DE1642636C - Verfahren zur fermentativen Herstel lung des Enzyms L Methiomndecarboxylase - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung des Enzyms L-Methionindecarboxylase.

Bei dem erfindungsgemäß erhältlichen Enzym 1.-Methionindecarboxylase handelt es sich um ein neues Enzym, das als Reaktionskatalysator bei der Bildung von 1 Mol Kohlendioxydgas und 1 Mol 3-Methylthiopropylamin aus 1 Mol 1.-Methionin wirkt:

1 -Methionin

CO₂ + 3-Methylthiopⁱ"opylamin

Das Enzym 1 - Methionindecarboxylase ist auf Grund dieser Fähigkeit für die Bestimmung des 1-Methionins durch Messung der gebildeten Kohlendioxydgasmenge mittels eines Manometers geeig- jo net. 1 -Methionin ist eine wichtige Aminosäure, deren Bestimmung in Futter. Nahrungsmitteln, klinischen Proben und Proben bei biochemischen Versuchen sehr häufig erforderlich ist. Das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wirkt spezifisch auf i.-Methionin und kt.nn daher als spezifisches analytisches Agens für ι -Methionin verwendet werden.

Es sind bereits die verschiedensten Decarboxylasen verschiedener Aminosäuren, beispielsweise von Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure u. dgl. bekannt. Die i.-Methionindecarboxylase war bisher jedoch nicht bekannt.

Es wurde bereits vorgeschlagen. 3-Methylthiopropylamin durch Beimpfen eines Methionin enthaltenden Kulturmediums mit Mikroorganismen des Genus Streptomyces herzustellen (vgl. die bekanntgemachte japanische Patentanmelduug 69 7601967). Weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet haben gezeigt, daß bei dieser Reaktion die erfindungsgemäß herstellbare 1.-Methionindecarboxylase als Katalysator wirkt. Darauf beruht nun das beanspruchte Verfahren.

Eis wurde nun gefunden, daß i.-Methionindecarboxylase dadurch hergestellt werden kann, daß man bestimmte Mikroorganismen des Genus Streptomyces unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert eines bestimmten pH-Wert-Bereichs in einem i.-Methionin enthaltenden wäßrigen Nährmedium kultiviert.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur fermentativen Herstellung des Enzyms i.-Methionindecarboxylase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces venezuelae ATCC 21 018, Streptomyces sp. ATCC 21 019 oder Streptomyces sp. ATCC 21 020 unter aevoben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 2,0 bij 9,5 in einem i.-Methionin enthaltenden wäßrigen Nährmedium kultiviert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erstmals möelich, das Enzym i.-Methionindecarboxvlase auf fermentativem Wege auf wirtschaftliche Art und Weise in hohen Ausbeuten herzustellen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals herstellbare i.-Methionindecarboxylase weist folgende Eieenschaften auf:

Sie stellt ein neues Enzym dar. das als Katalysator bei der Umsetzung von Methionin zu CO₂ und 3-Methylthiopropylamin wirkt. Sie wirkt spezifisch auf L-Methionin und greift andere Aminosäuren. wie z. B. n-Methionin. m.-Äihionin. L-Alanin, !.-Asparaginsäure, !.-Glutaminsäure, L-Glycin, 1-Valin, 1 -Isoleucin. L-Prolin. L-Homoserin. 1-Serin. i.-Threonin. -Tryptophan. !.-Phenylalanin, i.-Lysi.,. i.-Citrulin, i.-Ornithin. ι-Histidin und a-AminobuUersäure sowie Brenztraubensäure und Oxalessigsäure. nicht an. Der optimale pH-Wertbereich Tür das nach dem ciiindungssemäßen Verfahren erhältliche neue En/;, τι liegt" bei 7.0 bis 8.0. und es ist beständig bei einem pH-Wert von etwa 6 (gewöhnlich innerhalb des pH-Wertbereiches von 4 bis 9) und instabil bei einem pH-Wert von 2.2 oder weniger bzw. bei einem pH-WVq von 10.0 oder mehr.

Dies ändert jedoch nichts an der Tatsache, daß cu, neue Enzym 1 -Methionindecarboxylase bei einem pH-Wert von etwa 2.0 bis 9.5 hergestellt werden kann. ohne sich dabei zu zersetzen, da selbst bei der Kuhivienina der obengenannten Mikroorganismen K:> einem "pH-Wert \on 2.0 der pH-Wert innerhalb der Zellen stets nahe beim Neutralpunkt gehalten wir,·. so daß die innerhalbder Zellen angereicherte 1 -M-,-thionindecarboxylase unzersetzt bleibt.

Bei der Methode zur Bestimmung uer enzymatischem Aktivität des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren neuen Enzyms wird das bei der cnz\nutischen Reaktion unter bestimmten Bedingungen gebildete Kohlendioxydgas in einfacher Weise mn Hilfe eines Warburg-Manometers (wie in den naci. folgenden Beispielen beschrieben) gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse können entweder durch den Qco-Wert (die Menge an gebildetem Kohlendioxidgas Γη μΐ Stunde · mg Enzym) oder durch die Enzymmenge ausgedrückt werden, die notwendig ist. um 1 aMol des"Substrats {1 -Methionin) pro Minute umzuwandeln, wobei letzteres eine durch das Enzyme COmmitee of the International Union of Biochemistry (I. U. B.) festgelegte Einheit darstellt.

Die optimale Temperatur des erfindungsgemäb herstellbaren neuen Enzyms liegt bei 35 bis 50 C. und das Enzym verliert an Aktivität bei Behandlung bei 60^cC oder darüber. Das zu dem erfindungsgemiiS herstellbaren Enzym zugehörige Coenzym ist Pyridoxalphosphat. Es wird durch Hydroxylamin.. Cyanide. Isonikotinsäurehydrazid u. dgl. inhibiert. Pyridoxalphosphat geht leicht bei der Dialysebehandlung während der Reinigung des Enzyms auf Grund von Dissoziation verloren. Die Aktivität des Enzyms wird durch Zugabe von Pyridoxalphosphat zu dem gereinigten Produkt erheblich gesteigert.

Für den Fermentalionsprozeß der Erfindung eignet sich sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium, solange es 1 -Methionin und wesentliche Nährstoffe für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Substanzen, wie z. B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von

dem verwendeten Mikroorganismus in eeeisneten Mengen gebraucht werden.

Als Kohlenstoffquell·; seien beispielsweise Kohlehydrate, wie z. B. Glukose, Fructose. Maltose. Saccharose. Stärke. Stärkehydrolysate. Melasse. Glycerin u. dgl., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle. wie z. B. organische Säuren, z. B. Zitronensäure. Milchsäure u. dgl., genannt. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen von zweien oder mehreren verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat. Ammoniumacetat.Arnmuniumphosphatu.dgl.. oder natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, wie beispielsweise Maisquell wasse,. Hefeextrakt. Fleischextrakt. Pepton, Fischmehl. Bouillon. Caseinhydrolysate. lösliche Fisthsubstanz. Sojabohnenpulver. ErdnuPpulver, Proteinhydrolysate. Reiskleieextrakt u. dgl.. ve. /endet werden. Diese Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren angewendet werden. Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat. Natriumphosphat. Kaliumdihydrogenphosphat. Kaliummonohydrogenphosphat. Eisensulfai. Manganchlorid. Calciumchlorid, Natriumchlorid u. dal.

Wie oben angereben, isi. es wesentlich, "daß das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium ι-Met'nionin enthält. Es kann genügend 1-Methionin natürlicherweise in den organischen 'Mickstoffquellen, die in dem Med um vorliegen, vorhanden sun. so daß dessen Zugabe als gesonderte Komponente nicht notv. endig ist. Das ι -Methionin kann aber auch gesondert dem Medium zugesetzt werden.

Darüber hinaus ist es auch möglich, dem Kulturmedium eine Substanz zuzusetzen, die durch die Wirkung des verwendeten Mikroorganismus in 1 -Methionin übergeführt wird, wie beispielsweise Protein. Pepton u.dgl. Das 1.-Methionin kann in dem Kulturmedium in verschiedenen Konzentrationen vorliegen. Jedoch wird eine Konzentration von 10 mg, 1 oder mehr als freies 1 -Methionin bevorzugt, um eine hohe Mnzymausbeute zu erzielen.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. durch aerobes Schütteln der Kultur, oder unter Belüftung und Bewegung einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 15 bis 4OC. vorzugsweise bei 20 bis 35^CC, und einem pH-Wert von etwa 2.0 bis 9,5 durchgeführt.

Die dabei gebildete L-Methionindecarboxylase sammelt sich in den Mikroorganismenzellen und der KuI-lurflüssigkeit nach etwa ostündiger bis etwa 7tägiger Kultivierung an. Die bereits erzeugte Methionindecarboxylase nimmt manchmal ab. wenn das i.-Methionin in dem Kulturmedium verbraucht ist. Daher wird das Gewinnungsverfahren vorzugsweise unter Zurücklassung einer geringen i.-Methioninmenge in dem Kulturmedium durchgeführt.

Nach Beendigung der Fermentation kann die Methionindecarboxylase aus der Kulturbrühe unter Anwendung eines zur Isolierung von Enzymsubstanzen üblichen Gewinnungsverfahrens abgetrennt werden. Zu diesen Methoden gehören beispielsweise Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Chromatographie unter Anwendung von Adsorbentien, wie beispielsweise Ionenaustauschharzen, Tonerde, Kaolin, Sephadex (vernetztes Dextranderivate Diäthylaminoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose u.dgl., Dialyse (einschließlich elektrischer Dialysemethoden) und Ausfällung mit Aceton. Acrinol u.dgl. Diese Methoden können einzeln oder in Kombination miteinander, je nach Bedarf und den Erfordernissen der Umstände, angewendet werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben sind die Prozentangaben Gewichtsprozente, bezogen auf 11 Wasser.

Beispiel 1

Streptomyces venezüelae ATCC 21 018 wird unter aerobem Schütteln in einem Impfmedium, das 2% Glukose, 1% Pepton. 1% Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid (Gewicht/Volumprozent) aufweist. 24 Stunden lang bei 30" C kultiviert. 2 ml der erhaltenen Impfkultur werden in 20 ml eines in einem konischen 250-ml-Kolben enthaltenen Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

0.5° η ι-Methionin.

5% Glukose.

0.05% K,H PO₄.

0.025% MsSO₄-7H,O.

0.2% (NHJ₁SO₄.

0.3% Hefeextrakt (Gew. Vol.).

Der pH-Wert des Fermentationsmediums liegt bei 7.0.

Die Kultivierung wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur 8 Stunden lang bei 30 C durchgeführt.

Das so erhaltene Fermentationsmedium wird abzentrifugiert. wobei es in eine überstehende Flüssigkeit und Bakterienzellen getrennt wird. Die Bakterienzellen werden durch Behandlung mn Ultraschallwellen unter Verwendung einer Bakterienzellenkonzentration von 0.70 optischer Dichte (Lichtweg 1 cm) in einer Verdünnung von 2 1 aufgebrochen, wobei die Behandlung 20 Minuten lang bei 10 KC durchgeführt wird. Die Flüssigkeit wird zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit einer halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung ausgesalzen. Nach Abtrennen des Niederschlags wird anschließend die Dialyse mit einer auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellten V₁₅ m-Phosphatpufferlösung durchgeführt. Die erhaltene Flüssigkeit wird durch mit V₁₅ m- Phosphatpufferlösung (pH 6.0) gepufferte Diäthylaminoäthylcellulose geleitet, um Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzen, und es erfolgt eine Dialyse gegenüber destilliertem Wasser. Die Ausfällung erfolgt dann mit einem zweifachen Volumen an Aceton. Als Ergebnis wird gereinigte i.-Methionindecarboxylase erhalten.

Das Aussalzen der durch Zentrifugalabtrennung der Bakterienzellen von der Kühlflüssigkeit erhaltenen überstehenden Flüssigkeit erfolgt mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat. Anschließend wird das gleiche Verfahren — wie oben im Fall der aufgebrochenen Bakterienzellen beschrieben — durchgeführt. Man erhält daraus ebenfalls gereinigte Methionindecarboxylase.

Beispiel 2

Das Fermentationsmedium, das durch Kultivierung von Streptomyces venezüelae ATCC 21 018 in gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhalten wurde, wird zentrifu-

giert. Die so erhaltenen Bakterienzellen werden nach und nach unter Rühren in eine große Menge kaltes Aceton (etwa —10 C) geworfen, sodann filtriert und schließlich mit einer geringen Menge Äther gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute an mit Aceton getrockneten Bakterienzellcn beträgt nach dieser Methode 2.5 g aus 1 1 Fermentationsmedium.

Die Aktivität der L-Methionindecarboxylase in dem so erhaltenen rohen Enzymprodukt (mit Aceton getrocknete Bakterienzellen) zeigt einen Qco,-Wert von 130 al Stunde · mg acetongetrockneter Bakterienzellen. Die Aktivität wird dadurch bestimmt, daß man die Erzeugung von Kohlendio.xydgas bei 37C mit einem Warburg-Manometer unter Anwendung von ¹J₅ m-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7.0 und 4.5 n-Chlorwasserstoifsäure zur Freisetzung von gelöstem Kohlendioxyd mißt.

Beispiel 3

Streptomyces sp. ATCC 21 019 wud als Impfbakterium verwendet. Dieser Mikroorganismus ist ein Stpmm vom nichtchromogenen Typ. reduziert Nitrate und bildet eine Spirale. Die Kultivierung dieses Stammes erfolgt in gleicher Weise wie im Beispiel 2. und die Behandlung der resultierenden Bakterienzellen mit Aceton ergibt 2.5 g eines rohen Enzymprodukfes (mit Aceton getrocknete Bakterienzellen) aus 1 1 des erhaltenen Fermentationsmediums. Das Produkt hat eine L-Methionindecarboxylase-Aktivität (Qco,) von 120 al Stunde · mg Enzym.

Beispiel 4

Streptomyces sp. ATCC 21 020 wird als Impfbakterium verwendet. Dieser Stamm ist vom nichtchromogenen Typ. reduziert Nitrate nicht und bildet keine Spirale. 20 g rohes Enzymprodukt (mit Aceton getrocknete Bakterienzellen) werden aus 1 1 Fermentationsmedium erhalten, wenn man dieses in der im Beispiel 2 beschriebenen W :se kultiviert und anschließend die Bakterienzellen mit Aceton behandelt. Das Produkt weist eine L-Methionindecarboxylase-Aktivität (Qco,) ^von 98 al Stunde · mg Enzym auf.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur ferrnentativen Herstellung des Enzyms L-Methionindecarboxylase, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces venezuelae ATCC 21 018, Stireptomyces sp. ATCC 21 019 oder Streptomyces sp. ATCC 21 020 unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 2.0 bis 9,5 in einem L-Methionin enthaltenden wäßrigen Nährmedium kultiviert.