瘤组织，因而可以实现更大的选择性(和较低的有效剂量)。
在一个方面，本公开提供式(I)的免疫缀合物：
Ab—(L—(D)m)n
其中Ab表示本文所述的结合cKIT的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1-8的整数；并且
n是从1-20的整数。在一个方面，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体方面，n是3至4。在一些方面，m是1。在一些方面，m是2、3或4。
尽管对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率特定具有确切的整数值(例如，在式(I)中n乘以m)，但是可以理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，原因在于一般与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。免疫缀合物样品的平均载量在本文中称作药物对抗体比率或“DAR”。在类美登素方面，这种可以称作类美登素对抗体比率或“MAR”。在一些方面，DAR在约1和约5之间，并且一般是约3、3.5、4、4.5或5。在一些方面，以重量计至少50％的样品是化合物，具有加或减2的平均DAR，并且优选地至少50％的样品是含有平均DAR加或减1的缀合物。其他方面包括其中DAR是约3.5的免疫缀合物。在一些方面，‘约n’的DAR意指DAR的测量值在n的20％内。
本公开提供包含与药物部分连接或缀合的如本文中公开的抗体，抗体片段(例如，抗原结合片段)及其功能等同物物的免疫缀合物。在一个方面，药物部分D是类美登素药物部分，所述类美登素药物部分包括具有以下结构的那些：
其中波浪线表示类美登素的硫原子与抗体药物缀合物的接头共价连接。R在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基。使酰胺基团与硫原子连接的亚烷基链可以是亚甲基、亚乙基或亚丙基，即，m是1、2或3。(美国专利号633,410、美国专利号5,208,020，Chari等人,(1992)Cancer Res.52；127-131，Lui等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:8618-8623)。
对于所公开的免疫缀合物，构思类美登素药物部分的全部立体异构体，即在类美登素的手性碳处R构型和S构型的任何组合。在一个方面，类美登素药物部分具有以下立体化学。
在一个方面，类美登素药物部分是N2’-去乙酰-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(也称作DM1)。DM1由以下结构式代表。
在另一个方面，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美坦辛(也称作DM3)。DM3由以下结构式代表。
在另一个方面，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美坦辛(也称作DM4)。DM4由以下结构式代表。
药物部分D可以通过接头L与抗体连接。L是能够使抗体Ab与药物部分D连接的任何化学部分。接头L通过共价键使抗体Ab与药物D连接。接头试剂是可以用来连接药物部分D和抗体Ab以形成抗体药物缀合物的双官能或多官能部分。可以使用具有与药物部分D和与抗体Ab结合的反应性官能团的接头，制备抗体药物缀合物。半胱氨酸、巯基或胺，例如抗体的N末端或氨基酸侧链如赖氨酸，可以与接头试剂的官能团形成键。
在一个方面，L是可切割接头。在另一个方面，L是不可切割接头。在一些方面，L是酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶可切割接头、酯酶可切割接头、二硫键可还原接头、亲水接头、预先带电荷的接头或基于二羧酸的接头。
在药物部分D(例如类美登素)和抗体Ab之间形成不可切割接头的合适性交联试剂是本领域熟知的并且可以形成包含硫原子(如SMCC)的不可切割接头或无硫原子的那些不可切割接头。在药物部分D(例如类美登素)和抗体Ab之间形成不可切割接头的优选交联试剂包含基于马来酰亚胺或基于卤代乙酰基的部分。根据本公开，将这类不可切割接头描述为衍生自基于马来酰亚胺或基于卤代乙酰基的部分。
包含基于马来酰亚胺的部分的交联试剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(其是SMCC(LC-SMCC)的“长链”类似物)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMSA)、琥珀酰亚胺基-6-(-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(-p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMIP)和含有聚乙二醇间隔基的基于马来酰亚胺的交联试剂，如MAL-PEG-NHS。这些交联试剂形成从基于马来酰亚胺的部分衍生的不可切割接头。下文显示基于马来酰亚胺的交联试剂的代表性结构。
在另一个方面，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)或MAL-PEG-NHS。
包含基于卤代乙酰基的部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酸基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。这些交联试剂形成从基于卤代乙酰基的部分衍生的不可切割接头。下文显示基于卤代乙酰基的交联试剂的代表性结构。
在一个方面，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酸基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。
在药物部分D(例如类美登素)和抗体Ab之间形成可切割接头的合适交联试剂是本领域熟知的。含有二硫键的接头是通过可以在生理条件下发生二硫键交换的可切割的接头。根据本公开，将这类可切割接头描述为衍生自基于二硫键的部分。合适的二硫键交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)，下文显示其结构。这些二硫键交联试剂形成从基于二硫键的部分衍生的可切割接头。
N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
在一个方面，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)。
在药物部分D(例如类美登素)和抗体Ab之间形成带电荷的接头的合适交联试剂称作预先带电荷的交联试剂。在一个方面，从预先带电荷的交联试剂衍生的接头L是CX1-1。CX1-1的结构如下。
2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)
在本公开容提供的一个方面，缀合物由以下任一个结构式代表：
其中：
Ab是与人cKIT特异性结合的抗体或其抗原结合片段；
n，表示通过与Ab的伯胺形成酰胺键与D-L基团连接的数目，是从1至20的整数。在一个方面，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体方面，n是3或4。
在一个方面，缀合物中药物(例如，DM1或DM4)对抗体的平均摩尔比(即，平均w值，也称作类美登素对抗体比率(MAR))是约1至约10、约2至约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1)、约2.5至约7、约3至约5、约2.5至约4.5(例如、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0至约4.0、约3.2至约4.2，或约4.5至5.5(例如,约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5)。
在本公开提供的一个方面，缀合物具有实质高的纯度并具有以下一种或多种特征：(a)大于约90％(例如，大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，优选地大于约95％的缀合物种类是单体，(b)缀合物制品中的未缀合接头水平小于约10％(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)(相对于总接头)，(c)小于10的缀合物种类是交联的(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)，(d)缀合物制品中的游离药物(例如，DM1或DM4)水平小于约2％(例如，小于或等于约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(mol/mol相对总细胞毒性剂)。
如本文所用，术语“未缀合的接头”指与从交联试剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)衍生的接头共价连接的抗体，其中抗体不通过接头共价偶联于药物(例如，DM1或DM4)(即，“未缀合的接头”可以由Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1代表)。
1.药物部分
本公开提供与cKIT特异性结合的免疫缀合物。本公开的免疫缀合物包含与药物部分，例如抗癌剂、抗血液病剂、自身免疫治疗剂、抗炎性剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或麻醉剂缀合的抗cKIT抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物。可以使用本领域已知的任何方法，将抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与几个相同或不同的药物部分缀合。
在某些方面，本公开的免疫缀合物的药物部分选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
在一个方面，本公开的免疫缀合物的药物部分是类美登素药物部分，如但不限于DM1、DM3或DM4。
进一步，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物可以与调节给定生物学反应的药物部分缀合。药物部分不得解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活物、细胞因子、凋亡物质、抗血管生成物质、或生物学反应调节物，例如淋巴因子。
在一个方面，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与药物部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的例子包括但不限于紫杉烷(参见例如，国际(PCT)专利号申请号WO 01/38318和PCT/US03/02675)、DNA-烷基化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂(参见例如，Sasse等人,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)、Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)、Ichimura等人,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991)、Francisco等人,Blood200315；102(4):1458-65)、美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、待决美国专利申请系列号10/024,290和10/116,053和国际(PCT)专利号申请号WO 01/49698)、紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如，氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂药(例如，长春新碱和长春碱)。(参见例如，SeattleGenetics US 20090304721)。
可以与本公开的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等同物缀合的细胞毒素的其他例子包括多卡米星、刺孢霉素、美坦辛和澳瑞司他汀及其衍生物。
多种类型的细胞毒素、接头和用于使治疗药与抗体缀合的方法是本领域已知的，参见，例如，Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括，但不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的例子是可商业获得的，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来使用本文中公开的抗体制备放射免疫缀合物。在某些方面，大环螯合剂是可以经接头分子与抗体连接的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)。这类接头分子是本领域共知的并且在Denardo等人(1998)Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。
本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物还可以与异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合以产生融合蛋白。特别地，本公开提供融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白、多肽或肽。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组技术(统称为“DNA改组”)产生额外的融合蛋白。DNA改组可以用来改变本公开的抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,(1997),Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,(1998),Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物的每篇因而通过引用方式完整地并入)。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变，改变抗体或其片段或编码的抗体或其片段。编码与抗原特异性结合的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
另外，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物可以与标记序列如肽缀合以促进纯化。在优选的方面，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标签，可商业获得其中许多标记。如Gentz等人,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的便利纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell 37:767)，和“FLAG”标签(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods 49:455–465,2001)。如本公开中所述，抗体或抗原结合片段也可以与渗透肿瘤的肽缀合以提高它们的效力。
在其他方面，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与诊断物质或可检测物质缀合。这类免疫缀合物可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的功效)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。这类诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来完成，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于Alexa Fluor 350、AlexaFluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、AlexaFluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于、萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物也可以与特别可用于靶抗原的免疫测定法或纯化的固相支持体连接。这类固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
2.接头
如本文所用，“接头”是能够使抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与另一个部分如药物部分连接的任何化学部分。接头可以在化合物或抗体仍保持活性的条件易于切割(可切割接头)，如，酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。备选地，接头可以基本上抵抗切割(例如，稳定接头或不可切割接头)。在一些方面，接头是预先带电荷的接头、亲水接头或基于二羧酸的接头。
在一个方面，所用的接头衍生自交联试剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。在另一个方面，所用的接头衍生自交联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)或2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
不可切割接头是能够使药物如类美登素与抗体以稳定、共价方式连接并且不脱离上文对可切割接头所列分类的任何化学部分。因此、不可切割接头基本上抵抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键裂解。另外，不可切割指接头中或毗邻接头的化学键在药物如类美登素或抗体不丧失其活性的条件经受住酸、光不稳定性切割剂、肽酶、酯酶或切割二硫键的化学或生理学化合物诱导的切割作用的能力。
酸不稳定接头是在酸性pH可切割的接头。例如，某些胞内区室如内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)，并且提供合适切割酸不稳定接头的条件。
光不稳定接头是在体表在光可抵达的许多体腔中可用的接头。另外，红外光可以穿透组织。
一些接头可以被肽酶切割，即肽酶可切割接头。仅某些肽轻易地在细胞内部或外部被切割，参见例如Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人,43Int.J.Cancer,677-684(1989)。另外，肽由α-氨基酸和肽键组成，所述肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根和第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键。将其他酰胺键，如赖氨酸的羧酸根和ε-氨基之间的键，理解为不是肽键并且视为不可切割的。
一些接头可以被酯酶切割，即酯酶可切割接头。再次，仅某些酯可以被细胞内部或外部存在的酯酶切割。酯由羧酸和醇的缩合形成。简单酯是以简单醇如脂族醇和小环状醇和小芳族醇产生的酯。
预先带电荷的接头衍生自带电荷交联试剂，所述带电荷交联试剂在掺入抗体药物缀合物后保持其电荷。预先带电荷的接头的例子可以在US 2009/0274713中找到。
3.ADC的缀合和制备
本公开的缀合物可以通过本领域已知的任何方法(如在美国专利号7,811,572、6,411,163、7,368,565和8,163,888，以及美国申请公开2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100中描述的那些方法)制备。这些专利和专利申请公开的完整教导通过引用方式并入本文。
单步骤法
在一个方面，本公开的缀合物可以通过单步骤法制备。该方法包括在合适的pH将抗体、药物和交联剂在基本上水性的介质中合并，所述介质任选地含有一种或多种共溶剂。在一个方面，该方法包括步骤：在具有pH约4至约9的溶液中使本公开的抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物的第一混合物，并且随后使包含抗体和药物的第一混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以提供包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)和(iii)反应副产物的混合物。
在一个方面，单步骤法包括在具有约6或更大(例如、约6至约9、约6至约7、约7至约9、约7至约8.5、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约8.0至约9.0，或约8.5至约9.0)pH的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，该方法包括使细胞结合剂在具有pH约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的溶液中与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在另一个方面，该方法包括在具有pH约7.8(例如，pH 7.6至8.0或pH 7.7至7.9)的溶液中使细胞结合剂与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
单步骤法(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1接触)可以在本领域已知的任何合适温度实施。例如，单步骤法可以在约20℃或更低温度(例如，约-10℃(前提是防止溶液冻结，例如，因存在用来溶解细胞毒性剂和双官能交联试剂的有机溶剂防止溶液冻结)至约20℃、约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)，或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)进行。在一个方面，单步骤法在约16℃至约24℃(例如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)的温度进行。在另一个方面，单步骤法在约15℃或更低(例如，约-10℃至约15℃或约0℃至约15℃)的温度实施。例如，该方法包括在约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、约-1℃、约-2℃、约-3℃、约-4℃、约-5℃、约-6℃、约-7℃、约-8℃、约-9℃或约-10℃的温度使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，前提是防止溶液冻结，例如，通过存在用来溶解交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、磺基-SPDB、SPDB或CX1-1)的有机溶剂防止溶液冻结。在一个方面，该方法包括在约-10℃至约15℃、约0℃至约15℃、约0℃至约10℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约10℃至约15℃或约5℃至约10℃的温度使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在另一个方面，该方法包括在约10℃的温度(例如，8℃至12℃的温度或9℃至11℃的温度)使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在一个方面，通过以下方式实现上述的接触：提供抗体，随后使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的第一混合物，并且随后使包含抗体和药物的第一混合物(例如，DM1或DM4)与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，在一个方面，在反应容器中提供抗体，添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器(因而与抗体接触)，并且随后将交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加至包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物(因而与包含抗体和药物的混合物接触)。在一个方面，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后立即添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器。在另一个方面，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后某个时间区间(例如，在向该空间提供细胞结合剂后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟，约1小时、约1天或更长时间)之后添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器。药物(例如，DM1或DM4)可以迅速(即，在短时间区间，如约5分钟、约10分钟内)或缓慢(如通过使用泵)添加。
包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物随后可以与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后立即接触或在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后的某个更晚时间点(例如，约5分钟至约8小时或更长时间)接触。例如，在一个方面，在添加药物(例如，DM1或DM4)至包含抗体的反应容器后立即添加交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)至包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物。备选地，包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物可以在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长时间与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后，使反应推进约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更长时间(例如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时)。
在一个方面，单步骤法还包括使任何未反应的药物(例如，DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)猝灭的猝灭步骤。猝灭步骤一般在纯化缀合物之前进行。在一个方面，通过使混合物与猝灭试剂接触，使混合物猝灭。如本文所用，“猝灭试剂”指与游离药物(例如，DM1或DM4)和/或游离交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应的试剂。在一个方面，马来酰亚胺或卤乙酰胺猝灭试剂，如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰氨基丙酸，可以用来确保猝灭药物(例如，DM1或DM4)中的任何未反应基团(如巯基)。猝灭步骤可以帮助防止药物(例如，DM1)二聚化。二聚化DM1可能难以移除。一旦用极性、带电荷的巯基猝灭试剂(如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)猝灭，多余的未反应DM1转化成极性、带电荷的水溶性加合物，其中所述加合物可以在纯化步骤期间容易地与共价连接的缀合物分离。也可以使用用非极性和中性巯基猝灭试剂猝灭。在一个方面，使混合物与猝灭试剂接触，使混合物猝灭，其中所述猝灭试剂与未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应。例如，可以添加亲核试剂至混合物以猝灭任何未反应的SMCC。亲核试剂优选地是含有氨基的亲核试剂，如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。
在另一个方面，在使混合物与猝灭试剂接触之前，允许反应(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触)推进至完成。在这个方面，将猝灭试剂在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或约25小时至约48小时)添加至混合物。
备选地，通过降低混合物pH至约5.0(例如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)，使混合物猝灭。在另一个方面，通过降低混合物pH至小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0，使混合物猝灭。备选地，将pH降低至约4.0(例如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至约6.0(例如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、约4.0至约5.0、约4.5(例如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至约5.0。在一个方面，通过降低混合物pH至4.8，使混合物猝灭。在另一个方面，通过降低混合物pH至5.5，使混合物猝灭。
在一个方面，单步骤法还包括从抗体释放不稳定结合的接头的维持步骤。维持步骤包括在纯化缀合物之前(例如，在反应步骤后，在反应步骤和猝灭步骤之间，或在猝灭步骤后)维持混合物。例如，该方法包括(a)在具有pH约4至约9的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物；并且随后使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1，Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)，(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)，和(iii)反应副产物的混合物，(b)维持在步骤(a)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，和(c)纯化混合物以提供纯化的缀合物。
在另一个方面，该方法包括(a)在具有pH约4至约9的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物；并且随后使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)和(iii)反应副产物的混合物，(b)淬灭在步骤(a)中制备的混合物以猝灭任何未反应的药物(例如，DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)，(c)维持在步骤(b)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，和(d)纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)。
备选地，维持步骤可以在纯化缀合物后进行，随后进行额外的纯化步骤。
在另一个方面，在维持步骤之前允许反应推进至完成。在这个方面，维持步骤可以在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或约24小时至约48小时)后进行。
维持步骤包括将溶液维持在合适的温度(例如，约0℃至约37℃)持续合适的时间段(例如，约1小时至约1周、约1小时至约24小时、约1小时至约8小时或约1小时至约4小时)以从抗体释放不稳定结合的接头，同时基本上不从抗体释放稳定结合的接头。在一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约20℃或更低温度(例如，约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)，或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)。在一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约16℃至约24℃(例如，约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)的温度。在另一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃(例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃)的温度。在另一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约37℃(例如，约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度。
维持步骤的持续时间取决于实施维持步骤的温度和pH。例如，可以通过在升高的温度实施维持步骤大幅度减少维持步骤的持续时间，最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性限制。维持步骤可以包括将溶液维持约1小时至约1天(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时，或约24小时)、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约14小时至约24小时、约16小时至约24小时、约18小时至约24小时、约20小时至约24小时、约5小时至约1周、约20小时至约1周、约12小时至约1周(例如、约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)或约1天至约1周。
在一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃的温度持续至少约12小时、至多1周的时间。在另一个方面，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃的温度过夜(例如，约12至约24小时，优选地约20小时)。
用于维持步骤的pH值优选地是约4至约10。在一个方面，用于维持步骤的pH值是约4或更大，但是小于约6(例如，4至5.9)或约5或更大，但是小于约6(例如，5至5.9)。在另一个方面，用于维持步骤的pH值范围从约6至约10(例如，约6.5至约9、约6至约8)。例如，用于维持步骤的pH值可以是约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。
在其他方面，维持步骤可以包含将混合物在25℃在pH约6-7.5温育约12小时至约1周，将混合物在4℃在pH约4.5-5.9温育约5小时至约5天，或将混合物在25℃在pH约4.5-5.9温育约5小时至约1天。
单步骤法可以任选地包括向反应步骤添加蔗糖以增加溶解度和回收缀合物。合乎需要地，蔗糖以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)(例如，约0.1％(w/v)、1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)或20％(w/v))的浓度添加。优选地，蔗糖以约1％(w/v)至约10％(w/v)(例如，约0.5％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)或约11％(w/v))的浓度添加。此外，反应步骤还可以包括添加缓冲剂。可以使用本领域已知的任何合适缓冲剂。合适的缓冲剂例如包括柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在一个方面，缓冲剂选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)去水合物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
单步骤法还可以包括纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)的步骤。本领域已知的任何纯化方法可以用来纯化本公开的缀合物。在一个方面，本公开的缀合物使用切线流过滤(TFF)、非吸附性层析、吸附性层析、吸附性过滤、选择性沉淀或任何其他合适的纯化过程以及其组合。在另一个方面，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之前，首先通过一个或多个PVDF膜过滤缀合物。备选地，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之后，通过一个或多个PVDF膜过滤缀合物。例如，在一个方面，将缀合物通过一个或多个PVDF膜过滤并且随后使用切线流过滤法纯化。备选地，将缀合物使用切线流过滤法纯化并且随后通过一个或多个PVDF膜过滤。
任何合适的TFF系统可以用于纯化，包括型系统(Millipore，Billerica，MA)、 Cassette系统(Sartorius AG，Edgewood，NY)，和型系统(PallCorp.，East Hills，NY)。
任何合适的吸附性层析树脂可以用于纯化。优选的吸附性层析树脂包括羟基磷灰石层析、疏水性电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用层析(HIC)、离子交换层析、混合模式离子交换层析、固定化金属亲和层析(IMAC)、染料配体层析、亲和层析、反相层析及其组合。合适的羟基磷灰石树脂的例子包括陶瓷羟基磷灰石(CHTI型和II型，Biorad Laboratories，Hercules，CA)、HA 羟基磷灰石(PallCorp.，East Hills，NY)和陶瓷氟磷灰石(CFTI型和II型，Biorad Laboratories，Hercules，CA)。合适的HCIC树脂的例子是MEP树脂(PallCorp.，East Hills，NY)。合适的HIC树脂的例子包括丁基-Sepharose、己基-Sepharose、苯基-Sepharose和辛基Sepharose树脂(全部来自GEHealthcare，Piscataway，NJ)以及甲基树脂和叔丁基树脂(Biorad Laboratories，Hercules，CA)。合适的离子交换树脂的例子包括和树脂(全部来自GEHealthcare，Piscataway，NJ)和 S树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的混合模式离子交换剂的例子包括 ABx树脂(JTBaker，Phillipsburg NJ)。合适的IMAC树脂的例子包括螯合树脂(GEHealthcare，Piscataway，NJ)和 IMAC树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的染料配体树脂的例子包括蓝色Sepharose树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)和Affi-gel Blue树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的亲和树脂的例子包括蛋白A Sepharose树脂(例如，MabSelect，GE Healthcare，Piscataway，NJ)和凝集素亲和树脂，例如兵豆凝集素树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，其中抗体携带适宜的凝集素结合位点。合适的反相树脂的例子包括C4、C8、和C18树脂(Grace Vydac，Hesperia，CA)。
任何合适的非吸附性层析树脂可以用于纯化。合适的非吸附性层析树脂的例子包括但不限于、SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂(例如，S-200和S-300)、SUPERDEXTM树脂(例如，SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200)、树脂(例如，P-6、P-10、P-30、P-60、和P-100)和本领域普通技术人员已知的其他树脂。
两步骤法和单罐法
在一个方面，本公开的缀合物可以如美国专利7,811,572和美国专利申请公开号2006/0182750中所述制备。这种方法包括步骤：(a)使本公开的抗体与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以将接头(即，Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1)共价连接至抗体并因而制备包含具有与之结合的接头的抗体的第一混合物结合；(b)任选地使第一混合物经历纯化过程以制备具有与之结合的接头的抗体的纯化的第一混合物；(c)通过在具有pH约4至约9的溶液中使具有与之结合的接头的抗体与药物(例如，DM1或DM4)反应，使药物(例如，DM1或DM4)与第一混合物中具有与之结合的接头的抗体缀合以制备包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)；和(iii)反应副产物的第二混合物；和(d)使第二混合物经历纯化过程以将缀合物从第二混合物的其他组分纯化出来。备选地，可以省略纯化步骤(b)。本文所述的任何纯化方法可以用于步骤(b)和(d)。在一个实施方案中，TFF用于步骤(b)和步骤(d)。在另一个实施方案中，TFF是用于步骤(b)并且吸附性层析(例如，CHT)用于步骤(d)。
单步骤试剂和原位法
在一个方面，可以通过如下方式制备本公开的缀合物：使预先形成的药物-接头化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)与本公开的抗体缀合，如美国专利6,441,163和美国专利申请公开号2011/0003969和2008/0145374中所述，随后实施纯化步骤。可以使用本文所述的任何纯化方法。通过使药物(例如，DM1或DM4)与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应制备药物-接头化合物。药物-接头化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)任选地与抗体缀合之前经历纯化。
4.表征和选择所希望的抗体和抗体药物缀合物
可以通过本领域已知的多种测定法，表征本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物并选择它们的物理/化学特性和/或生物活性。
例如，可以通过已知的方法如ELISA、FACS、Biacore或蛋白质印迹法，对本公开的抗体测试其抗原结合活性。
转基因动物和细胞系特别可用于筛选具有预防性或治疗性治疗过量表达肿瘤相关抗原和细胞表面受体的癌的潜力的抗体药物缀合物(ADC)。筛选有用ADC可以涉及在一系列剂量范围内施用候选ADC至转基因动物，并且在各种时间点分析ADC对正在评价的疾病或病症的影响。备选地或额外地，如果适用，药物可以在疾病暴露于诱导物之前或与之同时施用。可以连续和独立地筛选或在中等通量或高通量筛选模式下平行筛选候选ADC。
一个方面是一种筛选方法，所述筛选方法包括(a)将来自表达cKIT的稳定癌细胞系或人类患者肿瘤的细胞(例如，GIST细胞系或肿瘤片段、黑素瘤细胞系或肿瘤片段，AML原代细胞)移植到非人动物中，(b)施用ADC候选药物至非人动物并且(c)确定候选物抑制来自所移植细胞系的肿瘤生长的能力。本公开还涵盖一种筛选ADC候选物用于治疗以过量表达cKIT为特征的疾病或病症的的方法，所述方法包括(a)使来自表达cKIT的稳定癌细胞系的细胞与候选药物接触，和(b)评价ADC候选物抑制稳定细胞系生长的能力。
另一个方面是一种筛选方法，所述方法包括(a)使来自表达cKIT的稳定癌细胞系的细胞与ADC候选药物接触和(b)评价ADC候选物阻断cKIT的配体激活作用的能力。在另一个方面，评价了ADC候选物阻断配体刺激的酪氨酸磷酸化的能力。
又一个方面是一种筛选方法，所述方法包括(a)使来自表达cKIT的稳定癌细胞系的细胞与ADC候选药物接触和(b)评价ADC候选物诱导细胞死亡的能力。在一个方面，评价了ADC候选物诱导凋亡的能力。
可以通过在一系列剂量范围内向转基因动物施用并且评价动物随时间推移对化合物的生理学反应，筛选候选ADC。在一些情况下，可能适宜的是将化合物连同将增强化合物效力的辅因子一起施用。如果衍生自受试者转基因动物的细胞系用来筛选可用于治疗与过量表达cKIT相关的多种病症的ADC，则将试验ADC在适宜的时间添加至细胞培养基，并且使用适宜的生物化学测定法和/或组织学测定法，评价随时间推移细胞对ADC的反应。
因此，本公开提供鉴定特异性靶向cKIT并与之结合的ADC和肿瘤细胞上cKIT过量表达的测定法。
cKIT抗体
本公开提供与人cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。本公开的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括但不限于如以下实施例中所述那样分离的人单克隆抗体或其片段。
本公开在某些方面提供特异性结合cKIT的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含VH结构域，其具有SEQ ID NO:9、28、46、64、82、100、118或136的氨基酸序列(表1)。本公开还提供与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有表1中所列任一个VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。在特定方面，本公开提供与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体包含(或备选地，组成为)一个、两个，三个，四个、五个或更多个具有下表1中所列任一个VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。
本公开提供与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含VL结构域，其具有SEQ ID NO:18、37、55、73、91、109、127或145的氨基酸序列(表1)。本公开还提供与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有下表1中所列任一个VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。特别地，本公开提供与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含(或备选地，组成为)一个、两个，三个或更多个具有表1中所列任一个VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
本公开的其他抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含已经被突变、然而在CDR区内具有至少60、70、80，90或95同一性百分数的氨基酸，所述CDR区以表1中所述的序列描述。在一些方面，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表1所述序列中描述的CDR相比时，已经突变CDR区内不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
本发明还提供了编码与cKIT特异性结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。这些核酸序列可以为哺乳动物细胞中的表达而优化。
表1.抗cKIT抗体的例子
其他本公开的抗体包括这些抗体，其中所述氨基酸或编码所述氨基酸的核酸已经被突变，仍与表1中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性。在一些方面，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表1所述序列中描述的可变区相比时，可变区内不多于1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变，同时保留基本上相同的治疗活性。
由于这些抗体的每一种可以与cKIT结合，可以“混合并匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)以产生其他结合cKIT的抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA，和实施例部分中描述的其他测定法)测试这类“混合和匹配的”结合cKIT的抗体。当这些链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当替换为结构上相似的VH序列。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当替换为结构上相似的全长重链序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当替换为结构上相似的VL序列。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当替换为结构上相似的全长轻链序列。因此，在一个方面，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO:9、28、46、64、82、100、118或136的氨基酸序列的重链可变区(表1)；和包含选自SEQ ID NO:18、37、55、73、91、109、127或145的氨基酸序列的轻链可变区(表1)；其中抗体与cKIT特异性结合。
在另一个方面，本公开提供(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含已经优化用于哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长重链，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:11、29、47、65、83、101、119或137；和包含已经优化用于哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长轻链，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:20、21、38、56、74、92、110、128或146；或(ii)包含其抗原结合部分的有功能的蛋白质。
在另一个方面，本公开提供结合cKIT的抗体，所述抗体包含如表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合。所述抗体的VH CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:3、22、40、58、76、94、112和130中显示。所述抗体的VH CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:4、23、41、59、77、95、113和131中显示。所述抗体的VH CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:5、24、42、60、78、96、114和132中显示。所述抗体的VL CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:12、31、49、67、85、103、121和139中显示。所述抗体的VL CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:13、32、50、68、86、104、122和140中显示。所述抗体的VL CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:14、33、51、69、87、105、123和141中显示。
鉴于这些抗体的每一种均可以与cKIT结合以及抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，不过每种抗体必须含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3以产生其他结合C5的结合分子。可以使用本领域已知的结合测定法和实施例中描述的那些测定法(例如，ELISA)测试这类“混合和匹配的”结合cKIT的抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为结构上相似的CDR序列。普通技术人员将轻易地明白，可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区序列取代为来自本文中对本公开单克隆抗所显示的CDR序列的结构上相似的序列，产生新的VH和VL序列。
因此，本公开提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其包含重链CDR1，所述重链CDR1包含选自SEQ ID NO:3、22、40、58、76、94、112和130的氨基酸序列；重链CDR2，所述重链CDR2包含选自SEQ ID NO:4、23、41、59、77、95、113和131的氨基酸序列；重链CDR3，所述重链CDR3包含选自SEQ ID NO:5、24、42、60、78、96、114和132的氨基酸序列；轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自SEQ ID NO:12、31、49、67、85、103、121和139的氨基酸序列；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自SEQ ID NO:13、32、50、68、86、104、122和140的氨基酸序列；轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自SEQ ID NO:14、33、51、69、87、105、123和141的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合cKIT。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:3的重链CDR1、SEQ ID NO:4的重链CDR2；SEQ ID NO:5的重链CDR3；SEQ IDNO:12的轻链CDR1；SEQ ID NO:13的轻链CDR2；和SEQ ID NO:14的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:22的重链CDR1、SEQ ID NO:23的重链CDR2；SEQ ID NO:24的重链CDR3；SEQ IDNO:31的轻链CDR1；SEQ ID NO:32的轻链CDR2；和SEQ ID NO:33的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:40的重链CDR1、SEQ ID NO:41的重链CDR2；SEQ ID NO:42的重链CDR3；SEQ IDNO:49的轻链CDR1；SEQ ID NO:50的轻链CDR2；和SEQ ID NO:51的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:58的重链CDR1、SEQ ID NO:59的重链CDR2；SEQ ID NO:60的重链CDR3；SEQ IDNO:67的轻链CDR1；SEQ ID NO:68的轻链CDR2；和SEQ ID NO:69的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:76的重链CDR1、SEQ ID NO:77的重链CDR2；SEQ ID NO:78的重链CDR3；SEQ IDNO:85的轻链CDR1；SEQ ID NO:86的轻链CDR2；和SEQ ID NO:87的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:94的重链CDR1、SEQ ID NO:95的重链CDR2；SEQ ID NO:96的重链CDR3；SEQ IDNO:103的轻链CDR1；SEQ ID NO:104的轻链CDR2；和SEQ ID NO:105的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:112的重链CDR1、SEQ ID NO:113的重链CDR2；SEQ ID NO:114的重链CDR3；SEQID NO:121的轻链CDR1；SEQ ID NO:122的轻链CDR2；和SEQ ID NO:123的轻链CDR3。
在一个具体方面，与cKIT特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:130的重链CDR1、SEQ ID NO:131的重链CDR2；SEQ ID NO:133的重链CDR3；SEQID NO:139的轻链CDR1；SEQ ID NO:140的轻链CDR2；和SEQ ID NO:141的轻链CDR3。
在某些方面，与cKIT特异性结合的抗体是在表1中描述的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
1.鉴定表位和与相同表位结合的抗体
本公开提供与cKIT受体的胞外结构域内部表位结合的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。在某些方面，抗体和抗体片段可以与具有cKIT胞外结构域的结构域1-3的表位结合。
本公开还提供与表1中描述的抗cKIT抗体所结合表位相同的表位结合的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。可以因此基于其在cKIT结合测定法中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性抑制结合作用)的能力，鉴定额外的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。试验抗体抑制本公开的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)与cKIT蛋白(例如，人cKIT)结合的能力表明试验抗体可以与这种抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)竞争与cKIT结合；根据非限制的理论，这种抗体可以与cKIT蛋白上与该抗体竞争的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)相同或相关(例如，结构上相似或空间接近的)的表位结合。在某个方面，与cKIT上本公开的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的相同表位结合的抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。可以如本文所述制备并分离这类人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
2.Fc区构架的进一步改变
本公开提供位点特异性标记的免疫缀合物。这些免疫缀合物可以包含修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段还在VH和/或VL内部包含对构架残基的修饰，例如以改善抗体的特性。一般，进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，已经历过体细胞突变的抗体可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可以通过将抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列比较而鉴定这类残基。为了使构架区序列恢复其种系构型，可以例如通过位点定向诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。还意在涵盖这类“回复突变”的抗体。
另一个类型的构架修饰涉及使构架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫化”并且在Carr等人的美国专利公开号2003/0153043中更详细地描述。
除了在构架区或CDR区内部作出修饰之外或作为替代，抗体还可以经工程化以在Fc区内部包含修饰，一般旨在改变抗体的一种或多种功能特征，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。另外，抗体可以经化学修饰(例如一种或多种化学部分可以与抗体连接)或经修饰以改变其糖基化作用，这再次旨在改变抗体的一个或多个功能特征。下文进一步详细描述这些方面的每一项。
在一个方面，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如，增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以便例如促进轻链和重链的装配或增加或减少抗体的稳定性。
在另一个方面，将抗体的Fc铰链区突变以减少抗体的生物半寿期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合作用，抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合作用。在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述这种方法。
在另外的其他方面，通过以下方式改变Fc区：将至少一个氨基酸残基替换为一个不同氨基酸残基以改变抗体的效应功能。例如，可以将一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的效应子配体亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中描述。
在另一个方面，可以将选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的C1q结合作用和/或减少或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。在例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中描述这种方法。
在另一个方面，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。在例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中描述这种方法。在一个具体方面，对于IgG1亚类和κ同种型，将本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸替换为一个或多个同种异型氨基酸残基。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述。
在又一个方面，修饰Fc区以增加该抗体介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的能力和/或以通过修饰一个或多个氨基酸而增加抗体对Fcγ受体的亲和力。在例如Presta的PCT公开WO 00/42072中描述这种方法。另外，已经定位人IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
在又一个方面，调节抗体的糖基化。例如，可以产生去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对“抗原”的亲和力。这类糖类修饰也可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以产生一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除在这个位点处的糖基化。这种去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中描述这种方法。
额外或备选地，可以产生一种抗体，所述抗体具有改变的糖基化类型，如岩藻糖残基数量减少的过低岩藻糖化的抗体或对分型GlcNac结构增加的抗体。这类改变的糖基化模式已经展示增加抗体的ADCC能力。这类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化装置的宿主细胞中表达这种抗体而完成。本领域中已经描述了具有改变的糖基化装置的细胞并且它们可以用作表达重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上遭破坏的细胞系，从而在这种细胞系中表达的抗体显示过低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了一种变异CHO细胞系(Lecl3细胞)，所述细胞系具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)连接的糖的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体过低岩藻糖化(还见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的对分GlcNac结构物，这导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
在另一个方面，修饰抗体以增加其生物半寿期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。备选地，为了增加生物半寿期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvagereceptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
为了使抗体的ADCC活性最小化，Fc区内的特定突变产生了与效应子细胞具有最小相互作用的“Fc沉默”抗体。从总体上看，“IgG Fc区”用来限定免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。人IgG重链Fc区通常上定义为包含IgG抗体的从位置C226或从位置P230至羧基端的氨基酸残基。Fc区中残基的编号是Kabat的EU index的编号。例如，在抗体的产生或纯化期间可以移除Fc区的C端赖氨酸(残基K447)。
沉默的效应功能可以通过在抗体的Fc区内突变获得并已经在本领域中描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.第20(6):685-691卷)和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.181:6664-69)还参见Heusser等人WO 2012065950。沉默的Fc lgG1抗体的例子是在lgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体。沉默的lgG1抗体的另一个例子是DAPA(D265A、P329A)突变(US 6,737,056)。另一个沉默的IgG1抗体包含N297A突变，该突变导致去糖基化/非糖基化的抗体。
Fc沉默抗体导致无ADCC活性或低ADCC活性，这意味Fc沉默抗体显示出低于50％特异性细胞裂解的ADCC活性，无ADCC活性意指Fc沉默抗体显示出低于1％的ADCC活性(特异性细胞溶解)。
3.cKIT抗体的产生
可以通过本领域已知的任何手段产生抗cKIT抗体及其抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述手段包括但不限于重组表达、化学合成和酶消化抗体四聚体，其中可以通过例如杂交瘤或重组产生获得全长单克隆抗体。重组表达可以来自本领域已知的任何适宜宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本公开进一步提供编码本文所述抗体的多核苷酸，例如，编码包含如本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:30、48、66、84、102、120和137的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:39、57、75、93、111、129和147的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些方面，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:30、48、66、84、102、120的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:39、57、75、93、111、129和147的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本公开的多核苷酸可以仅编码抗cKIT抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含一种所例举抗cKIT抗体的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与一种小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区基本上相同的两个多肽区段。
可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗cKIT抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实施例中所述的序列)产生这些多核苷酸序列。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，如Narang等人,Meth.Enzymol.68:90,1979的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持体法。例如可以如PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编著),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Innis等人(编著),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；and Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述，通过PCR向多核苷酸序列引入突变。
在本公开中还提供了用于产生上文描述的抗cKIT抗体的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码抗cKIT抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可以用来在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体，一般具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人类人工染色体(参见，例如，Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达抗cKIT多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen，圣迭戈，CA)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。可用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒的载体、痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)载体。参见，Brent等人,上文；Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于其中载体待表达的预期宿主细胞。一般，表达载体含有与编码抗cKIT抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些方面，使用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖启动子、lacZ启动子、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩大转化生物的培养物，而不偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体。除启动子之外，也可能要求或需要其他调节元件用于高效表达抗cKIT抗体链或片段。这些元件一般包括ATG起始密码子和毗邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过纳入适用于所用细胞系统的增强子增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置以形成含有多肽的融合蛋白，其中所述多肽由插入的抗cKIT抗体序列编码。更经常地，插入的抗cKIT抗体序列在纳入载体之前与信号序列连接。待用来接受编码抗cKIT抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。这类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，因而导致产生完整抗体或其片段。一般，这类恒定区属于人类。
用于携带并表达抗cKIT抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本公开多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以产生一般含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)的表达载体。此外，将存在任何数目的多种熟知启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子一般控制表达，任选地连同操纵基因序列，并具有用于启动并完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。其他微生物，如酵母，也可以用来表达抗cKIT多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用来表达并产生本公开的抗cKIT多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常非永生的或正常或异常的永生动物或人细胞。例如，已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的众多合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途通常例如在Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的和/或可调控或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变动。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理法或电穿孔法可以用于其他细胞宿主(总体上参见Sambrook等人，上文)。其他方法包括例如电穿孔法、磷酸钙处理法、脂质体介导的转化法、注射法和显微注射法、生物射弹法、病毒体法、免疫脂质体法、聚阳离子：核酸缀合物法、裸DNA法、人工病毒粒法、疱疹病毒结构蛋白VP22融合法(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、试剂增强的DNA摄取法和离体转导法。为了长期、高产率产生重组蛋白，将经常需要稳定表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体，制备稳定表达抗cKIT抗体链或结合片段的细胞系。在引入该载体之后，可以允许细胞在加富培养基中生长1-2日，之后将它们转换至选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。抗性、稳定转染的细胞可以使用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。
治疗性和诊断性用途
本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于多种应用，包括但不限于治疗癌症，如实体癌。在某些方面，抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)，和抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、缩减肿瘤体积和/或减少肿瘤的致瘤性。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一个方面，抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于检测cKIT在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在某些方面，这类组织包含相对于其他组织以较高水平表达cKIT的正常组织和/或癌组织。
在一个方面，本公开提供一种检测cKIT在生物样品中存在的方法。在某些方面，该方法包括使生物样品与抗cKIT抗体在允许抗体与抗原结合的条件下接触，并且检测复合物是否在抗体和抗原之间形成。
还包括一种诊断与cKIT表达增加相关的病症的的方法。在某些方面，该方法包括使检验细胞与抗cKIT抗体接触；通过检测抗cKIT抗体与cKIT抗原的结合，(定量或定性)确定检验细胞上的cKIT表达水平；并且比较检验细胞中的cKIT表达水平与对照细胞(例如，与检验细胞相同的组织来源的正常细胞或按照与这种正常细胞可比较的水平表达cKIT的细胞)中的cKIT表达水平，其中与对照细胞相比，检验细胞上cKIT的更高表达水平表示存在与cKIT表达增加相关的病症。在某些方面，检验细胞从疑似患有与cKIT表达增加相关的病症的个体获得。在某些方面，病症是细胞增殖性疾病，如癌症或肿瘤。
在某些方面，诊断或检测方法，如上文描述的那些，包括检测抗cKIT抗体与细胞表面上或膜制备物中表达的cKIT的结合，所述膜制备物从在其表面上表达cKIT的细胞获得。用于检测抗cKIT抗体与细胞表面上表达的cKIT结合的示例性测定法是“FACS”测定法。
某些其他方法可以用来检测抗cKIT抗体与cKIT的结合。这类方法包括但不限于本领域熟知的抗原结合测定法，如蛋白质印迹法、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和免疫组织化学(IHC)。
在某些方面，抗cKIT抗体是标记的。标记物包括但不限于直接检测到的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。
在某些方面，抗cKIT抗体固定在不溶性基质上。固定能够将抗cKIT抗体与在溶液中保持游离的任何cKIT蛋白分离。通过使抗cKIT抗体在分析流程之前不溶，如通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等人，美国专利号3,720,760)，或通过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)，或通过使在抗cKIT抗体和cKIT蛋白之间形成复合物后抗cKIT抗体不溶(例如，通过免疫沉淀法)，常规地完成这一点。
可以使用本公开的免疫缀合物替代抗cKIT抗体或除抗cKIT抗体外还使用本公开的免疫缀合物，实施诊断或检测的前述任一方面。
在一个方面，本公开提供一种治疗、防止或改善疾病的方法，所述方法包括向患者施用抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物，因而治疗疾病。在某些方面，用抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物治疗的疾病是癌症。可以治疗和/或防止的疾病的例子包括但不限于胃肠道间质肿瘤(GIST)、小细胞肺癌(SCLC)、急性髓样白血病(AML)、黑素瘤、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞增多症、神经纤维瘤病、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。在某些方面，癌症是以表达cKIT的细胞为特征，其中抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可以与所述表达cKIT的细胞特异性结合。
本公开提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面，癌症是实体癌。在某些方面，受试者是人。
在某些方面，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面，受试者是人。在某些方面，受试者患有肿瘤或已经去除了肿瘤。
在某些方面，肿瘤表达与抗cKIT抗体结合的cKIT。在某些方面，肿瘤过量表达人cKIT。
为了治疗疾病，抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的适宜剂量取决于多种因素，如待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、疾病的反应性、既往治疗，患者临床史等。抗体或药物可以一次性或经一系列治疗施用，持续几日至几个月或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如，肿瘤尺寸减少)。最佳给药方案可以从测量患者身体内的药物蓄积量计算出来并且将根据各自抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的相对效力而变动。在某些方面，剂量是每kg体重0.01mg至10mg(例如，0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、7mg、8mg、9mg或10mg)，并且可以每日、每周、每月或每年一次或多次给予。在某些方面，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物每两周一次或每三周一次给予。治疗医师可以基于药物在体液或组织中的实测停留时间和浓度，评估重复给药率。
联合疗法
在某些情况下，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物与其他治疗剂如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或镇吐药)、镇痛药、细胞保护剂及其组合组合。
考虑用于联合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨(希罗达)、N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸佐柔比星柠檬酸佐柔比星脂质体注射剂地塞米松、多西紫杉醇盐酸多柔比星 依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(difluorodeoxycitidine)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌米罗他(mylotarg)、紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20连同卡莫司汀植入物柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
在一个方面，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物在作为联合疗法的药物联合制剂或给药方案中与具有抗癌特性的第二化合物组合。药物联合制剂或给药方案的第二化合物可以对该联合的抗体或免疫缀合物具有互补活性，从而它们没有彼此不利地影响。例如，本公开的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物可以与但不限于化疗剂、酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼和其他cKIT途径抑制剂组合施用。
如本文所用，术语“药物联合”指在一个剂量单位形式中的固定组合或用于联合施用的非固定组合或试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以在相同时间独立地施用或在各时间区间内分别施用，特别地其中这些时间区间允许联合配偶体显示合作性例如协同效应。
术语“联合疗法”指施用两种或更多治疗剂以治疗本公开中描述的治疗性病状或病症。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率活性成分的单个胶囊施用。备选地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所需的剂量。此外，这类施用也包括在大致相同的时间或在不同的时间顺序使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病状或病症方面提供药物联合的有益作用。
联合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当所述活性成分一起使用时所实现的作用大于因分别使用这些化合物所产生的作用的总和。当将活性成分(1)共配制并且以组合的单位剂量剂型同时施用或递送；(2)作为分立的制剂交替或同时递送；或(3)通过一些其他方案施用时，可以获得协同效应。以交替疗法递送时，可以在依次(例如通过在独立注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依次地即顺次地施用，而在联合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
在一个方面，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂组合的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
例如，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼利尼伐尼(Linifanib)(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称作ABT869，从Genentech可获得)；苹果酸舒尼替尼博舒替尼(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，也称作SKI-606，并且在美国专利号6,780,996中描述)；达沙替尼帕唑帕尼索拉替尼Zactima(ZD6474)；尼洛替尼瑞格非尼和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(和)。
表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼吉非替尼(Gefitnib)N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3”S”)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺，)；凡德他尼拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；二盐酸卡纽替尼(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯乙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(AEE788，CAS497839-62-0)；木利替尼(mubritinib)(TAK165)；培利替尼(Pelitinib)(EKB569)；阿法替尼(BIBW2992)；来那替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS187724-61-4)。
EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗帕尼单抗马妥珠单抗(EMD-72000)；尼妥珠单抗(hR3)；扎鲁木单抗；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS339151-96-1)；和ch806(mAb-806，CAS946414-09-1)。
人表皮生长因子受体2(HER2受体)(也称作Neu，ErbB-2、CD340或p185)抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗培妥珠单抗来那替尼(HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧喹啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺，并在PCT公开号WO 05/028443中描述)；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW-2992，CAS850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626，CAS714971-09-2)；卡纽替尼二盐酸盐(PD183805或CI-1033)；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS781613-23-8)。
HER3抑制剂包括但不限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111和MEHD-7945A。
MET抑制剂包括但不限于卡博替尼(cabozantinib)(XL184，CAS849217-68-1)；Foretinib(GSK1363089，以前的XL880，CAS849217-64-7)；Tivantinib(ARQ197，CAS1000873-98-2)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺(AMG458)；克里唑替尼(Cryzotinib)(PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605，CAS943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903，CAS956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]硫酰胺(MK2461，CAS917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523，CAS1022150-57-7)；和(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752，CAS477575-56-7)。
IGF1R抑制剂包括但不限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。综述参见例如，Yee,JNCI,104；975(2012)。
在另一个方面，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用与一种或多种FGF下游信号传导途径抑制剂组合的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述FGF下游信号传导途径抑制剂包括但不限于MEK抑制剂、BRAF抑制剂、PI3K/Akt抑制剂、SHP2抑制剂并且还包括mTOR抑制剂。
例如，促分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂包括但不限于XL-518(也称作GDC-0973，Cas编号1029872-29-4，从ACC Corp.可获得)；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称作CI-1040或PD184352并且在PCT公开号WO 2000035436中描述)；N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称作PD0325901并且在PCT公开号WO 2002006213中描述)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称作U0126并且在美国专利号2,779,780中描述)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟基丙基]-环丙磺酰胺(也称作RDEA119或BAY869766并且在PCT公开号WO 2007014011中描述)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环十四烷-1,7(8H)-二酮](也称作E6201并且在PCT公开号WO 2003076424中描述)；2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也称作PD98059，从Biaffin GmbH&Co.,KG，德国可获得的)；威罗菲尼(PLX-4032，CAS918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS1035555-63-5)；Pimasertib(AS-703026，CAS1204531-26-9)；和曲美替尼二甲基亚砜(GSK-1120212，CAS1204531-25-80)。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称作GDC0941并且在PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730中描述)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也称作BEZ235或NVP-BEZ235，并且在PCT公开号WO06/122806中描述)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4基)吡啶-2-胺(也称作BKM120或NVP-BKM120，并且在PCT公开号WO 2007/084786中描述)；陶扎色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS502632-66-8)；和8-苯基-2-(吗啉-4基)-色烯-4-酮(LY294002，CAS154447-36-6)。
mTOR抑制剂包括但不限于坦罗莫司地磷莫司(正式地称作deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669，并且在PCT公开号WO03/064383中描述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；Simapimod(CAS164301-51-3)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰-丝氨酸-内盐(SF1126，CAS936487-67-1)。
在又一个方面，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用与一种或多种促凋亡剂组合的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述促凋亡剂包括但不限于IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、MCl1抑制剂、Trail剂、Chk抑制剂。
例如，IAP抑制剂包括但不限于NVP-LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406和TL32711。IAP抑制剂的其他例子包括但不限于WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295和WO 08/134679中公开的那些，全部文献均通过引用方式并入本文。
BCL-2抑制剂包括但不限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰]苯基]磺酰]苯甲酰胺(也称作ABT-263并且在PCT公开号WO 09/155386中描述)；替曲卡星(Tetrocarcin A)；抗霉素；棉酚((-)BL-193)；Obatoclax；乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-羧酸酯(HA14–1)；奥利默森(Oblimersen)(G3139，)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯基]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰]-苯甲酰胺(ABT-737，CAS852808-04-9)；和Navitoclax(ABT-263，CAS923564-51-6)。
促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAIL)和DR5(TRAIL)，包括但不限于度拉纳明(Dulanermin)(AMG-951，RhApo2L/TRAIL)；马帕木单抗(mapatumumab)(HRS-ETR1，CAS658052-09-6)；来沙木单抗(HGS-ETR2，CAS845816-02-6)；Apomab可那木单抗(conatumumab)(AMG655，CAS896731-82-1)；和替加珠单抗(tigatuzumab)(CS1008，CAS946415-34-5，从Daiichi Sankyo可获得)。
检查点激酶(CHK)抑制剂包括但不限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776，CAS891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762，CAS860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR124，CAS405168-58-3)；7-氨基更生霉素(7-AAD)、Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618，CAS911222-45-2)；莱菔硫烷(Sulforaphane)(CAS4478-93-7，4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸酯)；9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3.4-i][1,6]苯并二吖辛因-1,3(2H)-二酮(SB-218078，CAS135897-06-2)；和TAT-S216A(Sha等人,Mol.Cancer.Ther 2007；6(1):147-153),和CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在一个方面，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用与一种或多种FGFR抑制剂组合的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法。例如，FGFR抑制剂包括但不限于丙氨酸布立尼布(BMS-582664，(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；尼达尼布(Vargatef)(BIBF1120，CAS928326-83-4)；二乙酸多韦替尼(TKI258，CAS852433-84-2)；3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(BGJ398，CAS872511-34-7)；达鲁舍替(Danusertib)(PHA-739358)；和(PD173074，CAS219580-11-7)。在一个具体方面，本公开提供一种通过向有需求的受试者施用与FGFR2抑制剂组合的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述FGFR2抑制剂如3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6((4-(4-乙基哌嗪-1基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(也称作BGJ-398)或4-氨基-5-氟-3-(5-(4-甲基哌嗪1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(也称作多韦替尼(dovitinib)或TKI-258)AZD4547(Gavine等人,2012,Cancer Research 72,2045-56，N-[5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基]-4-(3R,5S)-二甲基哌嗪-1基)苯甲酰胺)、普纳替尼(Ponatinib)(AP24534；Gozgit等人,2012,Mol Cancer Ther.,11；690-99；3-[2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3基)乙炔基]-4-甲基-N-{4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基}苯甲酰胺，CAS943319-70-8)。
药物组合物
为了制备包含免疫缀合物的药物组合物或无菌组合物，将本公开的免疫缀合物与可药用载体或赋形剂混合。组合物可以额外地含有一种或多种适于治疗或防止以下癌的其他治疗剂：胃肠道间质肿瘤(GIST)、小细胞肺癌(SCLC)、急性髓样白血病(AML)、黑素瘤、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞增多症、神经纤维瘤病、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。
可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干粉剂、膏剂、水溶液剂、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman等人,Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等人,(编著),PharmaceuticalDosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；Lieberman等人,(编著),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY,1990；Lieberman等人,(编著)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,2000)。
在一个具体方面，本公开的抗体药物缀合物的临床使用形式(CSF)是小瓶中含有ADC、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20的冷冻干燥物。冷冻干燥物可以用注射用水重构，溶液包含ADC、琥珀酸钠、蔗糖和聚山梨醇酯20，pH约5.0。为了随后静脉内施用，将获得的溶液通常进一步稀释于载体溶液中。
为治疗剂选择施用方案取决于几种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的靶细胞可及性。在某些方面，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于具体实体和正在治疗的病状的严重程度。选择适宜剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见，例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编著),Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(编著),Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等人,New Engl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等人,New Engl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等人,New Engl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.343:1594-1602,2000)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的的参数或因素确定适宜的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所需的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以变动活性成分在药物组合物抗体药物缀合物中的实际剂量水平，从而以获得活性成分的量，其中对于特定患者、组合物和施用模型，所述的量有效实现所需的治疗反应，同时对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本公开具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域已知的因素。
可以通过连续输注或通过以例如，1日、1周或每周1-7次的时间间隔，提供包含抗体或其片段的组合物。可以静脉内、皮下、局部、经口、经鼻、直肠、肌内、脑内、或通过吸入提供剂量。特定剂量方案是一个涉及最大剂量或给药频率的方案，其避免明显不希望的副作用。
对于本公开的免疫缀合物，施用至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。该剂量可以在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计待施用的剂量，计算抗体或其片段的剂量。
可以重复免疫缀合物的剂量并且各施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3个月或至少6个月。在一个具体方面，每3周重复本公开免疫缀合物的剂量。
特定患者的有效量可以根据多种因素变动，如正在治疗的病状、患者的总体健康、施用方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见，例如，Maynard等人,A Handbook ofSOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,2001)。
施用途径可以是通过例如局部或皮肤应用、通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内注射或输注或通过缓释系统或植入物(参见例如，Sidman等人,Biopolymers 22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包含增溶剂或用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因或两者。此外，也可以利用肺部施用法，例如，通过使用吸入器或雾化器和具有雾化剂的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，每份专利通过引用方式完整并入本文。
也可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用本公开的组合物。如技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变动。选择用于免疫缀合物的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括，而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，本公开的组合物可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。在一个方面，通过输注法施用本公开的免疫缀合物。在另一个方面，皮下施用免疫缀合物。
如果本公开的免疫缀合物在控释或缓释系统中施用，泵可以用来实现控释或缓释(参见Langer，上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14:20,1987；Buchwald等人,Surgery 88:507,1980；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。高分子材料可以用来实现免疫缀合物的治疗剂的控释或缓释(参见例如，Medical Applications ofControlled Release,Langer和Wise(编著),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.,1974；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编著),Wiley,New York,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；还参见Levy等人,Science 228:190,1985；During等人,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等人,J.Neurosurg.71:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个方面，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质、储存时稳定、无菌并且是生物可降解的。可以将控释或持续释放系统靠近预防靶或治疗靶布置，因此仅需要全身性剂量的一部分(见，例如，Goodson,引自MedicalApplications of Controlled Release,上文,第2卷,第15-138页,1984)。
控释系统在Langer,Science 249:1527-1533,1990的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可以用来产生包含本公开的一种或多种免疫缀合物的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人,Radiotherapy&Oncology 39:179-189,1996；Song等人,PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397,1995；Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,1997，所述的每篇文献通过引用方式完整并入本文。
如果局部施用本公开免疫缀合物，则可以将它们按油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气溶胶剂、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他形式配制。见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾局部用剂型，一般使用包含载体或一种或多种赋形剂的粘稠至半固体或固体形式，其与局部施加相容并在一些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括而不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、粉剂、搽剂、药膏剂等，如果需要，它们进行消毒或与影响多种特性(例如，渗透压)的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其他合适的局部用剂型包括可喷雾气溶胶制品，其中与固体或液体惰性载体组合的活性成分在一些情况下包装在具有加压的挥发性物质(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物中或挤瓶中。如果需要，也可以将润湿剂或湿润剂添加至药物组合物和剂型。这类额外成分的例子是本领域熟知的。
如果鼻内施用包含免疫缀合物的组合物，则可以将它以气溶胶剂、喷雾剂、雾化剂形式或以滴剂形式配制。具体而言，根据本公开使用的预防剂或治疗剂可以在使用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压气溶胶剂的情况下，可以通过提供递送计量数量的阀确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊剂和套筒剂(cartridge)(由例如明胶组成)，其含有所述化合物及合适粉剂基料(powder base)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
以第二治疗剂例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或辐射共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如，Hardman等人,(编著)(2001)Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,第10增补版,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole和Peterson(编著)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:APractical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编著)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可以减少症状至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％或至少50％。
可以与免疫缀合物组合施用的额外治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)，可以按照与本公开的免疫缀合物间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时，按间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时、或间隔96小时至120小时施用。可以在一个相同的患者就诊内施用两种或更多种治疗剂。
在某些方面，可以配制免疫缀合物以确保正确的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)；可以将它们例如配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见，例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白质A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134；p120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本公开提供向有需求的受试者单独或与其他疗法组合下施用包含免疫缀合物的药物组合物的方案。联合疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时或依次向受试者施用。联合疗法的治疗(例如，预防剂或治疗剂)也可以是循环施用的。循环治疗涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间并重复这种依次施用，即，该循环，以减少对一种治疗剂(例如药物)的耐药性形成，以避免或减少一种治疗剂(例如药物)的副作用和/或以改善疗法的效力。
本公开联合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时施用至受试者。
术语“同时”不限于在完全相同的时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将包含抗体或其片段的药物组合物以这样的序列并在这样的时间间隔内部施用至受试者，从而免疫缀合物可以与其他疗法一起发挥作用，以提供与另外施加它们相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何顺序依次在不同的时间点施用至受试者；然而，如果不在相同的时间施用，则它们应当在时间上充分接近地施用，从而以提供所需的治疗作用或预防作用。可以将每种疗法以任何适宜的形成和通过任何合适的途径分别施用至受试者。在多个方面，将疗法(例如，预防剂或治疗剂)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、48小时、72小时或1周施用至受试者。在其他方面，将两种或更多种治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)在相同的患者就诊内施用。
联合疗法的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中施用至受试者。备选地，联合疗法的预防剂或治疗剂可以在分立的药物组合物中同时施用至受试者。预防剂或治疗剂可以通过相同或不同施用途径施用至受试者。
实施例
实施例1：通过杂交瘤技术产生cKIT抗体
抗原和其他蛋白质
通过转染293FreestyleTM细胞(Invitrogen，Carlsbad，Ca)产生分泌人cKIT蛋白的瞬时表达细胞系。简而言之，使用293FectinTM转染试剂和含有人cKIT cDNA的ECD并且在序列C末端含有His 6标签或鼠Fc的重组质粒(pFUSE，Invivogen，圣迭戈，CA)，转染在FreestyleTM培养基(Invitrogen)中培育的细胞。48-72小时后，将培养基离心以移除细胞，无菌过滤并且澄清的裂解物用于蛋白质纯化。
对于加His6标签的cKIT：将所得到的浓缩物以0.5mL/分钟施加至NiNTA His-结合Superflow柱。用PBS基线洗涤后，将结合的物质用含步进梯度的咪唑(10-500mM)的PBS洗脱。将所产生的洗脱物针对PBS，pH7.3透析，无菌过滤并等分。对于Fc-cKit融合物，如上文概述那样使用蛋白G快流柱(替代NiNTA)，并用pH 3甘氨酸缓冲液洗脱，所述洗脱液用Tris，pH 8中和。
杂交瘤产生
小鼠的免疫和杂交瘤的产生
在免疫Bcl-2转基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22Wehi品系)之前，将纯化的cKIT用弗氏完全佐剂1:1稀释。使用要求在多个位点反复免疫(RIMMS)的程序(McIntyre GD.,Hybridoma,1997)，免疫小鼠。简而言之，将小鼠在8个临近外周淋巴结(PLN)的特定位点用1-3μg抗原注射。在一段为期12天的时间内重复该程序8次。在第12日，采集检验血液并通过ELISA分析血清抗体滴度。在第15日从高滴度小鼠取出合并的PLN。为了收获淋巴细胞，将PLN用原始DMEM洗涤两次并且随后通过穿过.22微米筛(Falcon#352350,BD Bioscience,San Jose,CA)而解离。在融合之前，将所产生的淋巴细胞额外洗涤2次。将F0骨髓瘤细胞与淋巴细胞按2.5个淋巴细胞对1个F0细胞的比率混合。将细胞混合物离心并随后将1mLPEG15001分钟内逐滴添加到细胞沉淀物。在30秒后，缓慢添加1mL DMEM，并且1分钟后，添加19mLDMEM持续5分钟。将融合的细胞沉淀，以密度2x105个细胞/mL悬浮在HAT培养基(DMEM+20％FBS，青霉素/链霉素/Glu，1x NEAA，1x HAT，0.5x HFCS)中，并置于37℃持续1小时。随后将细胞以60μL/孔铺种在384孔板中。
筛选分泌针对cKIT的抗体的杂交瘤
融合后10天，对杂交瘤平板筛选cKIT特异性抗体的存在。为了ELISA筛选，将Maxisorp384孔板(Nunc#464718)用50μL cKIT(在PBS中稀释至15ng/孔)包被并在4℃温育过夜。吸出剩余的蛋白质并用PBS中的1％BSA封闭孔。在室温温育30分钟后，将孔用PBS+0.05％Tween(PBST)洗涤4次。将15μL杂交瘤上清液转移至ELISA平板。将15μL在PLN取出时取得的小鼠血清1:1000在PBS中稀释并作为阳性对照添加。将50μL第二抗体(山羊抗小鼠IgG–HRP(Jackson Immuno Research#115-035-071，West Grove，PA)，PBS中1:5000稀释)添加至ELISA平板上的全部孔。在室温温育1小时后，将平板用PBST洗涤8次。添加25μL TMB(KPL#50-76-05)并且在室温温育30分钟后；平板在吸光度605nm读取。来自阳性孔的细胞在HT培养基(DMEM+20％FBS，青霉素/链霉素/Glu，1x NEAA，1x HT，0.5x HFCS)中扩充至24孔板内。
抗体纯化
使用蛋白G(Upstate#16-266(Billerica，MA))纯化含有cKIT抗体的上清液。在装载上清液之前，树脂用10个柱体积的PBS平衡。在结合样品之后，将柱用10个柱体积的PBS洗涤，并随后用5个柱体积的0.1M甘氨酸，pH 2.0洗脱抗体。柱级分立即用1/10体积的TrisHCl，pH 9.0中和。测量级分的OD280，并汇集阳性级分并针对PBS，pH 7.2透析过夜。
实施例2：抗cKIT抗体的人源化和亲和力成熟
人源化的设计
杂交瘤衍生的抗cKIT抗体9P3的VH序列和VL序列分别是SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.18。用来产生完整IgG1的人IgG1恒定域的氨基酸序列就重链而言是SEQ ID NO.10并且就轻链而言是SEQ ID NO.19。通过移植来自抗cKIT抗体9P3的3个CDR区(GFTFSDYYMA(SEQID NO.148))、(NINYDGSSTYYLDS(SEQ ID NO.149))和(GDYYGTTYWYFDV(SEQ ID NO.150)到人种系接纳体构架VH3_3-07(vBASE数据库)上，完成重链的人源化。通过移植来自抗cKIT抗体9P3的3个CDR区(RASQDISNYLN(SEQ ID NO.151))、(YTSRLQS(SEQ ID NO.152))和(QQGKKLWS(SEQ ID NO.153))到人种系接纳体构架VK3-L25(vBASE数据库)上或移植2个CDR区(SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153)到人种系接纳体构架VK1-O12(vBASE数据库)上，完成轻链的人源化。除CDR区之外，留下来自9P3序列的可变轻链结构域的一个构架残基即VL#71，和在VK3-L25情况下，留下VL#79(残基编号基于SEQ ID NO.21)。另外，人J元件JH4和JK4分别用于重链和轻链。所产生的人源化抗体重链氨基酸序列是SEQ ID NO.11，并且对于两条轻链而言，是SEQ ID NO.20(VK1-O12)和SEQ ID NO.21(VK3-L6)。
我们假设氨基酸基序天冬氨酸后接甘氨酸(DG)可能易出现翻译后修饰(异天冬氨酸形成)并且CDR内部的赖氨酸可以减小抗体-药物缀合后活性抗体的比率。使用随机诱变(即易错PCR)和定向诱变的组合以优化人源化抗体。
人源化序列的产生
编码人源化VL和VH结构域的DNA序列在GeneArt订购(Life Technologies Inc.雷根斯堡，德国)，其包含针对智人(Homo sapiens)的密码子优化。通过切割和连接，将编码VL结构域和VH结构域的序列从GeneArt衍生的载体亚克隆至适于哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。将重链和轻链克隆至独立表达载体中以允许共转染。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体型复制和在原核生物中复制的元件(例如SV40复制起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素耐药基因和zeocin标记)。
人源化抗体的表达和纯化
以组成型方式表达SV40大T抗原的人胚肾细胞(HEK293-TATCC11268)是用于瞬时表达人源化和/或优化的IgG蛋白的优选宿主细胞系之一。使用PEI(聚乙烯亚胺，分子量25,000线型，Polysciences，美国目录号23966)作为转染试剂，进行转染。通过在室温(RT)在900ml细胞培养级水中小心溶解1g PEI，制备PEI母液。为了促进PEI的溶解，通过添加HCl至pH 3-5，随后用NaOH中和至最终pH 7.05，使溶液酸化。最后，将体积调节至1L并且将溶液经0.22μm滤器过滤，等分并冷冻在-80℃直至进一步使用。一旦融化，等分试样可以在-20℃再冷冻至多3次，但是不应当在-20℃长期储存。使用用于细胞转染和增殖的诺华专利无血清培养基，并使用ExCell VPRO无血清培养基(SAFCBiosciences，美国，目录号24561C)作生产/进料培养基，培养HEK293T细胞。以悬浮培养法培育为瞬时转染所制备的细胞。对于小规模(<5L)转染，在5％CO2的增湿培养箱中有轨摇床(100-120转/分钟)上的Corning摇瓶(Corning，Tewksbury，MA)中培育细胞(种子瓶)。应当维持种子培养物中的细胞处于指数生长期(细胞密度在5x105/mL和3x106/mL之间)并且对于转染，这些细胞显示>90％的生存力。这个范围之外的细胞密度将导致稀释后延迟期或转染效率减低。对于小规模(<5L)转染，将细胞等分试样从种子培养物取出并以诺华无血清培养基在36％终体积中调节至14x106个细胞/mL。通过以7％最终培养物体积稀释DNA至1mg/L(终体积)随后温和混合，制备DNA溶液(对于1L转染，溶液1:0.5mg重链表达质粒和0.5mg轻链表达质粒)。为了防止细菌的污染，使用0.22μm滤器(例如Millipore Stericup)过滤这种溶液。随后还将3mg/L(终体积)的PEI溶液稀释于7％的最终培养物体积中并温和地混合(溶液2)。两种溶液均在室温(RT)温育5-10分钟。此后将溶液2添加至溶液1，伴以温和混合，并在室温温育另外5-15分钟。随后将转染混合物添加至细胞并且细胞的培育继续4至6小时。最后，通过添加 VPRO无血清培养基实现剩余的50％总生产体积。转染后，将细胞继续培育11天。通过在4℃以4500转/分钟离心20分钟(Multifuge3S-R，Thermo Scientific，Rockford，IL)收获培养物。将回收的细胞上清液经stericup滤器(0.22μm)无菌过滤并贮存在4℃直至进一步处理。
使用新净化的(0.25M NaOH)HiTrap ProtA SuRe，5ml柱，在4℃在冷却柜中的“ explorer Air”层析系统上进行纯化。将柱用5个柱体积(CV)的PBS(Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA)平衡，并且随后将无菌过滤的上清液(2L)以4.0ml/分钟上样。将柱用8个CV的PBS洗涤以洗脱未结合的样品并用5个CV的PBS再次洗涤。将抗体用5个CV的50mM柠檬酸盐，70mM NaCl pH 3.2洗脱。洗脱物按3ml级分收集；汇集级分并用1M Tris HCl pH 10调整至pH 7。将汇集物汇集并无菌过滤(Millipore Steriflip，0.22μm)，在分光光度计ND-1000(NanoDrop)中测量OD 280nm，并基于序列数据计算蛋白质浓度。对洗脱物检验聚集(SEC-MALS)和纯度(SDS-PAGE、LAL和MS)。对于第二个纯化步骤，如果需要，将来自第一次纯化的汇集物装入新净化(0.5MNaOH)的SPX(Hi Load16/60Superdex 200级120mL(GE-Healthcare)中。将柱用PBS平衡并用PBS缓冲液按1ml/分钟运行，将洗脱物以1.2ml级分收集并如对第一纯化步骤所述那样分析。
实施例3：筛选抗cKIT抗体
HuCAL 淘选
为选择识别人cKIT的抗体，使用多次淘选策略。使用市售噬菌体展示文库Morphosys HuCAL 文库(Morphosys，Munich DE)作为抗体变体蛋白的来源，通过选择具有高亲和结合亲和力的克隆，产生针对人cKIT蛋白的治疗性抗体。该噬菌粒文库基于概念(Knappik等人,(2000)J Mol Biol 296:57-86)并利用在噬菌体表面上展示Fab的技术(Lohning，WO 01/05950)。为了分离抗cKIT抗体，使用固相、溶液、完整细胞和差异性完整细胞淘选法，执行标准淘选策略。
针对cKIT的固相淘选
将96孔MaxisorpTM平板在4℃用人或小鼠cKIT Fc融合蛋白包被过夜。对于每次淘选，将约4x1013个噬菌体-抗体添加至每块抗原包被的平板并且在室温在微量滴定板摇床上温育2小时。此后，通过几种洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体并且使用10mM Tris/HCl pH 8中的25mM DTT洗脱特异性结合的噬菌体。
将洗脱物转移至14ml大肠杆菌细菌中并温育以便噬菌体感染。感染的细菌重悬于2x YT培养基中，铺种在LB/Cam琼脂平板上并温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆和噬菌体产生。采用纯化的噬菌体，启动下一轮淘选。
根据第一轮的方案进行第二和第三轮固相淘选，例外是抗原的量减少和洗涤条件更严格。
针对cKIT的捕获淘选
对于捕获淘选，通过山羊抗小鼠Fc捕获抗体，将抗原cKIT/鼠Fc融合蛋白固定在96孔MaxisorpTM平板上。在噬菌体封闭期间，将人和小鼠γ球蛋白添加至封闭缓冲液以避免选择针对捕获抗体和抗原的小鼠Fc部分的抗体。如固相淘选方案(见上文)中所述，进行捕获淘选中的抗原包被和噬菌体封闭过程。
采用链霉亲和素-偶联的磁珠的溶液淘选方案
溶液淘选以两种不同模式(“经典”和“替代”)进行。对于每种淘选，将约4x1013个噬菌体-抗体用等体积的2xChemiblocker/0.1％Tween20封闭。为了移除结合链霉亲和素或结合珠的噬菌体，各自使用1mg封闭的链霉亲和素珠对封闭的噬菌体粒子预吸附2次。
a)“经典”模式：将生物素化的16P23mAb与人cKIT ECD-His蛋白温育并添加至封闭的噬菌体粒子。16P23抗体是内部产生的杂交瘤并作为捕获抗体用于各种筛选方案中以暴露cKIT的ECD上的不同结构域。16P23抗体还用于抗体分拣目的。在温育后，使用链霉亲和素珠，捕获噬菌体-抗原复合物并用磁力分离器收集与链霉亲和素珠结合的噬菌体粒子。
b)“备选”模式：将生物素化的16P23mAb添加至链霉亲和素珠并将抗体-珠混合物在室温在摇床上温育30分钟。将珠洗涤并重悬于含有人cKIT ECD-His蛋白的PBS中。随后，添加噬菌体并将抗体-珠-抗原-噬菌体复合物在室温在摇床上振摇额外1小时。在这个最后温育步骤后，用磁分离器捕获珠并弃去上清液。
使用两种展示法，使用PBS/0.05％Tween 20和PBS，通过几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体。通过使用10mM Tris/HCl pH 8中的25mM DTT从链霉亲和素珠洗脱特异性结合的噬菌体。后续噬菌体感染和噬菌体产生根据固相淘选方案进行。
根据第一轮的方案进行第二和第三轮溶液淘选，只是抗原的量减少和洗涤条件更严格。
针对cKIT的完整细胞淘选
使用表达抗原即人、小鼠或大鼠cKIT的靶细胞作为抗原并且使其与噬菌体-抗体接触以淘选。在PBS/5％FCS中洗涤噬菌体-细胞复合物3次。用0.1M甘氨酸-HCl/0.5M NaCl，pH 2.2从靶细胞洗脱特异性结合的噬菌体。后续噬菌体感染和噬菌体产生根据固相淘选方案进行。第二和第三轮完整细胞淘选根据第一轮的方案进行。
针对cKIT的差异性完整细胞淘选
在差异性完整细胞淘选中，在细胞和纯化的蛋白质上交替进行选择。在纯化抗原上的选择轮次如固相淘选方案中所述那样进行。对于细胞上的选择轮次，请参考针对cKIT的完整细胞淘选章节中的程序。
成熟淘选
为了获得亲和力增加的特异性抗体，进行成熟淘选(Prassler等人,FutureMed.Immuno.20091(4):571-583))。为此目的，将已经测试过cKIT特异性结合作用的已测序克隆用于LCDR3或HCDR2盒交换。此后，用人和/或小鼠cKIT Fc融合蛋白如固相淘选方案中所述那样进行两轮固相淘选。
a)对于将噬菌体衍生的载体DNA(Morphosys，Munich DE)的Fab编码片段酶促消化，并且将插入片段替换为TRIMTMLCDR3成熟盒(Virnekaes等人,NAR 1994 22(25):5600-5607)。随后，将1.25μg 展示载体与携带多样化LCDR3的插入物片段连接。
b)对于在第2轮淘选后，将噬菌体衍生的载体DNA的Fab编码片段酶促消化，并且将插入物替换为TRIMTMHCDR2成熟盒(Virnekas等人，上文)。随后，将1.25μg 展示载体与携带多样化HCDR2的插入物片段连接。
将生成的文库扩增并经历采用增加的严格性和降低的抗原浓度或轮换人cKIT抗原和小鼠cKIT抗原的两个淘选轮次以鉴定亲和力改进的克隆。
制备含有细菌裂解物的Fab用于ELISA筛选
为了初始筛选和表征单个表达Fab的大肠杆菌的过夜培养物，使用溶菌酶、4mMEDTA和10U/μl Benzonase裂解克隆。将含有Fab的大肠杆菌裂解物用于ELISA、FACS和SET筛选。
筛选含有Fab的粗制细菌裂解物
ELISA筛选
使用ELISA筛选，从淘选输出结果鉴定单个Fab克隆以便与靶抗原结合。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab。
Fab表达检验ELISA
为了验证制备的大肠杆菌裂解物中的Fab表达，将MaxisorpTM384孔平板(Nunc，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)用PBS中1:1000稀释的Fd片段特异性绵羊抗人IgG包被。用含有0.05％Tween 20的PBS中5％脱脂乳粉封闭后，添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。随后，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(1:5000稀释)温育，随后添加荧光底物(Roche，#11681982001，曼海姆，DE)，检测结合的-Fab片段。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
直接包被的抗原上的ELISA筛选
将MaxisorpTM384孔平板用PBS中浓度10μg/ml的加mFc标签的人cKIT ECD蛋白包被。用PBS中的5％脱脂乳粉封闭平板后，添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。使用荧光底物(Roche，#11681982001，曼海姆，DE)，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(1:5000稀释)检测Fab的结合。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
采用Fab BEL裂解物的表位分拣(epitope binning)
为了在亲和力成熟之前鉴定潜在的配体结合竞争者，采用Fab大肠杆菌裂解物和16P23抗体(一种已知的配体结合竞争者)进行竞争ELISA筛选。为此目的，将MaxisorpTM384孔平板用加mFc标签的人cKIT ECD蛋白包被并如上文所述封闭(在直接包被抗原上的ELISA筛选)。
将16P23mAb以终浓度5μg/ml添加，随后与含有Fab的大肠杆菌裂解物温育。最后，使用荧光底物(Roche，#11681982001)，以抗FLAG碱性磷酸酶-缀合物抗体(SigmaA-9469，稀释至1:10000)检测Fab的结合。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
FACS筛选
在FACS筛选中，从淘选输出结果鉴定与细胞表面表达的抗原结合的单个Fab克隆。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab。
FACS筛选以96孔或384孔平板样式进行：
a)在使用BD FACS阵列装置的96孔板形式中，将100μl细胞悬液转移至一块新的96孔板(产生1x105个细胞/孔)。将含有靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μl含有Fab的BEL提取物添加至相应的孔。将平板在冰上温育1小时。在温育后，将细胞离心并用200μl FACS缓冲液(PBS，3％FCS)洗涤3次。在每个洗涤步骤后，将细胞离心并小心地重悬。添加第二检测抗体(PE缀合的山羊抗人IgG；Dianova，Hamburg，DE)并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。最后，将细胞沉淀物重悬于每孔150μlFACS缓冲液中并在BD FACS阵列中分析样品。
b)在使用BD HTS装置(BD Biosciences，San Jose，CA)的384孔平板形式中，将20μl细胞悬液转移至一块新的384圆孔平板(产生4x104个细胞/孔)中。将含有靶细胞悬液的平板离心并且弃去上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将20μl含有Fab的提取物添加至相应的孔。将平板在4℃振摇温育1小时。在温育后，将细胞离心并用40μl FACS缓冲液(PBS，3％FCS)洗涤3次。在每个洗涤步骤后，将细胞离心并小心地重悬。添加40μl PE缀合的山羊抗人检测抗体并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。最后，将细胞沉淀物重悬于每孔35μl FACS缓冲液中并用BD FACSCalibur/HTS装置测量样品。
亲和力测定
对于KD测定，使用抗体蛋白的单体级分(至少90％单体含量，由分析性SEC分析；Superde x 75PC3.2/30(GE Healthcare，匹兹堡，PA)用于Fab，或Tosoh TSKgel G3000SWXL(7.8mm/30.0cm)(Tosoh Bioscience GmbH，斯图加特，DE)用于IgG)。
使用Sector成像仪6000(MSD)，用于KD测定的溶液平衡滴定(SET)法
溶液中的亲和力测定基本上如文献中所述进行(Friquet等人,J.Immuno.Meth.1985；77:305-319)。为了改善SET法的灵敏度和准确度，将它从经典ELISA转移至基于ECL的技术(Haenel等人Anal.Biochem.2005339(1):182-4)。根据制造商的说明书，将1mg/ml山羊抗人(Fab)2片段特异性抗体(Dianova)用MSD磺基-TAGTM NHS-酯(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD，美国)标记。将MSD平板用抗原包被并且将平衡的样品转移至这些平板。在洗涤后，将每孔30μl MSD-磺基标签标记的检测抗体(抗人(Fab)2)添加至MSD平板并在摇床上温育。在洗涤MSD平板并添加30μl/孔含表面活性剂的MSD读数缓冲液T后，使用Sector成像仪6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，美国)检测电化学发光信号。
采用定制的拟合模型，用XLfit(IDBS)软件评价数据。对于Fab分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据(Haenel等人,Anal.Biochem 2005；339(1):182-184)，根据(Abraham等人,J.Mol.Recogn 1996；9:456-461)修改)：
[Fab]t：施加的总Fab浓度
x：施加的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时Fab的最大信号
KD：亲和力
对于IgG分子的KD测定，对IgG使用以下拟合模型(根据(Piehler等人,1997)修改)：
[IgG]：施加的总IgG浓度
x：施加的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时IgGb的最大信号
KD：亲和力
实验设置：
抗cKIT IgG的KD测定基本上如下进行：将人cKIT-Fc在4℃以PBS中的0.1μg/ml在标准MSD平板上包被过夜/在室温以分析缓冲液中的0.1μg/ml在链霉亲和素MSD平板上包被1小时。随后，将MSD平板在室温用含3％BSA的PBS封闭1小时。在抗原包被之前，将链霉亲和素平板在4℃用含5％BSA的PBS封闭过夜。为了滴定抗原，使用人cKIT-His。
随后，使用Sector成像仪6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，美国)通过ECL检测，对未结合的Fab的浓度定量。采用相应拟合模型，使用XLfit(IDBS)软件处理结果，以评估亲和力并且因此鉴定通过成熟过程改进最大的克隆。
体外生物化学测定法(交叉反应性和结构域结合分析)
在ELISA中测试纯化的IgG与人、食蟹猴和小鼠cKIT全长ECD蛋白以及人cKIT ECD结构域构建体D1-3和D4-5的结合。为此目的，将平板在4℃用PBS中浓度5μg/ml的抗原包被过夜。使用作为底物，通过与碱性磷酸酶缀合的抗人或抗小鼠F(ab)2(在1％MPBS中1:5000稀释)检测IgG的结合。在430nm激发和535nm发射处测量荧光发射。
纯化的IgG的表位分拣
测试纯化的IgG候选物与内部产生的工具抗体的竞争作用，所述工具抗体先前显示确定cKIT胞外结构域上的独立bin。为此目的，将IgG以恒定的量包被在MaxisorpTM平板上并测试与渐增量的竞争者IgG在溶液中的竞争作用。作为阳性对照，对包被的IgG分析与自身在溶液中的竞争作用。全部测试的IgG均在室温在溶液中以50倍过量与糖生物素化人的cKIT-Fc融合物预先温育1小时。随后添加抗原/抗体复合物至包被的抗体并且借助生物素化抗原检测出现的结合型复合物。从总体上看，当包被的IgG不同于在溶液中所测试IgG，能够与抗原上可及表位结合时(即非竞争性抗体)，仅可能在高IgG浓度获得信号。与之相反，对于竞争性抗体，具有部分重叠表位的抗体或因空间位阻而阻断表位的抗体，与对照相比，高IgG浓度时的结合信号显著减少。
将MaxisorpTM平板的相应孔用PBS中浓度1.2μg/ml的20μl/孔IgG稀释物包被，在4℃温育过夜并且随后用PBST洗涤3次。将平板在室温用90μl 3％BSA/PBS孔封闭1小时并用PBST洗涤3次。
在细胞上通过FACS测定EC50
将纯化的IgG以单一浓度测试或在FACS中滴定，以测定与细胞表面表达的人、小鼠或大鼠cKIT结合的EC50值。为此目的，将Mo7e、P815或RBL-2H3细胞用(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)收获并在FACS缓冲液中稀释1x106/ml。全部后续步骤均在冰上进行以防止受体的内化。将细胞悬液以100μl/孔填充入96孔U底部平板中。在4℃以210g离心5分钟后，弃去缓冲液。随后每孔以15μg/ml的浓度或在滴定实验中以抗体浓度连续稀释物(1:3稀释梯级，起始浓度15μg/ml)添加100μl在FACS缓冲液中稀释的特异性mAb。在冰上温育1小时后，将细胞用150μl FACS缓冲液洗涤3次。将第二PE缀合的山羊抗人检测抗体(在FACS缓冲液中1:200稀释)以100μl/孔添加至细胞并在冰上温育1小时。将细胞用150μlFACS缓冲液洗涤3次。最后，将细胞沉淀物重悬于每孔200μl FACS缓冲液中并在BD FACS阵列中分析样品。
体外生物测定法
SCF依赖性增殖测定法
在Mo7e细胞系(人急性巨核母细胞白血病，DSMZ编号：ACC104)上进行增殖测定法，其中所述细胞系在含有稳定谷氨酰胺(PAN#P04-18500)、10％FCS和10ng/ml SCF(R&D CAT#255-SC；批号CM2810061，R&D Corp，Berkeley CA)的RPMI1640中培养。
在SCF依赖性增殖测定法中，测试纯化的IgG或含有IgG的细胞培养上清液。在两种实验设置下，将细胞收获并以0.5x106个细胞/ml的浓度重悬于50ml饥饿培养基(无SCF的培养基)中并且在37℃温育18小时。随后将细胞以1x106个细胞/ml的浓度重悬于含60ng/mlSCF(2x浓缩，添加抗体后终浓度是30ng/ml)的饥饿培养基中。白色96孔透明平底平板的每孔添加50μl细胞(5x104个细胞/孔)和50μl 2倍浓缩的纯化抗体或未稀释的细胞培养上清液。对于阴性对照和阳性对照，包括细胞w/o SCF和w/o抗体或细胞连同SCF和w/o抗体。将平板在37℃温育48小时，并且根据制造商说明书，使用(Promega#G7571，Promega，Madison，WI)测定最终细胞数目。
Fab-ZAP ADC背驮式测定法
为了检验抗体在结合受体后内化的能力，将Fab-ZAP试剂(肥皂草毒蛋白偶联的山羊抗hu-mAb；ATS Biotechnology，目录号IT-51-250，ATS Bio，圣迭戈，CA)与纯化的IgG或与含有IgG的细胞培养上清液混合，进行ADC测定法。在癌细胞系CMK-11-5(急性巨核母细胞白血病细胞，在RPMI1640+10％FCS中培养)上测试细胞毒潜力，因为这些细胞显示cKIT高表达。
将培养细胞计数并稀释于培养基中至浓度1x105个细胞/ml。将50μl细胞悬液(5000个细胞/孔)转移至96孔板(处理的透明平底白色平板TC，Corning目录号3903，Corning，Tewksbury，MA)。在一块独立平板(96孔V型底，Nunc，目录号249946，Nunc Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中，将IgG稀释于培养基中。将含有IgG的细胞培养上清液1:125稀释并且将纯化的IgG稀释至浓度0.4nM，产生60μl/孔的总体积。添加浓度5nm的等体积FabZAP溶液并且将平板在37℃温育60分钟。将50μl抗体/Fab-ZAP缀合物转移至CMK-11-5细胞(总体积100μl)。对于对照，制备仅含细胞的孔(＝100％生存力对照)和细胞仅与Fab-ZAP温育(以检验第二试剂的非特异性杀伤作用)的孔。Fab-ZAP的终浓度是1.25nM。将平板在37℃和5％CO2温育72小时。根据制造商的说明书，使用ingCellTiter- (Promega#G7571)确定细胞数目。生存力对仅细胞对照归一化。
概述
在筛选cKIT抗体中，执行2种不同的策略：
策略1:
在高亲和力方面选择具有人/食蟹猴交叉反应性(217HCDR3家族)的候选物，并且在IgG转化后，在CMK-11-5FabZAP ADC测定法和Mo7e增殖测定法中筛选克隆的功能性。基于功能活性和多样性，选择候选物用于探索性规模表达。
策略2：
将具有人/食蟹猴/小鼠交叉反应性(5HCDR3家族)的候选物进行亲和力成熟并且在IgG转化后，选择候选物用于表达。
总计，对来自策略1和2的82个纯化的IgG候选物进行深入表征。从这个82种候选物的汇集物中，选择26种IgG候选物用于放大生产、毒素缀合和作为抗体药物缀合物在体外和体内实验中后续检验。
当深入表征时，选择属于16个不同HCDR3家族的26种抗体(14种来自策略1的候选物和12种来自策略2的候选物)用于放大生产并作为抗体-DM1缀合物检验。根据以下标准选择候选物：1)在Fab-DM1背驮式测定法中强烈杀伤表达野生型和突变cKIT的细胞，EC50处于亚纳摩尔至低纳摩尔范围，2)针对食蟹猴cKIT的24/26IgG的KD值处于就针对人cKIT测定而言的3倍范围内。此外，12/26IgG与细胞上表达的小鼠和大鼠cKIT交叉反应。
来自这个筛选的所选择候选物可以是归属于不同的表位bin：
1)19/26IgG属于Bin1或Bin6(与cKIT D1-3结合，配体结合结构域)
2)6/26IgG属于Bin8(与cKITD4-5结合，二聚化结构域)
3)1/26IgG属于Bin2，其对人cKIT具有高亲和力，但是对食蟹猴cKIT仅具有弱亲和力。来自这种类型筛选方案的抗体的例子是抗体20376。
实施例4：人、食蟹猴、小鼠和大鼠cKIT ECD蛋白的构建体
基于来自GenBank或Uniprot数据库的氨基酸序列，将人、小鼠和大鼠cKIT胞外结构域进行基因合成(参见下表2)。基于使用来自各种食蟹猴组织的mRNA所生成的氨基酸序列信息，将食蟹猴cKIT和1个ECD cDNA模板进行基因合成(例如Zyagen Laboratories；下表2)。将全部合成的DNA片段克隆至带有C末端标签以允许纯化的适宜表达载体中，例如基于hEF1-HTLV的载体(pFUSE-mIgG2A-Fc2)。
表2
表3：食蟹猴cKIT蛋白的序列
重组cKIT蛋白的表达
在HEK293衍生的细胞系(293FS)中表达所需的cKIT重组蛋白，所述细胞系事先适应于悬浮培养并且在无血清培养基FreeStyle-293(Gibco，目录号12338018)中培育。小规模和大规模蛋白质生产均通过瞬时转染进行并且在各自至多1L的多个摇瓶中实施(Nalgene)，以293Fectin(Life Technologies，目录号12347019)作为质粒载体。以比率1:1.5(w:v)使用总DNA和293Fectin。DNA对培养物比率是1mg/L。转染后3-4天，将细胞培养上清液收获、离心并在纯化之前无菌过滤。
实施例5：人、食蟹猴，小鼠和大鼠cKIT ECD蛋白的纯化和cKIT亚结构域1-3和4-5的纯化
加标签的蛋白质纯化
从细胞培养上清液纯化加Fc标签的重组cKIT胞外结构域蛋白(例如，人cKIT ECD-Fc、人cKIT(ECD亚结构域1-3、4-5)-Fc、食蟹猴cKIT-mFc、大鼠cKIT-mFc、小鼠cKIT-mFc)。使澄清的上清液在已经用PBS平衡的蛋白A琼脂糖凝胶柱上通过。在洗涤至基线后，将结合的物质用Pierce Immunopure低pH洗脱缓冲液或100mM甘氨酸(pH 2.7)洗脱并立即用1/8洗脱体积的1M Tris pH 9中和。如果需要，使用具有10kD或30kD标称分子量截值的AmiconUltra 15mL离心浓缩器，浓缩汇集的蛋白质。随后使用Superde x 20026/60柱，通过SEC纯化汇集物，以除去聚集物。随后通过SDS-PAGE和SEC-MALLS(多角激光散射)表征纯化的蛋白质。使用通过Vector NTI从序列计算的理论吸收系数，借助280nm处的吸光度测定浓度。
实施例6：cKIT抗体与cKIT ECD亚结构域的结合
为了帮助确定cKIT抗体的结合位点，将人cKIT ECD划分成亚结构域1-3(配体结合结构域)和亚结构域4-5(二聚化结构域)。为了确定结合哪个亚结构域，利用夹层ELISA测定法。将1X磷酸缓冲盐水中稀释的1μg/ml的与cKIT亚结构域1-3、亚结构域4-5或全长cKITECD相对应的ECD包被在96孔Immulon 4-HBX平板(Thermo Scientific目录号3855，Rockford，IL)上并在4℃温育过夜。将平板用含0.01％Tween-20(Bio-Rad101-0781))的洗涤缓冲液(1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。将平板在室温用稀释于1X PBS中的280μl/孔3％牛血清白蛋白封闭2小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次。将抗体以2μg/ml在洗涤缓冲液中针对8个点以5倍稀释度制备并按100μl/孔一式三份添加至ELISA平板。将平板温育在室温在有轨摇床上以200转/分钟振摇1小时。分析平板用洗涤缓冲液洗涤3次。将第二抗体F(ab’)2片段山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch目录号109-036-088，WestGrove，PA)在洗涤缓冲液中1:10,000制备并以100μl/孔添加至ELISA平板。将平板在室温在有轨摇床上以200转/分钟与第二抗体振摇温育1小时。分析平板用洗涤缓冲液洗涤3次。为了形成ELISA信号，将100μl/孔SureTMB底物(KPL目录号52-00-03，Gaithersburg，MD)添加至平板并且允许在室温温育10分钟。为终止反应，将50μl 1N氢氯酸添加至每个孔。使用Molecular Devices SpectraMax M5平板读数仪在450nm测量吸光度。为了确定每种抗体的结合反应，将光密度量值平均化，生成标准差值并利用Excel作图。下表5中显示每种独立抗cKIT抗体的结合结构域。
实施例7：cKIT抗体的亲和力测量
使用2000仪(GE Healthcare，匹兹堡，PA)及连同CM5传感芯片，使用SPR技术测定抗体与cKIT物种直向同源物的亲和力及其与cKIT的亲和力。
简而言之，使用补充有2％封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)的HBS-P(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)作为全部实验的运行缓冲液。通过响应单位(RU)测量固定化水平和分析物相互作用。进行预试以检验和证实固定抗人Fc抗体(目录号BR100839，GE Healthcare，匹兹堡，PA)及捕获试验抗体的可行性。
对于动力学测量，进行以下实验，其中通过固定的抗人Fc抗体，将抗体捕获到传感芯片表面并测定cKIT蛋白在游离溶液结合的能力。简而言之，在全部两个流动小室上通过胺偶联法以流速5μl/分钟，将25μg/ml抗人Fc抗体在pH 5固定在CM5传感芯片上以实现10,500RU。随后以10μl/分钟注射0.1-1μg/ml试验抗体1分钟。通常保持抗体的捕获水平低于200RU。随后，将3.125-50nMcKIT受体胞外结构域(ECD)以2倍系列稀释并且以流速40μl/分钟在参比流动小室和检验流动小室上注射3分钟。下文列出所测试ECD的表。跟踪结合作用的解离10分钟。在每个注射循环后，将芯片表面用3M MgCl2以10μl/分钟再生30秒。全部实验均在25℃进行并且响应数据总体上用简单1:1相互作用模型拟合(使用软件第2.0b版(BioLogic Software)以获得结合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和力(KD)的估计值。
表4ECD同种型和来源：
表5列出了结构域结合作用和亲和力。如本表中所示，抗体9p3、NEG024、NEG027、NEG085、NEG086、NEG087和20376均在纳摩尔水平与人cKIT反应，并且与针对食蟹猴猴ECD所测试的那些抗体具有相似的亲和力。但是，仅20376与小鼠交叉反应。测试的抗体均不与大鼠cKIT交叉反应。
表5
实施例8：ADC的制备
通过单步骤法制备DM1缀合物
在开始缀合反应之前，将各个cKIT抗体借助切线流过滤(TFF#1)渗滤到反应缓冲液(15mM磷酸钾，2mM EDTA，pH 7.6)中。随后，将cKIT抗体(约5.0mg/mL)与DM1(相对抗体数量，5.6倍摩尔过量)混合并且随后与SMCC(相对抗体数量，约5.0倍摩尔过量)混合。反应在20℃在含有2mM EDTA和10％DMA的15mM磷酸钾缓冲液(pH 7.6)中进行大约16小时。通过添加1M乙酸以调节pH至5.0，使反应猝灭。在pH调整后，将反应混合物通过一个多层(0.45/0.22μm)PVDF滤器过滤并且使用切线流过滤(TFF#2)，纯化及渗滤到含有8.22％蔗糖的20mM琥珀酸盐缓冲液(pH 5.0)中。下表6中列出用于切线流过滤的仪器参数的例子。
表6用于切线流过滤的仪器参数
通过UV光谱法分析从上文所述方法获得的缀合物的细胞毒性剂载量(类美登素对抗体比率，MAR)；通过SEC-HPLC分析所述缀合物以测定缀合物单体；并通过反相HPLC或疏水性屏蔽相(Hisep)-HPLC分析所述缀合物的游离类美登素百分数。
通过原位法制备DM1缀合物
也可以通过原位法根据以下程序缀合抗cKIT抗体。使用磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)接头，将cKIT抗体与DM1缀合。在DMA中制备DM1和磺基-SMCC异双官能接头的母液。将磺基-SMCC和DM1硫醇混合在一起，以在25℃在含有40％v/v50mM琥珀酸酯水性缓冲液、2mM EDTA，pH 5.0的DMA中按DM1对接头比率1.3:1摩尔当量和DM1终浓度1.95mM反应10分钟。随后抗体与反应物的等分试样反应，以在50mMEPPS，pH 8.0和10％DMA(v/v)中2.5mg/mL抗体的最终缀合条件下产生SMCC对抗体摩尔当量比率约6.5:1。在25℃大约18小时后，使用SEPHADEXTMG25柱纯化缀合反应混合物，其中所述柱用10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween 20，pH 5.5平衡。
任一种方法可用于抗体的缀合。下表提供cKIT ADC的例子。
表7DM1缀合的抗体的特性
用SPDB接头制备ADC
在25℃在含有50mM NaCl、2mM EDTA和5％DMA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，将抗cKIT抗体(例如，抗体9P3)(8mg/ml)用N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB，分别5.0倍、5.5倍和4.9倍摩尔过量)修饰120分钟。随后在25℃在含有50mM NaCl、2mM EDTA和5％DMA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，将修饰的Ab在不纯化的情况下以修饰的抗体最终浓度4mg/mL与DM4(相对未结合的接头1.7倍摩尔过量)缀合18小时。使用SEPHADEXTMG25柱纯化缀合反应混合物，其中所述柱用10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween20，pH 5.5平衡并洗脱。
用CX1-1接头制备ADC
将抗cKIT抗体(例如，抗体9P3(5.0mg/mL))与DM1(相对于抗体数量，7.15倍摩尔过量)混合并且随后与CX1-1(相对于抗体数量，5.5倍摩尔过量)混合。反应在25℃在含有2mMEDTA和5％DMA的60mM EPPS[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸]缓冲液(pH 8.5)中进行大约16小时。随后使用SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物，其中所述柱在10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween 20，pH 5.5中平衡并洗脱。
图2中显示了比较抗体-MCC-DM1、抗体-SPDB-DM4和抗体-CX1-1-DM1的体外效力的例子。
实施例9：ADC相对于亲本抗体的亲和力
使用Biacore技术，使用 T100仪(GE Healthcare，匹兹堡，PA)和CM5传感芯片，使用与以上实施例7中所述相似的方法学，测定SMCC-DM1缀合之后抗体对cKIT的亲和力。
就所评估的抗体而言，相对于未缀合的亲本抗体，对SMCC-DM1缀合的抗体获得了与人cKIT结合的相似亲和力估计值，提示缀合并未明显影响抗体结合作用(表8)。
表8未缀合抗体和MCC-DM1缀合的抗体的亲和力
实施例10：9P3-MCC-DM1、9P3-SPDB-DM4和9P3-CX1-1-DM1在一组细胞系上的活性
与MCC-DM1接头-有效负载缀合后，测定了抗体药物缀合物(ADC)抑制AML、SCLC、GIST和黑素瘤细胞系增殖的能力。GIST-T1细胞系由Dr.Takahiro Taguchi,Kochi U.,日本友情提供。TheGIST 430和GIST882细胞系由Dr.Jonathan Fletcher,Brigham和Women’sHospital,Boston,MA友好提供。
对于小细胞肺癌(SCLC)，使用NCI-H526和NCI-H1048细胞系。NCI-H526是cKIT高表达者并从ATCC获得(CRL-5811，ATCC马纳萨斯，VA)。NCI-H1048以较低水平表达cKIT，并且也从ATCC获得(CRL-5853)。CMK-11-5是表达高水平cKIT的AML系((JCRB目录号IFO50430，日本)，还参见Nagano等人,Int.J.Hematol.1992；56:67-78))。UKE-1也是AML细胞系并且它表达少量的cKIT。UKE-1细胞系由德国汉堡University Hospital Eppendorf的WalterFiedler教授慷慨提供。Kasumi1从ATCC获得(CRL-2724)。Kasumi-6从ATCC获得(CRL-2775)。MDA-MB-453从ATCC获得(HTB-131)。NCI-H889系和NCI-H1930系购自ATCC(分别是CRL-5817和CRL-5906)。Hel92.1.7细胞从Sigma-Aldrich(目录号92111706-1VL，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)获得。M-07e和SKNO1细胞从DSMZ购买，分别是ACC-104和ACC-690(DSMZ，布伦瑞克，DE)。OCI-M1细胞系也来自DSMZ(ACC-529)。
简而言之，将细胞在组织培养箱中在37℃，5％CO2在如供应商推荐的培养基中培养。在分析当日，将细胞用PBS(Cellgro，Corning，Tewksbury MA(目录号21-031-CV))洗涤2次，之后用0.1％胰蛋白酶-EDTA(自有技术服务)处理5分钟并重悬于推荐的培养基中。随后将细胞计数并以2,000-10,000个细胞/孔的密度接种在96孔平板(Costar目录号3603，Corning，Tewksbury，MA)的100μl细胞培养基中。产生一式两份平板用于第0日测量并且将全部平板在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育过夜。还产生仅含培养基的孔以充当阴性对照。在这种温育之后，将100μl/孔细胞滴定试剂(Promega目录号G7573，Madison，WI)添加至第0日平板，随后温和振摇所述平板2分钟，温育10分钟，并且使用Perkin ElmerWallac Microbeta 平板读数仪(Perkin Elmer，Waltham，MA)，测量所产生的发光强度。将试验ADC在适宜的细胞培养基中连续稀释至3X母液并且添加50μl 3X连续稀释的ADC(分析终浓度0.0002-68nM DM1当量)，之后在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育5天。在这个温育时间之后，通过添加如上文所述的细胞滴定试剂测定相对细胞生存力。使用重复平板的平均数如下计算ADC对细胞增殖的影响：(抑制百分数＝(ADC处理-未处理的)/(未处理的–第0日)*100)。将抑制百分数数据对4-参数逻辑方程拟合并测定GI50值。
如图1中所示，在增殖测定法中对一组GIST(GISTT-1、GIST882、GIST 430)，SCLC(NCI-H526、NCI-H1048)和AML(Kasumi-6、Kasumi-1)细胞系测试cKIT ADC。该表中列出了IC50值和最大杀伤值。MDA-MB453(乳腺癌细胞系)不表达cKIT。IgG-MCC-DM1是同种型对照。如由图1所展示，全部cKIT ADC在所用的7个细胞系中均具有纳摩尔至亚纳摩尔IC50。这表明这些cKIT ADC具有宽适应症谱，并且在肿瘤表达适宜水平的cKIT的情况下均可使用。
还评价了通过SPDB-DM4和CX1-1-DM1接头-有效负载缀合的抗cKIT抗体(9P3)的能力并在图2中显示。如上文所述实施的这些研究揭示，使用SPDB-DM4或CX1-1-DM1时，评价的抗cKIT ADC也是细胞增殖的强力抑制剂，这提示它们成功递送毒素以杀伤细胞的能力不限于MCC-DM1。图1和图2均提供在纳摩尔至亚纳摩尔范围有效的cKITADC。
此外，图3是抗cKIT ADC GI50对cKIT受体水平及适应症(AML、GIST、黑素瘤和SCLC)的图。如图3中所示，抗cKIT ADC在全部所列出的适应症当中均有效。
实施例11：cKIT–MCC-DM1ADC在GIST、SCLC和AML细胞系上的体外活性
与MCC-DM1接头-有效负载缀合后，测定了抗体药物缀合物(ADC)抑制AML、SCLC和GIST细胞系增殖的能力。对于这些实验中由供应商所用的细胞的名单，参见以上实施例10。
简而言之，将细胞在组织培养箱中在37℃，5％CO2在如供应商推荐的培养基中培养。在分析当日，将细胞用PBS(Cellgro，目录号#21-031-CV，CorningTewksbury，MA)洗涤2次，之后用0.1％胰蛋白酶-EDTA(自有技术服务)处理5分钟并重悬于推荐的培养基中。随后将细胞计数并对于AML和SCLC细胞以5,000个细胞/孔的密度以及对于GIST细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔平板(Costar目录号3603，Corning，Tewksbury，MA)的100μl细胞培养基中。产生一块重复平板用于第0日测量并且将全部平板在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育过夜。在这种温育之后，将100μl/孔细胞滴定试剂(Promega目录号G7573，Promega，Madison，WI)添加至第0日平板，随后温和振摇所述平板2分钟，温育10分钟，并且使用Perkin Elmer Wallac Trilux平板读数仪(Perkin Elmer，Waltham，MA)，测量所产生的发光强度。将试验ADC在适宜的细胞培养基中连续稀释至3X母液并且添加50μl 3X连续稀释的ADC(分析终浓度0.0002-68nM DM1当量)，之后在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育5至8天。在这个温育时间之后，通过添加如上文所述的细胞滴定试剂测定相对细胞生存力。使用重复平板的平均数如下计算ADC对细胞增殖的影响：(最大影响％(AMAX)＝(未处理的-处理的最高ADC浓度)*100)。
将抑制百分数数据对4-参数逻辑方程拟合并测定GI50值。图4-9中显示该数据。如图中所示，使用一种IgG-MCC-DM1缀合物作为对照。全部测试的ADC均具有比对照抗体更大的活性。如通过图4-9中的曲线展示，抗cKIT ADC，例如，theNEG085，NEG024和20376抗体，在减少细胞增殖方面非常有效，并且因此将会在治疗GIST、AML和SCLC方面有效。
实施例12：通过FACS(荧光激活的细胞分选法)对细胞系上的cKIT表面受体密度定量
使用Quantum Simply Cellular珠(Bangs Laboratories,目录号815，Fishers，IN)作为标准物。珠标准物的抗体结合能力是0至约310,000。将珠子或五十万个细胞离心并用100μl/样品的FACS缓冲液(PBS，0.2％BSA，0.1％NaAz)洗涤两次。在每个洗涤步骤后，将珠子或细胞离心并小心地重悬。在洗涤之后，添加FACS缓冲液并对于终体积100l/样品，将10μg/mlof APC-小鼠抗人CD117(BD Pharmigen目录号550412，BD Biosciences，San Jose，CA)或10μg/ml APC-小鼠IgGκ同种型对照(BD Pharmigen目录号554681)添加至相应的孔。
随后将细胞-抗体悬液在冰上温育1小时。在温育后，将细胞离心并用100μl FACS缓冲液洗涤2次。在每个洗涤步骤后，将珠子或细胞离心并小心地重悬。
通过在100μl/样品含有7-AAD(BD Pharmigen目录号559925)的FACS缓冲液中重悬，排除无活力的细胞。将样品在冰上温育10分钟并在BD FACS (BDBiosciences，San Jose，CA)中分析。使用软件测定每份样品的信号的几何平均数，并且如Quantum Simply Cellular手册中所述确定抗原密度。在TIBCO Spotfire 4中分析体外细胞系对ADC的敏感性和细胞系受体密度。
在图3的Y-轴上显示这种受体密度。在这个方面，受体密度分析可用作患者分级的初始生物标记物。例如，在图3中，高受体密度与X-轴上显示的抗cKIT ADC的效力GI50相关。受体密度的分析可用于临床环境下，以确定哪位患者应当接受抗cKIT ADC治疗药。
实施例13：通过氘交换质谱法(HDx-MS)对cKIT 9P3抗体的表位定位
氘交换质谱法(HDx-MS)测量蛋白质的酰胺主链上的氘摄取量。这些量值对酰胺的溶剂可及性和主链酰胺的氢键网络的变化敏感。HDx-MS经常用来比较处于两个不同状态(如结合apo和结合配体)的蛋白质并且与胃蛋白酶快速消化法偶联。在这类实验中，可以定位显示两个不同状态之间差异性氘摄取量的区域，其一般具有10至15个氨基酸。受到保护的区域直接参与配体结合或以变构方式受抗体与配体的结合影响。
在这些实验中，在治疗性mAb 9P3不存在和存在下测量cKIT胞外结构域(SEQ IDNO:160，见下文)的氘摄取量。cKIT中当抗体结合时显示氘摄取量下降的区域可能参与表位；然而，归因于测量的性质，还可能检测远离直接结合位点的变化(变构效应)。通常，具有最大数量保护作用的区域参与直接结合，不过并非总是如此。为了阐明来自变构效应的直接结合事件，需要正交测量(例如X射线结晶学、丙氨酸诱变)。
表9.cKIT胞外结构域构建体
cKIT表位定位实验在Waters G2HDx-MS平台上进行，所述平台包括机器人系统、 UPLC系统和 质谱仪。在这种方法中，如下实施一式三份对照实验。将300pmol(1.4mg/ml)cKIT抗原稀释于110μl 95％氘化的PBS缓冲液(pH 7.4)中并在室温在桌面摇床上温育25分钟(％D＝85.5％)。通过在冰上用冷猝灭缓冲液(6M脲和1M TCEP pH＝2.5)1:1稀释5分钟，使氘交换猝灭。在猝灭后，将管转移到LEAP系统(Thermo箱设定在2℃)上并且将猝灭样品通过LEAP系统注射到UPLC系统上以便分析。UPLC系统并入了维持在12℃的固定化胃蛋白酶柱2.1mm x 30mm(LifeTechnologies 2-3131-00)。将持续8分钟的2％至35％乙腈梯度和Waters UPLC CSHC181.0x100mm柱用于分离。接下来，使用该抗体实施一式三份实验。使用标准技术，将300pmol 9P3抗体固定在蛋白G琼脂糖珠(Thermo Scientific目录号22851)上。简而言之，将抗体离心以移除储存缓冲液。随后，将200μl PBS缓冲液(pH 7.4)和300pmol cKIT添加至固定化的抗体并在室温温育30分钟。在温育后，将复合物离心并用200μl PBS缓冲液洗涤并且再次离心。对于氘交换，将200μl氘化的PBS添加至抗原-抗体复合物以在室温温育25分钟(％D＝85.5％)。随后移除氘缓冲液，并立即添加125μl冰冷的猝灭缓冲液。在猝灭5分钟后，将柱离心并将流通液转移至预先冷却的HPLC小瓶中。使用与对照实验相同的在线胃蛋白酶消化/LC-MS设置，分析样品。
图10和图11中总结这些测量的结果。图10显示对照和9P3抗体结合的样品之间基线修正差异除以测量中标准误。在这个图中，更负的值表示当9P3抗体与cKIT抗原结合时所给出区域内量更大的保护作用。一旦9P3与cKIT结合，我们在cKIT的以下两个区域内观察最明显量的保护：VFVRDPAKLFL((区域1，109-119(SEQ ID NO.161))和HCSVDQEGKSVLSE((区域2，185-198(SEQ ID NO.162))。区域1包含残基109-119并且是D1和D2结构域的部分。区域2包含残基185-198并且是D2结构域的部分。在图11中，我们具有将最受保护的两个区域(参见图10)定位到cKIT胞外结构域的晶体结构(PDB ID2e9w)上。此外，我们还已经使用文献值，将cKIT上的SCF结合位点标记为位点I、II和IIII(Yuzawa等人,Cell 2007；130:323-334)。存在来自图11的两个关键发现。首先，区域1和2在晶体结构中非常接近，甚至它们在一级序列空间上相隔遥远。这种观察结果表明两个区域可能潜在地是表位的部分，并且如果是这样，则9P3的表位是不连续的。第二，区域1和2远离文献中报告的SCF结合位点。这是一项重要观察结果，因为它表明9P3抗体不直接干扰配体结合。相反，当结合配体时，抗体可能在空间上干扰配体结合和/或干扰受体二聚化。在独立的竞争测定法中，使用ELISA和FACS，我们观察到SCF与cKIT的结合被9P3部分地阻断，从而似乎存在部分空间干扰。总之，HDx-MS数据显示9P3抗体的表位由远离SCF结合位点的不连续表位组成。NEG024、NEG085、NEG086、NEG027和NEG087预计具有相同的作用机理。
实施例14：使用cKIT野生型细胞株系Mo7e和cKIT突变体细胞系GISTT-1，评价cKITADC充当激动剂的能力
为了评价cKIT ADC的潜在激动特性，将2x106个GISTT-1(由日本Kochi U.的Takahiro Taguchi博士友好提供)或Mo7e(DSMZ，ACC-104)细胞在37℃，5％CO2(用于GISTT-1的DMEM和补充有0.1％FBS的用于Mo7e的RPMI)在6孔平板(NUNC目录号14067)中血清饥饿过夜。将细胞在37℃用10ng/ml rh-SCF(R&D，目录号255-SC，R&D，Berkeley，CA)、5μg/mlNEG085-MCC-DM1、NEG024-MCC-DM1和20376-MCC-DM1处理15分钟。一个孔命名为未处理的(UT)。将细胞收获在1ml PBS中。将细胞沉淀物在冰上在30μl裂解缓冲液：20mM Tris-HCl；pH 7.5，137mM NaCl，1％Triton X-100，15％甘油，蛋白酶和磷酸酶抑制剂中裂解60分钟。随后将裂解物在4℃以12,000转/分钟离心40分钟。将每份样品20μg在75℃煮10分钟并加载于12孔4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies，NP0322BOX，Carlsbad，CA)上。在蛋白质转移至膜印迹物后，将膜在室温在TBST-5％乳中封闭1小时并且随后在4℃用第一抗体探测过夜。次日，将印迹物在TBST(4×5分钟)中洗涤。将印迹物在室温在第二抗体(山羊-抗兔-HRP 1:30,000，Santa Cruz)中温育1小时。将印迹物在TBST(4×5分钟)中洗涤并显色。
用于蛋白质印迹的第一抗体是α-cKIT、Tyr703(Cell Signaling Technology目录号3073，Beverly，MA)、α-cKITTyr721(NOVUS，目录号NBP1-51412，Novus，Littleton，CO)、AKT Ser473(Cell Signaling Technology目录号9271)、AKT(Cell Signaling Technology目录号4691)、ERK Thr202/Tyr204(Cell Signaling Technology目录号9101)、ERK(CellSignaling Technology目录号9102)和GAPDH(Cell Signaling Technology目录号3683)。
如图12中所示，cKIT抗体NEG085、NEG024和20376可以在配体(SCF)不存在的情况下介导cKIT的磷酸化。然而，下游信号传导途径不受影响，因为信号不转导到磷酸ERK或磷酸AKT。
实施例15：如通过流式细胞术测定的GIST-T1细胞上表面的cKIT抗体介导的cKIT内化
使用温度变动法和流式细胞术读出，通过细胞单层中用抗体处理，评价cKIT抗体介导的内化的动力学。将GIST-T1细胞(由Dr.TakahiroTaguchi，KochiU.，日本友好提供)以2.5x10E5个细胞/孔接种在五块12孔组织培养处理的平板(BD Falcon 353043)中。将细胞在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育过夜。次日，将培养基取出并更换为450μl新鲜培养基。将cKIT抗体NEG085、20376和同种型对照以10X 10μg/ml浓度在适宜的细胞培养基中制备，并且每孔以终浓度10μg/ml添加50μl试验cKIT抗体或同种型。将全部细胞在冰上温育1小时，随后用1mL1X磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并重悬于500μl细胞培养基中。将平板#2-5转移至37℃并且在37℃，5％CO2在以下时间点收获：30分钟、2小时、4小时和24小时。将100μl细胞解离缓冲液(Gibco目录号13150-016，Life Technologies，Carlsbad，CA)添加至平板#1(4℃结合对照)并在37℃温育直至细胞脱离。将细胞用100μl培养基中和并转移至96孔V形底组织培养处理平板(Costar 3894)。将细胞离心并用FACS缓冲液(1X磷酸缓冲盐水，2％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)洗涤两次。将藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG第二抗体(InvitrogenH10104，Life Technologies，Carlsbad，CA)以1:100比率在FACS缓冲液中制备。将第二抗体以100μl/孔添加至细胞并且与细胞在冰上温育45分钟。在温育时间结束时，将细胞离心并用FACS缓冲液洗涤3次。细胞用100μl/孔1％多聚甲醛固定并贮存在4℃暗处。对于在37℃各个时间点温育的细胞，重复细胞解离步骤、第二抗体温育步骤和固定步骤。次日，使用HTS系统(BD Biosciences，San Jose，CA)，使用设备，分析全部样品。样品用FlowJo软件分析以获得藻红蛋白通道的荧光几何平均值。图13A是初始细胞表面结合作用％对几何平均-PE 4℃结合作用/几何平均值-PE 37℃时间点x100的图。如图13A中所示，抗体NEG085和20376均结合细胞表面上的cKIT并快速内化至细胞中。这表明公开的cKIT ADC将被快速地内化，因此有效地递送毒素至细胞中。
在另一个内化实验中，在人骨髓细胞上评价NEG085对cKIT受体水平的影响。将正常人CD34+骨髓细胞(All Cells，目录号#ABM022F，Emeryville，CA)解冻并用10mL-34SFM培养基(Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA)洗涤。将细胞以4x105个细胞/mL重悬于1.25mL StemPro-34SFM培养基中并均等分入两个管。一个管是未处理的，并且另一个管用10μg/ml NEG085处理，并且将两个管在37℃，5％CO2温育。将100μL细胞悬液在每个时间点(0、15、30、60、120和240分钟)从每种条件收集并置于冰冷的收集管中以停止内化。将细胞用3mL冰冷的FBS染色缓冲液洗涤并重悬于100μLFBS染色缓冲液中。将5mL104D2-BV421(小鼠抗人IgG1k，Biolegend，圣迭戈CA)添加至每只管并且在冰上温育1小时。在用FBS染色缓冲液另一次洗涤后，通过在FACS (BD Biosciences，SanJose，CA)上评估BV421的平均荧光强度，通过流式细胞术测量总cKIT受体。
如图13B中所示，cKIT当结合NEG085时快速内化，大部分的内化快速发生(15分钟)并且随后继续稳定地减少表面上cKIT的量直至4小时终点。
实施例16：在野生型cKIT细胞系(NCI-H526)或突变cKIT细胞系(GIST-T1)中评定NEG085-MCC-DM1调节cKIT降解的能力
将5x106个GIST-T1细胞(由Dr.Takahiro Taguchi，KochiU.，日本友好提供)或NCI-H526细胞(ATCCCRL-5811)在前一夜在37℃，5％CO2接种在生长培养基(对于GISTT-1，是DMEM，10％FBS，并且对于NCI-H526，是RPMI，10％FBS)中。随后细胞用无甲硫氨酸培养基(GIBCO：DMEM，21013-024；RPMI，A14517-01，Life Technologies，Carlsbad，CA)中100mM放线菌酮(cycloheximide)(CHX)(目录号090M4009，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)处理。将细胞在37℃，5％CO2用5μg/ml ADC(NEG085-MCC-DM1)、10ng/ml rh-SCF(R&D，255-SC)或ADC和rh-SCF处理1、4或6小时.在处理后1小时、4小时和6小时，将细胞收获在1ml PBS中。将细胞沉淀物在冰上在50μl裂解缓冲液(20mM Tris-HCl；pH 7.5，137mM NaCl，1％Triton X-100，15％甘油，蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中裂解60分钟。随后将裂解物在4℃以12,000转/分钟离心40分钟。将每份样品5μg在75℃煮10分钟并加载于15孔4-12％Bis-Tris凝胶(NP0323BOX Life Technologies，Carlsbad，CA)上。在蛋白质转移至膜印迹物后，将膜在室温在TBST-5％乳中封闭1小时并且随后在4℃用抗cKIT抗体(Cell SignalingTechnology目录号3074，Beverly，MA)探测过夜。次日，将印迹物在TBST(4×5分钟)中洗涤。将印迹物在室温在第二抗体(山羊-抗兔-HRP 1:30,000，Santa Cruz Biotechnologies，Dallas，TX)中温育1小时。将印迹物在TBST(4×5分钟)中洗涤并显色。用于蛋白质印迹的第一抗体是抗cKIT(Cell Signaling Technology目录号3074)和GAPDH(Cell SignalingTechnology目录号3683)。图14A/B显示NEG085-MCC-DM1介导的cKIT受体降解的时程。降解迅速，6小时后水平变得很低/不可检出。注意在表达突变cKIT受体的GIST T1细胞中采用NEG085-MCC-DM1时，cKIT受体的降解比SCF更快发生(小图14A)。另外，NEG085-MCC-DM1不阻断cKIT受体结合SCF，因为添加NEG085-MCC-DM1和SCF引起更快的降解，如图14B中所见。如果NEG085-MCC-DM1是配体阻断剂，则采用SCF时NEG085-MCC-DM1和NEG085-MCC-DM1之间不存在差异。
实施例17：未缀合的NEG085和20376不抑制SCF依赖性细胞系Mo7e的增殖。
为了评价裸抗体的潜在拮抗特性和抗体药物缀合物(ADC)抑制表达cKIT的细胞系增殖的能力，将MO7e(DSMZ，目录号ACC-104，布伦瑞克，DE)在用于存活的cKIT配体，即干细胞因子(SCF)存在或不存在下培育。以5000个细胞/孔在96孔平板(Costar目录号#3904，Corning，Tewksbury，MA)中的100μl稀释培养基内接种之前，将MO7e细胞随10ng/ml人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(R&D Systems目录号215-GM，Minneapolis，MN)或10ng/ml人干细胞因素SCF(R&D Systems目录号255-SC)培育。产生一式两份平板用于第0日测量并且将全部平板在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育过夜。在这个温育之后，添加额外50μl稀释培养基，随后添加90μl/孔Cell titer 试剂(Promega目录号G7573，Madison，WI)至命名为“第0日”平板的的每个孔。将分析平板温和振摇20分钟并且使用Perkin Elmer1450Microbeta 平板读数仪(Perkin Elmer，Waltham，MA)，测量所产生的发光强度。以3X浓度制备试验裸抗体和ADC；在适宜细胞培养基中30μg/ml并针对8个点5倍连续稀释。还产生仅含培养基的孔以充当阴性对照。添加50μl 3X连续稀释的抗体或ADC(分析终浓度0.0009-68nM)，之后在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育5天。在这个温育时间之后，通过添加如上文所述的Cell titer Glo试剂测定相对细胞生存力。使用一式两份平板的平均数如下计算ADC对细胞增殖的影响：(抑制百分数＝(ADC或处理的抗体)/(未处理的)*100)。将抑制百分数数据对4-参数逻辑方程拟合并测定IC50值。
如图15和图16中所示，抗cKIT裸抗体不抑制细胞增殖。在图15中，NEG085-MCC-DM1与未缀合的NEG085、NEG024和20376比较。如图中清晰显示，NEG085-MCC-DM1在低浓度抑制M07e细胞的细胞增殖，而未缀合的抗体不具有这种作用。IgG-MCC-DM1对照比未缀合的NEG085、NEG024或20376具有更大抗增殖作用。
这还在图16中见到，其中该实验使用GM-CSF而非SCF抵消SCF配体具有的对cKIT受体的内化效应。图16中的结果与图15一致，与未缀合的IgG对照相似，未缀合的NEG085抗体对细胞增殖没有有害作用。总之，图15和图16上所示的结果显示细胞增殖减少归因于抗cKIT抗体与毒素的缀合。
实施例18：评价体外ADCC活性
相对于Uke-1细胞(靶细胞；由德国汉堡University Hospital Eppendorf的Walter Fiedler教授慷慨提供)，与NK3.3细胞(杀伤细胞或效应细胞；来自Saint Louis大学的Jacky Kornbluth友好提供)共温育时，测定未缀合的抗cKIT抗体(NEG085，20376)介导抗体依赖性细胞毒作用的能力。简言之，将Uke-1细胞用钙黄绿素乙酰氧基-甲酯染色(钙黄绿素-AM；Sigma-Aldrich目录号17783-5MG，St.Louis，MO)，洗涤2次，以每孔5000个细胞的浓度吸入96孔微量滴定板(96孔，U形底，透明塑料；CorningCostar，目录号650,160，Tewksbury，MA)中并且与上文提到的抗体和蛋白质的连续稀释物(从50,000至0.003μg每ml)预温育10分钟，之后，以效应子对靶比率20:1添加效应子NK3.3细胞持续1小时。为了计算靶细胞的抗体特异性溶解，在没有充当基线和阴性对照的抗体或效应子细胞的情况下平行温育仅靶细胞，而通过用1％Triton-X100溶液裂解仅靶细胞，确定阳性对照或最大溶解或特异性裂解％。作为额外阳性对照，使用识别Uke-1细胞上的CD52的(Sanofi，Paris，FR)。在共温育靶和效应子细胞之后，将微量滴定板离心并将等分试样的上清液转移至另一块微量滴定板(96孔，平底，黑色透明底(CorningCostar，目录号3904，Tewksbury，MA)，并且用荧光计数器(多标记计数器，Perkin Elmer，Waltham，MA)确定溶液中游离钙黄绿素的浓度。
图17中展示结果。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的免疫力机制，其中效应子细胞溶解已经被特异性抗体结合的靶细胞。在这个实验中，以及抗cKIT抗体20376和NEG085是未缀合的人IgG1抗体。如图17中所示，仅MabCampath抗体介导靶细胞的ADCC杀伤作用。20376和NEG085均不能够诱导ADCC，甚至在更高浓度也是如此。因而，当使用一种ADC例如NEG085-MCC-DM1时所见到的任何细胞杀伤作用不归因于ADCC作用机理。
实施例19：使用原代人肥大细胞研究NEG085和20376造成肥大细胞凋亡的能力
根据Saito等人,Nature Protocols 2006；1(4):2178-2183描述的方法，培养来自人外周血的原代人肥大细胞。在1.6nM rhSCF(Genscript，目录号#Z00400，Piscataway，NJ)存在下，将已经在液体培养基中培养最短1周的肥大细胞在37℃与渐增浓度(0.05–100nM)的抗人cKIT抗体NEG085和20376或同种型对照IgG温育48小时，之后添加胱天蛋白酶-3/7试剂(Promega，目录号G8093，Madison，WI)以测量凋亡。在室温温育30分钟后，在 Synergy平板读数仪(BioTek，Winooski，VT)上记录发光。
由于cKIT在肥大细胞上表达，任何治疗性抗cKIT抗体不应当造成肥大细胞耗尽。图18显示在1.6nM rhSCF存在下用抗人cKIT抗体或同种型对照抗体处理后，采用原代人肥大细胞的凋亡测定法。将原代人肥大细胞与渐增浓度的抗cKIT抗体NEG085和20376或同种型对照IgG温育。如图18中所见，NEG085和20376未缀合抗体均不导致人原代肥大细胞离体的凋亡。
实施例20：使用原代人肥大细胞确定NEG085和20376介导肥大细胞脱颗粒的能力
根据Saito等人(上文)描述的方法，培养来自人外周血的原代人肥大细胞。将已经在液体培养中培养最短1周的肥大细胞用5％抗原特异性IgEJW8(自有批次ACE27283)、95％非特异性单克隆人IgE(Abbiotec，目录号#12030635，San Deigo，CA)和10ng/mL rhIL-4(R&D Systems目录号#204-IL，Minneapolis，MN)在37℃预处理5天。随后在山羊抗人IgG(H+L)Fc-特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号#109-005-008-JIR，West Grove，PA)存在下，将细胞与渐增浓度(0.05–100nM)的同种型对照IgG、抗人cKIT抗体20376和NEG085、抗IgEAb、LE27或NIP(5)BSA抗原在37℃温育90分钟。随后将细胞离心并且将上清液转移至96孔黑壁平板中，之后添加β–己糖胺酶底物。在37℃温育90分钟之后，通过添加tris碱(Sigma，目录号#T1503-500G，pH 12，St.Louis，MO)终止反应并且在平板读数仪上记录荧光强度。
如实施例19的此前实验中那样，重要的是评估抗cKIT抗体对肥大细胞的任何有害作用。此前实验检验肥大细胞的凋亡，而本实验涉及肥大细胞脱粒。如图19中所示，阳性对照NIP(5)和LE27显示高水平的肥大细胞脱粒。与之相反，抗cKIT抗体NEG085和20376不诱导离体下人原代肥大细胞的肥大细胞脱粒。
实施例21：借助cKIT ADC调节体内靶上药效动力学标志物
实施研究以评估cKIT ADC NEG027-MCC-DM1在体内调节药效动力学标志物的能力，包括在表达突变cKIT的GIST T1肿瘤异体移植物中检验NEG027抗体与有丝分裂抑制的药效动力学(PD)事件的共定位。这些研究的目的是评价G2/M细胞周期抑制的程度和持续时间。
通过使用免疫组织化学方法检测肿瘤中的人IgG抗体(其在小鼠中是NEG027)间接地估计ADC的存在。从Jackson ImmunoResearch Laboratories(目录号309-005-082，WestGrove，PA)获得亲和纯化的兔抗人IgG(H+L)。抗体与人IgG完整分子和其他人免疫球蛋白的轻链反应，与小鼠血清蛋白的交叉反应最少。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂(Ventana，Tucson，AZ)。将第一抗体稀释至工作浓度2μg/ml并在室温温育32分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4315，Ventana，Tucson，AZ)温育32分钟。
使用pHH3阳性胞核的堆积(如通过免疫组织化学所评估)作为G2/M抑制的标志物。通过用从Cell Signaling Technology(Danvers，MA，目录号9701)获得的合成性磷酸肽免疫动物，产生兔多克隆抗体，所述的合成性磷酸肽与围绕人组蛋白H3(pHH3)的Ser10的残基相对应。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂。将第一抗体稀释至1:50并在室温温育60分钟。随后，与JacksonImmunoResearchLaboratories山羊抗兔生物素化第二抗体(目录号111-065-144，West Grove，PA)温育32分钟。
为了评估GIST T1皮下肿瘤异体移植物模型中抗cKIT ADC诱导的PD标志物变化，对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％MatrigelTM(BD Biosciences)的悬液中的10x106个细胞。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到300mm3至500mm3(n＝3/组)，将小鼠随机分配以接受NEG027-MCC-DM1(2.5mg/kg)、非特异性IgG1-MCC-DM1同种型对照(2.5mg/kg)或tris-缓冲盐水(TBS；5ml/kg)单次静脉内给药。人IgG的免疫染色显示NEG027位于何处，并且这与更大密度的pHH3免疫染色区域相关(图20中显示的代表性图像)，从而为抗体与药效动力学效应的共定位提供支持。与类美登素有效负载的预计作用机理一致，相对于非特异性同种型IgG1-MCC-DM1或PBS处理的对照，就pHH3阳性而言，NEG027-MCC-DM1导致细胞阳性百分数的明显时间依赖性增加，峰值在给药后33小时和48小时，信号在约1周时返回基线(图21中显示的代表性图像，图22中显示的曲线)。还评价了切割的胱天蛋白酶3的时间依赖性变化。在这些研究中，通过用从EMD Millipore(目录号PC679)获得的合成肽免疫动物，产生兔多克隆抗体，所述的合成肽与毗邻于人胱天蛋白酶-3中(Asp175)的氨基端残基相对应。IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂。将第一抗体稀释至20μg/ml并在室温温育32分钟。随后，与JacksonImmunoResearch Laboratories山羊抗兔生物素化第二抗体(目录号111-065-144，WestGrove，PA)温育32分钟。
与pHH3相似，也观察到切割的胱天蛋白酶3的时间依赖性变化(图21中显示代表性图像，图22中显示的曲线)。这些数据显示cKIT ADC NEG027-MCC-DM1能够激发与类美登素有效负载作用机理一致的稳健的体内细胞PD效应。
显示GIST T1肿瘤上cKIT免疫染色的代表性照片以显现这种异体移植模型中的染色样式(图21)。从Dako(目录号A4502)获得了通过用合成肽免疫动物所产生的兔多克隆抗体，其中所述合成肽与cKIT胞质C端部分处的氨基酸963至976相对应。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂。将第一抗体稀释至工作浓度14μg/ml并在室温温育60分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4315)温育16分钟。
实施例22：抗cKIT ADC对抗小鼠中胃肠道间质肿瘤(GIST)的体内效力
在几种肿瘤异种移植物模型中评价抗cKIT ADC的抗肿瘤活性。在表达突变cKIT的GIST T1皮下肿瘤异种移植物模型中评价非小鼠cKIT交叉反应的抗人cKIT ADC NEG027-MCC-DM1的剂量依赖性抗肿瘤活性和药代动力学(PK)。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。
植入后10天小鼠入选于研究中,平均肿瘤体积为207mm3。在随机分配到五个组之一(n＝9/组)后，对小鼠施用TBS、ADC载体(5ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(2.5mg/kg)或NEG027-MCC-DM1(0.625、1.25或2.5mg/kg)单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重。对照IgG1-MCC-DM1在2.5mg/kg无明显活性。与TBS处理组相比，NEG027-MCC-DM1在0.625mg/kg时显示统计显著的效力，然而1.25mg/kg和2.5mg/kg引起甚至更大的效力，根据卡尺测量，二者均诱导相似的肿瘤体积停滞，不过组织学评定未显示肿瘤细胞的存在。脂肪组织和外周神经和横纹肌区段是切片中的主要组织组分，而非结缔组织的混合物。这支持肿瘤的组织学消退(图23-26)。
还在给药后1小时，24小时和4、7、11和21天从这项研究采集血清以分别使用抗人IgG1ELISA和抗DM ELISA，测量抗体/ADC随时间推移的浓度。为了评估PK参数，通过眶后采血法采集血清并通过ELISA分析。总抗体PK测定法测量总抗体浓度，伴以/不伴比色ELISA测量DM1。将平板用(Fc特异性)抗人IgG包被，并用抗人IgG-HRP检测，之后在适宜的平板读数仪上读数。缀合物PK测定法通过比色ELISA测量与至少一种(1)DM1分子结合的抗体。在这种形式中，将平板用抗美坦辛抗体包被，并用抗人IgG-HRP检测。PK与7天近似血清半寿期按剂量成比例(图23-24)。
由于单次0.625mg/kg剂量的NEG027-MCC-DM1仅造成GIST T1肿瘤生长延迟，因此提供一个动态范围以评估不同的ADC活性，选择这种剂量水平以评估一组密切相关的ADC的效力，所述ADC还衍生自原始鼠9P3-MCC-DM1ADC。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences，San Jose，CA)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。植入后10天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为195mm3。在随机分配到各组(n＝8/组)后，对小鼠施用TBS(8ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、NEG085-MCC-DM1(0.625mg/kg)、NEG086-MCC-DM1(0.625mg/kg)、NEG087-MCC-DM1(0.625mg/kg)、NEG024-MCC-DM1(0.625mg/kg)或NEG026-MCC-DM1(0.625mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图27-29)。对照IgG1-MCC-DM1甚至在高剂量10mg/kg时没有活性。按0.625mg/kg给药的各抗cKIT ADC统计学上并未彼此不同。NEG085-MCC-DM1和NEG024-MCC-DM1处理组具有最紧密范围内的最小肿瘤体积。
还在给药后1小时、24小时及3天、7天、10天、14天和21天从这项研究采集血清以分别使用抗人IgG1ELISA和抗DM ELISA，测量抗体/ADC随时间推移的浓度。为了评估PK参数，通过眶后采血法采集血清并通过ELISA分析。总抗体PK测定法测量总抗体浓度，伴以/不伴比色ELISA测量DM1。将平板用(Fc特异性)抗人IgG包被，并用抗人IgG-HRP检测，之后在适宜的平板读数仪上读数。缀合物PK测定法通过比色ELISA测量与至少一种(1)DM1分子结合的抗体。在这种形式中，将平板用抗美坦辛抗体包被，并用抗人IgG-HRP检测。这些ADC显示相似的血清暴露(图30)。
实施例23：抗cKIT ADC对抗小鼠中小细胞肺癌的体内效力
在NCI-H1048小细胞肺癌异体移植模型中评估一组ADC的抗肿瘤活性，所述模型具有与GIST T1肿瘤异种移植物相比显示更大异质性的中度cKIT免疫染色(图21-图30)。将NEG085-MCC-DM1与一组作为cKIT信号传导的强拮抗剂的cKIT ADC比较，所述ADC均不与小鼠cKIT结合。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。植入后15天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约120mm3。全部处理组均接受单次静脉内剂量2mg/kg。在随机分配到各组(n＝8/组)后，对小鼠施用TBS(5ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(2mg/kg)、NEG024-MCC-DM1、NEG085-MCC-DM1和NEG086-MCC-DM1的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图31、32)。对照IgG1-MCC-DM1没有活性。NEG085-MCC-DM1趋向于具有9％低ΔT/ΔC的效力，但是在这个2mg/kg剂量时统计学上与载体并无不同。NEG024-MCC-DM1和NEG026-MCC-DM1显著有效。
cKIT ADC的抗肿瘤效力还在NCI-H1048小细胞肺癌异体移植模型中评估，评估了NEG085-MCC-DM1的剂量依赖性抗肿瘤活性。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。植入后11天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约150-200mm3。在随机分配到各组(n＝8/组)后，对小鼠施用TBS(5ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、或NEG085-MCC-DM1(2.5、5和10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图33、34)。对照IgG1-MCC-DM1没有活性，2.5mg/kg剂量的NEG085-MCC-DM1也没有活性。但是，5mg/kg和10mg/kg剂量显著有效。
类似于GIST T1肿瘤异种移植物，在具有较高cKIT水平的第二小细胞肺癌异体移植模型中评估两种抗cKIT ADC的抗肿瘤活性(图21上的代表性照片和图35中的图)。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有6x106个细胞的50％MatrigelTM(BDBiosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。植入后6天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约150mm3。在随机分配到各组(n＝9/组)后，对小鼠施用TBS(8ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、NEG024-MCC-DM1(2.5，5和10mg/kg)和小鼠交叉反应性ADC20376-MCC-DM1(10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图35和图36)。对照IgG1-MCC-DM1没有活性。20376-MCC-DM1在10mg/kg时起初使肿瘤消退，然而在初始消退后，观察到肿瘤复发。采用三种剂量的NEG024-MCC-DM1时观察到明显的剂量依赖性效力，在10mg/kg出现持久长期消退，60天后肿瘤开始再生长，这提示20376-MCC-DM1可能在这项研究中需要不止施用单次剂量。10mg/kg剂量的20376-MCC-DM1和NEG024-MCC-DM1的血清暴露量大约相等。
实施例24：抗cKIT ADC对抗小鼠中急性髓细胞白血病的体内效力
在表达突变cKIT的急性髓细胞白血病Kasumi-1皮下肿瘤异种移植物模型中评价抗cKIT ADC鼠9P3-MCC-DM1和9P3-SPDB-DM4的剂量依赖性抗肿瘤活性。对雌性SCID-beige小鼠在右侧腹部随MatrigelTM(BD Biosciences)一起皮下移植2-3小片1mm3碎片化的Kasumi-1肿瘤组织。植入后21天具有Kasumi-1的肿瘤小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为150mm3。在随机分配到8个组之一(n＝8/组)后，对小鼠施用PBS(200μl)、非特异性同种型对照IgG1-SPDB-DM4(10mg/kg)、9P3-MCC-DM1(10mg/kg)和9P3-SPDB-DM4(1或5mg/kg)的单次静脉内剂量。每周3次测量肿瘤体积和体重(图37)。对照IgG1-SPDB-DM4在10mg/kg无明显活性。随5mg/kg和10mg/kg剂量的9P3-SPDB-DM4观察到肿瘤生长消退。
表10.Kasumi-1效力
实施例25：抗cKIT ADC对抗小鼠中肥大细胞增多症的体内效力
在表达突变cKIT的HMC-1.2皮下肿瘤异种移植物模型中评价抗cKIT ADC鼠9P3-MCC-DM1和9P3-SPDB-DM4的抗肿瘤活性。HMC-1.2细胞系由Joseph Butterfield博士(MayoClinic,Rochester,MN)友好提供。对雌性Foxn-1裸鼠皮下植入无FBS的DMEM培养基中含有3x106个、5x106个和10x106个细胞的50％Matrigel(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是100μl。
植入后33天携带HMC-1.2肿瘤的小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为100mm3。在随机分配到三个组之一(n＝4/组)后，对小鼠施用PBS(200μl)、9P3-MCC-DM1(10mg/kg)或9P3-SPDB-DM4(10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周3次测量肿瘤体积和体重(图38)。在10mg/kg的9P3-SPDB-DM4和9P3-MCC-DM1时观察到肿瘤消退。
表11.HMC-1研究
实施例26：小鼠交叉反应性cKITADC20376-MCC-DM1的体内效力
在表达突变cKIT的GIST T1皮下肿瘤异种移植物模型中评价小鼠cKIT交叉反应性抗人cKIT ADC 20376-MCC-DM1的剂量依赖性抗肿瘤活性和药代动力学(PK)。植入后10天雌性SCID-beige小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约200mm3。在随机分配到五个组之一(n＝9/组)后，对小鼠施用TBS(5ml/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、NEG085-MCC-DM1(0.625mg/kg)或20376-MCC-DM1(0.625、2.5、5或10mg/kg)单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图39-41)。对照IgG1-MCC-DM1在10mg/kg无明显活性。203786-MCC-DM1也无效，而NEG085-MCC-DM1在0.625mg/kg时显示低有效性，不过统计学上还不显著。20376-MCC-DM1在2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg时均显著有效。
还在给药后1小时，24小时和4、7、11和21天从这项研究采集血清以分别使用抗人IgG1ELISA和抗DM ELISA，测量抗体/ADC随时间推移的浓度。为了评估PK参数，通过眶后采血法采集血清并通过ELISA分析。总抗体PK测定法测量总抗体浓度，伴以/不伴比色ELISA测量DM1。将平板用(Fc特异性)抗人IgG包被，并用抗人IgG-HRP检测，之后在适宜的平板读数仪上读数。缀合物PK测定法通过比色ELISA测量与至少一种DM1分子结合的抗体。在这种形式，将平板用抗美坦辛抗体包被，并用抗人IgG-HRP检测。采用小鼠cKIT交叉反应性ADC20376-MCC-DM1，PK不是成剂量比率的，原因在于正常组织中结合ADC的小鼠cKIT影响暴露(组织介导的药物分布)，并且因此在20376-MCC-DM1和无小鼠cKIT交叉反应性ADCNEG085-MCC-DM1之间存在血清浓度的清晰的差异(图40)。这解释了这两种ADC之间在低剂量0.625mg/kg时效力的差异。在更高的剂量，组织介导的药物分布效应较不明显，并且在小鼠中GIST T1肿瘤异种移植物模型中效力变得明显。
实施例28：具有SPDB-DM4接头/有效负载的cKIT ADC对抗胃肠道间质肿瘤的体内效力
在表达突变cKIT的GIST T1皮下肿瘤异种移植物模型中比较具有MCC-DM1(不可切割)和SPDB-DM4(可切割)接头/有效负载的鼠9P3ADC(从中衍生NEG024和NEG085)的剂量依赖性抗肿瘤活性。植入后18天雌性SCID-beige小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约170mm3。在随机分配到各组(n＝8/组)后，对小鼠施用TBS(5ml/kg)、未缀合的鼠9P3抗体(10mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(5mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(5mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-SPDB-DM4(10mg/kg)、9P3-MCC-DM1(5mg/kg和10mg/kg或9P3-SPDB-DM4(2.5mg/kg和5mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图42、43)。对照非特异性IgG1ADC和未缀合的9P3均无效。全部9P3ADC在测试的剂量水平均有效；然而，来自2.5mg/kg9P3-SPDB-DM4处理组的肿瘤比其他组显得略微效力较低。
在表达突变cKIT的胃肠道间质肿瘤的第二肿瘤异种移植物模型GIST 430中比较具有MCC-DM1(不可切割)和SPDB-DM4(可切割)接头/有效负载的鼠9P3ADC(从中衍生NEG024和NEG085)的剂量依赖性抗肿瘤活性。植入后11天雌性SCID-beige小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约200mm3。在随机分配到各组(n＝9/组)后，对小鼠施用TBS(5ml/kg)、未缀合的鼠9P3抗体(10mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(5mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、非特异性同种型对照IgG1-SPDB-DM4(5mg/kg)、9P3-MCC-DM1(10mg/kg)或9P3-SPDB-DM4(5mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图44、45)。对照非特异性IgG1ADC均无效。然而，两种9P3ADC在测试的剂量水平具有相似的效力。
实施例29：制剂
ADC的临床使用形式(CSF)是小瓶中含有50mg抗cKIT-MCC-DM1、16.2mg琥珀酸钠，410.8mg蔗糖和1mg聚山梨醇酯20的冷冻干燥物(不考虑过量10％以允许抽出宣称的含量)。在冷冻干燥物以5mL注射用水复水后，获得pH5.0含有10mg/mL抗cKIT-MCC-DM1、20mM琥珀酸钠，240mM蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20的溶液。
为了后续静脉内施用，将获得的溶液通常进一步稀释于载体溶液中成为用于输注的即用型ADC溶液。
对于CSF，基于初步稳定性检验，选择10mg/mL的ADC浓度。选择240mM的蔗糖浓度以产生等渗制剂，以维持非晶态冷冻干燥物滤饼结构并且以提供蛋白质稳定作用。
选择最稳定制剂的显示稳定性的重要分析方法涵盖确定聚集水平的大小排阻层析、亚可见颗粒物检验、游离毒素测定和效力检验等。
筛选前研究显示浓度0.02％的聚山梨醇酯20提供对抗机械应力的足够稳定作用。在实时和加速稳定性条件(25℃和40℃)下的液体和冻干稳定性研究显示琥珀酸pH 5.0制剂提供总体最好的贮存稳定性。这种制剂中最值得注意地，可以达到全部所测试制剂在聚集和游离毒素释放之间的最佳平衡。在40℃三个月后，不能测定出降解产物明显增加。
实施例30：借助cKIT ADC调节体内靶上药效动力学标志物
实施研究以评估cKIT ADC NEG085-MCC-DM1在体内调节药效动力学标志物的能力，包括在表达突变cKIT的GIST T1肿瘤异种移植物中检验NEG085抗体与有丝分裂抑制的药效动力学(PD)事件的共定位。这些研究的目的是评价G2/M细胞周期抑制的程度和持续时间。
使用磷酸-组蛋白H3(pHH3)阳性胞核的堆积(如通过免疫组织化学所评估)作为G2/M抑制的标志物。通过用从Cell Signaling Technology(Danvers，MA，目录号9701)获得的合成性磷酸肽免疫动物，产生兔多克隆抗体，所述的合成性磷酸肽与围绕人组蛋白H3(pHH3)的Ser10的残基相对应。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂(Ventana，Tucson，AZ)。将第一抗体稀释至1:50并在室温温育60分钟。随后，与Jackson ImmunoResearch Laboratories山羊抗兔生物素化第二抗体(目录号111-065-144，West Grove，PA)温育32分钟。
为了评估GIST T1皮下肿瘤异种移植物模型中抗cKIT ADC诱导的PD标志物变化，对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％MatrigelTM(BD Biosciences)的悬液中的10x106个细胞。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到200mm3至300mm3(n＝3/组)，将小鼠随机分配以接受NEG085-MCC-DM1(5mg/kg)、非特异性IgG1-MCC-DM1同种型对照(5mg/kg)或TRIS缓冲液(10mM Tris-HCl，80mM NaCl，3.5％蔗糖，0.01％Tween 20pH 7.5)的单次静脉内剂量。
与类美登素有效负载的预计作用机理一致，就pHH3阳性而言，NEG085-MCC-DM1导致细胞阳性百分数的明显时间依赖性增加，并且因此细胞周期抑制。相对于非特异性同种型IgG1-MCC-DM1或Tris-缓冲液处理的对照，pHH3阳性在给药后1-2天达到峰值，处理4天后信号下降(图46中显示的代表性图像，和图47中显示的曲线)。
实施例31：抗cKIT ADC对抗小鼠中胃肠道间质肿瘤(GIST)的体内效力
在两个GIST肿瘤异种移植物模型中评价抗cKIT ADC NEG085-MCC-DM1的抗肿瘤活性。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。
显示GIST T1肿瘤和GIST 430肿瘤上cKIT免疫染色的代表性照片以显现这些异体移植模型中的染色样式(分别是图48A和图49A)。从Dako(目录号A4502)获得了通过用合成肽免疫动物所产生的兔多克隆抗体，其中所述合成肽与cKIT胞质C端部分处的氨基酸963至976相对应。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂(Ventana，Tucson，AZ)。将第一抗体稀释至工作浓度14μg/ml并在室温温育60分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4315)温育16分钟。
对于GIST T1效力研究，植入后18天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约118mm3–234mm3。在随机分配到五个组之一(n＝9/组)后，对小鼠施用TRIS缓冲液(ADC载体)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(5mg/kg)、或NEG085-MCC-DM1(1.25mg/kg、2.5mg/kg或5mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图48B和图48C)。对照IgG1-MCC-DM1在5mg/kg明显无活性。用NEG085-MCC-DM1以1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg处理的小鼠具有与tris-缓冲液处理的对照相比，分别显示63％、11％和12％的平均肿瘤体积变化％(ΔT/ΔC)的肿瘤，并且表12中显示该数据的总结。NEG085-MCC-DM1处理在全部剂量水平均良好耐受。
表12：
第38日GIST T1异种移植物小鼠模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应
对于GIST 430效力研究，植入后12天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约125mm3–200mm3。在随机分配到各组(n＝8/组)后，对小鼠施用TRIS缓冲液(ADC载体)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(10mg/kg)、未缀合的NEG085抗体或NEG085-MCC-DM1(2.5mg/kg、5mg/kg或10mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图49B和图49C)。对照IgG1-MCC-DM1和未缀合的NEG085在10mg/kg时无活性。用NEG085-MCC-DM1以2.5mg/kg和5mg/kg处理的小鼠不显著活跃(ΔT/ΔC分别是78％和56％)，对比物伊马替尼也是如此(ΔT/ΔC是47％)，所述伊马替尼在SCID-beige小鼠中起初以100mg/kg给药，因在100mg/kg剂量水平耐受不良而降低剂量至80mg/kg。10mg/kg显著有效(ΔT/ΔC是19％)，如在图49B中图示并于表13中汇总。NEG085-MCC-DM1处理在全部剂量水平均良好耐受。
表13
第28日GIST430异种移植物小鼠模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应
实施例32：抗cKIT ADC对抗小鼠中小细胞肺癌的体内效力
在NCI-H526小细胞肺癌异体移植模型中评价抗cKIT ADC NEG085-MCC-DM1的抗肿瘤活性。对雌性SCID-beige小鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有10x106个细胞的50％MatrigelTM(BD Biosciences)。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。
显示NCI-H526肿瘤上cKIT免疫染色的代表性照片以显现这种异体移植模型中的染色样式(图50A)。从Dako(目录号A4502)获得了通过用合成肽免疫动物所产生的兔多克隆抗体，其中所述合成肽与cKIT胞质C端部分处的氨基酸963至976相对应。简而言之，IHC方案包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂(Ventana，Tucson，AZ)。将第一抗体稀释至工作浓度14μg/ml并在室温温育60分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4315)温育16分钟。
植入后6天小鼠入选于研究中，平均肿瘤体积为约180mm3。在随机分配到各组(n＝9/组)后，对小鼠施用TRIS缓冲液(ADC载体)、非特异性同种型对照IgG1-MCC-DM1(5mg/kg)、或NEG085-MCC-DM1(1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)的单次静脉内剂量。每周二次测量肿瘤体积和体重(图50B和图50C)。对照IgG1-MCC-DM1没有活性。在1.25mg/kg的NEG085-MCC-DM1起初引起肿瘤体积停滞，随后肿瘤再生长。2.5mg/kg和5mg/kg处理显著有效，引起肿瘤消退(分别是74％和96％消退)并且这在图50B中显示并汇总于表14中。这些剂量的处理显示单次处理大约3周后肿瘤再生长。全部NEG085-MCC-DM1处理均良好耐受。
表14
第19日NCI-H526异种移植物小鼠模型中的NEG085-MCC-DM1剂量反应
还在给药后1小时、24小时及5天、7天、9天、14天、21天和28从这项研究采集血清以分别使用抗人IgG1ELISA和抗DM ELISA，测量抗体/ADC随时间推移的浓度。为了评估PK参数，通过眶后采血法采集血清并通过ELISA分析。总抗体PK测定法测量总抗体浓度，伴以/不伴以比色ELISA测量DM1。将平板用(Fc特异性)抗人IgG包被，并用抗人IgG-HRP检测，之后在适宜的平板读数仪上读数。缀合物PK测定法通过比色ELISA测量与至少一种(1)DM1分子结合的抗体。在这种形式中，将平板用抗美坦辛抗体包被，并用抗人IgG-HRP检测。这项研究中采用NEG085-MCC-DM1时的剂量依赖性效力与如通过抗总抗体ELISA和抗美坦辛ELISA所测量的总抗体和ADC的剂量依赖性血清暴露量相关(分别是图51A和图51B)。
实施例33：抗cKIT ADC对抗小鼠中急性髓细胞白血病的体内效力
在诺华建立的HAMLX5343全身性原发性AML(急性髓细胞白血病)异种移植模型中评价抗cKIT ADC NEG085-MCC-DM1的抗肿瘤活性。对雌性NSG小鼠全身性(通过尾静脉注射)植入磷酸缓冲盐水中的5x106个细胞。含有悬液中细胞的总注射体积是200μl。
植入后43天小鼠入选于研究中，平均白血病负荷为大约14.8％CD45阳性外周血单核细胞(PBMC)。在随机分配到各组(n＝6/组)后，将小鼠留下不作处理或对其腹膜内每日一次施用ARA-C(阿糖胞苷)持续6天或静脉内每两周一次施用NEG085-MCC-DM1(10mg/kg)。通过流式细胞术测量白血病负荷。每周一次，从全部研究动物经尾采集血液。将红细胞溶解并将剩余的PMBC用抗hCD45抗体(eBioscience，圣迭戈CA，目录号P/N17-9459-42)染色。在FACS Canto流式细胞仪(BD Biosciences)上分析染色细胞(图52A)。每周二次测量体重(图52B)。在三只动物中有效的同时，ARA-C具有高度毒性，在其他三只动物中造成>20％体重丢失。10mg/kg NEG085-MCC-DM1处理导致肿瘤进展延迟，包括在第二剂量之后短暂消退(图52A)。与未处理的对照相比，NEG085-MCC-DM1处理显著有效，如图52中及表15中所示。NEG085-MCC-DM1的处理良好耐受(图52B)。
表15
第71日全身性原发性AML异种移植模型HAMLX5343中的NEG085-MCC-DM1
实施例34.联合疗法中的NEG085-MCC-DM1
使用不同剂量-矩阵，测试与小分子抑制剂组合的NEG085-MCC-DM1。对每种剂量组合计算细胞生存力的相对抑制。使用Chalice软件(Zalicus，Cambridge，MA)或ComboExplorer应用程序(诺华，巴赛尔CH)，针对广泛使用的药物-联合-自身剂量-加合作用Loewe模型(Lehar等人,Nat.Biotechnol.(2009)27:659–666；Zimmermann等人,DrugDiscov.Today(2007)12:34–42)，将联用反应与其单一药物比较。可以将与加合作用相比的过度抑制作用作为全剂量-矩阵图作图，以显现协同作用出现情况下的药物浓度。协同性组合在剂量-矩阵内部产生过度抑制作用区域。表16显示几种NEG085-MCC-DM1/组合的数据。当与采用单一药物本身的反应相比，联用产生相同的细胞生存力抑制作用时，“加合作用”出现。当细胞生存力抑制作用大于单一药物与自身相比的反应时，显示“协同作用”。备选地，“加合作用”以小于5的Loewe评分指示，并且“协同作用”以大于5的Loewe评分指示。
通过使用CellTiter Glo发光测定法(Promega，Madison WI)测量细胞的ATP含量，测定细胞生存力。在添加药物之前一日，将来自2个不同细胞系的250-500个GIST细胞铺种至384孔板(Greiner，Monroe，NC)中的20μl生长培养基内。GIST 430细胞在cKIT中含有使这些细胞部分抵抗(伊马替尼)的双突变。GIST882细胞在cKIT中具有单突变并对(伊马替尼)敏感。随后将细胞与多种浓度的作为单一药物的NEG085-MCC-DM1、单一药物化合物或NEG085-MCC-DM1/化合物组合温育120小时，之后将CellTiter Glo试剂添加至每个孔并在Envision平板读数仪(Perkin Elmer，Waltham MA)上记录发光。相对于DMSO处理的细胞(0％抑制)，将发光值用来计算细胞生存力的抑制作用。
表16
总之，与其他分子组合时，本文中公开的抗cKIT抗体具有协同效应，这导致更多治疗选择。例如，NEG085-MCC-DM1可以与IAP抑制物(例如NVP-LCL161)作为一种治疗药共施用以获得协同效应。
实施例35.NEG085的表位定位
原位有限蛋白酶解
产生具有残基Q26-G311(N130S，N145S－这些变化导致糖基化缺乏，旨在表达无聚糖形式的蛋白质)的人cKIT(登录代码NM_000222结构域1(D1)-结构域3(D3)胞外结构域(ECD)蛋白。将等摩尔比的人cKIT D1-D3ECD和NEG085Fab混合并且经历最终凝胶过滤步骤，用20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl平衡并浓缩至20mg/ml。将胰蛋白酶添加至蛋白质复合物结晶样品以产生1:100w/w稀释物。在结晶实验建立前，将蛋白酶/样品混合物在室温温育30分钟。
结晶
在4℃从蛋白质复合物套装F5(0.1M NaCl，0.1M Tris pH 8.0，8％PEG 20k；Qiagen)直接获得cKIT ECD/NEG085Fab复合物的衍射用晶体，并且在微小优化后，产生衍射至的自有晶体。通过用座滴蒸气扩散法平衡等体积的蛋白质溶液(20mg/mL)和储器溶液(0.1M NaCl，0.1M Tris pH 8.0，10％PEG 20k)，在4℃生长用于数据采集的晶体。在数据采集之前，将晶体在含有30％甘油的储器溶液中冷冻保护并在液氮中快速冷却。
数据采集
使用ADSC QUANTUM 315检测器(ADSC，Poway CA)和同步辐射在高级光源的光束线5.0.2处对冷却至100K的单晶采集数据。cKIT ECD/NEG085Fab的晶体衍射至分辨率并属于空间群C2，晶胞参数为α＝90°，β＝118.47°，γ＝90°。该晶体以不对称单位含有cKIT ECD/NEG085Fab复合物的四个副本，计算的溶剂含量为66％。使用autoPROC(Global Phasing Ltd,Cambridge UK)处理数据。
结构测定和修正
使用cKIT ECD的已公开晶体结构(PDB ID代码：2EC8)(Yuzawa等人,Cell 2007；130(2):323-34)和抗α1β1整联蛋白I Fab的已公开晶体结构(PDB ID代码:1MHP)(Karpusas等人,J.Mol.Biol.2003；327(5):1031-41)作为起始模型，通过采用PHASER(McCoy等人,J.Appl.Crystallogr.2007；40(4):658-74)的分子置换法，以分辨率解析cKIT ECD/NEG085Fab复合物的结构。使用在Phenix执行的模拟退火复合缺失图(simulatedannealing composite omit map)(Adams等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.2010；66(2):213-21)，以COOT(Emsley和Cowtan,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.2004；60(12):2126-32)手工重建NEG085Fab片段的CDR环。实施后续轮次模型建立和Phenix.refine程序修正直至汇聚。
结果：与NEG085的Fab片段复合的人cKIT D1-D2的结构
cKIT D1-D3/NEG085Fab共同结构表明，通过与结构域1、2内部所含的众多残基和这两个结构域之间的接头残基特异性相互作用，NEG085识别cKIT的胞外膜远端结构域并与之结合。由NEG085识别的cKIT表位可以因此定义为：
cKIT结构域1残基：R49、V50
cKIT结构域2残基：Q152、G153、H185和环Q190-E198
在结构域1和2之间的接头：D113-L117
使用全部CDR(H1-H3和L1-L3)，NEG085结合cKIT D1-D2(图53)。图53是Kit D1-D2/NEG085Fab复合物的晶体结构的示意图，所述示意图显示Fab重链结构域(深灰色)、Fab轻链结构域(白色)和Kit D1-D2结构域(浅灰色)。表位和互补位为黑色。NEG085/cKIT界面包埋总计大约溶剂可及表面积(分别来自来自H链和L链的和)。该表位以cKIT D1-D2接头区域D113-L117(SEQ ID NO.163)和环Q190-E198(SEQ IDNO.164)为中心。表2中将这些残基加粗并加下划线SEQ ID NO.155。应当指出这些表位在一级序列是不连续的，但是在晶体结构中非常接近。这些表位相互作用由与R49、V50、Q152、G153和H185的周围相互作用补充(图53)。使用PISA(蛋白质界面、表面和组件)检查cKITD1-D2和NEG085Fab之间的分子间相互作用(Krissinel和Henrick,J.Mol.Biol.2007,372(3):774-97)。表17中显示该项数据。
cKIT在二聚体cKIT/SCF信号传导复合体(Yuzawa等人,Cell 2007；130(2)；323-34)和cKIT/NEG085复合物中的叠加显示NEG085和SCF似乎彼此不竞争与cKIT的结合。NEG085结合至与负责SCF结合的结合表位不同的表位。因此，NEG085与cKIT的结合将不直接竞争与SCF的缔合。
表17
NEG085Fab VH残基和VL残基基于其线性氨基酸序列编号。cKIT残基基于登录代码NM_000222编号。使用PISA(蛋白质界面、表面和组件)检查分子间相互作用(Krissinel和Henrick,J.Mol.Biol.2007,372(3):774-97)。
可以理解本文中所述的实施例和方面旨在起到说明目的，并且在其影响下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且将纳入本申请的精神与权限内和所附权利要求书的范围内。

Claims (28)

1.下式的抗体药物缀合物
Ab-(L-(D)m)n
或其可药用盐；其中
Ab是与人cKIT在如SEQ ID NO.155所示的结构域1-3处的表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:76的HCDR1、(b)SEQ ID NO:77的HCDR2、(c)SEQ ID NO:78的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:85的LCDR1、(e)SEQ ID NO:86的LCDR2和(f)SEQID NO:87的LCDR3；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1至10的整数，
其中所述抗原结合片段选自scFv、Fab、F(ab')和F(ab)2。
2.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述n是3或4。
3.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQ IDNO.161和SEQ ID NO.162处特异性结合人cKIT。
4.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体。
6.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人源化抗体。
7.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人工程化抗体。
8.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述接头(L)选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。
10.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其中所述接头衍生自选自以下的交联试剂：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧杂吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
11.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其中所述接头衍生自交联试剂N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分(D)选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
13.根据权利要求12所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分是类美登素。
14.根据权利要求13所述的抗体药物缀合物，其中所述类美登素是N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM4)。
15.下式的抗体药物缀合物
或其可药用盐；其中：
Ab是与人cKIT在如SEQ ID NO.155所示的结构域1-3处的表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段，并且至少n个数目的伯胺；并且n是从1至10的整数，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链可变区，所述重链可变区包含(a)SEQ ID NO:76的HCDR1、(b)SEQ IDNO:77的HCDR2、(c)SEQ ID NO:78的HCDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:85的LCDR1、(e)SEQ ID NO:86的LCDR2和(f)SEQ ID NO:87的LCDR3，其中所述抗原结合片段选自scFv、Fab、F(ab')和F(ab)2。
16.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在SEQID NO.161和SEQ ID NO.162处特异性结合人cKIT。
17.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
18.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体。
19.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人源化抗体。
20.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人工程化抗体。
21.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人抗体。
22.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述n是从2至8的整数。
23.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述n是从3至4的整数。
24.一种组合物，其由根据权利要求15所述的抗体药物缀合物与另一种治疗剂组成。
25.一种组合物，其由根据权利要求15所述的抗体药物缀合物与一种选自伊马替尼、舒尼替尼、 依维莫司、
的治疗剂组成。
26.药物组合物，其包含根据权利要求15所述的抗体药物缀合物和可药用载体。
27.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体药物缀合物或根据权利要求26所述的药物组合物在制备治疗需要其的患者中cKIT阳性癌的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述癌选自胃肠道间质肿瘤(GIST)、小细胞肺癌(SCLC)、急性髓样白血病(AML)、黑素瘤、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞增多症、神经纤维瘤病、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。
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