JP6058650B2 - 廃棄流中のモノマー含有量を増大させるためのヒドロラーゼの使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年6月17日に提出された仮出願第61/498404号および2011年11月11日に提出された仮出願第61/558718号の優先権を主張するものであって、その内容は参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる。
本発明は、産業用シクロアルカン酸化の廃棄流のモノマー成分を富化するための、それらの二酸およびアジピン酸濃度を富化するための、ならびに/またはそれらからα,ω-二官能性アルカンを産生するための方法に関する。
ナイロンは、ジアミンとジカルボン酸、ωアミノ酸、またはラクタムとの縮重合によって一般的に合成されるポリアミドである。よく見られるナイロンの変種は、ヘキサメチレンジアミンとヘキサン-1,6-二酸(アジピン酸)の反応によって形成されるナイロン6,6である。代替的には、ナイロン6が、カプロラクタムの開環重合によって合成され得る。ゆえに、ヘキサン-1,6-二酸(アジピン酸)、アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン(hexamethyldiamine)、およびカプロラクタムはすべて、ナイロンの産生における重要な中間体である(Anton, A. and Baird, B. R. 2005. Polyamides, Fibers. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology(非特許文献1))。
本発明は、酵素、天然微生物、および非天然微生物の使用を通して、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善する必要性に対処する。とくに本発明者らは、驚くべきことに、酵素および微生物を用いて、商業用シクロアルカン酸化(例えば、シクロヘキサン酸化)からのこれらの混合有機性廃棄流(例えば、NVR、COP酸、および洗浄水廃棄流)中に存在している化学物質の複雑な毒性混合物の成分を変換してモノマーに富む流を産生でき、次にこれを、混合物中の成分の生物毒性(biotoxicity)にもかかわらず、ポリオール、二酸、ナイロン中間体もしくはナイロン中間体に変換され得る前駆体、またはポリウレタン中間体等の有用な化合物に変換できることを、見出した。これによって、商業用シクロアルカン酸化プロセスからの副生成物の回収および/または再利用が可能となり、ゆえにより経済的かつ持続可能なプロセスを提供する。
[本発明1001]
(a)シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流と生体触媒とを組み合わせる工程;ならびに
(b)該廃棄流のダイマー成分および/またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程
を含む、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流中のモノマー含有量を富化するための方法。
[本発明1002]
前記生体触媒を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該生体触媒が、少なくとも1種のヒドロラーゼ酵素、天然宿主細胞、または非天然宿主細胞を含む、工程;
該廃棄流中のオリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程;および
該混合有機性廃棄流中のモノマー成分の量を増大させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
天然のまたは非天然の宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に:
a.該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解するか;
b.該混合有機性廃棄流中のラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解するか;または
c.該混合有機酸廃棄流中に存在している直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化する
、工程;ならびに
該流中の二酸の相対量を増大させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
非天然宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に:
a.該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する;
b.該混合有機性廃棄流中のε-カプロラクトンの少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に加水分解する;
c.該混合有機性廃棄流中のカプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および6-オキソカプロン酸の少なくとも一部をアジピン酸に酸化する;
d.該混合有機性廃棄流中の環状C6成分の少なくとも一部をアジピン酸に変換する;
e.該混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する;または
f.該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する
、工程;ならびに
該廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を増大させ、かつ該流中の一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
非天然宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に:
i.該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する;
ii.該混合有機性廃棄流中のカプロン酸の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に酸化する;
iii.該混合有機性廃棄流中の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸もしくは6-オキソカプロン酸に変換する;
iv.該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する;または
v.該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化し;かつ、アジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、もしくは6-オキソヘキサン酸を1,6-ヘキサンジオール、6-アミノカプロン酸、ε-カプロラクタム、もしくはヘキサメチレンジアミンに変換する少なくとも1種の生合成経路酵素を発現する
、工程;ならびに
該流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記混合有機性廃棄流が、NVR、洗浄水、COP酸、苛性洗浄液流、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
単離されたもしくは固定化されたヒドロラーゼ、または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌される内在性もしくは異種性ヒドロラーゼによる、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解をさらに含む、本発明1002〜1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
ヒドロラーゼ(EC 3.1.1.-)が、リパーゼ(EC 3.1.1.3)、エステラーゼ(EC 3.1.1.1)、クチナーゼ(EC 3.1.1.74)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)デポリメラーゼ(EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76)、ラクトンヒドロラーゼ;グルコノラクトナーゼ(EC 3.1.1.17)、ラッカーゼ(EC 1.10.3.2)、またはそれらの組み合わせである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ラクトンヒドロラーゼが1,4-ラクトナーゼ(EC 3.1.1.25)である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
酸性pH、生理的pH、またはアルカリ性pHで活性を有するヒドロラーゼによる、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を触媒する工程をさらに含む、本発明1002〜1005のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記ヒドロラーゼを用いた処理によって前記混合有機性廃棄流の粘性を低下させて、該流を燃焼させる効率を改善し、かつ/またはさらなる化学的もしくは生物学的処理のために該流を調製する、本発明1002の方法。
[本発明1012]
前記処理された混合有機性廃棄流を燃料価値のためにまたは合成ガスを産生するために燃焼させる工程をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
混合エステルもしくはポリオールを産生するためのエステル化、ジオールへの水素化、二酸への酸化、還元的アミノ化、スルホン化、またはNH 4 OHもしくはポリアミンを用いた処理のために、前記処理された混合有機性廃棄流の1種もしくは複数種の成分を使用する工程をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
さらなる分離、化学的変換、または生体触媒による酵素的変換と同時に、オリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程を含む、本発明1002の方法。
[本発明1015]
オキソ酸を介してC4-C6またはC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸を二酸に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性のω酸化経路を有する、本発明1003〜1005のいずれかの方法:
a.酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸のコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸への変換;
b.酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸の4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸への変換;
c.4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸への変換;または
d.4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸のコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸への変換。
[本発明1016]
内在性または異種性のω酸化経路を有する天然のまたは非天然の宿主細胞が、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し、かつ該天然のまたは非天然の宿主細胞が、n-アルカンを利用する酵母または細菌である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記n-アルカンを利用する酵母が、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、C.アルビカンス(C. albicans)、C.クロアカエ(C. cloacae)、C.ギリエルモンジイ(C. guillermondii)、C.インターメディア(C. intermedia)、C.マルトサ(C. maltosa)、C.パラプシローシス(C. parapsilosis)、C.ゼイラノイデス(C. zeylenoides)、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ(Rhodotorula)属、リゾプス(Rhizopus)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、およびリポマイセス(Lipomyces)属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり;かつ前記n-アルカンを利用する細菌が、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、P.プチダ(P. putida)、P.エルギノーサ(P. aeroginosa)、P.オレオボランス(P. oleoverans)、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、アシネトバクター・ベネチアヌス(Acinetobacter venetianus)、オレイフィラス・メシネンシス(Oleiphilus messinensis)、アルスロバクター・ビスコサス(Arthrobacter viscosus)、カプリアビダス・メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、スフィンゴモナス・パウシモビリス(Sphingomona spaucimobilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)、アルカニボラクス・ディエソレイ(Alcanivorax diesolei)、またはそれらの組み合わせである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する、前記天然のまたは非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性の経路を有する、本発明1004または1005の方法:
I.シクロヘキサノールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換:
a.シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換;
b.シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換;
c.ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換;もしくは
d.6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換;
II.1,2-シクロヘキサンジオールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換:
a.シクロヘキサン-1,2-ジオールのシクロヘキサン-1,2-ジオンへの変換;もしくは
b.シクロヘキサン-1,2-ジオンの6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換;および
III.6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換。
[本発明1019]
前記天然のまたは非天然の宿主細胞がNVRに対して耐性を有する、本発明1002〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記宿主細胞が混合有機性廃棄流の少なくとも1容量%に対して耐性を有する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記混合有機性廃棄流に対する前記宿主細胞の前記耐性を、該流中の阻害性化合物の量を低下させることによって改善する工程を含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記阻害性化合物がラクトンを含み、前記方法が、前記天然のまたは非天然の宿主細胞を用いた前記混合有機性廃棄流の処理の前または最中の、ラクトンを対応するヒドロキシル酸に加水分解する1種または複数種の生体触媒を用いた該流の処理によって、該混合有機性廃棄流中のラクトンの量を低下させる工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記生体触媒が、前記宿主細胞によって発現されかつ発酵の間に分泌される酵素である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記廃棄流からより高収率のC6成分を提供するために、前記宿主細胞によるC6化合物の異化の割合を減少させる工程を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1025]
前記宿主細胞によるβ酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸のアセチル-CoAへの分解を低下させる工程を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸を用いてCoAエステルを生成する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる、本発明1025の方法。
[本発明1027]
CoAエステルを酸化する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる工程を含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
CoAエステルが、CoAリガーゼ、トランスフェラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼ、またはアシル-CoAデヒドロゲナーゼを含む、本発明1026または1027の方法。
[本発明1029]
C4、C5、またはC6二酸への分離の前に二酸混合物をエステル化する工程を含む、本発明1003の方法。
[本発明1030]
混合物からアジピン酸を結晶化させる工程を含む、本発明1003〜1005のいずれかの方法。
[本発明1031]
オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、およびアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、1,6-ヘキサンジオールも産生する、本発明1005の方法。
[本発明1032]
1,6-ヘキサンジオールを産生する前記宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸も産生する、本発明1005の方法。
[本発明1034]
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換するアミノトランスフェラーゼを発現する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸をε-カプロラクタムに変換するアミドヒドロラーゼも発現する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換する1-アミノトランスフェラーゼによって、ヘキサメチレンジアミンを産生する、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素を含み、かつ該酵素が、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;クラスEC 1.1.1由来のアルコールデヒドロゲナーゼ;バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ;カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;アルコールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;またはα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ(EC 3.1.1.-)である、本発明1001〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素であり、かつ該酵素が、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ/ChnA;クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ/ChnB;クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ/ChnC;クラスEC 1.1.1.2由来のChnD;EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;EC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11由来のシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;リパーゼ(EC 3.1.1.3);エステラーゼ(EC 3.1.1.1);クチナーゼ(EC 3.1.1.74);ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)デポリメラーゼ(EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76);1,4-ラクトナーゼ(EC 3.1.1.25);グルコノラクトナーゼ(EC 3.1.1.17);ラッカーゼ(EC 1.10.3.2);またはそれらの組み合わせである、本発明1001〜1036のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記混合有機性廃棄流中の炭素供給源を利用する宿主細胞生体触媒を用いて、該廃棄流をpH5.0〜8.0で処理する工程を含む、本発明1003〜1005のいずれかの方法。
[本発明1040]
シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流と生体触媒とを含む、組成物。
[本発明1041]
前記混合有機性廃棄流が、NVR、洗浄水、COP酸、苛性洗浄液流、またはそれらの組み合わせである、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
前記生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素である、本発明1039または1040の組成物。
[本発明1043]
前記宿主細胞がNVRに対して耐性を有する、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
前記宿主細胞が前記混合有機性廃棄流の少なくとも1容量%に対して耐性を有する、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
前記天然のまたは非天然の宿主細胞が、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換する内在性または異種性のω酸化経路を含み、かつ該天然のまたは非天然の宿主細胞が、n-アルカンを利用する酵母または細菌である、本発明1042〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
前記n-アルカンを利用する酵母が、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、デバリオマイセス属、およびリポマイセス属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり;かつ前記n-アルカンを利用する細菌が、シュードモナス・フルオレッセンス、P.プチダ、P.エルギノーサ、P.オレオボランス、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス、アシネトバクター・ベネチアヌス、オレイフィラス・メシネンシス、アルスロバクター・ビスコサス、カプリアビダス・メタリデュランス、ロドコッカス・エリスロポリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、バークホルデリア・セパシア、デルフチア・アシドボランス、アルカニボラクス・ディエソレイ、またはそれらの組み合わせである、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
前記酵素がヒドロラーゼである、本発明1042の組成物。
[本発明1048]
前記ヒドロラーゼが、リパーゼ(EC 3.1.1.3)、エステラーゼ(EC 3.1.1.1)、クチナーゼ(EC 3.1.1.74)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)デポリメラーゼ(EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76)、ラクトンヒドロラーゼ;グルコノラクトナーゼ(EC 3.1.1.17)、ラッカーゼ(EC 1.10.3.2)、またはそれらの組み合わせである、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
前記ラクトンヒドロラーゼが1,4-ラクトナーゼ(EC 3.1.1.25)である、本発明1048の組成物。
[本発明1050]
前記酵素が、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;クラスEC 1.1.1由来のアルコールデヒドロゲナーゼ;バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ;カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;アルコールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;α,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ(EC 3.1.1.-);またはそれらの組み合わせである、本発明1042の組成物。
[本発明1051]
前記酵素が、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ/ChnA;クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ/ChnB;クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ/ChnC;クラスEC 1.1.1.2由来のChnD;EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;EC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11由来のシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;またはそれらの組み合わせである、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
前記廃棄流から前記モノマー成分、二酸、アジピン酸、または他のα,ω-二官能性C6アルカンを回収するまたは分離する工程をさらに含む、本発明1001〜1039のいずれかの方法。
[本発明1053]
NVR、COP酸、または洗浄水の存在下で微生物を培養する工程であって、該NVR、COP酸、または洗浄水が、該微生物の増殖に必要とされる炭素の少なくとも一部を補給する工程、ならびに
該NVR、COP酸、または洗浄水中のモノマー含有量を富化する工程であって、該微生物が、該廃棄流のダイマー成分および/またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程
を含む、微生物の流加培養または連続培養のための方法。
[本発明1054]
培養物のpHを6.0〜7.5の間で制御する、本発明1053の方法。
[本発明1055]
栄養供給物または前記廃棄流とともに、グリセロールまたはグルコース等の追加の発酵性炭素供給源を補給する工程をさらに含む、本発明1053または1054の方法。
[本発明1056]
流加培養発酵の場合には部分的滴下による細胞保持またはケモスタット培養の最中の細胞保持をさらに含む、本発明1053〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記微生物がY.リポリティカである、本発明1053〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記モノマー成分が、二酸、アジピン酸、α,ω-二官能性アルカン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1053〜1057のいずれかの方法。
本発明の方法は、有機性廃棄流からの成分のより高収率でありかつ改善された回収を可能にする少なくとも1種の生体触媒を用いる。本明細書において用いられる「生体触媒」という用語は、単離されたもしくは精製された酵素、または1つの有機分子の単一化学転換を行う宿主細胞によってインサイチューで産生された酵素、または1つもしくは複数の有機分子の一連の連続的転換を触媒するホールセルを表す。単離されたもしくは精製された酵素を、商業的供給源から購入してよく、または該酵素を天然にもしくは非天然に発現させた宿主細胞から精製してよい。宿主細胞は、天然でも非天然でも、例えば遺伝子操作されたものであってよい。宿主細胞は、細菌もしくは古細菌等の原核生物、または酵母もしくは動物細胞等の真核生物であってよい。宿主細胞は、特定の反応、例えば加水分解を触媒し得る酵素を発現かつ分泌し得る。加えて、宿主細胞は、異なる反応を触媒するさらなる酵素経路を含有し得る。例として、宿主細胞は、混合有機性廃棄流中の一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸成分の酸化を触媒するω水酸化経路、または廃棄流の成分から形成される6-オキソヘキサン酸等の化合物を転換して、6-アミノカプロン酸等の商業的により価値のある生成物を生成する酵素を含有し得る。
商業的シクロアルカンの二酸への酸化プロセスは、概して2つの工程を伴う。これらの工程の最初に、空気を用いてシクロアルカンを酸化して、シクロアルカノールおよびシクロアルカノンの混合物を産生する。次いで、硝酸を用いてこの混合物を二酸に酸化する。KA混合物の産生の間に、いくつかの副生成物流が生成される。より具体的には、シクロヘキサンが酸素または酸素を含有する気体で酸化された場合、シクロヘキサン中にシクロヘキサノール(A)、シクロヘキサノン(K)、およびシクロヘキシルヒドロペルオキシド(CHHP)を含有する中間体流が産生される。この中間体流は、CHHPをKAに変換することを意図した後続の処理工程を妨げる、副生成物も含む。したがって、商業的プロセスは、K、A、およびCHHPを含有する中間体流を水または腐食剤(米国特許第3,365,490号に記載されているもの等)と接触させて、不要な副生成物を除去する工程を含んでよい。この抽出工程は、(i)K、A、およびCHHPを含有する精製されたシクロヘキサン流;ならびに(ii)水廃棄流を産出する。
シクロヘキサン酸化の非揮発性残留物および洗浄水廃棄流は、化合物の混合物を含み、その一部は直鎖状C6分子であり、一部は環状C6分子であり、かつ一部は直鎖状C6分子を含むポリマーエステルである。他のより短い鎖長の化合物も、NVRおよび洗浄水廃棄流中に存在している。
NVR中の利用可能なC6炭素分子の最大60%が、ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、およびヘキサン酸のエステルオリゴマーとして、ならびにC4-C5ヒドロキシ酸、一酸、および環式アルコールを組み入れた混合ポリマーエステルとして存在している。より低い不均一性ではあるが、主にヒドロキシカプロン酸からなる類似のオリゴマーエステルがCOP酸中に存在している。ヒドロキシカプロン酸はこれらのオリゴマーの主要な成分であり、一方で一酸および二酸は鎖終結剤(chain terminator)として作用し、異なる鎖長のオリゴマーをもたらす。NVRおよびCOP酸の商業的に実現可能な利用のためには、これらの廃棄流に由来し得る、ポリマー用途に有用なポリオール、C4-C6二塩基酸もしくは二塩基エステル混合物、またはα,ω-二官能性C6アルカン等の生成物の収率を改善するための、オリゴマーエステルからのモノマーの放出が必要とされる。NVR中の高レベルのオリゴマーはまた、NVRがボイラー燃料として処分される場合の、高粘性で低効率な焼却にもつながる。
本発明は、一酸およびヒドロキシ酸成分を二酸に変換することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供する。これらの廃棄流の主要な成分は、C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、および二酸の混合物からなる。しかしながら、多くの用途を有する二酸を、廃棄流中の一酸およびヒドロキシ酸成分から容易に分離することはできず、それによって、他の潜在的用途に加えて、さらなる化学的または生物学的処理に対する廃棄流の有用性および収率を制限している。
6-オキソヘキサン酸を、ナイロンの合成における用途を有する種々の化合物にさらに変換することができる。例えば、6-オキソヘキサン酸をヘキサン-1,6-二酸(アジピン酸)に変換することができる。さらに、アジピン酸または6-オキソヘキサン酸を、6-アミノヘキサン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサナール、またはヘキサン-1,6-ジアミン(ヘキサメチレンジアミン)に変換することができる。本発明は、これらの化合物を生成するための方法も提供する。
一局面において、混合有機性廃棄流からの6-オキソヘキサン酸の産生は、NVRおよび/または洗浄水等の廃棄流中に存在しているポリマーエステルおよびオリゴマーエステルを加水分解することを伴う。これらのダイマー、トリマー、テトラマー、またはオリゴマーのエステルは、該ポリマーおよびオリゴマーからの放出後に6-ヒドロキシヘキサン酸、カプロン酸、および潜在的には1,6-ヘキサン二酸に変換され得る直鎖状C6分子から構成される。ゆえに、本発明は、エステラーゼ/リパーゼおよびポリヒドロキシアルカノエート(PHA)デポリメラーゼを含むカルボキシルエステラーゼ等のα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来の生体触媒の使用を含む、シクロヘキサン酸化の混合有機性廃棄流から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。
ヘキサン酸からの6-オキソヘキサン酸の産生における一工程は、ヘキサン酸(カプロン酸)の6-ヒドロキシヘキサン酸(ヒドロキシカプロン酸)への変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、シトクロムP450、またはクラスEC 1.14.15.3由来のω-ヒドロキシラーゼもしくはω-オキシゲナーゼ酵素等の酵素を用いて、混合有機性廃棄流中に存在している成分から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。特定の変換に対する特異的酵素の使用が公知であるが(例えば、Coon, Biochemical & Biophysical Research Communications, 2005,338:378-385)、本発明者らは驚くべきことに、これらの酵素を用いて、混合有機性廃棄流の成分を酵素的に変換し得ることを発見した。
シクロヘキサノールからの6-オキソヘキサン酸の産生における一工程は、シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、クラスEC 1.1.1-由来のアルコールデヒドロゲナーゼまたはシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ/ChnA等の酵素、例えばEC 1.1.1.90、1.1.1.245などの使用を含む、シクロヘキサン酸化の混合有機性廃棄流の成分からシクロヘキサノンを産生する方法を提供する(Donoghue & Trudgill, Eur J Bochem., 1975,60:1-7)。
本明細書において記述されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用によって、6-オキソヘキサン酸をヘキサン-1,6-二酸(アジピン酸)に酵素的に変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に提示した生体触媒を用いて6-オキソヘキサン酸を産生する工程、ならびに例えばEC 1.2.1.4およびEC 1.2.1.63などに由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ等の生体触媒を用いた6-オキソヘキサン酸のヘキサン-1,6-二酸への酵素的変換をさらに含む、ヘキサン-1,6-二酸(アジピン酸)を産生する方法を提供する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現および分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
本発明は、生体触媒を用いて、NVR等の混合有機性廃棄流の複雑性を低下させ、かつ該流中のアジピン酸の相対濃度を増大させることによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供するものであって、これは廃棄流からのアジピン酸の回収を促進する。とくに、方法は、混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を増大させ、かつ該流中の一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させる。およそ10%のアジピン酸が、オリゴマー化の結果としてならびに/または一酸およびヒドロキシ酸と分離不可能に混合された二酸として、混合有機性廃棄流中で喪失する。しかしながら、本発明者らは、少なくとも1種の生体触媒を有機性廃棄流に適用することによって、アジピン酸の回収が改善され得ることを発見した。
本発明は、生体触媒を用いて、廃棄流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供する。
シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中に存在しているC-4およびC-5一酸(酪酸およびペンタン酸)ならびに/またはヒドロキシ酸(4-ヒドロキシ酪酸および5-ヒドロキシペンタン酸)を、カプロン酸およびヒドロキシカプロン酸に関して記載される、ω-ヒドロキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる同じ経路を介して任意で変換する。酪酸およびペンタン酸を対応する二酸、つまりコハク酸およびグルタル酸に変換する。この変換によって、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中の化学種の混合物の複雑性は、主にC6、C5、およびC4二酸からなる混合物まで低下する。混合物中の化学種の数を低下させることによって、得られる二酸混合物は、二酸としての商業的用途のための発酵液からより容易に回収され、または二塩基エステル混合物としての商業的用途を有する対応する二塩基エステルに公知の方法によって任意でエステル化され、または公知の方法によってC6、C5、およびC4二塩基エステルに任意で分離される。酪酸、ペンタン酸、コハク酸、グルタル酸、4-ヒドロキシ酪酸、および5-ヒドロキシペンタン酸等の、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中に存在しているC4およびC5種の一部またはすべては、TCA回路を介したアセチル-CoAにβ酸化を介して異化され、それによって化学種の複雑性が低下し、かつアジピン酸、アミノカプロン酸、カプロラクタム、またはヘキサメチレンジアミンのより容易な回収を促進し、一方でバイオマス産生のための炭素供給源として機能し、ゆえにバイオマス産生に必要とされる発酵性炭素供給源の量を低下させる。ゆえに、本発明は、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中のC-4およびC-5炭素種C3種の少なくとも一部を異化することによって、C-4およびC-5種の濃度を低下させる方法を提供する。カプロン酸および/またはアジピン酸(β酸化を介してまたはTCA回路を介して異化される)の喪失を最小限に抑えるために、宿主の遺伝子操作を実施することができる。
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法における変換を実施するために用いられる酵素は非天然である、すなわち、該酵素をコードするDNAは、該酵素の特性の1つまたは複数を改善するために野生型配列から変異されている。遺伝子の突然変異誘発およびタンパク質工学のための方法は、当技術分野において周知である。変異のライブラリーの創出のために、DNAシャッフリング、STEPおよびエラープローンPCR、分子進化、ならびに突然変異誘発株等の手法を含む、ランダムおよび/または組み合わせ突然変異誘発の手法を代替的または付加的に用いてよい。突然変異誘発による変化の非限定的なリストには、欠失、挿入、置換、転位、点変異、およびサプレッサー突然変異が含まれる。
本明細書において記載される方法または組成物のいずれかにおいて、多種類の酵素が存在してよい。例えば、本明細書において記述される酵素の種類の、例えば2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、または12種の任意の組み合わせを用いてよい。適切な酵素には、シトクロムP450またはω-ヒドロキシラーゼ(オメガ-ヒドロキシラーゼ)、脂肪酸オキシダーゼまたは第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはChnE、アルコールデヒドロゲナーゼまたはChnA、グルコノラクトナーゼまたはバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ、シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼまたはエステラーゼまたはリパーゼまたはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ、トランスアミナーゼまたは6-ヒドロキシカプロエートデヒドロゲナーゼ、アミドヒドロラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびジアミンオキシダーゼまたはジアミントランスアミナーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本発明は、混合有機性廃棄流、例えばシクロヘキサン酸化等のシクロアルカン酸化の非揮発性残留物または洗浄水廃棄流中に見出される化合物を、ナイロンの合成に有用である化合物に酵素的に変換するための生体触媒の使用に関する。
酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸の対応する二酸(すなわち、それぞれコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸)への変換;
酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸の対応するヒドロキシ酸(すなわち、それぞれ4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸)への変換;
4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の対応するオキソ酸(すなわち、それぞれ4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸)への変換;または
4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸の対応する二酸(すなわち、それぞれコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸)への変換。
本発明の方法に用いられる生体触媒は、酵素が天然で存在している種である、非改変宿主細胞であってよい。しかしながら、該宿主細胞を遺伝子改変して、操作された細胞を産生することが必要である可能性がある。本明細書において使用するとき、操作された細胞とは、そのゲノムが野生型細胞のゲノムから変更されるように操作された細胞を意味する。ゲノムの変更には、プラスミドの導入および欠失が含まれる。一局面において、遺伝子改変とは、細胞のゲノム内への核酸の導入である。図3を参照されたい。細胞内に導入される核酸は、別の種または生物由来の核酸配列、例えばホールセルの野生型ゲノム内に存在していないDNA配列を含んでよい。他の例では、導入されるDNA配列は、ホールセルのゲノム内のDNA配列のさらなるコピーであってよい。いくつかの選択肢において、遺伝子改変は、ホールセルのゲノムからのDNA配列の欠失である。別の局面において、遺伝子改変は、細胞のゲノムの改変である。
細胞内に導入される核酸は、いくつかのエレメントのうちの1つまたは複数を含んでよい。典型的には、エレメントの1つは、本発明の方法に用いられる酵素、例えばシトクロムP450、ω-ヒドロキシラーゼ(オメガ-ヒドロキシラーゼ)、脂肪酸オキシダーゼ、第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、ケトレダクターゼ、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、カプロラクトンヒドロキシラーゼ、ジオンヒドロラーゼ、エステラーゼ/リパーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミドヒドロラーゼ、またはこれらの種類の酵素のいずれかの操作された型をコードする遺伝子である。いくつかの選択肢において、核酸は、シャペロンまたは遺伝子のアクチベーターもしくはリプレッサーとして作用するタンパク質等、本発明の方法において機能する酵素ではないタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、単一株のホールセルを用いて、本発明の方法に用いられる1種を上回る酵素を発現させる。この場合、複数の酵素は、導入される同じ核酸によってコードされてもよい。代替的に、酵素は、導入される別個の核酸フラグメント上でコードされてもよい。酵素を、単一のプロモーターからすべて発現させてよい(例えば、酵素をオペロンの形態に配置することによって)。代替的に、酵素を、複数の分離したプロモーターから発現させてよい。いくつかの例において、複数の分離したプロモーターを、同じ化学物質によって誘導してよい(例えば、複数の酵素のそれぞれを酵母GALプロモーターから発現させてよく、ゆえに各遺伝子がガラクトースで誘導可能であることを意味する)。他の適切なプロモーターは、当技術分野において公知である。代替的に、本発明の方法に用いられる酵素をコードする遺伝子のそれぞれは、異なるプロモーターの制御下にある。ゆえに、異なる誘導化合物の使用によって、異なる酵素を個々に導入することができる。別の選択肢において、いくつかの酵素が同じプロモーターの制御下にあり、かついくつかの酵素が異なるプロモーターの制御下にある、中間型の手法を用いる。この代替策は、ホールセル内に多数の酵素経路が作製されておりかつ経路の各メンバーを他の経路メンバーと協調させて制御したいが各経路を別々に制御したいと望まれる場合に、とりわけ有利であり得る。
天然ではない条件下でタンパク質を発現するように細胞が操作されている場合(例えば、種にとって天然型であるタンパク質を天然のレベルを上回るレベルで発現させた場合、または代替的に、異なる種由来のタンパク質を宿主細胞において発現させた場合)、場合によっては、そのタンパク質は活性型で発現されない。その代わり、それは不正確に折り畳まれ、機能的でない「封入体」凝集物として蓄積し得る。この場合、該タンパク質を発現させるために用いられた細胞を遺伝子改変に供して、該タンパク質の誤った折り畳みを阻止し得るまたは凝集した状態からそれを再折り畳みし得るシャペロンタンパク質を、さらに発現させてよい。
代謝工学とは、化合物を産生し得る細胞の能力を増大させるために、ホールセルにおけるパラメーターを最適化するプロセスである。本発明の方法に用いられるホールセルは、二酸、あるいはアジピン酸または6-オキソヘキサン酸、1,6-ヘキサンジオール(1,6-hexanedoil)、6-アミノヘキサン酸、カプロラクタム、およびヘキサメチレンジアミンの産出を最適化するように任意で操作されている。
本発明の方法において開始材料として用いられるシクロヘキサン酸化プロセスの混合有機性廃棄流は、酸化した炭化水素分子を含む。主張される方法は、廃棄流中に存在している望ましくない成分をより望ましい生成物に酵素的に変換する少なくとも1種の生体触媒を該流に適用することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善し、それによって処理された廃棄流を後続の化学的および/または酵素的処理に用いて、可能な限り高い純度で高収率の所望の生成物を提供することができる。上記に記載されるように、シクロヘキサン酸化の結果として生じる生成物には、NVRおよび/または洗浄水中に見出される、ペンタン酸、5-ヒドロキシペンタン酸、ブタン酸、4-ヒドロキシブタン酸、およびプロパン酸を含む、当初のC6分子の崩壊生成物が含まれる。NVRおよび/または洗浄水の特性を改善するために、ホールセル生体触媒を廃棄流に適用して、開始材料中に存在している不要な化合物を利用する。
本発明者らは、混合有機性廃棄流中に存在している主要な阻害性化合物としてバレロラクトンを同定しており、バレロラクトンがNVR耐性宿主細胞の増殖を阻止することに関与していることを確認した。NVRの存在下において適当な宿主細胞の増殖を可能にするために、NVRの重要な阻害性成分としてのバレロラクトンの同定に基づき、廃棄流を適切に処理して、廃棄流からバレロラクトンを除去する、または廃棄流中に存在しているバレロラクトンの量を軽減することができる。
あるいは、混合有機性廃棄流を含有する培養物中での生体触媒の増殖を改善するために、それが混合有機性廃棄流に対して耐性を有する、例えばNVR、COP酸、または洗浄水流を含有する培養物中で増殖し得る宿主細胞を選択してよい。
本発明は、本明細書において記載されるモノマー成分(例えば、二酸、アジピン酸)の分離および回収も提供する。例えば、本発明は、混合有機性廃棄流の6炭素成分、例えば6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換後に、反応混合物からアジピン酸またはアジピン酸誘導体を分離する方法を提供する。これらの分離した生成物を、初期工程において分離され得るC4およびC5二酸、ならびに/または誘導体の除去によってさらに精製することができる。
本発明は、シクロヘキサン酸化プロセスの混合有機性廃棄流と生体触媒とを含む組成物も提供する。一局面において、混合有機性廃棄流は、NVR、洗浄水/COP酸、または苛性洗浄液流である。
本発明の発酵プロセスを、バッチ様式、流加培養様式、または連続様式で実施してよい。流加培養様式において、該プロセスを部分的滴下で実施してよい。あるいは、細胞保持の有無にかかわらず、ケモスタット発酵を採用してよい。実施例3を参照されたい。さらには、廃棄流中の成分を唯一の炭素およびエネルギー供給源として供給してよく、あるいはグリセロールもしくは糖類、または他の適切な発酵性炭素もしくはエネルギー供給源の同時供給をエネルギーおよび炭素のさらなる供給源として用いて、より高等なバイオマスを獲得してよい。炭素供給源限定的培養を採用して、NVRおよびCOP酸中の種の毒性を低下させてよい。好ましい態様において、5〜8のpH範囲内で、より好ましくはpH6〜pH7.5の間で培養を実施して、解離していない有機酸による増殖阻害を克服する。
それらの結合部位の形状に基づいて異なるクラス由来の商業用リパーゼ(遊離および固定)およびエステラーゼを選択して、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルの加水分解についてスクリーニングした(表1および2)。このスクリーニングの結果に基づき、リパーゼエンジニアリングデータベース(LED)(Widmann et al., BMC Genomics 2010, 11:123)および他のバイオインフォマティクス資源を用いて、オリゴマーエステルの加水分解についてスクリーニングするためのさらなる酵素候補、およびとくに、熱安定性または低いpHで活性を有する酵素を同定した。当業者であれば、合理的設計を用いた酵素工学または指向進化技術によって、所望の活性を有する酵素のpH最適条件および安定性を変化させること、または所望のpHおよび安定性特性を有する酵素の基質特異性を変更すること、またはその両方が可能であることも理解するであろう。
カラム:100×2mm Synergi Fusion RPカラム(Phenomenex)
カラムオーブン温度:40℃
注入容量:2μL
溶離液:
A:0.1%酢酸を含有する5mM酢酸アンモニウム
B:5%水を含有するアセトニトリル
勾配:
C4およびC5一酸(酪酸および吉草酸)ならびにヒドロキシ酸を対応する二酸に変換することによって、またはβ酸化を介して増殖のために利用することによって、NVRからこれらを除去することは、NVRからC4-C6二酸混合物またはアジピン酸を産生するために重要である。NVRから二酸混合物を産生するために、ω酸化を介した一酸からの二酸の蓄積、および一酸よりも低い二酸の消費速度が望ましい。本実施例は、混合有機性廃棄流の主要なC4およびC5成分を異化し得る宿主細胞微生物の選択を実証する。
ブチレートおよびバレレートを唯一の炭素供給源として効率的に利用し得る約13種のヤロウイア・リポリティカ株の混合培養物(コロニー形態の視覚的査定に基づく)が、元の72種の株から単離された。
図16に示されるように、1Lの被覆されたガラス発酵槽および225[cm2]ポリエーテルスルホン0.2[μm]中空繊維膜を用いた、細胞保持を伴うケモスタット発酵を設定した。実験機構には、蠕動ポンプを介して発酵槽内に濾過滅菌されたNVR供給物、栄養供給物、および塩基供給物(12[%](v/v)NH3(水溶液))を提供した。さらには、蠕動ポンプによって、中空繊維膜に必須のクロスフロー保持物流速が提供され、蠕動ポンプによって、透過物の離脱が可能となり、かつ蠕動ポンプによって、発酵槽からのバイオマス流出が可能となった。
13種のY.リポリティカ株を、酪酸および吉草酸を消費する能力について選択した。C供給源限定およびpHスタットを含む異なる条件において唯一のエネルギーおよび炭素供給源としての2.5%(v/v)NVRについて、ケモスタットで株を培養した。いずれの場合にも、培養物は定常状態に達せず、洗い出された。重金属を含む、NVR中に存在していることが知られるすべての成分を毒性について評価および試験したが、唯一の炭素供給源としてのNVRの供給の間に観察される重度の阻害効果を説明するものはない。ブロス中の成分のHPLC分析によって、未知の化合物がブロス中に蓄積し、全く消費されなかったことが示された。
ラクトンの加水分解は、ヒドロキシカルボン酸のラクトンおよび酸の形態間の相互変換を仲介する1,4-ラクトナーゼクラスの酵素(EC 3.1.1.25)およびグルコノラクトナーゼ(EC 3.1.1.17)によって触媒される。唯一の炭素供給源としてのシクロヘキサノールまたはシクロヘキサノンで増殖し得る微生物細胞は、ε-カプロラクトンを介してシクロヘキサノンをアジピン酸に変換する。ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサノエートへの加水分解は、ChnCによって触媒される(図20)。
ヤロウイア・リポリティカの野生型(W29またはPo1d(Mata ura3-302-270、xpr2-322、Ura−、Leu−))および種々のPOX遺伝子欠失を有する変異体株(下記の表)をYPD(3ml)中で16時間前培養し、0.05の最終OD600まで、10%産生培地(Y1T2D1O2、pH6.8−一般的方法を参照されたい)を含有する振とうフラスコに植菌するために用いた。
LIP2遺伝子は、Y.リポリティカの主要な細胞外リパーゼ活性をコードし(Pignede G, Wang H, Fudalej F, Gaillardin C, Seman M, Nicaud JM (2000). Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology. 182: 2802-2810)、そのcDNA配列は、13アミノ酸のシグナル配列、ジアミノペプチダーゼの基質である一続きの4個のジペプチド(X-AlaまたはX-Pro)、およびXprエンドプロテアーゼに対する基質であるKR(Lys-Arg)部位を含有する12アミノ酸のプロ領域を含有する、プレプロ酵素をコードする(Fickers P, Marty A, Nicaud JM (2011). The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 29: 632-644)。増殖の早期段階において、細胞外リパーゼは、増殖期の最後に培養ブロス中に放出される前に主に細胞壁に結合している(Fickers P, Nicaud JM, Gaillardin C, Destain J, Thonart P (2004). Carbon and nitrogen sources modulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Applied Microbiology 96:742-9)。その結果として、LIP2のシグナル配列は、分泌を可能にする他のタンパク質との融合に適している。
図2は、6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの、アジピン酸の6-オキソヘキサン酸への、および6-オキソヘキサン酸の6-アミノカプロン酸への酵素的変換を示している。6-アミノカプロン酸は次に、ヘキサメチレンジアミンまたはカプロラクタムに変換することができる。
Claims (38)
- (a)シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流と生体触媒とを組み合わせる工程であって、該生体触媒が、エステラーゼ(EC 3.1.1.1)、クチナーゼ(EC 3.1.1.74)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)デポリメラーゼ(EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76)、1,4-ラクトナーゼ(EC 3.1.1.25)、もしくはグルコノラクトナーゼ(EC 3.1.1.17)、またはそれらの組み合わせである、工程;および
(b)該混合有機性廃棄流のラクトン、ダイマー成分および/またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程
を含む、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流中のモノマー含有量を富化するための方法。 - a.オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し、かつ
b.モノマー成分の量を増大させる、
少なくとも1種のヒドロラーゼ酵素、天然のまたは非天然の宿主細胞
を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。 - a.オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解するか;
b.ラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解するか;または
c.直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化する
天然のまたは非天然の宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理して、二酸の量を増大させる工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - a.オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーへ加水分解するか;
b.ε-カプロラクトンの少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸へ加水分解するか;
c.カプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および6-オキソカプロン酸の少なくとも一部をアジピン酸へ酸化するか;
d.環状C6成分の少なくとも一部をアジピン酸へ変換するか;
e.C3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化するか;または
f.C3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する
非天然宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理して、アジピン酸の濃度を増大させ、かつ一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させる工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - a.オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーへ加水分解するか;
b.カプロン酸の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸へ酸化するか;
c.環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸もしくは6-オキソカプロン酸へ変換するか;
d.C3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化するか;または
e.C3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化し、かつアジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、もしくは6-オキソヘキサン酸を1,6-ヘキサンジオール、6-アミノカプロン酸、ε-カプロラクタム、もしくはヘキサメチレンジアミンに変換する少なくとも1種の生合成経路酵素を発現する
非天然宿主細胞を用いて、前記混合有機性廃棄流を処理する工程、および
該流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - シクロアルカン酸化プロセスからの前記混合有機性廃棄流が、非揮発性残留物(NVR)、洗浄水、濃縮された水抽出物(COP酸)、苛性洗浄液流、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 単離されたもしくは固定化されたヒドロラーゼ、または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌される内在性もしくは異種性ヒドロラーゼによってオリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 酸性pH、生理的pH、またはアルカリ性pHで活性を有するヒドロラーゼによってオリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を触媒する工程をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記ヒドロラーゼを用いた処理によって前記混合有機性廃棄流の粘性を低下させて、該流を燃焼させる効率を改善し、かつ/またはさらなる化学的もしくは生物学的処理のために該流を調製する、請求項2記載の方法。
- 前記処理された混合有機性廃棄流を燃料価値のためにまたは合成ガスを産生するために燃焼させる工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 混合エステルもしくはポリオールを産生するためのエステル化、ジオールを産生するための水素化、二酸を産生するための酸化、還元的アミノ化、スルホン化、またはNH4OHもしくはポリアミンを用いた処理を実施する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 前記オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解が、さらなる分離、化学的変換、または生体触媒による酵素的変換と同時に実施される、請求項2記載の方法。
- オキソ酸を介してC4-C6またはC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸を二酸に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性のω酸化経路を有する、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法:
a.酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸のコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸への変換;
b.酪酸、吉草酸、および/もしくはアジピン酸の4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸への変換;
c.4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および/もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸への変換;または
d.4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および/もしくは6-オキソヘキサン酸のコハク酸、グルタル酸、および/もしくはアジピン酸への変換。 - 内在性または異種性のω酸化経路が、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し、かつ該天然のまたは非天然の宿主細胞が、n-アルカンを利用する酵母または細菌である、請求項13記載の方法。
- 前記n-アルカンを利用する酵母が、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、C.アルビカンス(C. albicans)、C.クロアカエ(C. cloacae)、C.ギリエルモンジイ(C. guillermondii)、C.インターメディア(C. intermedia)、C.マルトサ(C. maltosa)、C.パラプシローシス(C. parapsilosis)、C.ゼイラノイデス(C. zeylenoides)、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ(Rhodotorula)属、リゾプス(Rhizopus)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、およびリポマイセス(Lipomyces)属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり;かつ前記n-アルカンを利用する細菌が、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、P.プチダ(P. putida)、P.エルギノーサ(P. aeroginosa)、P.オレオボランス(P. oleoverans)、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、アシネトバクター・ベネチアヌス(Acinetobacter venetianus)、オレイフィラス・メシネンシス(Oleiphilus messinensis)、アルスロバクター・ビスコサス(Arthrobacter viscosus)、カプリアビダス・メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、スフィンゴモナス・パウシモビリス(Sphingomona spaucimobilis)、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)、アルカニボラクス・ディエソレイ(Alcanivorax diesolei)、またはそれらの組み合わせである、請求項14記載の方法。
- 前記廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する、前記非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性の経路を有する、請求項4または5記載の方法:
I.シクロヘキサノールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換:
a.シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換;
b.シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換;
c.ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換;もしくは
d.6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換;
II.1,2-シクロヘキサンジオールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換:
a.シクロヘキサン-1,2-ジオールのシクロヘキサン-1,2-ジオンへの変換;もしくは
b.シクロヘキサン-1,2-ジオンの6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換;および
III.6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換。 - 前記天然のまたは非天然の宿主細胞が非揮発性残留物(NVR)に対して耐性を有する、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記天然のまたは非天然の宿主細胞がシクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流の少なくとも1容量%に対して耐性を有する、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- シクロアルカン酸化プロセスからの前記混合有機性廃棄流中の阻害性化合物の量を低下させることによって、該混合有機性廃棄流に対する前記宿主細胞の耐性を向上させる工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 前記阻害性化合物がラクトンを含み、かつ方法が、前記天然のまたは非天然の宿主細胞を用いた前記混合有機性廃棄流の処理の前または最中に、ラクトンを対応するヒドロキシ酸に加水分解する1種または複数種の生体触媒を用いて処理することによって、シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流中のラクトンの量を低下させる工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- ラクトンを加水分解する前記生体触媒が、前記天然のまたは非天然の宿主細胞によって発現され、かつ発酵の間に分泌される酵素である、請求項20記載の方法。
- 前記非天然宿主細胞によるC6化合物のより低い割合の異化が、シクロアルカン酸化プロセスからの前記混合有機性廃棄流からより高収率のC6成分をもたらす、請求項4または5記載の方法。
- 前記非天然宿主細胞によるβ酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸のアセチル-CoAへの分解を低下させる工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
- カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸を基質として用いてCoAエステルを生成する1種または複数種の酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる、請求項23記載の方法。
- CoAエステルを酸化する1種または複数種の酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる工程を含む、請求項24記載の方法。
- 前記酵素が、CoAリガーゼ、CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼ、およびアシル-CoAデヒドロゲナーゼから選択される、請求項25記載の方法。
- C4、C5、またはC6二酸への分離の前に二酸をエステル化する工程をさらに含む、請求項3記載の方法。
- アジピン酸を結晶化させる工程をさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
- オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、およびアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、1,6-ヘキサンジオールも産生する、請求項5記載の方法。
- 1,6-ヘキサンジオールを産生する前記非天然宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、請求項29記載の方法。
- オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、およびアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸も産生する、請求項5記載の方法。
- 6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換するアミノトランスフェラーゼを発現する、請求項31記載の方法。
- 6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸をε-カプロラクタムに変換するアミドヒドロラーゼも発現する、請求項32記載の方法。
- 6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換する1-アミノトランスフェラーゼによって、ヘキサメチレンジアミンも産生する、請求項32記載の方法。
- 単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素を添加する工程をさらに含み、かつ該酵素が、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;クラスEC 1.1.1.-由来のアルコールデヒドロゲナーゼ;バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ;カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ;脂肪アルコールオキシダーゼ;アルコールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;またはα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ(EC 3.1.1.-)である、請求項1記載の方法。
- 単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素を添加する工程をさらに含み、該酵素が、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ/ChnA;クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ/ChnB;クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ/ChnC;クラスEC 1.1.1.2由来のChnD;EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ;EC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11由来のシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ;またはそれらの組み合わせである、請求項1記載の方法。
- 前記天然のまたは非天然の宿主細胞が、pH5.0〜8.0で炭素供給源を利用する、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記モノマー成分、二酸、アジピン酸、またはα,ω-二官能性C6アルカンを回収するまたは分離する工程をさらに含む、請求項1、2、3、4、5、6、35、または36記載の方法。
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