DE2751879C2

DE2751879C2 -

Info

Publication number: DE2751879C2
Application number: DE19772751879
Authority: DE
Inventors: Toru Atsugi Kanagawa Jp Nakanishi; Yozo Machida Tokio/Tokyo Jp Machida; Kenichiro Atsugi Kanagawa Jp Takayama; Shoji Tokio/Tokyo Jp Adachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-11-19
Filing date: 1977-11-21
Publication date: 1988-08-25
Also published as: GB1592413A; DE2751879A1; CA1096797A; FR2375323A1; FR2375323B1

Description

Bekanntlich wird eine Cholinoxidase durch Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter erzeugt, die die Umwandlung von Cholin-chlorid in Betain beschleunigt. Bei dieser Umwandlung entsteht Wasserstoffperoxid. Ein Verfahren zur Bestimmung von Cholin durch Messung der entstandenen Menge an Wasserstoffperoxid ist ebenfalls bekannt; vgl. Rinsho Byori (Clinical Pathology); Bd. 24 (1976), S. 461.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Cholinoxidase zu schaffen, die die Oxidation von Cholin zu Betainaldehyd und von Betainaldehyd zu Betain beschleunigt. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei der Züchtung eines Stammes von Brevibacterium album in einem Nährmedium erhebliche Mengen an Cholinoxidase in der Kulturbrühe gebildet werden. Die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase kann zur Bestimmung von Cholin verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Fig. 1 gibt das Dünnschichtchromatogramm der Reaktionslösung wieder, die bei der Oxidation von Cholin mit der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase erhalten wird.

Fig. 2 zeigt die Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase. Die Kurven (A), (B), (C) und (D) geben die relative Aktivität des aus den Zellen von Brevibacterium album KY 4319 (NRRL B-11 046) (A) im Vergleich mit Corynebacterium murisepticum KY 3505 (B), Corynebacterium cholinoxidans KY 4707 (C) und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 (D) isolierten Enzyms wieder. In den nachfolgenden Figuren haben (A), (B), (C) und D) die gleiche Bedeutung, wie sie vorstehend angegeben ist.

Fig. 3 zeigt das pH-Optimum der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Fig. 4 zeigt das Temperaturoptimum der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Fig. 5 zeigt den Bereich der Temperaturstabilität der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Fig. 6 zeigt die stabilisierende Wirkung von EDTA auf die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Brevibacterium album KY 4319 (NRRL B-11046) und Brevibacterium cerinum KY 4320 sowie diejenigen von Corynebacterium murisepticum KY 3505 sind in den US-PSen 32 22 258 und 36 30 842 beschrieben.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet werden, sofern es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und geringe Mengen anderer Nährstoffe enthält, die für den hier verwendeten Stamm erforderlich sind.

Als Kohlenstoffquelle kommen bevorzugt Cholin und dessen Salze, jedoch auch Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose oder Melassen, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine oder Kerosin, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure oder Fumarsäure, oder Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, in Frage.

Als Stickstoffquellen können Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat, Harnstoff, Mononatriumglutamat, Glykokoll, Mononatriumaspartat, Cholin und andere stickstoffhaltige Verbindungen, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl, Sojabohnenmehl oder andere stickstoffhaltige organische Substanzen verwendet werden.

Beispiele für verwendbare anorganische Salze sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Kaliumchlorid und Calciumcarbonat.

Spezielle Nährstoffe zur Vermehrung des Mikroorganismus, wie Biotin oder Thiamin, können dem Nährmedium im Bedarfsfall in entsprechender Menge zugesetzt werden. In einigen Fällen können die stickstoffhaltigen organischen Verbindungen, die als Stickstoffquelle verwendet werden, auch als Quelle für die erforderlichen Nährstoffe dienen. Bei Verwendung derartiger stickstoffhaltiger organischer Verbindungen ist es deshalb nicht nötig, die erforderlichen Nährstoffe dem Nährmedium gesondert zuzusetzen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bildung von Cholinoxidase durch Zusatz von Cholin oder dessen Salz zum Nährmedium zur Induktion der Bildung von Cholinoxidase erhöht. Beispiele für als Kohlenstoffquelle und Induktionsmittel verwendbare Cholinsalze sind Cholin-chlorid, Cholin-bromid, Cholin-bicarbonat, Cholin- citrat und Cholin-ascorbat. Bei Verwendung von Cholin oder dessen Salz als Induktionsmittel beträgt die Konzentration im Nährmedium 7 bis 800 mMol/Liter, berechnet als Cholin-chlorid. Der Zusatz von Cholin oder dessen Salz kann zu Beginn oder während der Fermentation erfolgen. Beim Zusatz von Cholin oder dessen Salz während der Fermentation wird die Zugabe vorzugsweise gegen Ende der logarithmischen Wachstumsphase des Mikroorganismus beendet.

In dem nachstehenden Vergleichsbeispiel wird die Bestimmung eines bevorzugten Mengenbereichs des dem Nährmedium zuzusetzenden Induktionsmittels erläutert.

Die Aktivität der Cholinoxidase im Beispiel und Vergleichsbeispiel wird anhand der Oxidation von Cholin mit Cholinoxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid, Zersetzung des Wasserstoffperoxids mit Peroxidase in Gegenwart von Phenol und 4-Aminoantipyrin zur Bildung eines Farbstoffs und Messung der Absorption der Farbstofflösung bestimmt. Einzelheiten der Bestimmung sind nachstehend angegeben.

Es wird eine 0,05 Mol/Liter Tris-Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt, die 0,01 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,1 Mol/Liter Phenol und 5000 E/Liter Peroxidase enthält. Diese Lösung dient als Farbbildner. 3 ml der Farbbildnerlösung werden zur Bestimmung der Aktivität mit 0,1 ml Enzymlösung sowie 0,1 m l einer 1/30 Mol/Liter Cholin-chlorid-Lösung versetzt. Die Reaktion wird 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann wird die Absorption der Lösung bei 500 nm bestimmt. Die Menge des umgesetzten Cholin-chlorids wird aufgrund des gemessenen Wertes berechnet. Die Enzymaktivität wird ausgedrückt durch "E". Eine Einheit ist definiert als diejenige Menge Enzym, die 1 µMol Cholin in 1 Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zersetzt.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Brevibacterium album KY 4319 (NRRL B-11046) wird als Einsaatstamm verwendet. 10 ml eines Einsaatmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung werden in ein 70 ml fassendes Reagensglas gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Zusammensetzung des Einsaatmediums:
Cholin-chlorid 2 g/dl, Maisquellwasser 0,5 g/dl, Hefeextrakt 0,5 g/dl, Mononatriumglutamat 0,5 g/dl, K₂HPO₄ 0,1 g/dl, MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g/dl; pH-Wert 7,2.

Eine Platinöse des Stammes wird in das Einsaatmedium überimpft und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird die erhaltene Kulturbrühe in 30 ml des gleichen Einsaatmediums in einem 2 Liter umfassenden Erlenmeyerkolben übertragen und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet.

Die gesamte erhaltene Kulturbrühe wird erneut in 3,0 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie das Einsaatmedium in einem 5 Liter fassenden Fermenter übertragen. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30°C unter Belüftung mit 1 Liter/Liter Medium/Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,62 E/ml Cholinoxidase angereichert.

Aus der Kulturbrühe werden die Zellen abgeschleudert. Die Zellen werden in 1 Liter eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit einer Dyno-Laboratoriumsmühle (KDL-Typ) behandelt. Es wird ein Gemisch mit aufgebrochenen Zellen erhalten. Sodann wird das Gemisch abgeschleudert. Es wird ein Überstand erhalten. Die vorstehend erwähnte Menge des Enzyms in der Kulturbrühe wird berechnet, bezogen auf die Cholinoxidase-Aktivität des Überstands. Der Überstand wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 30% versetzt. Es bildet sich eine Fällung. Das erhaltene Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60% versetzt. Die erhaltene Fällung wird abzentrifugiert und in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen den gleichen tris-Puffer 15 Stunden bei 5°C unter Verwendung eines Cellophanschlauchs dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung auf eine Säule mit 1 Liter DEAE- Cellulose gegeben, die mit 0,05 Mol/Liter tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,05 Mol/Liter Natriumchlorid äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen des Harzes mit 1 Liter 0,05 Mol/Liter tris-Puffer (pH 8,0), der 0,05 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, wird eine Gradienteneluierung mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer durchgeführt, der Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,05 bis 0,45 Mol/Liter enthält.

Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60% versetzt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert und in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösung wird auf eine Kolonne mit 500 ml Sephadex G-150 gegeben, die mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) äquilibriert worden ist.

Die Eluierung wird mit dem gleichen Puffer wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60% versetzt. Die erhaltene Fällung wird abzentrifugiert und in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösung wird gegen den gleichen Puffer 15 Stunden bei 5°C unter Verwendung eines Cellophanschlauchs dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung auf eine Kolonne mit 500 ml DEAE Sephadex A-50 gegeben, der mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,1 Mol/Liter Natriumchlorid äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen des Harzes mit 500 ml 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0), der 0,1 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, wird eine Gradienteneluierung mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer durchgeführt, der Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Mol/Liter enthält. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und 15 Stunden mittels eines Cellophanschlauchs gegen 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung gefriergetrocknet. Es wird Cholinoxidase in einer Ausbeute von etwa 10% erhalten. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 2,2 E/mg Protein.

Vergleichsbeispiel

In diesem Versuch werden Brevibacterium album KY 4319 (Erfindung), sowie teilweise Corynebacterium murisepticum KY 3505 (NRRL B-11049), Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 (NRRL B-11158) und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 (NRRL B-11157) verwendet. 10 ml Anteile eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung werden in 70 ml fassende Reagenzgläser gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Cholin-chloridKonzentration in Tabelle I angegeben

Maisquellwasser0,5 g/dl Hefeextrakt0,5 g/dl K₂H PO₄0,1 g/dl MgSO₄ · 7H₂O0,05 g/dl Mononatriumglutamat (pH 7,2)0,5 g/dl

Eine Platinöse der vorstehend genannten Stämme wird gesondert in das Nährmedium in den Reagensgläsern überimpft und 24 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Kulturbrühen zentrifugiert. Die erhaltenen mikroben Zellen werden in 10 ml 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert und mit Ultraschall aufgebrochen. Das erhaltene Gemisch wird abgeschleudert und die Aktivität der Cholinoxidase im Überstand bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und Rühren, durchgeführt. Die geeignete Temperatur zur Züchtung liegt bei 25 bis 35°C. Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung vorzugsweise auf einen Wert von 7,0 bis 8,5 eingestellt. Gewöhnlich hat sich nach 1- bis 3tägiger Züchtung eine beträchtliche Menge an Cholinoxidase in der Kulturbrühe, hauptsächlich in den Zellen, angesammelt.

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen von der Kulturbrühe abgetrennt, beispielsweise abgeschleudert und aufgebrochen, beispielsweise mittels Ultraschall. Das erhaltene Gemisch der Zelltrümmer wird abgeschleudert. Aus dem Überstand kann Cholinoxidase nach verschiedenen Verfahren zur Reinigung von Enzymen isoliert werden, beispielsweise durch Aussalzen, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, Dialyse, Spulenchromatographie an Dextrangel (Sephadex) Säulenchromatographie an Ionenaustauschern oder Cellulose.

Die enzymatischen Eigenschaften der hergestellten Cholinoxidasen sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Die enzymatischen Eigenschaften in Tabelle II werden nach folgenden Methoden bestimmt.

(1) Wirkung

In den nachstehend geschilderten Versuchen (1) und (2) wird Cholinoxidase aus Brevibacterium album KY 4319 verwendet. Die gleichen Ergebnisse werden mit Cholinoxidase der anderen Stämme erhalten.

Versuch (1)

Identifizierung der Produkte der enzymatischen Reaktion durch Dünnschichtchromatographie.

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 17,0 E/ml gelöst. 0,1 ml der Lösung, 3,0 ml eines 0,2 Mol/Liter Borat-Puffers vom pH-Wert 9,0, 5 ml einer 1 Mol/Liter wäßrigen Lösung von Cholin-chlorid und 5 mg Peroxidase werden miteinander vermischt und 15 Stunden bei 30°C unter Schütteln umgesetzt. Die nachstehend angegebenen Probelösungen einschließlich der vorstehend aufgeführten Reaktionslösung werden in einer Menge von jeweils 5 µl auf eine mit Cellulose beschichtete Dünnschichtchromatographieplatte (20 × 20 cm) aufgetragen.

Probelösungen:

(a) 0,1 Mol/Liter wäßrige Lösung von Cholin-chlorid
(b) 0,1 Mol/Liter wäßrige Lösung von Betain
(c) 0,13 Mol/Liter wäßrige Lösung von Betainaldehyd
(d) Reaktionslösung
(e) Gemisch der Reaktionslösung und 0,1 Mol/Liter wäßrige Lösung von Betain (Volumverhältnis 1 : 1).
(f) Gemisch der Reaktionslösung und einer 0,13 Mol/Liter wäßrigen Lösung von Betainaldehyd (Volumverhältnis 1 : 1).

Die Entwicklung wird mit einem Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser (Volumverhältnis 18 : 1 : 1) durchgeführt. Nach der Entwicklung wird die Platte an der Luft getrocknet und einmal in Dragendorff's Reagens eingetaucht; vgl. Karel Macek, Pharmaceutical Applications of Thin-layer and Paper Chromatography, Elsevier Publishing Co., Amsterdam-London-New York, 1972, S. 659. Hierauf wird die Platte an der Luft getrocknet und zur Farbentwicklung mit verdünnter Schwefelsäure besprüht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß als Produkte der enzymatischen Oxidation von Cholin Betainaldehyd und Betain anfallen.

Versuch (2)

Sauerstoffaufnahme und Wasserstoffperoxid-Bildung bei der enzymatischen Reaktion mit Cholin-chlorid und Betainaldehyd.

Teil 1 - Sauerstoffaufnahme
0,5 ml einer wäßrigen Lösung des Substrats (mit Cholin- chlorid oder Betainaldehyd in der in Tabelle III angegebenen Menge) und 1,0 ml eines 0,2 Mol/Liter Boratpuffers (pH-Wert 8,0) mit 0,01 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,01 Mol/Liter Phenol und 50 mg/Liter Peroxidase werden in den Hauptbehälter eines Warburg-Gefäßes gegeben. Ferner werden 0,5 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers (pH-Wert 8,0) mit 1,5 E/ml Cholin- oxidase in den Seitenarm gegeben. Die Reaktion wird bei 37°C durchgeführt. Während der Umsetzung wird die aufgenommene Sauerstoffmenge in regelmäßigen Zeitabständen bestimmt. Die Umsetzung ist innerhalb 30 bis 40 Minuten beendet. Das Molverhältnis von aufgenommenem Sauerstoff (µMol) zur Menge des eingesetzten Substrats (µMol) ist in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Teil 2 - Bildung von Wasserstoffperoxid
Als Farbbildnerlösung wird ein Gemisch von 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,001 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,001 Mol/Liter Phenol und 50 mg/Liter Peroxidase verwendet. 1,9 ml der Farbbildnerlösung werden mit 0,1 ml einer wäßrigen Lösung des Substrats (die Cholin-chlorid oder Betainaldehyd in der in Tabelle IV angegebenen Menge enthält), 0,2 ml 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 3,5 E/ml Cholinoxidase und 0,8 ml Wasser versetzt. Die Umsetzung wird 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 500 nm gemessen. Die Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids wird auf Grund des Meßwertes berechnet. Das Molverhältnis der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids (µMol) zur Menge des eingesetzten Substrats (µMol) ist in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß die Menge des durch 1 Mol Cholin-chlorid verbrauchten Sauerstoffs 1,87 bis 1,91 Mol beträgt. Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß die Menge des aus 1 Mol Cholin-chlorid erzeugten Wasserstoffperoxids 1,67 bis 1,80 Mol beträgt. Daraus kann geschlossen werden, daß aus 1 Mol Cholin-chlorid unter Verbrauch von 2 Mol Sauerstoff 2 Mol Wasserstoffperoxid gebildet werden. Es ist ferner daraus zu schließen, daß aus 1 Mol Betainaldehyd unter Verbrauch von 1 Mol Sauerstoff 1 Mol Wasserstoffperoxid gebildet wird.

Aus den Ergebnissen der Versuche (1) und (2) ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase die in Tabelle II angegebene Wirkung besitzt.

(2) Stabiler pH-Bereich

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,5, 0,9, 1,4 und 1,4 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706) 0,5 ml Anteile der Lösung werden mit jeweils 1 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers unterschiedlichen pH-Werts zur Herstellung von Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert zwischen 5 und 10 vermischt. Die erhaltenen Lösungen werden 30 Minuten auf 45°C erwärmt. Sodann wird die Cholinoxidase bestimmt. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die höchste Enzymaktivität unter den mit den Lösungen unterschiedlichen pH-Werts erhaltenen Aktivitäten zu 100 angenommen wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt.

In Fig. 2 (A), (B), (C) und (D) sind die Versuchsergebnisse der Enzyme aus den Zellen von Brevibacterium album KY 4319, Corynebacterium murisepticum KY 3505, Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 zusammengefaßt. Die entsprechenden Versuchsergebnisse sind in den weiteren Figuren zusammengefaßt.

(3) Optimaler pH-Bereich für die Reaktion

Ein 4 ml Reaktor zur Bestimmung der Sauerstoffabsorption wird im Falle von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706 auf eine bestimmte Temperatur eingestellt, nämlich auf 30, 30, 37 und 37°C. Sodann wird eine Sauerstoffelektrode eingesetzt.

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (2,3, 1,2, 1,6 und 1,6 E/ml im Falle von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 KY 4706). 0,1 ml der erhaltenen Enzymlösung, 0,1 ml einer 0,1 Mol/Liter wäßrigen Cholin- chloridlösung und 3,6 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers mit unterschiedlichem pH-Wert zwischen 6 und 11 werden in den Reaktor gegossen und gerührt. Die Konzentration des in der Lösung gelösten Sauerstoffs wird kontinuierlich aufgezeichnet. Die Abnahme der Sauerstoffkonzentration im Zeitraum zwischen 30 Sekunden und 3 Minuten nach Beginn der Reaktion wird berechnet. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die maximale Abnahme unter den mit den Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert erhaltenen Abnahmen als Enzymaktivität 100 definiert wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 zusammengefaßt.

(4) Optimaler Temperaturbereich zur Reaktion

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,2, 0,5 und 0,5 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 4707 und KY 4706). Die erhaltenen Lösungen werden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Cholinoxidase untersucht, wobei die Reaktion bei verschiedenen Temperaturen zwischen 20 und 60°C durchgeführt wird. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die höchste Enzymaktivität unter den bei den verschiedenen Temperaturen erhaltenen Aktivitäten zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 zusammengefaßt.

(5) Substratspezifität

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,5, 0,4, 0,9 und 0,9 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706). Die erhaltenen Lösungen werden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Cholinoxidase untersucht, jedoch werden verschiedene andere Substanzen als Cholin-chlorid, die in Tabelle II angegeben sind, als Substrat verwendet. Die relativen Enzymaktivitäten gegenüber den verschiedenen Substanzen werden berechnet, wobei die Enzymaktivität gegenüber Cholin-chlorid zu 100 gesetzt wird.

(6) Stabiler Temperaturbereich

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 2,2 E/ml gelöst. Anteile der erhaltenen Lösung werden 30 Minuten auf 30, 40, 45, 50, 55, 60 und 65°C erwärmt und sodann abgekühlt. Die abgekühlten Lösungen werden auf Cholinoxidase untersucht. Die realtiven Enzymaktivitäten bei den verschiedenen Temperaturen werden berechnet, wobei die Enzymaktivität bei 30°C zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengefaßt. Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß bei 30minütiger Behandlung bei 65°C ein Aktivitätsverlust von 84% eintritt.

(7) Stabilisatoren

Cholinoxidase und EDTA werden in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 in einer Konzentration von 2,2 E/ml bzw. 10^-3 Mol/Liter gelöst. Davon getrennt wird Cholinoxidase in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 2,2 E/ml gelöst (Kontrollprobe). Die erhaltenen Lösungen werden als solche oder nach dem Erwärmen auf 45°C während 15, 30, 40 oder 60 Minuten und anschließendem Abkühlen auf Cholinoxidase untersucht. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die Enzymaktivität ohne Wärmebehandlung zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 zusammengefaßt. In Fig. 6 zeigt die Kurve a den Fall der EDTA-Zugabe und die Kurve b den Fall ohne EDTA-Zugabe. Aus Fig. 6 ist ersichtlich, daß EDTA die Aktivität der Cholinoxidase stabilisiert.

(8) Inhibitoren

Ein 4 ml Reaktor zur Bestimmung der Sauerstoffabsorption wird auf 37°C eingestellt und es wird eine Sauerstoffelektrode eingesetzt. Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 0,8 E/ml gelöst. 0,1 ml der erhaltenen Enzymlösung, 50 µLiter einer 1 Mol/Liter wäßrigen Cholin-chloridlösung, 0,1 ml einer 1,7 × 10^-3 Mol/Liter wäßrigem Natriumazidlösung und 3,5 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers vom pH-Wert 8,0 werden in den Reaktor gegossen. Die Konzentration des in der Lösung gelösten Sauerstoffs wird kontinuierlich aufgezeichnet, während die Lösung gerührt wird. Die Abnahme der Sauerstoffkonzentration innerhalb 5 Minuten nach Beginn der Reaktion wird berechnet.

Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben, wird wiederholt, jedoch wird kein Natriumazid zugesetzt (Kontrollversuch).

Als Ergebnis wird gefunden, daß die Enzymaktivität durch Zusatz von 1,7 × 10^-3 Mol/Liter Natriumazid im Vergleich zur Kontrollprobe um 44,4% inhibiert wird.

(9) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der Cholinoxidase wird nach der Gelfiltrationsmethode vgl. Biochemical Journal, Bd. 96 (1965). S. 595) an Sephadex G 200 bestimmt. Nach dieser Methode hat das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 97 000.

(10) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der Cholinoxidase wird nach der Elektrofocussiermethode unter folgenden Bedingungen bestimmt:

Trägerampholite:pH-Werte von 3,5-5,0 Säulenvolumen:110 ml Dauer der elektrischen Spannung:24 Stunden Fraktion:2 g.

Aufgrund dieser Untersuchung hat das Enzym einen isoelektrischen Punkt beim pH-Wert 4,05.

Claims

1. Cholinoxidase, erhältlich durch Züchtung von Brevibacterium album NRRL B-11 046 und Isolieren der Cholinoxydase und gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

a) Katalytische Beschleunigung der Oxidation von Cholin zu Betainaldehyd und von Betainaldehyd zu Betain,
b) stabil im pH-Bereich von 7,0 bis 8,3,
c) pH-Optimum für die Reaktion 7,5 bis 9,0,
d) Temperaturoptimum für die Reaktion bei 20 bis 35°C,
e) Temperaturstabilität im Bereich von 20 bis 45°C,
f) enzymatische Aktivität gegenüber Cholin oder dessen Salzen, geringe Aktivität gegenüber 2-Dimethylaminoäthanol, keine oder sehr geringe Aktivität gegenüber Acetylcholinchlorid, Sarkosin, Betain, Glykokoll, 2-Methylaminoäthanol und Äthanolamin-hydrochlorid,
g) Stabilisierung durch EDTA,
h) Inhibierung durch Natriumazid,
i) Molekulargewicht etwa 97 000 (bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode an Sephadex G 200) und
j) isoelektrischer Punkt pH 4,05.

2. Verfahren zur Herstellung der Cholinoxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium album NRRL B-11 046 in einem Nährmedium züchtet und die Cholinoxidase aus der Gärmaische isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 7 bis 800 mMol Cholin oder dessen Salz (berechnet als Cholin-chlorid) pro Liter enthaltendes Nährmedium verwendet.

4. Verwendung der Cholinoxidase nach Anspruch 1 und 2 zur Bestimmung von Cholin.