DE3719332C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von L-Isoleucin durch einen enzymatischen Prozeß.
Erfindungsgemäß kann L-Isoleucin in hoher Ausbeute und mit hoher Effektivität hergestellt werden.
L-Isoleucin ist eine essentielle Aminosäure, die in der Ernährung von Menschen und Tieren eine wichtige Rolle spielt; der Bedarf für die Aminosäure auf den Gebieten der Medizin, Nahrungsmittel, Nahrungsmittelzusätze usw. hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen. Wie andere Aminosäuren weist L-Isoleucin Stereoisomerie auf und die selektive Herstellung der L-Verbindung durch chemische Synthese im kommerziellen Maßstab ist schwierig. Daher ist diese Verbindung bis jetzt hauptsächlich durch Fermentation hergestellt worden. Als Beispiele für diese Fermentationstechnologie können die Verfahren erwähnt werden, in denen ein Vorläufer von L-Isoleucin wie DL-α- Aminobuttersäure, Threonin oder andere verwendet wird (japanische Offenlegungsschriften Nr. 8 709/68, 2 880/65) und das sogenannte direkte Fermentationsverfahren, das den Zusatz eines Vorläufers nicht erfordert (japanische Offenlegungsschriften Nr. 7 091/63, 93 586/74).
Als enzymatische Verfahren sind Verfahren bekannt, in denen L-Isoleucin aus D-, L- oder DL-α- keto-β-methylvaleriansäure in Gegenwart von Ammoniumionen oder einer anderen L- oder DL-Aminosäure als Isoleucin hergestellt wird (japanische Offenlegungsschrift Nr. 29 789/71), ein Verfahren, in dem L-Isoleucin aus D-Isoleucin und/oder D-Alloisoleucin oder einer Mischung davon mit optischen Isomeren davon in Gegenwart eines Ammoniumions oder einer anderen L- oder DL-Aminosäure als Isoleucin hergestellt wird (japanische Offenlegungsschrift Nr. 29 788/71), ein Verfahren, in dem L-Isoleucin aus Glucose und D-Threonin hergestellt wird, indem immobilisierte Zellen eines Bakterienstammes der Gattung Serratia verwendet werden (Proceedings of the 1977 Congress of the Japanese Society of Fermentation Technology, pp. 47-48).
Diese Verfahren sind jedoch mit den Nachteilen hoher Materialkosten oder geringer Ausbeuten verbunden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung von L-Isoleucin zur Verfügung, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
  • (a) Kultivieren von Zellen eines biotinabhängigen Stammes der Gattung Brevibacterium in einem biotinhaltigen Medium;
  • (b) Gewinnen der Zellen aus dem biotinhaltigen Medium;
  • (c) Überführen der Zellen in ein wäßriges Reaktionsmedium, welches α-Aminobuttersäure oder β- Ketobuttersäure und mindestens Ethanol, jedoch kein Biotin enthält, um L-Isoleucin in dem wäßrigen Reaktionsmedium herzustellen; und
  • (d) Isolieren von L-Isoleucin aus dem wäßrigen Reaktionsmedium.
Erfindungsgemäß kann L-Isoleucin aus α-Aminobuttersäure oder α-Ketobuttersäure in hoher Ausbeute und mit hoher Effektivität hergestellt werden. Das ethanolhaltige synthetische Vollmedium, das für das erfindungsgemäße Verfahren als enzymatisches Reaktionsmedium bevorzugt benutzt wird, eignet sich hervorragend zur Produktionskontrolle, weil es keine Sterilisation und andere komplizierte Verfahren, die bei Fermentationen unvermeidlich sind, erfordert.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Mikroorganismus ist ein biotinabhängiger Stamm der Gattung Brevibacterium, bevorzugt ein Ethanol verwertender Stamm. Unter diesen Stämmen sind zur Herstellung von L-Isoleucin fähige Stämme. Beispiele für solche Stämme umfassen
Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM-BP 1497),
Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM-BP 1498),
Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11(FERM-BP 1500),
Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM-BP 1499)
(diese Stämme sind am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt). Zellen dieser Stämme können für die Durchführung der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden.
Neben den oben genannten Stämmen können Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, B. ammoniagenes ATCC 13745, B. ammoniagenes ATCC 13746, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 (diese Stämme sind an der American Type Culture Collection, U. S. A., hinterlegt) ebenfalls verwendet werden.
Der oben erwähnte Stamm FERM-BP 1498 ist ein Ethanol verwertender Stamm mit DL-α-Aminobuttersäureresistenz (japanische Patentschrift Nr. 12 77 992 und japanische Offenlegungsschrift Nr. 28 398/84, col.3-4), der aus dem Elterstamm FERM-BP 1497 (japanische Patentschrift Nr. 11 47 343 und japanische Offenlegungsschrift Nr. 26 755/82) abgeleitet worden ist. Der Stamm FERM-BP 1500 ist ein mutierter Stamm mit einer hohen L-α-Aminobuttersäure-Transaminaseaktivität (japanische Offenlegungsschrift Nr. 51 998/87), der von dem Elterstamm FERM-BP 1497 abgeleitet worden ist. Der Stamm FERM-BP 1499 ist ein mutierter Stamm mit hoher D-α-Aminobuttersäure-Desaminaseaktivität (japanische Offenlegungsschrift Nr. 1 77 993/86) abgeleitet von dem Elterstamm FERM-BP 1497.
Für die erfindungsgemäße Verwendung des biotinabhängigen Stammes der Gattung Brevibacterium können die Mikrobenzellen als solche oder nach Immobilisierung mit konventionellen Methoden eingesetzt werden. Solche Immobilisierungsmethoden umfassen z. B. Einschluß in Polyacrylamid, Alginat und Karrageentang und Ionenbindung an DEAE-Sephadex, DEAE-Zellulose oder ähnliches.
Das Medium, das für die Herstellung der Mikrobenzellen eines biotinabhängigen Stammes des Genus Brevibacterium, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, benutzt wird, ist in seiner Zusammensetzung nicht kritisch, sondern kann aus den für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein üblichen Medien ausgewählt werden. Bevorzugt ist ein Medium, das Ethanol als hauptsächliche Kohlenstoffquelle enthält.
Als Stickstoffquellen können Materialien wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff und ähnliches verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können entweder alleine oder in Kombination verwendet werden.
Die anorganischen Salze, die dem Medium zugefügt werden können, umfassen Kaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat usw. Wenn es für das Wachstum der Mikroorganismen und die Herstellung von L-Isoleucin erforderlich ist, können andere Nährstoffe wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maislaugenflüssigkeit (corn step liquor), Casamino Acids und verschiedene Vitamine zugefügt werden.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in Roll-(Spinner-) oder Schüttelkulturen usw., bei einer Inkubationstemperatur im Bereich von ungefähr 20 bis 40°C, bevorzugt zwischen ungefähr 25 und 35°C, durchgeführt. Die Kultivierung wird bei ungefähr pH 5 bis 10 und bevorzugt bei pH 7 bis 8 durchgeführt. Zur pH-Kontrolle während der Kultivierung kann eine Säure und/oder eine Lauge zugesetzt werden.
Die Ethanolkonzentration beträgt zu Beginn der Kultivierung bevorzugt ungefähr 1 bis 5 Volumenprozent und besonders bevorzugt ungefähr 2 bis 3 Volumenprozent. Die Inkubationsdauer beträgt 2 bis 9 Tage und bevorzugt 4 bis 7 Tage.
Die Mikrobenzellen werden aus dem Kulturmedium gesammelt, mit Wasser von pH 7 bis 9 oder einem geeigneten Puffer, z. B. 0,1 M Phosphatpuffer oder ähnlichem im gleichen pH-Bereich gewaschen, und der erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktion unterworfen.
Erfindungsgemäß wird α-Aminobuttersäure oder α-Ketobuttersäure einer enzymatischen Reaktion in einem wäßrigen Reaktionsmedium, das mindestens Ethanol in der Gegenwart von Mikrobenzellen, die wie oben hergestellt worden sind (einschließlich immobilisierter Zellen), enthält, unterworfen. Die Ethanolkonzentration in dem wäßrigen Reaktionsmedium beträgt 1 bis 20 Volumenprozent und bevorzugt 2 bis 10 Volumenprozent.
Obwohl das wäßrige Reaktionsmedium ethanolhaltiges Wasser (pH 7 bis 9) oder eine Pufferlösung, wie z. B. Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer oder ähnliches (pH 7 bis 9) sein kann, ist ein ethanolhaltiges synthetisches Vollmedium bevorzugt. Die Bezeichnung "synthetisches Vollmedium" bezeichnet eine wäßrige Lösung, die diejenigen anorganischen Stickstoffquellen und anorganischen Salze enthält, die definierte chemische Zusammensetzungen oder Strukturen haben. Daher umfassen die anorganischen Stickstoffquellen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung dem synthetischen Vollmedium zugefügt werden können, Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw. Die anorganischen Salze können Kaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensulfat usw. sein. Diese anorganischen Stickstoffquellen und anorganischen Salze können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Konzentration dieser anorganischen Stickstoffquellen und/oder anorganischen Salze kann der Konzentration in dem Kulturmedium, das für die Kultivierung der Mikroorganismen verwendet wird, ähnlich sein und unterliegt keiner speziellen Einschränkung.
Ein typisches Beispiel für ein solches synthetisches Vollmedium ist eine wäßrige Lösung von pH 7,6, die 2 g/l (NH4)2SO4, 0,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l K2HPO4, 0,5 g/l MgSO4 · 7H2O, 20 ppm FeSO4 · 7H2O und 20 ppm MnSO4 · 4-6H2O enthält.
Das erfindungsgemäß verwendete synthetische Vollmedium enthält kein Biotin oder irgendein biotinhaltiges natürliches Material. Aminosäuren, Vitamine, Kohlenwasserstoffe usw. mit definierter, von Biotin verschiedener chemischer Struktur können zugesetzt werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen α-Aminobuttersäure und α-Ketobuttersäure ihre Salze. Weiterhin kann α-Aminobuttersäure L- oder DL-α-Aminobuttersäure sein und D-α-Aminobuttersäure wird nach Umwandlung zu DL-α-Aminobuttersäure verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es vorteilhaft, Produkte zu verwenden, die dadurch erhalten wurden, daß DL-α-Aminobuttersäure, die kommerziell zu niedrigen Preisen verfügbar ist, oder D-α-Aminobuttersäure oder D-reiche DL-α-Aminobuttersäure, die als nicht umgesetzter Rest in der enzymatischen Reaktion zurückgeblieben ist, der Racemisierung in Gegenwart von Mikroorganismen, die zur Racemisierung von D-α-Aminobuttersäure fähig sind, ohne L-Isoleucin als Substrat zu verwenden, prozessierter oder immobilisierter Preparationen davon unterworfen werden. Beispiele für prozessierte, von den Mikroorganismen abgeleitete Preparationen umfassen aufgebrochene Mikroorganismen, ein daraus extrahiertes Enzym, usw.
Der zur Racemisierung von D-α-Aminobuttersäure ohne Verwendung von L-Isoleucin als Substrat fähige Mikroorganismus kann z. B. Pseudomonas putida IFO 12996 sein (der Stamm ist am Institut für Fermentation, Osaka, hinterlegt).
Der oben erwähnte Mikroorganismus oder ein dazu gleichwertiger, der zur Racemisierung von D-α-Aminobuttersäure fähig ist, kann erfindungsgemäß zu Beginn der enzymatischen Reaktion oder im Verlauf der enzymatischen Reaktion zugesetzt werden. Alternativ kann der Mikroorganismus oder sein Äquivalent in einem von der enzymatischen Reaktion unabhängigen Reaktionssystem für die Racemisierung eingesetzt werden.
Der oben erwähnte Mikroorganismus, der zur Racemisierung von D-α-Aminobuttersäure fähig ist, die prozessierten oder immobilisierten Preparationen werden im allgemeinen in einem Verhältnis von ungefähr 0,1 bis 50 Gew.-% und bevorzugt in einem Verhältnis von ungefähr 1 bis 30 Gew.-% verwendet.
Die Konzentration von α-Aminobuttersäure oder α-Ketobuttersäure in der erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktion ist nicht kritisch, aber liegt im allgemeinen im Bereich zwischen 0,1 bis 20% (w/v) und bevorzugt 2 bis 10%. Die Menge an Mikrobenzellen ist ebenfalls nicht kritisch, aber liegt im allgemeinen zwischen 1 bis 50% (w/v) und bevorzugt 2 bis 30%.
Die erfindungsgemäße enzymatische Reaktion wird im allgemeinen bei ungefähr 20 bis 50°C und bevorzugt bei ungefähr 30 bis 40°C 10 bis 72 Stunden durchgeführt.
Die enzymatische Reaktion wird bevorzugt durchgeführt, während Luft oder Sauerstoff kontinuierlich oder intermittierend in das wäßrige ethanolhaltige Reaktionsmedium und bevorzugt in ein synthetisches ethanolhaltiges Vollmedium geblasen wird, so daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff mindestens 0,05 ppm und bevorzugt zwischen 0,05 und 8 ppm beträgt.
Die Isolierung und Reinigung des L-Isoleucin aus der Reaktionsproduktmischung kann mit üblichen Methoden durchgeführt werden, wie z. B. Ionenaustauscherharzbehandlung, Präzipitierung usw.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen Beispielen wurde L-Isoleucin qualitativ durch den Rf-Wert der Papierchromatographie, elektrophoretische Beweglichkeit und mikrobielle Aktivität im Mikrobioassay identifiziert. Die quantitative Abschätzung des L-Isoleucins wurde mit einem Mikrobioassay unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042 als Testorganismus in Kombination mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Shimadzu Modell LC-5A) vorgenommen. Wenn nicht anders angegeben, bedeutet "%" in den Beispielen "Gew.-%".
Beispiel 1 (Bereitstellung von Mikrobenzellen als Enzymquelle)
Ein 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurde mit 100 ml eines Vorkulturmediums gefüllt, das zusammengesetzt war aus 0,4% Harnstoff, 1,4% Ammoniumsulfat, 0,05% KH2PO4, 0,05% K2HPO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 2 ppm CaCl2 · 2 H2O, 2 ppm FeSO4 · 7 H2O, 2 ppm MnSO4 · 4-6 H2O, 2 ppm ZnSO4 · 7 H2O, 2 ppm NaCl, 200 umg/l Biotin, 100 ug/l Thiamin.HCl, 0,1% Casamino Acids und 0,1% Hefeextrakt. Nach dem Sterilisieren (pH 7,0 nach dem Sterilisieren) wurde der Kolben mit Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM-BP 1497) inokuliert. Dann wurden 2 ml Ethanol steril zugefügt und die Kultur wurde 2 Tage bei 30°C geschüttelt.
Dann wurde ein aerobes 2-Liter Roll-(Spinner)kulturgefäß mit 1000 ml eines Kulturmediums beschickt, das 2,3% Ammoniumsulfat, 0,05% KH2PO4, 0,05% K2HPO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 20 ppm FeSO4 · 7 H2O, 20 ppm MnSO4 · n H2O, 200 ug/l Biotin, 100 ug/l Thiamin.HCl, 0,03% Casamino Acids und 0,3% Hefeextrakt enthielt. Nach der Sterilisation (120°C, 20 Minuten) wurden 20 ml Ethanol und 20 ml der oben beschriebenen Vorkultur zugefügt. Anschließend wurde die Kultivierung bei 1000 u. p. m., 1 vvm Belüftung (Luftvolumen pro Flüssigkeitsvolumen pro Minute), 33°C und pH 7,6 48 Stunden durchgeführt.
Ethanol wurde schrittweise in Abständen von 1 bis 2 Stunden hinzugefügt, so daß seine Konzentration im Medium 2 Volumenprozent nicht überschritt.
(Enzymatische Reaktion von DL-α-Aminobuttersäure)
Die obenbeschriebene Kultur (100 ml) wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die dann in 50 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,6), der 0,5 g Ammoniumsulfat, 0,5 g DL-α-Aminobuttersäure und 1 ml Ethanol enthielt, suspendiert wurden. Die enzymatische Reaktion wurde 48 Stunden unter Schütteln bei 30°C durchgeführt.
Nach Ablauf der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Der Überstand enthielt 1,0 mg/ml L-Isoleucin.
Der oben genannte Überstand (40 ml) wurde über eine Säule eines stark sauren Kationaustauscherharzes (H⁺-Form) gegeben, um L-Isoleucin daran zu adsorbieren, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak durchgeführt. Die L-isoleucinreichen Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert und das Konzentrat wurde mit kaltem Ethanol behandelt, um L-Isoleucin auszufällen. Das Verfahren ergab eine Ausbeute von 28 mg roher Kristalle.
Beispiel 2
Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM-BP 1498) wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert und die enzymatische Reaktion wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Der Überstand enthielt 1,3 mg/ml L-Isoleucin.
Dieser Überstand (40 ml) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 aufgearbeitet und ergab 36 mg rohe L-Isoleucin-Kristalle.
Beispiel 3
Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM-BP 1500) wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert und die enzymatische Reaktion wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der Überstand enthielt 1,4 mg/ml L-Isoleucin.
Dieser Überstand (40 ml) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 aufgearbeitet und ergab 40 mg roher L-Isoleucin-Kristalle.
Beispiel 4
Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM-BP 1499) wurde unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1 beschrieben, kultiviert und die enzymatische Reaktion wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Der Überstand enthielt 1,1 mg/ml L-Isoleucin.
Dieser Überstand (40 ml) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 aufgearbeitet und ergab 30 mg roher L-Isoleucin-Kristalle.
Beispiel 5
Die Kultur (500 ml), die durch Vorkultur und Kulturverfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und die Zellen wurden zweimal mit entsalztem destilliertem Wasser gespült. Die gewaschenen Zellen wurden in 1000 ml eines Reaktionsmediums suspendiert, das 2 g/l (NH4)2SO4, 0,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l K2HPO4, 0,5 g/l MgSO4 · 7 H2O, 20 ppm FeSO4 · 7 H2O, 20 ppm MnSO4 · 4-6 H2O, 100 ug/l Thiamin · HCl und 10 g/l DL-α-Aminobuttersäure (pH 7,6) enthielt und diese Suspension wurde in 2 l aerober Rollerkulturgefäße gefüllt. Nach Zugabe von 20 ml Ethanol wurde die enzymatische Reaktion bei 300 u. p. m., 33°C und pH 7,6 24 Stunden durchgeführt, wobei die Konzentration von gelöstem Sauerstoff, wie in Tabelle 1 gezeigt, variiert wurde.
Nach Ablauf der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert (4000 u. p. m., 15 Minuten, 4°C), um die Zellen zu entfernen, und der L-Isoleucingehalt des Überstandes wurde bestimmt. Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 6
Das Verfahren zur Kultivierung und enzymatischen Reaktion von Beispiel 5 wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM-BP 1498) eingesetzt wurde. Das erhaltene L-Isoleucin wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Beispiel 7
Das Verfahren zur Kultivierung und enzymatischen Reaktionen aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM-BP 1500) eingesetzt wurde; das erhaltene L-Isoleucin wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Beispiel 8
Das Verfahren zur Kultivierung und enzymatischen Reaktion aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM-BP 1499) eingesetzt wurde; das erhaltene L-Isoleucin wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Beispiele 9 bis 12
Das Verfahren der Beispiele 5 bis 8 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß anstelle von 10 g/l DL-α-Aminobuttersäure 10 g/l Natrium-α-Ketobutyrat verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Beispiele 13 bis 16
Aus jeweils 500 ml der Mischungen der enzymatischen Reaktionsprodukte aus den Beispielen 5 bis 8, die mit 1,5 ppm gelösten Sauerstoff erhalten wurden, wurde L-Isoleucin abgetrennt und unter den folgenden Bedingungen gereinigt. Dafür wurde jede Reaktionsproduktmischung über eine Säule mit stark sauren Kationaustauscherharz (H⁺-Form) gegeben, um L-Isoleucin daran zu adsorbieren, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak durchgeführt. Die L-isoleucinreichen Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert und das Konzentrat mit kaltem Ethanol behandelt, um Kristalle von L-Isoleucin zu ergeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 1
Vergleichsbeispiel 1 (Herstellung von D- -Aminobuttersäureracemase)
Ein 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurde mit 100 ml Medium A gefüllt, dessen Zusammensetzung unten gezeigt ist; nach 15 Minuten Sterilisation bei 120°C wurde das Medium mit einer Impföse voll Pseudomonas putida IFO 12996 beimpft und die Kultur 24 Stunden bei 30°C geschüttelt. Dann wurde ein 5-l- Erlenmeyer-Kolben mit 1 l des gleichen Mediums A wie oben beschickt und nach 15 Minuten Sterilisation bei 120°C wurde das Medium mit 20 ml der oben beschriebenen Vorkultur inokuliert und unter Schütteln 24 Stunden bei 30°C inkubiert.
Nach Abschluß der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation des Mediums (1 l) gesammelt und in reinem Wasser suspendiert, um 20 ml einer Zellsuspension zu ergeben. Dieser Zellsuspension wurden 4,2 g Acrylamid zugefügt, 0,28 g N,N′-Methylen-bis-acrylamid, 3 ml 4%iges β-(Dimethylamino)propionitril und 2 ml 2%iges Kaliumperchlorat; die Mischung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um ein zellhaltiges Polymer zu erhalten. Das Produkt der Polymerisationsreaktion wurde pulverisiert und mit reinem Wasser abgespült, um 30 g immobilisierter Zellen für die Verwendung als D- -Aminobuttersäure- Racemasequelle zu erhalten. Das Verfahren zur Immobiliserung der Zellen wurde steril durchgeführt.
Medium A
Fleischextrakt|1%
Pepton 1%
NaCl 0,5%
pH 7,2
Beispiel 17
Ein 500 ml Erlenmeyer-Kolben wurde mit 50 ml eines Mediums gefüllt, das 0,4% Harnstoff, 1,4% Ammoniumsulfat, 0,05% KH2PO4, 0,05% K2HPO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 2 ppm CaCl2 · 2 H2O, 2 ppm FeSO4 · 7 H2O, 2 ppm MnSO4 · 4-6 H2O, 2 ppm ZnSO4 · 7 H2O, 2 ppm NaCl, 200 ug/l Biotin, 100 ug/l Thiamin.HCl, 0,1% Casamino Acids und 0,1% Hefeextrakt enthielt. Nach der Sterilisation (pH 7,0 nach Sterilisation) wurde die Flasche mit Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM-BP 1497) inokuliert. Dann wurden 1,5 ml Ethanol steril zugefügt und die Kultur 3 Tage bei 30°C geschüttelt. Nach Abschluß der Kultivierung wurden die Zellen für die Verwendung als Enzymquelle für die Herstellung von L-Isoleucin aus DL-α-Aminobuttersäure durch 15 Minuten Zentrifugation bei 4000 u. p. m. geerntet.
Die obengenannten Zellen (5 g) und die immobilisierten Zellen (20 g), hergestellt im Vergleichsbeispiel 1, wurden in 100 ml eines Reaktionsmediums suspendiert, das 0,5 mg DL-α-Aminobuttersäure, 5 ug Pyridoxalphosphat, 100 uMol Phosphatpuffer und 10 mg Ethanol pro ml (pH 7,0) enthielt und die enzymatische Reaktion wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 45 mg.
Die Zellen und Verunreinigungen wurden aus der Reaktionsmischung entfernt und das Filtrat über eine Säule mit stark saurem Kationenaustauscherharz (H⁺-Form) gegeben, um L-Isoleucin daran zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule wurde die Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak durchgeführt. Die L-isoleucinreichen Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert und das Konzentrat wurde mit kaltem Ethanol behandelt, um 31 mg rohe L-Isoleucin-Kristalle zu erhalten. Wenn die im Vergleichsbeispiel 1 hergestellten immobilisierten Zellen nicht zugefügt wurden, betrug die Gesamtausbeute an L-Isoleucin 35 mg.
Beispiel 18
Ein 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurde mit 50 ml des gleichen Mediums, das im Beispiel 17 verwendet wurde, gefüllt und nach der Sterilisation (pH 7,0 nach der Sterilisation) wurde der Kolben mit Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM-BP 1498) inokuliert. Die Kultur wurde 3 Tage bei 30°C geschüttelt. Die erhaltene Kultur wurde 15 Minuten bei 4000 u. p. m. zentrifugiert, um die Zellen zu ernten.
Die obengenannten Zellen (5 g) und die immobilisierten Zellen (20 g), die in Übereinstimmung mit Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in 100 ml des gleichen Reaktionsmediums, das im Beispiel 17 verwendet worden ist, suspendiert, und die enzymatische Reaktion wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 55 mg. Wenn die immobilisierten Zellen nicht zugefügt worden waren, betrug die Gesamtausbeute an L-Isoleucin 41 mg.
Beispiel 19
Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM-BP 1500) wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 17 kultiviert und das erhaltene Medium wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Diese Zellen (5 g) und die immobilisierten Zellen (20 g), die in Übereinstimmung mit Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in 100 ml des gleichen Reaktionsmediums, das in Beispiel 17 verwendet worden ist, resuspendiert, und die enzymatische Reaktion wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 61 mg. In Abwesenheit immobilisierter Zellen betrug die Gesamtausbeute an L-Isoleucin 35 mg.
Beispiel 20
In der gleichen Weise wie in Beispiel 17 hergestellte Zellen (5 g) von Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM-BP 1497) wurden in 100 ml eines Reaktionsmediums suspendiert, das 0,5 mg D-α- Aminobuttersäure, 5 ug Pyridoxalphosphat, 100 uMol Phosphatpuffer und 10 mg Ethanol pro ml (pH 7,0) enthielt; anschließend wurden 20 g der immobilisierten Zellen, die in Übereinstimmung mit Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden waren, zugefügt. Die enzymatische Reaktion wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 30 mg. In Abwesenheit immobilisierter Zellen betrug die Gesamtausbeute 2,5 mg.
Beispiel 21
Unter Verwendung von Zellen von Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM-BP 1498), die in der gleichen Weise wie im Beispiel 18 hergestellt worden waren, und unter Verwendung des gleichen Reaktionsmediums, das in Beispiel 20 verwendet worden ist, wurde die enzymatische Reaktion 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 36 mg. In Abwesenheit immobilisierter Zellen betrug die Gesamtausbeute 7 mg.
Beispiel 22
Unter Verwendung der Zellen von Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM-BP 1500), die in der gleichen Weise wie im Beispiel 19 hergestellt worden sind, und unter Verwendung des gleichen Reaktionsmediums, wie dem in Beispiel 20 verwendeten, wurde die enzymatische Reaktion 24 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Gesamtausbeute an L-Isoleucin betrug 42 mg. In Abwesenheit immobilisierter Zellen betrug die Gesamtausbeute 2,7 mg.

Claims (3)

1. Verfahren für die Herstellung von L-Isoleucin durch eine enzymatische Reaktion, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
  • (a) Kultivieren von Zellen eines biotinabhängigen Stammes der Gattung Brevibacterium in einem biotinhaltigen Medium;
  • (b) Gewinnen der Zellen aus dem biotinhaltigen Medium;
  • (c) Überführen der Zellen in ein wäßriges Reaktionsmedium, welches α-Aminobuttersäure oder β- Ketobuttersäure und mindestens Ethanol, jedoch kein Biotin enthält, um L-Isoleucin in dem wäßrigen Reaktionsmedium herzustellen; und
  • (d) Isolieren von L-Isoleucin aus dem wäßrigen Reaktionsmedium.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Reaktionsmedium ein synthetisches Vollmedium ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion durchgeführt wird, während die Konzentration gelösten Sauerstoffs im wäßrigen Reaktionsmedium auf einem Niveau von mindestens 0,05 ppm gehalten wird.
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