DE1642636A1 - Methionindecarboxylase und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

frr.-Ing. ::-JV: RuSlHXH Patentanmeldung P 16 4-2 636.1-41 Dipl.-Irig rίΠ{;\'Ζ AC>U-" AR Unser Zeichen: K 808

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München, den ^ ^

KYOWA HAKKO KOü-YO CO₀, LTDo Tokyo/Japan

Methionindecarboxylase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Zusammenfassung

Das Verfahren zur Herstellung des Enzyms Methionindecarboxy läse umfaßt -die Kultivierung eines zur Erzeugung von Methionindecarboxyläse befähigten Mikroorganismus unter aeroben .Bedingungen in einem wäßrigen Ii-Methionin-enthaltenden llährmedium, wobei die Methionindecarboxylase in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt und daraus gewonnen v/ird. Geeignete verwendbare Mikroorganismen gehören zum ü-enus Streptomycec.

Die Erfindung betrifft das iSnaym Metnionindecarboxylase und

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Unterlag ^7.,^a*..-.--

OHiGlNAU

ein Verfahren zu seiner Herstellung» Inabesondere oetrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von Methionindecarooxylase durch fermentation und im speziellen ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Enzyms Methionindecarboxylase durch Fermentation in einem wäßrigen L-Methionin-entnaltenden Nährmediume

Das erfindungsgemäß erhältliche neue Enzym Methionindecarboxylase ist ein Enzym, das als Reaktionskatalysator bei der .bildung von einem Molekül Kohlendioxydgas und einem Molekül 3-Methyl-thiopropylamin aus einem Mol It-jaettiionin wirkt:

Methionin * CO₂ + 3-Methylthiopropylamin

Methionindecarboxylase ist auch aufgrund ihrer Fähigkeit zur Anwendung für die spezifische Ermittlung von L-Methionin durch Bestimmung der bei der Reaktion erzeugten Kohlendioxydgasmenge mittels eines Manometers geeignet. L-Methionin ist als wesentliche Aminosäure wichtig, und die Bestimmung des (jehalts dieser Aminosäure in butter, Nahrungsmittel, klinischen Proben und Proben biochemischer Versuche ist sehr oft notwendig. Das gemäß der Erfindung erhaltene Enzym wirkt spezifisch auf L-Methionin und wird daher als spezifisches analytisches reagens für L-Methionin verwendet.

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Das Vorhandensein spezifiscner Decarboxylasen verschiedener Aminosäuren wie beispielsweise Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl. war bereits bekannte Jedoch war 1-Methionindecarboxylase bisher noch nicht ermittelt worden und stellt eine neue Erfindung dar. Es wurde gefunden, daß 3-Methylthiopropylamin durch Einimpfen von zum Genus Streptomyces gehörenden Mikroorganismen in ein methioninhaltiges Kulturmedium erzeugt wird, und daraus wurde ein Verfahren zur Herstellung von 3-Methylthiopropylamin entwickelt C japa- | nische Patentanmeldung 69 760/1967). Weitere Untersuchungen dieses Phänomens ergaben, daß das neue erfindungsgemäße Enzym Methionindecarboxylase als ein Katalysator wirkt, und auf dieser Tatsache basiert die vorliegende Erfindung.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Methionindecarboxylase.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Methionindecarboxylase durch Fermentation, das in wirksamer und rasch anwendbarer Weise durchgeführt werden kann.

Weiterhin liefert die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung

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yon Methionindecarboxylase durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise unter geringem Kostenaufwand und Erzielung hoher Produktausbeute durchgeführt werden kann,.

Ferner betrifft die Erfindung Methionindecarboxyläse.

Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß Methionindecarboxylase dadurch erhalten wird, daß Mikroorganismen, die 3-Me thy L-thiopropylamin und Kohlendioxydgas aus !-Methionin erzeugen können, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert werden, die Methionindecarboxylase in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt und daraus gewonnen wird.

Die erfindungsgemäß erhaltene Methionindecarboxylase weist folgende Eigenschaften auf. Wie oben angegeben, ist sie ein Enzym, das als Katalysator bei der Umsetzung von Methionin zu CO₂. und 3-Methyltiiiopropylamin wirkt. Sie wirkt spezifisch auf L-Methionin und wirkt nicht auf D-Methionin, DL-Methionin, !--Alanin, !-Asparaginsäure, L-U-lutaminsäure, L-Glycin, L-Valin, L-Isoleucin, L-Prolin, L-Homoserin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Phenylalanin*, L-Lysin, L-Citrulin, L-Ornithin, L-Histidin und o-Aminobuttersäure sowie Brenztraubensäure und Oxalessigsäure. Der optimale pH-Bereich

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für das vorliegende Enzym liegt bei 7,0 bis 8,0, und es ist stabil bei einem pH-Wert von etwa 6 ^gewöhnlich pH 4 bis 9) und unstabil bei einem pH-Wert von 2,2 oder weniger oder bei einem pH-Wert von 10,0 oder mehr.

Bei uer Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wird das durch eine enzymatische Reaktion unter bestimmten .bedingungen erzeugte Kohlendioxydgas in einfacher weise unter Verwendung ,eines ,Waruurg-Manometers, wie in den folgenden Beispielen Deschrieben, gemessen. Die Ergebnisse können durch den Q^₀ -Wert ^ die Menge an erzeugtem Jiohlendioxydgas /ul/Stunde . mg Enzymprodukt) oder durch die Enzymmenge wiedergegeben werden, die notwendig ist, um 1 /U Mol des Substrats (Ii-Methionin) pro Minute umzuwandeln, wobei letzteres eine durch das Enzyme Commitee of the International Union of Biochemistry (I.U.-d.) beschriebene Einheit darstellt»

Die Optimaltemperatür des erfindungsgemäßen Enzyms liegt dqj. 35 bis 50 ⁰G, und das Enzym verliert an Aktivität durch Behanalung bei 60 ⁰G oder darüber. Das vorliegai de Enzym erfordert Pyridoxalphosphat als ein üoenzym und wird durcn Hydroxylamin, Cyanide, Isonikotinsäurehydrazid und dgl. inhibiert. Pyridoxalphosphat geht leicht bei der Dialysebe-

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handlung während der Reinigung des Enzyms aufgrund von Dissoziation verloren. Die Aktivität des Enzyms wird durch Zugabe von Pyridoxalphosphat zu dem gereinigten Produkt erheblich gesteigert.

Mikroorganismen, die Mexhionindecarboxylase erzeugen können, welche- wiederum 3-Methylthiopropylamin erzeugt, können bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, unabhängig von ihrer eingeordneten Stellung. Zu geeigneten Stämmen, die verwendet werden können, gehören solche, die zum Genus Streptomyces gehören, wie in den Beispielen gezeigt wird·

Sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium ist für den Fermentationsprozess der Erfindung geeignet, solange es !-Methionin und wesentliche Uänrsxoffe für das Wachstum der verwendeten Stämme enthält· Derartige Mhrstoffe sind bekannt und dazu gehören Suostanzen, wie z.B. eine Kohlenstoffquelle, ein Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl.j die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen geDraucht werden. Als Kohlenstoff quelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, G-lyceriri und dgl. oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie z.B. or^aniscne Säuren, z.B.

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Zitronensäure, Milchsäure und dgl. genannt. Diese Substanzen ** kennen entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren verwendet werden. Als dtickstoffquelle können verscüiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z.B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniuinsulfat, Ammoniumnitrat, Aroitoniumacetat, Ammoniumphosphat und dgl. ode.r natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie beispielsweise Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Fischsubstanz, Sojabohnenpulver, Erdnußpulver, Proteinhydrolysate, Reiskleieextrakt und dgl. verwendet werden. Diese Sudstanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren angewendet werden. Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Hanganchlorid, Calciumchlorid, natriumchlorid und dgl.« Wie oben angegeben, ( ist es wesentlich, dass das Kulturmedium gemäß dem Verfahren der Erfindung L-Methionin enthalte Es kann genügend L-Methionin natürlicherweise in den organischen Stickstofiquellen, die in dem Medium vorliegen, vorhanden sein, so daß dessen Zugabe als gesonderte Komponente nicht notwendig ist. Das L-Methionin kann auch gesondert dem Medium zugesetzt werden.

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Darüberhinaus ist es auch möglich, dem Kulturmedium eine Substanz zuzusetzen, die in jj-Methxonin durch die Wirkung des verwendeten Mikroorganismus überführt wird, wie "beispielsweise Protein, Pepton und dgl.. Das L-idethionin kann in dem Kulturmedium in verschiedenen Konzentrationen vorliegen. Jedoch wird "eine Konzentration von 10 mg/1 oder mehr als freies L-Methionin bevorzugt, um eine nohe ünzymausbeute zu erhaltene

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B. aerobes Schütteln der Kultur oder unter Belüftung und Bewegung einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 15 bis 40 ⁰G, vorzugweise bei 20 bis 35 ⁰C, und einem pH-Wert

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von etwa \&τ$Ι bis 9»5 durchgeführt.

Die gewünschte L-Metiiionindecarboxylase sammelt sich in den Mikroorganismenzellen und der KuIturflUssigkeit nach einer etwa 6-stündigen bis etwa 7-tägigen Kultivierung an. Die bereits erzeugte Methionindecarboxyläse nimmt manchmal ab, wenn das L-Methionin in dem Kulturmedium verbraucht ist. Daher wird das Gewinnungsverfahren vorzugsweise unter Zurücklassung einer geringen L-Methioninmenge "in dem Kulturmedium durchgeführt·

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nach Beendigung der Fermentation kann die Methionindeoarboxylase aus der Kulturflüssigkeit unter Anwendung eines zur Isolierung von Enzymsubstanzen üblichen G-ewinnungsVerfahrens abgetrennt werden. Zu diesen Methoden gehören beispielsweise Aussalzen mit Ammoniumsulfat und dgl., Chromatographie unter Anwendung von Adsorbentien, wie beispielsweise Ionenaustausehharzen, i'onerde, Kaolin, Sephadex (.vernetztes jJextranderivat, ein Produkt der Pharmacia Oompnay, Uppsala, Schweden) , Diäthylaminoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose una dgl., Dialyse (einschließlich elektrischer uialysemetnoden) und Ausfällung mit Aceton, Acrinol und dgl». Diese Methoden können einzeln oder in Kombination miteinander, je nach Bedarf und den Erfordernissen der Umstände, angewendet v/erden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sj.e zu begrenzen, iralls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter «vasser.

Beispiel 1

Streptomyoes venezuelae A'i'CC 21 01 'ö wird unter aerobem Schütteln in einem Iiupfmedium, das ά ψ Glucose, 1 '/ο Peptan, 1 -/■■ Hofeextrakfc und 0,5 f' Hatriumchlorid {Gewicht/Volumen)

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aufweist, während 24 Stunden bei 30 ⁰C kultiviert. 2 ml der er- Qt- haltenen Impfkultur werden in 20 ml eines in einem
konischen 250 ml-Kolben enthaltenen Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpfts

0,5 io Xi-Methionin

5 io Glucose

0,05 1o K₂HPO₄

0,025 fo MgSO^.7H₂O

0,2 Io (HH₄)₂S0₄

0,3 ψ Hefe extrakt (&ew./Volo)

Der pH-Wert des Kulturmediums liegt bei 7,0.

Die Kultivierung wird dann unter aerobem schütteln der Kultur während 8 otunden bei 30 ⁰C durchgeführt ο

Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wird abzentrifugiert und in eine überstehende Flüssigkeit und Bakterienzellen getrennt. Die .bakterienzellen v/erden durch behandlung mit
Ultraschallwellen unter Anwendung einer Bakterienzellenkonzentration von 0,70 optischer Dichte (Lichtweg 1 cm; in
einer Verdünnung von 2 1 aufgebrochen, wooei die Behandlung wäiirend 20 Minuten oei 10 KG durchgeführt wird» Die aufgespaltene Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren getrennt, uai

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die überstellende Flüssigkeit zu entfernen, und das Aussalzen wird mit einer halbgesättigten Amnioniumsulfatlösung durchgeführt und anschließend die Dialyse mit einer auf einen pH-Wert von b,0 eingestellten 1/15 m Phosphatpufferlösung durchgeführte Die erhaltene Flüssigkeit wird durch mit 1/15 m Phosphatpufferlösung vpH 6,0) gepufferte Diäthylaminoäthylcellulose geleitet, um Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird mit halbgesättigtem ümmoniumsulfat ausgesal- Λ zen, und es erfolgt eine Dialyse gegenüber destilliertem wasser. Die Ausfällung erfolgt dann mit einem zweifachen Volumen an Aceton. Als Ergebnis wird gereinigte Methionindecarboxylase erhalten.

jüas Aussalzen der durch Zentrifugalabtrennung der Bakxerienzellen von der Kulturflüssikgeit erhaltenen überstehenden Flüssigkeit erfolgt mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat„ Anschließend wird das gleiche Verfahren, wie oben im Fall der aufgeoroehenen Bakterienzellen beschrieben, durchgeführt. Man erhält daraus ebenfalls gereinigte Methionindecarboxylase.

Beispiel 2

Die Kulturflüssigkeit, welche durch Kultivierung von Strep-

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tomyces venezuelae ATCG 21 018 in gleicher «'eise, wie in .Beispiel 1 besenrieben, erhalten wurde, wird mittels einer Zentrifuge getrennt, .ide so erhaltenen x,akterienzellen werden nach und nach unter Rühren in eine große Menge kaltes .aceton (etwa -10 ⁰C) geworfen, filtriert und schließlich mit einer geringen Menge Äther gewascnen und getrocknete Die Aus Deute an Aceton-getrockneten Bakterienaellen beträgt nach dieser Methode 2,5 g aus einem 1 KuIturflüssigkeit.

Die Aktivität uer Mexhionmdecarboxylase in dem so erhaltenen rohen Enzymprodukt (.Aceton-getrocknete Bakterienzellen) zeigt einen Q~_o -Wert von 130 /ul/Stunde . mg Aceton-getrockneter Bakterienzellen. Die Aktivität wird dadurch bestimmt, daß man die Erzeugung von Kohlendioxydgas bei 37 ⁰O mit einem Warburg-Manometer unter Anwendung von 1/15 m Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 und 4,5 η Chlorwasserstoffsäure als Säurespitze zur Freisetzung von gelöstem Kohlendioxyd mißt.

Beispiel 3

Streptomyces sp„ ATCC 21 019 wird als Impfbakterium verwendet. 'Dieser Mikroorganismus ist ein Stamm vom nichtchromogenen Typ, reduziert beträte und bildet eine Spirale. Die

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Kultivierung dieses ütanmis erfolgt in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, und die Behandlung der resultierenden Bakterienzellen mit Aceton ergibt 2,5 g eines rohen Enzymproduktes v.Aceton-getrocknete Bakterienzellen) aus 1 1 der erhaltenen KuIturflüssigkeit. Das Produkt hat eine Methionindecarboxylaseaktivität (Qqq ) von i20 /ul/Stunde . mg ^nzymprodukt.

Seispiel 4

Streptomyces sp. AtCO 21 020 wirct als Impfbakterium verwendete Lieser Stamm gehört zu den nichtchromogenen Arten, die nitrate nicht reduzieren und keine Spirale bilden. 2u g rohes aJnzyrnprodukt (Aceton-getrocicnete Bakterienaellen) werden aus 1 1 Kulturflüssigkeit erhalten, die sich aus der Kultivierung dieses Staiarnes in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise und anschließender Behandlung der Bakcerinezellen mit Aceton er.^iüt. Das Proaukt weist eine Metnio.ujLiidecarboxylaseaktivi-

tät {'-4_nn ) von 9'ö .ul/ütunde _o mg auf. ^υυ2 '

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Claims (1)

1. -H-

   Patentanmeldung £ 16 42 636.1-41 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Unser Zeichen: K 808 _

   München, den

   Patentansprüche

   1«) Verfahren zur .Herstellung des iinzyms Methionindecarboxylase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Erzeugung von Methionindecarboxylase befähigten Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen L-Metüionin enthaltenden Nährmedium kultiviert, die Methionindecarboxylase in der erhaltenen KiilturfliiGsigkeit ansammelt und daraus gewinnt.

   2o) Verfahren nach Ansprucn 1, dadurch _e ekennzelehneu, daß man als Mikroorganismus einen zum Genus Strepxomyces gehörenden Mikroorganismus einsetzt.

   3.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein iiährmedium verwendet, das wenigstens 10 mg/1 freies L-iVietnionin enthält.

   4.) Verfahren nach Ansprucn 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Jiährmedium verwendet, in dem eine Substanz- vor-

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   Neue Unterlagen (Art 711 Abs. 2 nm sau 3 d« Alanine«*«*. % 4.9. tee?i_{; βΑ£) 0R|G1NÄL}

   liegt, die in eine ausreichende Menge L-Methionin überführt werden kann.

   L^:-o) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß axe Kultivierung bei einer Temperatur von etwa

   Z₁O 15 bis 40 C und "bei einem pü-Wert von etwa j^riJjf ^ui^s 9»5 durchgeführt wird β

   ϋ_β) Verfahren zur Herstellung des Enzyms Metiiionindecarboxylase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zum Genus ätreptomvces gehörenden Mikroorganismus bei einer Temperatur von etwa 15 eis 40 ⁰C und einem pH-Wert von etwa/&-J-5/bis 9>5 unter aeroben Bedingungen in einem wäiBrigen wenigstens 10 mg/1 freies L-Methionin enthaltenden JMährmedium kultiviert, die Methionindecarboxylase in der erhaltenen Kulturflüssigkeit ansammelt und daraus gewinnt.

   7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, I daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 und 35 ⁰C durchgeführt wird«,

   8.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces venezuelae ATGC 21 verwendet wird.

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   9.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces sp. ATOO 21 019 verwendet wird·

   10.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces sp. ATCO 21 020 verwendet wird.

   11.) Das Enzym Methionindecarboxylase.

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