DE3903759C2

DE3903759C2 -

Info

Publication number: DE3903759C2
Application number: DE3903759A
Authority: DE
Inventors: Franz Prof. Dr. Lingens; Renate 7000 Stuttgart De Bauder; Hartmut Dipl.-Biochem. Dr. 4620 Castrop-Rauxel De Hoeke
Original assignee: Ruetgerswerke AG
Current assignee: WEYL GmbH 68305 MANNHEIM DE
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1989-02-09
Publication date: 1992-03-12
Also published as: DE3903759A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Oxochinolin aus Chinolin sowie auf das dazu notwendige Enzym.

2-Oxochinolinderivate werden als Weißmacher für Textilien verwendet. In der Medizin spielen sie eine Rolle als Herztherapeutika, Antihistaminika, Adrenalinantagonisten, Malariamittel, Chemotherapeutikum und werden als Arzneimittel zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation verwendet.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene chemische Verfahren zur Herstellung von 2-Oxochinolin entwickelt. Sie reichen von der direkten Hydroxylierung von Chinolin durch Kaliumhydroxyd bei erhöhter Temperatur (Ber. dt. Chem. Ges., 56, 1879, 1923) bis zur Cyclisierung von o-Aminozimtsäure (Ber. dt. Chem. Ges., 18, 2395, 1885) o-Acetaminobenzaldehyd (Beilstein 21 H, 77, E III/IV 1057) oder 2-N-Acetaminobromstyrol (Heterocycles, 13, 329-32, 1979).

Ein Nachteil der herkömmlich durchgeführten chemischen Synthesen besteht in zum Teil geringen Produktausbeuten und in der Bildung von unerwünschten Nebenprodukten, die in aufwendigen Reinigungsverfahren entfernt werden müssen, da für die Herstellung von Arzneimitteln hochreine Produkte verwendet werden müssen.

Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Umsetzung von Chinolin in 2-Oxochinolin mit hoher Produktspezifität, Isomerenreinheit und hoher Ausbeute zu entwickeln.

Erreicht wird dieses Ziel durch ein Verfahren zur Herstellung von 2-Oxochinolin aus Chinolin, durch das Chinolin mit Hilfe von Chinolin-Oxidoreduktase in Anwesenheit eines Elektronenakzeptors aus der Gruppe Phenazinmethosulfat, Methylenblau, Dichlorphenolindophenol, Kaliumhexacyanoferrat(III) und Nitroblautetrazoliumsalz in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 und einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 35°C umgesetzt wird.

Üblicherweise wird der eingesetzte Elektronenakzeptor in gleicher stöchiometrischer Menge wie das umzusetzende Chinolin eingesetzt. Wird jedoch Methylenblau als Elektronenakzeptor verwendet, kann dieses in einer Menge eingesetzt werden, die kleiner ist als die entsprechende stöchiometrische Menge des Chinolins, und während der Umsetzung durch Zuführung von Sauerstoff regeneriert werden.

Das im Verfahren einsetzbare Enzym kann auf einem Träger fixiert sein.

Als Umsetzungen mit sehr hoher Produktspezifität und Isomerenreinheit sind solche mit Hilfe von Mikroorganismen oder Enzymen bekannt. So kennt man Mikroorganismenkulturen, die mit Chinolin als Kohlenstoffquelle 2-Oxochinolin in der Fermentationsbrühe anreichern (Bennett et al., Microbios Letters, 29, 147-154, 1985; Skukla, Proc. Indian Acad. Sci. (Chem. Sci.), 93 (7), 1143-1153, 1984). Der Angriff von Chinolin durch Mikroorganismen in 2-Stellung erfolgt bevorzugt, da der Heterocyclus durch das freie Elektronenpaar am Stickstoff der reaktivere Ring ist. In Gegenwart von Chinolin-adaptierten, intakten Mikroorganismenzellen bleibt die biologische Reaktion jedoch nicht stehen.

Nach weiteren Hydroxylierungen erfolgt der Abbau des aromatischen Ringsystems und am Schluß die Bildung von CO₂ aus Chinolin.

Andererseits verbleibt die Möglichkeit, das in den Mikroorganismen vorhandene Enzym für diese Umsetzung zu nutzen, sofern das Enzym isoliert werden kann. Die gezielte Umsetzung von Chinolin zu 2-Oxochinolin läßt sich mit intakten Zellen, die zum richtigen Zeitpunkt geerntet werden, mit Mutanten, die im Anschluß an die Hydroxylierung blockiert sind, oder mit dem für die Reaktion verantwortlichen, aus den Zellen isolierten Enzym durchführen.

Bisher konnte weder eine Mutante, bei der der weitere Abbau des hydroxylierten Reaktionsprodukts blockiert ist, erzeugt noch isoliert werden. Daher wurde angestrebt, das für die Umsetzung verantwortliche Enzym zu isolieren. Durch die Verwendung eines Enzyms zur Hydroxylierung kann ein sehr reines Produkt mit hoher Ausbeute gewonnen werden, da in das Medium im Gegensatz zur mikrobiellen Umsetzung keine Stoffwechselprodukte und keine Zell-Lysate abgegeben werden.

Grant und Al-Najjar (Microbios, 15, 177-189, 1976) haben versucht, mit zellfreien Extrakten, gewonnen aus Chinolin abbauenden Mikroorganismen, nachzuweisen, welche Enzyme für die Umsetzung verantwortlich sind. Die Versuche waren jedoch erfolglos, und die Autoren zogen daraus den Schluß, daß das gesuchte Enzym instabil ist.

Überraschenderweise wurde nun bei eigenen Arbeiten mit Zellextrakten gefunden, daß dieses Enzym, Chinolin-Oxidoreduktase, stabil ist, daß es jedoch zu seiner Aktivität eines zusätzlichen Elektronenakzeptors bedarf.

Als verwendbare Elektronenakzeptoren wurden gefunden:

Phenazinmethosulfat, PMS
Methylenblau
Dichlorphenolindophenol, DCPIP
Kaliumhexacyanoferrat (III)
Nitroblautetrazoliumsalz, NBT

NAD⁺ bzw. NADH waren bei den untersuchten Versuchsbedingungen nicht wirksam. Auch andere natürlich vorkommende physiologische Elektronenakzeptoren konnten nicht gefunden werden.

Es kann demnach mittels zellfreier Extrakte von Chinolin abbauenden Mikroorganismen aus Chinolin 2-Oxochinolin hergestellt werden, wenn dem Reaktionsgemisch ein geeigneter Elektronenakzeptor zugegeben wird. Das gesuchte Produkt muß aber noch aufwendig gereinigt werden.

Entsprechende Chinolin abbauende Mikroorganismen können aus Boden-, Wasser- und Klärschlammproben, die nicht Chinolin belastet sind, erhalten werden (Schwarz et. al., System. Appl. Microbiol., 10 (2), 185-190, 1988). Sie wurden als zur Gattung Pseudomonas gehörend identifiziert.

Weiterhin wurde das Enzym Chinolin-Oxidoreduktase mit an sich bekannten Methoden aus den Zellextrakten isoliert. In den Beispielen ist ein Verfahren hierzu beschrieben.

Bevorzugt wurden hierzu Mikroorganismen verwendet, die durch gezieltes Anbieten von Chinolin als Substrat das Enzym stark exprimierten.

Das isolierte Enzym, dem Molybdän als aktivierender Effektor dient, ist eine Substanz mit folgenden Eigenschaften:

- Isoelektrischer Punkt bei
pH 4,3-4,5
- Molekulargewicht:	ca. 124 000 D
- Untereinheiten:	3 verschiedene zu
	74 000 D
	32 000 D
	18 000 D
- prosthetische Gruppen:	Eisen
	säurelabiler Schwefel
	FAD
	Molybdopterin

Das angereicherte Enzym, die Chinolin-Oxidoreduktase, ist im Bereich von -80°C bis +8°C über einen längeren Zeitraum stabil. Für kurze Zeit hält es auch Temperaturen bis 50°C aus.

Das pH-Optimum liegt bei pH 7,5-8,0. Das Enzym ist stabil im Bereich pH 6,0-8,0. Außer einem Elektronenakzeptor benötigt das Enzym keinen zusätzlichen, von außen zugeführten Cofaktor.

Erfindungsgemäß wird demnach Chinolin mit Hilfe des isolierten Enzyms Chinolin-Oxidoreduktase und einem Elektronenakzeptor aus der Gruppe

Phenazinmethosulfat
Methylenblau
Dichlorphenolindophenol
Kaliumhexacyanoferrat (III)
Nitroblautetrazoliumsalz

zu 2-Oxochinolin umgesetzt.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß dieses Enzym am aromatischen Ring substituierte Chinolinderivate, wie z. B. 5-, 6-, 7-, 8-Hydroxy- und 8-Chlorchinolin, ebenfalls in 2-Stellung oxidiert.

Diese Umsetzung kann in rein wäßriger Lösung, wobei alle Reaktionsparameter gelöst vorliegen, erfolgen.

Organische Lösungsmittel wurden nicht getestet.

Fernerhin kann das Enzym an einem festen Träger fixiert sein.

Beim enzymatischen Test wird Nitroblautetrazoliumsalz verwendet, das irreversibel zu Formazan reduziert wird. Die Geschwindigkeit der Formazanbildung kann photometrisch verfolgt werden und ist ein Maß für die Aktivität des Enzyms beziehungsweise für die eingesetzte Enzymmenge. Dabei entspricht 1 U 1 µmol Substratumsatz pro Minute.

Der Testansatz ist 350 µmolar an Chinolin und 500 µmolar an Nitroblautetrazoliumsalz. Während des Tests wird das gesamte Chinolin zu 2-Oxochinolin oxidiert. Für die technische Umwandlung von Chinolin in 2-Oxochinolin kann ein durch Luftsauerstoff autoxidabler Elektronenakzeptor, zum Beispiel Methylenblau, eingesetzt werden.

Beispiel 1 Verfahren zur Züchtung von Pseudomonas putida Stamm 86 mit Chinolin

Die Züchtung wird im 100-l-Bioreaktor mit folgendem Mineralsalzmedium bei pH 7,3 durchgeführt:

K₂HPO₄\|0,79 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,20 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	0,02 g/l
NaCl	1,00 g/l
Spurenelement-Lösung	1,00 ml/l

Die Spurenelement-Lösung besteht aus:

B(OH)₃\|0,50 g/l
CuSO₄ · 5 H₂O	0,04 g/l
FeCl₃ · 6 H₂O	0,20 g/l
MnSO₄ · 7 H₂O	0,40 g/l
(NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4 H₂O	0,20 g/l
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,40 g/l

50 ml = 55 g Chinolin werden insteril zugegeben.

Angeimpft wird mit 5 l einer 16 Stunden alten Vorkultur gleicher Zusammensetzung.

Die Fermentation findet bei einer Temperatur von 30°C und einer Luftzufuhr von 25 l/min statt. Ein Rührwerk sorgt mit 100 Umdrehungen/min für gute Durchmischung. Nach 12 und nach 24 Stunden Fermentationszeit werden nochmals je 50 ml = 55 g Chinolin zugegeben. Ca. 5 Stunden nach der letzten Substratzugabe werden die Zellen mittels einer Durchlaufzentrifuge abzentrifugiert. Zu diesem Zeitpunkt ist Chinolin noch vorhanden, 2-Oxochinolin aber im Medium gut nachweisbar und daher die Chinolin-Oxidoreduktase induziert. Man erhält aus 100 l Medium mit insgesamt 150 ml Chinolin zwischen 230 und 280 g Zellen (Naßgewicht).

Beispiel 2 Verfahren zur Anreicherung und Isolierung der Chinolin-Oxidoreduktase a. Ultraschallzellaufschluß

Ca. 250 g Zellen (Naßgewicht) werden in 250 ml 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0 suspendiert und in 100-ml-Portionen in 30-sec.-Intervallen 15 min lang bei 0°C beschallt. Das Zellhomogenat wird anschließend 40 min mit 48 000 g bei 5°C zentrifugiert. Im trüben Überstand befinden sich durchschnittlich 8000 U Chinolin-Oxidoreduktase in ca. 350 ml Volumen.

b. Hitzebehandlung

Der Enzymrohextrakt wird nun einer Hitzebehandlung unterworfen. Dazu wird der Extrakt im Wasserbad unter ständigem Rühren auf 45°C gebracht und 10 min lang auf dieser Temperatur gehalten. Das ausgefallene Protein wird mit 48 000 g 30 min bei 5°C zentrifugiert. Der nun klare Überstand (ca. 6000 U, 250 ml) wird über Nacht gegen 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5 dialysiert, um den pH-Wert für die anschließende Ammoniumsulfatfällung zu erhöhen

c. Ammoniumsulfatfällung

Zu der dialysierten Proteinlösung wird so viel Ammoniumsulfat zugegeben, daß eine Sättigung von 30% erhalten wird. Das Ammoniumsulfat muß fein pulverisiert sein und wird langsam in kleinen Mengen unter Rühren bei 0°C in die Lösung gestreut. Die gesamte Zugabe dauert ca. 1,5 Stunden. Anschließend wird noch 1 Stunde gerührt und dann mit 30 000 g 30 min zentrifugiert. Die Chinolin-Oxidoreduktase befindet sich nun im Pellet. Dieses wird in ca. 60 ml 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5, der 22% an Ammoniumsulfat gesättigt ist, unter Rühren suspendiert. Die Chinolin-Oxidoreduktase löst sich dabei wieder und kann von nicht gelöstem Fremdprotein mit 30 000 g 30 min abzentrifugiert werden. Der Überstand wird gegen 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,0 dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen, das bei der anschließenden Ionenaustauschchromatographie stört.

Das Volumen nimmt dabei um etwa ein Drittel zu.

d. Ionenaustauschchromatographie

Als Anionenaustauschgel wird Sephadex DE52 verwendet, das 5×10 cm in eine Chromatographiesäule gepackt und mit 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,0 äquilibriert wird. Die Enzymlösung wird mit einer Flußrate von 50 ml/Stunde aufgetragen. Die Chinolin-Oxidoreduktase bindet an den Anionenaustauscher, weil sie bei pH 7,0 negativ geladen ist. Proteine, die bei diesem pH-Wert eine positive Ladung tragen, passieren die Säule, ohne zu binden. Um diese vollständig zu entfernen, wird die Säule mit ca. 800 ml Puffer gespült.

Dann wird ein linearer Natriumchloridgradient von 0 bis 1 M NaCl in einem Gesamtvolumen von 1,6 l angeschlossen und das Eluat fraktioniert (Fraktionsgröße 5 ml). Mit steigender Natriumchloridkonzentration werden die Proteine gegen Chloridionen ausgetauscht. Die Chinolin-Oxidoreduktase wird zwischen 0,4 und 0,5 M NaCl von der Säule eluiert. Fraktionen mit Chinolin-Oxidoreduktaseaktivität werden gesammelt und in einer Konzentrationszelle mit einer XM 100 A Membran auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt. Nach diesem Schritt sind noch ca. 40% der Ausgangsaktivität vorhanden.

e. Gelfiltration

Die konzentrierte Proteinlösung wird auf eine Chromatographiesäule (2,5×100 cm) mit Sephacryl S 300, die mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6,5 äquilibriert ist, aufgetragen. Die Flußrate beträgt 10 ml/Stunde und das Fraktionsvolumen ca. 3 ml. Nach ca. 270 ml wird die Chinolin-Oxidoreduktase von der Säule eluiert. Wieder werden die Fraktionen mit Chinolin-Oxidoreduktaseaktivität gesammelt, auf ca. 5 ml Volumen konzentriert und eingefroren. Am Ende dieses Anreicherungsverfahrens sind noch ca. 2000 U entsprechend 25% an Ausgangsaktivität vorhanden. Die spezifische Aktivität beträgt ca. 10 U/mg, was einer 30fachen Anreicherung entspricht (siehe Tabelle).

Beispiel 3 Analog Fried, R., Fried, L. W. in: H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1, 682-687, 1974

Testvolumen\|1,2 ml
660 µl	100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,8 (Testpuffer)
120 µl	10 mM EDTA pH 7,8
200 µl	1%ige Gelatine (w/v) in Testpuffer
40 µl	0,653 mM Phenazinmethosulfat in Testpuffer
120 µl	5 mM Nitroblautetrazoliumsalz in Testpuffer
50 µl	8,4 mM Chinolin in Testpuffer
10 µl	Enzym-Lösung

Gemessen wird bei 25°C bei 540 nm die Zunahme des reduzierten Nitroblautetrazoliums mit einem Extinktionskoeffizienten von

Die Volumenaktivität wird nach der Formel

berechnet.

1 U entspricht 1 µMol Substratumsatz pro Minute.

Enzym-Reinigung

Beispiel 4 Nitroblautetrazoliumsalz (NBT) als Elektronenakzeptor

Ansatz:
700 µl Testpuffer (100 mM Na₂HPO₄/HCl pH 7,8)
180 µl 1%ige Gelatine in Testpuffer
110 µl NBT in Testpuffer (0,436 mg = 0,534 · 10^-6 mol)
10 µl Chinolinoxidoreduktase (0,13 U)
50 µl Chinolinlösung in Testpuffer (0,05 µl 0,425 · 10^-6 mol)

Chinolin wird dabei in einer Zeit von ca. 5 min vollständig zu 2-Oxochinolin umgesetzt.

Beispiel 5 Methylenblau als autoxidabler Elektronenakzeptor

1 mol Chinolin wird von 2 mol Methylenblau in Anwesenheit von Chinolinoxidoreduktase in 1 mol 2-Oxochinolin umgesetzt. Anstatt Methylenblau in stöchiometrischer Menge einzusetzen, kann es auch im Unterschuß verwendet werden. Folgender Versuch wurde dazu unternommen:

Ansatz:
100 µl Chinolin-Lösung (0,2 µl Chinolin = 1,7 · 10^-6 mol)
100 µl Methylenblau-Lösung (0,24 mg = 0,68 · 10^-6 mol)
780 µl Testpuffer (100 mM Na₂HPO₄/HCl pH 7,8)
20 µl Chinolinoxidoreduktase-Lösung (0,26 U)

Methylenblau ist dabei im 5fachen Unterschuß eingesetzt. Zur besseren Autoxidation des Methylenblaus wurde die Reaktionslösung mit Preßluft begast. Die vollständige Umsetzung von Chinolin in 2-Oxochinolin dauert mit diesem Ansatz ca. 30 min. Dabei ist die Autoxidation des Methylenblaus der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 2-Oxochinolin aus Chinolin, dadurch gekennzeichnet, daß Chinolin mit Hilfe von Chinolin-Oxidoreduktase in Anwesenheit eines Elektronenakzeptors aus der Gruppe Phenazinmethosulfat, Methylenblau, Dichlorphenolindophenol, Kaliumhexacyanoferrat(III) und Nitroblautetrazoliumsalz in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 und einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 35°C umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronenakzeptor in gleicher stöchiometrischer Menge wie das Chinolin eingesetzt wird.

3. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Methylenblau in einer Menge eingesetzt wird, die kleiner ist als die entsprechende stöchiometrische Menge des Chinolin und daß das Methylenblau während der Umsetzung mit Hilfe von Sauerstoff wieder regeneriert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf einem Träger fixiert eingesetzt wird.

5. Chinolin-Oxidoreduktase in isolierter Form mit folgenden Eigenschaften:

a) Molybdän dient als aktivierender Effektor;
b) Molekulargewicht: ca. 124 000 D;
c) Untereinheiten: 3 verschiedene zu 74 000 D, 32 000 D und 18 000 D;
d) isoelektrischer Punkt bei pH 4,3 bis 4,5;
e) prosthetische Gruppen: Eisen, säurelabiler Schwefel, FAD und Molybdopterin;
f) pH-Optimum bei pH 7,5 bis 8,0;
g) stabil im Bereich pH 6,0 bis 8,0;
h) außer einem Elektronenakzeptor aus der Gruppe Phenazinmethosulfat, Methylenblau, Dichlorphenolindophenol, Kaliumhexacyanoferrat(III) und Nitroblautetrazoliumsalz benötigt das Enzym keinen zusätzlichen, von außen zugeführten Cofaktor;
i) das angereicherte Enzym ist im Bereich von -80°C bis +8°C über einen längeren Zeitraum stabil und für kurze Zeit hält es auch Temperaturen bis 50°C aus.