DE102014200497A1

DE102014200497A1 - Enzymatisches Verfahren

Info

Publication number: DE102014200497A1
Application number: DE102014200497.7A
Authority: DE
Inventors: Philip ENGEL; Thomas Haas; Wolfgang Kroutil; Johann H. Sattler
Original assignee: Evonik Industries AG
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2015-07-16
Also published as: WO2015106922A1; US20160326555A1; EP3094732A1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfassend die Verfahrensschritte A) Bereitstellen mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel I)mit X = zweibindiger organischer Rest umfassend 1 bis 19 Kohlenstoffatome B) In Kontakt Bringen der Verbindung der allgemeinen Formel I) mit einem Enzym E1 ausgewählt aus der Gruppe Esterasen, Lipasen und Lactonasen, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in Anwesenheit mindestens eines aliphatischen Alkohols umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome durchgeführt wird.

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfassend die Verfahrensschritte

A) Bereitstellen mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel I)
mit X = zweibindiger organischer Rest umfassend 1 bis 19 Kohlenstoffatome
B) In Kontakt Bringen der Verbindung der allgemeinen Formel I) mit einem Enzym E₁ ausgewählt aus der Gruppe Esterasen, Lipasen und Lactonasen,

Stand der Technik
Macromolecules, 1995, 28, 73–78, Macromolecules, 2004, 37, 2450–2453 und Macromolecules 2006, 39, 7967–7972 offenbaren enzymatische Verfahren zur Hydrolyse von Lactonen mit Lipasen, Esterasen und Lactonasen in nicht wässrigen Medien. Unter den beschriebenen Bedingungen polymerisieren die erhaltenen Produkte, so dass eine weitere Modifikation an der ω-Position, beispielsweise in Form einer Aminierung nicht möglich ist.
Aufgabe der Erfindung war es, ein enzymatisch katalysiertes Verfahren zur Ringöffnung von Lactonen bereitzustellen, welches weitere Modifikation an der ω-Position ermöglicht.
Beschreibung der Erfindung Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die der Erfindung gestellte Aufgabe zu lösen vermag.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren umfassend die Verfahrensschritte

A) Bereitstellen mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel I)
mit X = zweibindiger organischer Rest umfassend 1 bis 19 Kohlenstoffatome
B) In Kontakt Bringen der Verbindung der allgemeinen Formel I) mit einem Enzym E₁ ausgewählt aus der Gruppe Esterasen der EC 3.1, Lipasen der EC 3.1.1 und Lactonasen der EC 3.1.1,

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Umsatzrate des Verfahrens sehr hoch ist. Somit kann das Verfahren in verkürzter Zeit durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Ausbeuten gesteigert werden. Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Produkte vereinfacht aufgereinigt werden können. Noch ein Vorteil ist es, dass die Reaktion hoch selektiv verläuft und keine Ringöffnung ohne Umsetzung zum Ester stattfindet.
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den Protein Bank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 01.10.2013; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch „.Ziffer“ wie beispielsweise „1“, kenntlich gemacht. Werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Dokumente zitiert, so soll deren Inhalt vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung gehören. Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Herstellung von ω-Hydroxycarbonsäureestern geeignet, wobei die Verbindung der allgemeinen Formel I) unter Ringöffnung mit dem aliphatischen Alkohol verestert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist X ausgewählt aus gegebenenfalls substituierten Alkylengruppen, bevorzugt -(CH₂)-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆- und -(CH₂)₇-, besonders bevorzugt -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃- und -(CH₂)₄-.
Der aliphatische Alkohol ist bevorzugt ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Propanol, Ispopropanol und Butanol, wobei Methanol besonders bevorzugt ist.
Der aliphatische Alkohol wird in Verfahrensschritt B) insbesondere in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 60 Gew.-%, bevorzugt von 10 Gew.-% bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt von 12 Gew.-% bis 30 Gew.-% eingesetzt wird, wobei sich die Gewichtsprozente auf den Gesamtreaktionsansatz beziehen.
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in wässriger Umgebung durchgeführt wird. Unter dem Begriff „wässriger Umgebung“ wird bevorzugt verstanden, dass Wasser in einer Konzentration von 3 Gew.-% bis 95 Gew.-%, bevorzugt von 5 Gew.-% bis 90 Gew.-%, besonders bevorzugt von 10 Gew.-% bis 85 Gew.-% eingesetzt wird, wobei sich die Gewichtsprozente auf den Gesamtreaktionsansatz beziehen.
Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C, bevorzugt von 15 °C bis 60 °C, besonders bevorzugt von 25 °C bis 40 °C; durchgeführt.
Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt in einem pH-Bereich von 3 bis 11, bevorzugt von 5 bis 9, besonders bevorzugt von 6,5 bis 8; durchgeführt. Der „pH-Wert“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist definiert als der Wert, welcher für entsprechende Zusammensetzung bei 25 °C nach fünf Minuten Rühren gemessen wird mit einer kalibrierten pH-Elektrode gemäß ISO 4319 (1977).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₁ ausgewählt aus Esterasen bei denen der Zugangstunnel, den das Substrat zurücklegen muss um in das aktive Zentrum zu gelangen, hydrophob ist und dieser durch einen Hydrophobicitätsindex von 0,1 bis 1,8 gekennzeichnet ist.
Die Bestimmung des Hydrophobicitätsindexes ist in Journal of Cheminformatics 2013, 5:39 doi:10.1186/1758-2946-5-39 und Protein Eng. (1992) 5 (5): 373–375. doi: 10.1093/protein/5.5.373 beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₁ ausgewählt aus der Gruppe
XP_003364701.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X2),
XP_005608328.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X3),
NP_388425.1 (Esterase 008 SD Bacillus subtilis),
Pig Liver Esterase 03 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE03),
Pig Liver Esterase 06 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE06), sowie
CAO81735.1 (Alternative Pig liver esterase),
GI:576155 (Horse pancreatic lipase Chain A: 1HPL_A),
GI:576156 (Horse pancreatic lipase Chain B: 1HPL_B) und
AAC12774.1 (Esterase aus Bacillus subtilis pdb 1JKM brefeldin A esterase),
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge an ε-Caprolacton bezogen auf die eingesetzte Bezugsenzymmenge mit Methanol zu dem entsprechenden Ester verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Beispiel 1 beschrieben.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn neben dem Enzym E₁ in Verfahrensschritt B) mindestens ein Enzym ausgewählt aus E₂, E₃ und E₄ eingesetzt wird, wobei
das Enzym E₂ die Umsetzung von ω-Hydroxycarbonsäureestern zu den entsprechenden ω-Oxocarbonsäureestern katalysiert,
das Enzym E₃ die Umsetzung von ω-Oxocarbonsäureestern zu den entsprechenden ω-Aminocarbonsäureestern katalysiert und
das Enzym E₄ die Umsetzung von ω-Oxocarbonsäureestern zu den entsprechenden ω-Aminocarbonsäuren katalysiert.
Die Enzyme E₁, E₂, E₃ und E₄ können somit als Enzymkombinationen ausgewählt aus E₁, E₁E₂, E₁E₃, E₁E₄, E₁E₂E₃, E₁E₃E₄, E₁E₂E₄ und E₁E₂E₃E₄ eingesetzt werden. Je nach Wahl der Enzymkombination kann das Verfahren zur Herstellung von ω-Hydroxycarbonsäureestern (z.B. E₁), zur Herstellung von ω-Oxocarbonsäureestern (z.B. E₁E₂), zur Herstellung von ω-Aminocarbonsäureestern (z.B. E₁E₂E₃) und/oder zur Herstellung von ω-Aminocarbonsäuren (z.B. E₁E₂E₃E₄) eingesetzt werden.
Erfindungsgemäße Verfahren, bei denen in Verfahrensschritt B) Enzymkombinationen umfassend E₁E₂E₃E₄ eingesetzt werden, weisen bevorzugt den aliphatischen Alkohol in einer Konzentration von 12 Gew.-% bis 22 Gew.-% auf, wobei sich die Gewichtsprozente auf den Gesamtreaktionsansatz beziehen und insbesondere bevorzugt wird diese Konzentration kombiniert mit einem Temperaturbereich in Verfahrensschritt B) von 25 °C bis 40 °C.
Erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass E₂ ausgewählt ist aus Alkanmonooxygenasen, Alkoholdehydrogenasen und Alkoholoxidasen. Geeignete Enzyme E₂ sind beispielsweise als „Enzyme E_II“ in der EP2222844 und als „NAD(P)+-abhängige Alkoholdehydrogenasen“ in der WO2013011018 beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₂ ausgewählt aus der Gruppe, P42328.1 (ADH-hT), NP_415995.4 (primary ADH from Escherichia coli), ACB78191.1 (Ralstonia eutropha), YP_795183.1 (Lactobacillus brevis), ACF95832.1 (Lactobacillus kefiri), ACB78182.1 (Paracoccus pantotrophus), EU427523.1 (Sphingobium yanoikuyae), AY123972.1 (Arthrobacter sp. BP2), sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge an ω-Hydroxyhexansäuremethylester bezogen auf die eingesetzte Bezugsenzymmenge zu dem entsprechenden ω-Oxocarbonsäureester verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird im Folgenden beschrieben. Die Bestimmung +der Aktivität erfolgt durch photometrische Messung der Absorptionsänderung von NAD zu NADH (0.5 mM) bei 340 nm in Gegenwart eines Substrates (6-Hydroxyhexansäuremethylester, 50 mM) und des geeigneten Enzymes aus der Gruppe E₂.
Erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass E₃ ausgewählt ist aus ω-Transaminasen. Geeignete Enzyme E₃ sind beispielsweise als „Enzyme E_III“ in der EP2222844 , als „polypeptide having transaminase activity“ in der EP2557176 und als „Transaminasen“ in der WO2013011018 beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₃ ausgewählt aus der Gruppe, NP_901695.1 (Chromobacterium violaceum), YP_917746.1 (Paracoccus denitrificans), sowie BAK39753.1 (Arthrobacter sp.), sowie die vorgenannten geeigneten Enzyme E₃, sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge an ω-Oxohexansäuremethylester bezogen auf die eingesetzte Bezugsenzymmenge zu dem entsprechenden ω-Aminocarbonsäureester verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird im Folgenden beschrieben. Die Aktivität der lyophilisierten Zellen (20 mg) wird mit Hilfe einer Zeit-Umsatzkurve bestimmt, wobei zu verschiedenen Zeitpunkten (0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 20 h) die Umsetzung des Substrates (6-Oxohexansäuremethylester, 50 mM) zum Amin bestimmt wird. Zuvor erfolgt die Rehydratisierung der Zellen durch Schütteln (120 rpm, 30 min) unter erfolgter Zugabe von PLP +(Pyridoxalphosphat) (0.4 μmol). Die Recyclierung des NAD zu NADH (0.5 mM) erfolgt mit Hilfe einer GDH (1 U) und Glukose (100 mM). Für die Berechnung der Aktivität wird der lineare Teil der Kurve herangezogen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₄ ausgewählt aus der Gruppe XP_003364701.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X2),
XP_005608328.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X3),
NP_388425.1 (Esterase 008 SD Bacillus subtilis),
Pig Liver Esterase 03 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE03),
Pig Liver Esterase 06 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE06), sowie
CAO81735.1 (Alternative Pig liver esterase),
GI:576155 (Horse pancreatic lipase Chain A: 1HPL_A),
GI:576156 (Horse pancreatic lipase Chain B: 1HPL_B) und
AAC12774.1 (Esterase aus Bacillus subtilis pdb 1JKM brefeldin A esterase), sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge an ω-Aminohexansäuremethylester bezogen auf die eingesetzte Bezugsenzymmenge zu der entsprechenden ω-Aminocarbonsäure verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Beispiel 1. beschrieben.
Es ist möglich und erfindungsgemäß bevorzugt, dass das jeweilig eingesetzte Enzym E₁ die enzymatische Aktivität des Enzyms E₄ ausüben kann; solche Enzyme sind oben als bevorzugte Enzyme E₁ genannt.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn neben den möglichen Enzymkombinationen gebildet aus E₁ E₂, E₃ und E₄ in Verfahrensschritt B) zusätzlich mindestens ein Enzym E₅ ausgewählt aus Alanindehydrogenasen eingesetzt wird. Es ist eine besondere Stärke der vorliegenden Erfindung, dass diese Ausgestaltung eine reduktionsäquivalentneutrale Reaktionsführung ermöglicht, d.h. die Reaktion läuft ohne Zufuhr oder Entfernung von Elektronen in Form von Reduktionsäquivalenten ab, da die von der Alkoholdehydrogenase im Zuge der Alkoholoxidation erzeugte NAD(P)H bei der Erzeugung von Alanin unter Verbrauch eines anorganischen Stickstoffdonors, bevorzugt Ammoniak oder eine Ammoniakquelle, verbraucht wird. Das Alanin wiederum kann von der anwesenden Transaminase verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Alanindehydrogenase“, wie hierein verwendet, ein Enzym verstanden, das die Umwandlung von L-Alanin unter Verbrauch von Wasser und NAD(P)⁺ zu Pyruvat, Ammoniak und NAD(P)H katalysiert. Bevorzugt handelt es sich bei der Alanindehydrogenase um eine intrazelluläre Alanindehydrogenase. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym E₅ ausgewählt aus der Gruppe:
Alanin Dehydrogenase aus Bacillus subtilis (NP_391071.1)
Rhizobium leguminosarum (YP_0029754337.1)
Bacillus megaterium (YP_003565624.1)
Rhodobacter capsulatus (ADE84249.1)), sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen.
In diesem Zusammenhang bevorzugt eingesetzte Enzymkombinationen sind ausgewählt aus E₁E₂E₅, E₁E₂E₃E₅, E₁E₂E₄E₅, und E₁E₂E₃E₄E₅.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren die jeweiligen Enzyme der möglichen Enzymkombinationen in Form von gentechnisch veränderten Zellen eingesetzt werden, die eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der vorgenannten Enzyme aufweisen.
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Beispiele:
Beispiel 1: Esterasen zur Ringöffnung von ε-Caprolacton in Anwesenheit von Methanol
Methanol (100 µl, 10 % v/v) wurde zu Puffer (870 µl, 100 mM Na₂KPO₄, pH 8.5) hinzugefügt, zusammen mit Enzym (6 mg, rehydriert für 20 min in 30 µl Puffer).
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 6 µl (50 µM) ε-Caprolactons gestartet. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Extraktion mit 600 µl Ethylacetat gestoppt. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase erneut mit 600 µl Ethylacetat extrahiert und die beiden gesammelten organischen Phasen anschließend vereinigt, mit Na₂SO₄ getrocknet und über GC-MS analysiert.
Als Enzym wurden die kommerziellen Präparate
Bacillus subtilis „Esterase 008-SD” von Codexis, (NP_388425.1) und
„Esterase horse liver“ eingesetzt.
Bei allen konnte ein Umsatz zu 6-Hydroxyhexansäuremethylester nachgewiesen werden. Die eingesetzte „Esterase horse liver“ ist eine Mischung zweier Isoenzyme XP_003364701.1 und XP_005608328.1 (predicted horse liver esterase), vgl. hierzu Comp. Biochem. Physiol. D: Genomics Proteomics 2009, 4, 54–65.
Beispiel 2: Kombination von Esterase mit Alkoholdehydrogenase und Transaminase
L-Alanin (250 mM) und NH₄Cl (150 mM) wurden in Eppendorf tubes (2 mL) vorgelegt. Der pH-Wert wurde auf 8.5 mit 6 M NaOH aq eingestellt. NAD+ (0.5 mg, 0.6 µmol, in 50 µl H₂O), der Transaminase co-Faktor PLP (0.1 mg, 0.4 µmol, in 50 µl H₂O) und Methanol (100 µl, 10%v/v) wurden zusammen mit 300 µl H₂O hinzugefügt. Danach wurden die jeweiligen Enzyme entsprechend der nachfolgenden Tabelle zugegeben. Für die ADHs (E₂) wurde im Fall der ADH-hT (P42328.1) 100 µL gereinigtes Enzym (0,4 U) zugeben, alternativ wurde die 6-hydroxyhexanoate dehydrogenase (chnD) aus Arthrobacter sp. BP2 (AY123972.1) eingesetzt. Von der Transaminase (E₃) wurden im Falle der Transaminase 20 mg lyophilisierte Zellen zugegeben. Bei den zwei eingesetzten Transaminasen handelt es sich um Transaminase aus Ralstonia eutropha (RalEu) (YP_917746.1) und Transaminase aus Paracoccus denitrificans (TA_ParDen) (YP_917746.1). Von der Esterase (E₁) aus Bacillus subtilis (008) (NP_388425.1) und aus horse liver (HL) (XP_003364701.1 und XP_005608328.1) wurden 15 µL (10 U laut Hersteller) des kommerziell erhältlichen Enzyms eingesetzt. Der Versuch wurde bei 30 °C und 120 rpm für 18 h bei pH 7.8–8.5 (eingestellt mit 6 M NaOH) durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des ε-Caprolactons gestartet (6µl, 50 mM). Nach 5 min wurde der pH durch Zugabe von NaOH (6 M, 12 µl) auf 7,5–8,5 erhöht.
Die Ergebnisse der Reaktion mit der beschriebenen Enzymkaskade sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst.

Nr. E₁ E₂ E₃ 6-aminohexanoic acid^[a] [%]

1a 008 chnD RalEu ~7

1b HL 2

2a 008 hT 2

2b HL 2

3a 008 hT TA_ParDen ~40

3b HL ~75

^[a] 6-aminohexanoic acid und -ester sind in der Analytik nicht zu unterscheiden.
Beispiel 3: Einfluss von Methanol-Konzentration und Temperatur
Alanin (250 mM) wurde in einem Eppendorf Tube (2 mL) vorgelegt. Puffer wurde hinzugefügt (Na₂HPO₄/KH₂PO₄ 300 mM, pH 8.0, 300 µl). NH₄Cl wurde hinzugefügt (50 µl, 267.1 mg in 1.25 mL H₂O gelöst und supplementiert mit 20 µl 6 M NaOH aq). NAD+ (0.3 mg, gelöst in 50 µl Puffer) und PLP (0.05 mg gelöst in 50 µl Puffer; 1 mg/mL Stocklösung) wurden hinzugefügt. Die Mischungen wurden bis zur homogenen Lösung bei 37 °C 120 rpm für ca.10 min geschüttelt. Der Einfluss des Co-Solvents Methanol wurde auf die Umsetzung von ε-Caprolacton zu 6-aminohexansäure untersucht. Von der Transaminase (TA_ParDen) wurden 20 mg lyophilisierte Zellen für 15 min rehydratisiert. Von der ADH-hT wurden 100 µL, entsprechend einer Aktivität von 0.4 U auf das Substrat 6-hydroxyhexansäure eingesetzt. Von der AlaDH aus Bacillus subtilis (NP_388425.1) wurden 10 µL mit einer Aktivität von 0.22 U für Alanin als Substrat eingesetzt. Von der Esterase PLE03 wurden 2 mg, entsprechend einer Aktivität von 0.66 U zugegeben. Zusätzlich wurden NH₄Cl (8 mg, 150 mM), Alanin (22.3 mg, 250 mM), PLP (0.05 mg, 0.18 +mM), NAD (0.5 mg, 0.75 mM) zugegeben. Die Versuchsbedingungen waren 30 °C, 120 rpm, 18 h, pH 7.8–8.5 (eingestellt mit 6M NaOH). Der Versuch wurde durch Zugabe des Eduktes (6 µL ε-Caprolacton (50 mM)) gestartet
Die folgende Tabelle zeigt, dass mit steigender MeOH-Konzentration eine Bildung von 6-Aminohexansäure begünstigt wird.

MeOH v/v [%] 6-Hydroxyhexanoic acid [%] 6Aminohexanoic acid [%]

2 0 78 22

3 0 65 35

5 0 57 43

10 0 49 51

Zur Untersuchung des Einflusses des pH-Wertes wurden zwei verschieden Puffersysteme analog zu oben genanntem Beispiel getestet, Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Entry	MeOH v/v [%]	pH	Buffer (mM)	ε-Caprolacton	6-Hydroxyhexanoic acid + Ester [%]	6-Aminohexanoic acid + Ester [%]
1	2	6.8–7.4	PIPES (120)	0	87	13
2	5	6.8–7.4	PIPES (120)	0	85	15
3	10	6.8–7.4	PIPES (120)	0	78	22
4	15	6.8–7.4	PIPES (120)	0	73	27
5	2	6.8–7.4	PO₄ (120)	0	86	14
6	5	6.8–7.4	PO₄ (120)	0	80	20
7	10	6.8–7.4	PO₄ (120)	0	71	29
8	15	6.8–7.4	PO₄ (120)	0	65	35

Zusätzlich wurde der Einfluss der Temperatur, ebenfalls mit dem beschriebenen Versuchssetup untersucht:

Entry	MeOH v/v [%]	pH	Temp. [°C]	ε-Caprolactone [%]	6-Hydroxyhexanoic acid + Ester [%]	6-Aminohexanoic acid + Ester [%]
1	20	6.8–7.4	30	0	76	24
2	25	6.8–7.4	30	16	74	10
3	10	6.8–7.4	37	0	80	20
4	15	6.8–7.4	37	2	64	34
5	20	6.8–7.4	37	13	76	11
6	20	8.7–9.0	30	19	76	5

Analoge Ergebnisse mit Bacillus subtilis 008 SD als E₁:

Entry	MeOH v/v [%]	Temp. [°C]	ε-Caprolacton	6-Hydroxyhexanoic acid [%]	6Aminohexanoic acid [%]
1	15	30	0	60	40
2	20	30	0	75	25
3	30	30	27	64	9
4	35	30	33	67	0
5	15	37	0	63	37
6	20	37	2	96	2
7	30	37	30	70	0

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 2222844 [0021, 0022]
WO 2013011018 [0021, 0022]
EP 2557176 [0022]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Macromolecules, 1995, 28, 73–78 [0002]
Macromolecules, 2004, 37, 2450–2453 [0002]
Macromolecules 2006, 39, 7967–7972 [0002]
ISO 4319 (1977) [0014]
Journal of Cheminformatics 2013, 5:39 doi:10.1186/1758-2946-5-39 [0016]
Protein Eng. (1992) 5 (5): 373–375. doi: 10.1093/protein/5.5.373 [0016]
Comp. Biochem. Physiol. D: Genomics Proteomics 2009, 4, 54–65 [0031]

Claims

Verfahren umfassend die Verfahrensschritte A) Bereitstellen mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel I)
mit X = zweibindiger organischer Rest umfassend 1 bis 19 Kohlenstoffatome B) In Kontakt Bringen der Verbindung der allgemeinen Formel I) mit einem Enzym E₁ ausgewählt aus der Gruppe Esterasen der EC 3.1, Lipasen der EC 3.1.1 und Lactonasen der EC 3.1.1, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in Anwesenheit mindestens eines aliphatischen Alkohols umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituierten Alkylengruppen, bevorzugt -(CH₂)-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₆- und -(CH₂)₇-, besonders bevorzugt -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃- und -(CH₂)₄-,
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der aliphatische Alkohol ausgewählt ist Methanol, Ethanol, Propanol, Ispopropanol und Butanol, wobei Methanol besonders bevorzugt ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der aliphatische Alkohol in Verfahrensschritt B) in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 60 Gew.-%, bevorzugt von 10 Gew.-% bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt von 12 Gew.-% bis 30 Gew.-% eingesetzt wird, wobei sich die Gewichtsprozente auf den Gesamtreaktionsansatz beziehen.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in wässriger Umgebung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C, bevorzugt von 15 °C bis 60 °C, besonders bevorzugt von 25 °C bis 40 °C; durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) in einem pH-Bereich von 3 bis 11, bevorzugt von 5 bis 9, besonders bevorzugt von 6,5 bis 8; durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym E₁ ausgewählt ist aus der Gruppe XP_003364701.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X2), XP_005608328.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X3), NP_388425.1 (Esterase 008 SD Bacillus subtilis), Pig Liver Esterase 03 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE03), Pig Liver Esterase 06 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE06), sowie CAO81735.1 (Alternative Pig liver esterase), GI:576155 (Horse pancreatic lipase Chain A: 1HPL_A), GI:576156 (Horse pancreatic lipase Chain B: 1HPL_B) und AAC12774.1 (Esterase aus Bacillus subtilis pdb 1JKM brefeldin A esterase), sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt B) mindestens ein Enzym ausgewählt aus E₂, E₃ und E₄ eingesetzt wird, wobei das Enzym E₂ die Umsetzung von ω-Hydroxycarbonsäureestern zu den entsprechenden ω-Oxocarbonsäureestern katalysiert, das Enzym E₃ die Umsetzung von ω-Oxocarbonsäureestern zu den entsprechenden ω-Aminocarbonsäureestern katalysiert und das Enzym E₄ die Umsetzung von ω-Aminocarbonsäureestern zu den entsprechenden die Enzyme ω-Aminocarbonsäuren katalysiert.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt B) eine Enzymkombination ausgewählt aus E₁E₂, E₁E₃, E₁E₄, E₁E₂E₃, E₁E₃E₄, E₁E₂E₄ und E₁E₂E₃E₄ eingesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass E₂ ausgewählt ist aus Alkanmonooxygenasen, Alkoholdehydrogenasen und Alkoholoxidasen.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass E₃ ausgewählt ist aus ω-Transaminasen.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass E₄ ausgewählt ist aus der Gruppe XP_003364701.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X2), XP_005608328.1 (predicted equus caballus carboxylesterase isoform X3), NP_388425.1 (Esterase 008 SD Bacillus subtilis), Pig Liver Esterase 03 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE03), Pig Liver Esterase 06 (kommerziell erhältlich von Enzymicals als ECS-PLE06), sowie CAO81735.1 (Alternative Pig liver esterase), GI:576155 (Horse pancreatic lipase Chain A: 1HPL_A), GI:576156 (Horse pancreatic lipase Chain B: 1HPL_B) und AAC12774.1 (Esterase aus Bacillus subtilis pdb 1JKM brefeldin A esterase), sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Enzyme der Enzymkombinationen ausgewählt aus E₁, E₁E₂, E₁E₃, E₁E₄, E₁E₂E₃, E₁E₃E₄, E₁E₂E₄ und E₁E₂E₃E₄ in Form von gentechnisch veränderten Zellen eingesetzt werden, die eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der vorgenannten Enzyme aufweisen.