DE3320653A1

DE3320653A1 - Fermentatives verfahren zur herstellung von l-leucin

Info

Publication number: DE3320653A1
Application number: DE19833320653
Authority: DE
Inventors: Gary Jim 21227 Elkridge Calton, Md.; Mark Hampton 21227 Baltimore Updike, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1982-06-16
Filing date: 1983-06-08
Publication date: 1983-12-22
Also published as: GB2122990A; SE8303391L; SE8303391D0; CA1192156A; FR2528868A1; IT8321508A0; US4421854A; IT1163478B; AU551985B2; AU1327183A; GB2122990B; NL8300370A; JPS58220692A; GB8315822D0; CH654850A5

Description

Beschreibung

Die fermentative Herstellung von L-Leucin, L-Valin und anderen Aminosäuren war bereits Gegenstand umfangrei-. eher Forschungsarbeiten. Dabei sind zahlreiche Mikroorganismengattungen zusammen mit verschiedenen Aminosäureanalogen angewandt worden. Aus der US-PS 3 865 690 ist die Herstellung von L-Leucin durch Züchtung eines gegenüber einem Leucinantagonisten resistenten Stammes von Brevibacterium oder Corynebacterium bekannt. Aus der US-PS 3 970 519 ist die Züchtung von Stämmen der gleichen Gattung in Gegenwart verschiedener Aminosäuren zur Herstellung von L-Leucin bekannt. Aus der US-PS 3 893 888 ist bekannt, daß L-Valin von mutanten Stämmen von Brevibacterium gebildet werden kann, die gegenüber a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV) resistent sind. Ferner beschreibt die US-PS 3 668 073 die Herstellung von L-Leucin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium in Gegenwart eines "Promotors" für Isoleucin, Methionin, Phenylalanin oder Valin, wie beispielsweise Azaleucin oder AHV. Azaleucin ist ebenfalls als Analoges für die Herstellung von L-Leucin verwendet worden, vgl. Wang et al. "Fermentations und Enzym-Technologie", John Wiley und Söhne, Inc., 1979, Seiten 18 bis 20. Die US-PS 3 759 789 beschreibt die Verwendung von Arthrobacter alkanicus-Kultüren, welche gegenüber L-Threonin resistent sind. L-Leucin- und L-Isoleucin-precurser können zugegeben werden, um die Ausbeute zu verbessern.

Die nachfolgend genannte Literatur ist relevant:

1. Araki, Kazumi, H. Ueda and S. Saigusa. Fermentative Herstellung von L-Leucin mit auxotrophen Mutanten von Corynebacterium glutamicum. Agr. Biol. Chem. 3j3 (3), 565-572 (1974).

2. CaIvo, R.A., and J.M. Calvo. Fehlen der Endprodukthemmung und Repression bei der Leucinsynthese bei

-|0 einem Stamm von Salmonella typhimurium. Science, 156, 1107-1109 (1967).

3. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. Leucinakkumulationen bei Isoleucinrevertanten von Serratia

-15 marcescens, die resistent gegenüber a-Aminobuttersäure sind: Fehlen von sowohl Feedbackhemmung als auch Repression. J. Biochem., 73.# 107-115 (1973).

4. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose ^ar*d S. Okumura. Kulturbedingungen zur L-Leucinherstellung bei Stamm Nr. 218, einer Mutante von Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 3J9(5)_f 1149-1153 (1975).

5. Tsuchida, T., and H. Momose. Genetische Veränderungen der Regulationsmechanismen bei Leucin und Valin bildenden Mutanten abgeleitet von Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. ^i(¹¹K 2193-2198 (1975).

6. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Bildung von L-Leucin durch eine Mutante von Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 38(10), 19097-1911 (1974).

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5 -

7. Freundlich. M. and J.M. Trela. (1969)· Steuerung der Isoleucin-, Valin- und Leucinbiosynthese. J. of Bacteriology, 101-106.

8. Izumi, Y., Y. Asano, Y. Tani and K., Ogata. (1977). Bildung von Valin und Leucin durch gegenüber Analogen resistente Mutanten eines obligat methylotrophen Methylomonas aminofaciens. J. Ferment. Technol., ^5, 452-458.
10

9. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. (1977) Syntheseweg der Isoleucinbildung aus Pyruvat durch enzymatische Leucinbiosynthese bei Leucin-akkumulierenden Isoleucinrevertanten von Serratia marces-

cens. J. Biochem., 82!, 95-103. ;

10. Kisumi, M., J. Kato, S. Komatsubara, I. Chibata. (1973) Bildung von Isoleucin, Valin und Leucin durch Regulations-Mutanten von Serratia marcescens. "Genetics of Industrial Microorganismus - Bacteria".

11. Rogerson, Α., and M. Freundlich. (19 69). Steuerung der Isoleucin-, Valin- und Leucinbiosynthese. VIII. Mechanismus der Wachstumshemmung durch Leucin bei Relaxed- und Stringent-Stämmen von Escherichia coli K-12. Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.

Ferner wurden allgemeine Artikel über Biosynthesewege für L-Leucin ebenso wie für andere Aminosäuren veröff"entlicht, vgl.:

12. Szentirmai, A. and I. Horvath. (1976). Regulation der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 23, 137-149.

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13. Umbarger, H. E. (1974). Die bei der multivalenten Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin und Valin bei Enterobacteriaceaen beteiligten Elemente. Proceedings of the 1st. Intersectional Congress of IAMS, ]L, Tokyo.

14. Umbarger, H.E. (1973). Genetische und physiologische Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin, Valin und Leucin bei Enterobacteriaceaen. "Genetics of Industrial Microorganisms."

15. Umbarger, H.E. (1978). Aminosäurebiosynthese und ihre Regulation. Ann. Rev. Biochem., AJ_, 533-606, 563.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin durch Züchtung von gegenüber einem Analogen von L-Leucin resistenten Stämmen von Arthrobacter citreus unter aeroben Bedingungen.

Für die Mutation ausgewählte Wildstämme von Arthrobacter citreus (beispielsweise ATCC 17775) sind durch eine Überproduktion von Glutaminsäure gekennzeichnet. Der Biosyntheseweg, auf dem Mikroorganismen L-Leucin bilden ist allgemein bekannt, vgl. Umbarger, "Aminosäurebiosynthese und ihre Regulation", Ann. Rev. Biochem. 1978, 47, 563-565. Wie in dieser Literaturstelle angegeben ist, nimmt man an, daß die Synthese über folgende Stufen verläuft: Pyruvat, ot-Acetolactat, α ,ß-Dihydroxyisovaleriat, a-Ketoisovaleriat, a-Isopropylmalat, ß-Isopropylmalat, a-Ketoisocapronat, L-Leucin.

Bestimmte Analoge der natürlich auftretenden Aminosäuren eignen sich zur Isolierung der erfindungsgemäßen mutanten Stämme. Diese Analogen sind für Stämme

toxisch, welche keine Überproduktion von L-Leucin haben. Beispiele für derartige Analoge sind a-Amino-ßhydroxyvaleriansäure, D-Leucin, a-Aminoisoamylsulfonsäure, Norvalin, Norleucin, Methallylglycin , a-Amino-ßehlorbuttersäure, Valin, a-Chlorleucin, Isoleucin, ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin, 3-Cyclopenten-l-alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure, 5',5",5'-Trifluorleucin, 4-Azaleucin.

Die gegenüber Leucinanalogen resistente Mutante kann durch ultraviolette Bestrahlung eines Wildtypstammes von Arthrobacter citreus oder durch Behandlung des WiIdstairanes mit einer inutagenen Substanz wie beispielsweise Ethylmethansulfonat, N-Methyl-N,-nitro-N-nitrosoguanidin usw. erhalten werden. Anschließend kann der Stamm in Gegenwart des Analogen angezogen werden, um die Kolonien mit L-Leucin-Überproduktion zu isolieren.

Eine lebensfähige Kultur einer L-Leucin erzeugenden Mutante von Arthrobacter citreus, die gegenüber Azaleucin (Produkt aus Beispiel 1) resistent ist, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Nr. ATCC 39103 hinterlegt. Auf die gleiche Weise wurde eine Kultur des Produktes aus Beispiel 2 unter der Nr. ATCC 39106 hinterlegt.

Die Fermentation der isolierten Mutanten von Arthrobacter citreus kann durch Schüttelkultivierung oder submerse Fermentation unter aeroben Bedingungen bewirkt werden. Die Fermentation wird bei 25 bis 40° C und einem pH-Wert von 5 bis 8 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) durchgeführt. Für die Einstellung des pH-Wertes des Mediums können Calciumcarbonat und/oder Ammoniak verwendet werden. Alternativ können Morpholinsulfonsäurederivate

verwendet werden, vgl- Beispiel 1. Das Fermentationsmedium enthält eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie weitere Elemente. Zur Fermentation geeignete Kohlenstoffquellen schließen fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate und Proteine ein. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von organischen Säuren (beispielsweise Ammoniumacetat und Amoniumoxalat) und Ammoniumsalze anorganischer Säuren (beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder

-IO Ammoniumchlorid). Die Mengen der Kohlenstoff- und Stickstoff quellen in dem Medium betragen von 0,001 bis 20 % (Gew./Vor). Auch organische Nährstoffe (beispielsweise Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakte, Sojabohnenextrakte) und/oder anorganische Elemente (beispielsweise

Ι 5 Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Vitamine wie Biotin und Thiamin und Aminosäuren, z.B. Valin) können dem Medium zugefügt werden. Die Fermentation ist innerhalb von 16 bis 17 6 Stunden beendet, wobei L-Leucin in der Fermentationsbrühe angereichert wird.

Nach Abschluß der Fermentation, d.h. nachdem sich 0,1 bis 0,8 % (Gew./Vol.) L-Leucin in der Brühe angesammelt haben, werden die Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur nach herkömmlichen Verfahren aus der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Zur Gewinnung und/oder Reinigung des L-Leucins aus dem Filtrat oder dem Überstand können bekannte Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem starken Kationenaustauscherharz behandelt werden. Das Harz wird anschließend mit einer verdünnten alkalischen Lösung, z.B. wäßrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Leucin enthaltenden Eluate werden vereinigt und eingeengt. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Alkanol wie Methanol oder Ethanol gegeben. Die ausgefällten Kristalle können aus

einem wäßrigen Alkanol wie wäßrigem Methanol oder wäßrigem Ethanol umkristallisiert werden, um reine Kristalle von L-Leucin zu erhalten.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1

EMS-Mutation und Resistenz gegenüber niedrigen
Konzentrationen von Azaleucin

Eine frische Schrägkultur von Arthrobacter citreus (ATCC 17775) wurde mit 0,1 molarem Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die gebildete Zellsuspension wurde in ein steriles Teströhrchen dekantiert, zu dem eine ausreichende Menge Ethylmethansulfonat (EMS) gegeben wurde, um eine 0,05 molare Konzentration zu erhalten. Das Röhrchen wurde 18 Stunden bei 30° C inkubiert. Die Zellsuspensionen wurden anschließend zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in frischem Puffer resuspendiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen zum Beimpfen eines das folgende Medium (Medium E) enthaltenden Röhrchens verwendet. Es wurde 10 %iges Inokulat verwendet.

- ίο -

Glucose

NH₄Cl Harnstoff

K₂HPO₄ KH₂PO₄ MgSO₄ · 7H₂O Biotin Thiamin HCl

3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure (i.e. "MOPS", Sigma Chemical Company)

Spurenelementlösung (siehe unten)

Medium E	/5	g
	,5	g
	,5	g
Je Liter entionisiertes ^H2°		g
50		g
5	,9	g
5		. μ9
0	mg
0	. g
0	ml
100
1
20
1

Der pH-Wert des Mediums wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt. Das Medium wurde 15 Minuten bei 112° C autoklaviert. Zur Herstellung von Medium E Agar wurden X5 g/l 20 Agar Nobel (Difco) zu der Medium Ε-Lösung gegeben.

- 11 -

Die Spurenelementlösung setzte sich wie folgt zusammen;

Spurenelementlösung

ZnSO

FeSO₄ · 7H₂O CuSO₄ · 5H_£0 Na₂B₄O₇ · 10H₂O Na₂Mo₂O₄ · 2H₂O MnSO₄ · H₂O CoCl₂ · 6H₂O CaCl

Je Liter entionisiertes
Wasser

8,8 gm

10,0 gm

60 mg

88 mg ' |

53 mg

7,5 gm

120 mg ^;

55 mg

Der pH-Wert der Spurenelementlösung wurde mit H„S0. auf 2 eingestellt und die Lösung in einer dunklen Flasche bei etwa 2 bis 0° C aufbewahrt.

Die Zellen wurden 17 Stunden bei 30° C in einem Gyrotary-Schüttler bei 300 Upm inkubiert und anschließend auf Medium E Agar (modifiziert - nur 2 % Glucose, der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 7,8 eingestellt), zu dem nach dem Autoklavieren unterschiedliche Mengen (d.h. von 0,2 bis 10 g/l) Azaleucin gegeben worden waren, plattiert. Die Platten wurden bei 30° C inkubiert. Wenn sich Kolonien bildeten (z.B. nach etwa 2 bis 4 Inkubationstagen) wurden diese auf frische Medium E Agarplatten übertragen.

Die isolierten Azaleucinkulturen wurden in Röhrchen mit Medium E und Isoleucinmedium 5 überimpft und 3 Tage bei 30° C und 300 Upm inkubiert.

Isoleucinmedium 5

Per Liter E.I.— H-O

Glucose 100 g

(NH)₂SO₄ 50 g

MgSO₄ · 7H₂O 0,4 g

CaCO₃ 50 g

KH₂PO₄ 3 g

2/

Bacto-soytone—' 0,6 g ·

Biotin 100 yg

Thiamin HCl 1 mg

Spurenelementlösung 1 ml

Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,8 eingestellt. 15

—D.I. = entionisiert

2/

— Ein enzymatisches Hydrolysat aus Sojabohnenmehl, vertrieben von Difco Laboratories, Inc.

0 Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung 17775/14, resistent gegenüber 4 g/l Azaleucin, lieferte 4,56 g/l Leucin in Isoleucinmedium 5, bestimmt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).

5 Für die HPLC-Analyse wurden die Aminosäuren in ihre Dansylderivate (siehe unten) überführt, anschließend getrennt und jede Komponente.nach Standardverfahren quantitativ analysiert. Das nachfolgende Verfahren gibt die Umsetzung der Aminosäuren zur HPLC-Analyse an:

Reaktionsmechnismus

Dansylchlorid (l-Dimethylaminonaphthalen-5-sulfonylchlorid) reagiert mit der Aminogruppe von Aminosäuren. Die Dansylderivate können durch Flüssigchromatographie getrennt und durch Ultraviolettabsorption nachgewiesen werden.

Die folgenden Reagenzien wurden bei der HPLC-Analyse verwendet:

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1. Puffer: Es wurden 2,956 g Lithiumcarbonat in einen 1-Liter-Kolben eingewogen und mit destilliertem Wasser bis zu der Markierung aufgefüllt. Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 9,5 eingestellt.

2. Dansylchloridlösung: 75 mg Dansylchlorid wurden in einen 25 ml Meßkolben eingewogen und bis zur Markierung mit Acetonitril aufgefüllt.

20

3. Löscher: 5,0 g Methylaminhydrochlorid wurden in einen 250 ml Meßkolben eingewogen und mit destilliertem Wasser bis zur Markierung aufgefüllt.

4. Essigsäure

5. Aminosäurestandard H (Pierce Chemical Co., Kat. No. 20088).

6· Triethylamin

8. Lösungsmittelmischung: 877 ml destilliertes Wasser

100 ml Methanol

14 ml Essigsäure

20 ml Tetrahydrofuran

1,7 ml Triethylamin.

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- 14 -

Verfahren
A. Herstellung der Standardlösungen

1. Unter Verwendung einer Mikrospritze wurden jeweils 50, 100 und 200 μΐ des Pierce Aminosäurestandards in 5 ml Meßkolben überführt.

2. Die 5 ml Meßkolben wurden in einen Vakuumexsiccator gebracht und unter Vakuum bis zur Trockne evaporiert (gewöhnlich wird dazu 1 Nacht benötigt).

3. In jeden Meßkolben wurden 2,0 ml Puffer (Reagenz 1 siehe oben) pipettiert.

4. In jeden Meßkolben wurden 1,0 ml Dansylchlorid (Reagenz 2 siehe oben) pipettiert.

5. Es wurde gründlich gemischt und die Kolben 30 Minuten in ein Wasserbad von 30 C gesetzt.

6. Zu jedem Meßkolben wurden 100 μΐ Löscher gegeben (Reagenz 3).

7. Es wurde gründlich gemischt und man ließ die Kolben etwa 5 Minuten stehen.

8. Zu jedem Kolben wurden 75 μΐ Essigsäure (Reagenz 4) gegeben und gemischt.

9. Es wurde mit Lösungsmittelmischung (Reagenz 7) bis zur Markierung aufgefüllt und gemischt.

Anmerkung: Die Standardlösungen sollten bis zur Verwendung gekühlt werden.
35

B. Probenherstellung;

Anmerkung: Alle zur Analyse vorgesehenen Proben müssen

gekühlt werden.
5

1. Eine Teilmenge von 50 μΐ jeder Probe wunde in einen 5 ml Meßkolben überführt.

2. Die Umsetzung wurde beginnend mit Schritt A/3 wie oben angegeben fortgesetzt.

Anmerkung: Alle umgesetzten Proben wurden bis zur Analyse gekühlt.

Beispiel 2

Zweite EMS-Mutation und Resistenz gegenüber höheren Konzentrationen von Azaleucin

Die gemäß Beispiel 1 hergestellte gegenüber Azaleucin resistente Mutante 17775/14 wurde nochmals in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben einer Behandlung mit Ethylmethansulfonat unterzogen.

Nach der EMS-Mutation und Inkubation bei 30° C in Medium E über Nacht wurden die Zellen einmal mit 0,1 molarem Phosphatpuffer gewaschen und auf Medium E Agar plattiert, welcher Azaleucin (nach dem Autoklavieren zugegeben) in Konzentrationen von 4 bis 20 g/l enthielt. Der pH-Wert des 12 bis 20 g/l Azaleucin enthaltenden Agars war vor dem Autoklavieren mit NaOH auf 9,6 eingestellt worden. Die Zugabe von 20 g/l Azaleucin nach dem Autoklavieren ließ den pH-Wert auf 5,6 fallen.

Die Platten wurden 3 bis 7 Tage bei 30° C inkubiert. Die resistenten Kulturen wurden auf frische Medium-E

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- 16 -

Platten übertragen, von denen sie in Röhrchen mit Isoleucinmedium 5 überimpft wurden. Nach Inkubation bei 30° C und 300 Upm für 3 Tage wurden die gewonnenen Brühen mit HPLC analysiert, wie im einzelnen in Beispiel 1 beschrieben. Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung 17775-14-7, resistent gegenüber 20 g/l Azaleucin, zeigte einen Titer von 8,0 g/l Leucin.

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante von Arthrobacter citreus, die resistent gegenüber Analogen von L-Leucin ist, unter aeroben Bedingungen züchtet, um eine Fermentationsbrühe zu erhalten, und das angereicherte L-Leucin aus der Fermentationsbrühe gewinnt«
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 25 bis 40° C für 16 bis 176 Stunden durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einem pH-Wert des Fermentationsmediums von 5 bis 9 durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 verwendet und die Fermentation bei 25 bis 40° C für 16 bis l'<
5 bis 8 durchführt.

4 0° C für 16 bis 17 6 Stunden bei einem pH-Wert von
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Analoges a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure , D-Leucin, cx-Aminoisoamy lsulf onsäure , Norvalin, Norleucin, Methallylglycin, a-Amino-ß-chlorbuttersäure, Valin, α-Chlorleucin, Isoleucin, ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin, 3-Cyclopenten-l-alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure, 5',5',5'-Trifluorleucin und 4-Azaleucin verwendet.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante eine Mutante von ATCC 39103 verwendet.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante ATCC 39103 verwendet.