CH654850A5

CH654850A5 - Fermentative herstellung von l-leucin.

Info

Publication number: CH654850A5
Application number: CH2747/83A
Authority: CH
Inventors: Mark Hampton Updike; Gary Jim Calton
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1982-06-16
Filing date: 1983-05-19
Publication date: 1986-03-14
Also published as: AU1327183A; JPS58220692A; DE3320653A1; SE8303391D0; AU551985B2; NL8300370A; GB8315822D0; IT8321508A0; IT1163478B; GB2122990A; SE8303391L; GB2122990B; US4421854A; FR2528868A1; CA1192156A

Description

Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, welches die Kultivierung von mutierten Stämmen von Arthrobacter citreus, welche resistent gegen ein Analoges von L-Leucin sind, unter aeroben Bedingungen umfasst.

Wildstämme von Arthrobacter citreus (z.B. ATCC 17775), welche für die Mutation ausgewählt wurden, zeichnen sich durch eine Überproduktion von Glutaminsäure aus. Der Biosyntheseweg, auf welchem Mikroorganismen L-Leucin synthetisieren, ist allgemein bekannt. Siehe zum Beispiel Umbarger, «Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation», Annu. Rev. Biochem. 1978.47: 563-565. Wie in dieser Literaturstelle angegeben, wird angenommen, dass die Synthese über die folgenden Stufen erfolgt: Pyruvat - a-AcetoIactat - <x,ß-Di-hydroxyisovaleriat - a-Ketoisovaleriat - a-Isopropylmalat -ß-Isopropylmalat - a-Ketoisocaproat - L-Leucin.

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Gewisse Analoge der natürlichen Aminosäuren eignen sich zur Isolierung der für diese Erfindung benötigten Mutantenstämme. Diese Analogen sind für Stämme, welche keine Überproduktion von L-Leucin aufweisen, toxisch. Solche Analoge umfassen a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, D-Leu-cin, a-Aminoisoamylsulfonsäure, Norvalin, Norleucin, Methallylglycin, a-Amino-ß-chlorbuttersäure, Valin, c-Chlor-leucin, Isoleucin, ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin, 3-Cyclopenten-1 -alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure, 5',5',5'-Trifluoroleucin und 4-Azaleucin.

Eine gegen Leucinanaloge resistente Mutante kann durch Ultraviolettbestrahlung eines Wildstammes von Arthrobacter citreus erzeugt werden, oder durch Behandlung des Wildstammes mit einem Mutagen, z.B. Äthylmethansulfonat, N-Methyl-Ni-nitro-N-nitrosoguanidin usw. Danach kann der Stamm in der Gegenwart des Leucinanalogen kultiviert werden, um Kolonien, welche L-Leucin in erhöhter Menge produzieren, zu isolieren.

Eine lebensfähige Kultur einer L-Leucin produzierenden Mutante von Arthrobacter citreus, welche resistent gegen Azaleucin ist (gemäss Beispiel Nr. 1 erzeugt), ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rock-ville, Maryland 20852, unter der Bezeichnung ATCC 39103 am 15.4.1982 hinterlegt worden. In ähnlicher Weise ist eine Kultur, welche gemäss dem Beispiel Nr. 2 erhalten worden ist, unter der Bezeichnung ATCC 39106 am 15.4.1982 hinterlegt worden.

Die Fermentation der isolierten Mutantenstämme von Arthrobacter citreus kann in Schüttelkultur oder in belüfteten Fermentern unter aeroben Bedingungen erfolgen. Die Fermentation erfolgt im allgemeinen zwischen 25 und 40 °C und bei einem pH zwischen 5 und 8 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5). Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums können Calciumcarbonat und/oder Ammoniak verwendet werden. Als Alternative können auch Derivate der Morpholinosulfonsäure verwendet werden, wie dies z.B. im untenstehenden Beispiel Nr. 1 beschrieben ist. Das Wachstumsmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere Bestandteile. Fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate und Proteine eignen sich als Kohlenstoffquellen. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von organischen Säuren (z.B. Ammoniumacetat und Ammonium-oxalat) und Ammoniumsalze von anorganischen Säuren (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumchlorid). Die im Medium vorhandenen Mengen an Kohlenstoff-und Stickstoffquellen betragen in der Regel zwischen 0,001 und 20 Gewichtsprozent. Organische Nährstoffe (z.B. Com steep liquor, Pepton, Hefeextrakte, Sojabohnenextrakte) und/ oder anorganische Bestandteile (z.B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Vitamine, wie Biotin und Thiamin, und Aminosäuren, z.B. Valin) können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden. Die Fermentation wird üblicherweise 16 bis 176 Stunden lang gefahren, wobei sich L-Leucin im Wachstumsmedium anreichert.

Nach Beendigung der Fermentation, d.h., wenn das Medium zwischen 0,1 und 0,8 Gewichtsprozent L-Leucin enthält, werden Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur durch konventionelle Techniken, wie Filtration oder Zentrifu-gation, aus dem Medium entfernt. Für die Anreicherung und/ oder Reinigung des L-Leucins aus dem Filtrat oder dem Überstand können bekannte Verfahren verwendet werden. Die filtrierte Fermentationsbrühe kann beispielsweise mit einem starken Kationenaustauscher behandelt werden. Der Ionenaustauscher wird danach mit verdünntem Alkali, wie einer wässrigen Ammoniaklösung ausgewaschen. Die L-Leucin enthaltenden Eluate werden zusammengeschüttet und konzentriert.

Ein Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, wird der konzentrierten Lösung zugesetzt. Die präzipitierten Kristalle können in wässrigen Alkanollösungen, beispielsweise wässriger Methanol- oder wässriger Äthanollösung, umkristallisiert werden, um reines, kristallines L-Leucin zu erhalten. 5 Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung:

Beispiel 1

EMS Mutation und Resistenz gegen niedrige Konzentrationen von Azaleucin io Eine frische Schrägagar-Kultur von Arthrobacter citreus (ATCC 17775) wurde mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer gewaschen. Die resultierende Zellsuspension wurde in ein steriles Röhrchen dekantiert, und es wurde Äthylmethansulfonat in genügender Menge, um eine Endkonzentration von 15 0,05 M zu erhalten, zugesetzt. Das Röhrchen wurde während 18 Stunden bei 30 °C inkubiert. Die Zellsuspensionen wurden draufhin abzentrifugiert, der Überstand wurde abdekantiert, und die Zellen wurden in frischem Puffer resuspendiert.

Nach zwei solchen Waschvorgängen wurden die Zellen 20 verwendet, um ein Röhrchen mit dem folgenden Medium (Medium E) zu beimpfen. Die Grösse des Inoculums betrug 10%.

Medium E

25

pro Liter entionisiertes

Wasser

Glucose

50 g

NH4CI

5g

Harnstoff

5g

K2HPO4

0,5 g

KH:P04

0,5 g

MgS04-7H20

0,5 g

Biotin

100 jig

Thiamin HCl

1 mg

40

3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure

(d.h. «MOPS», Sigma Chemical Company) 20,9 g

Spurenelemente-Lösung (siehe unten) 1 ml

Das pH des Mediums wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt. Das Medium wurde während 15 Minuten bei 112 °C autoklaviert. Um Medium E-Agar herzustellen, werden dem 45 flüssigen Medium E 15 g/1 Noble-Agar (Difco) zugesetzt.

Die Spurenelemente-Lösung war wie folgt zusammengesetzt:

Spurenelemente-Lösung

50

55

pro Liter entionisiertes

Wasser

ZnS04-7H20

8,8 g

FeS04-7H20

10,0g

CuS04-5H20

60 mg

Na2B407-10H20

88 mg

Na2Mo204-2H20

53 mg

MnS04-H20

7,5 g

CoCh-öHiO

120 mg

CaCh

55 mg

Das pH der Spurenelemente-Lösung wurde mit H2SO4 auf 65 2 eingestellt, und die Lösung wurde in einer dunklen Flasche bei ungefähr 2-0 °C aufbewahrt.

Die Zellen wurden während 17 Stunden bei 30 °C auf einem sich drehenden Schüttler bei 300 Umdrehungen pro

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4

Minute inkubiert und darauf auf Medium E-Agar (modifiziert, nur 2% Glucose; das pH wurde auf 7,8 vor dem Auto-klavieren eingestellt), welcher verschiedene Konzentrationen von nach dem Autoklavieren zugesetztem Azaleucin enthielt, ausplattiert. Die Platten wurden bei 30 °C inkubiert. Auftretende Kolonien (z.B. nach ungefähr 2 bis 4 Tagen Bebrütung) wurden auf frische Medium E-Agarplatten übertragen.

Die von den Azaleucin enthaltenden Platten gewonnenen Isolate wurden verwendet, um Röhrchen mit Medium E und Isoleucin-Medium 5 zu beimpfen, welche dann während drei Tagen bei 30 °C und 300 Umdrehungen pro Minute bebrütet wurden.

Isoleucin-Medium 5

pro Liter entionisiertes

Wasser

Glucose 100 g

(NH4)2SC>4 50 g

MgS04-7H20 0,4 g

CaCCb 50 g

KH2PO4 3 g

Bacto-Soytone3 0,6 g

Biotin 100 (ig

Thiamin HCl 1 mg

Spurenelemente-Lösung 1 ml pH mit NaOH auf 7,8 einstellen.

a Ein enzymatisches Hydrolysat von Sojabohnenmehl, welches von Difco Laboratories, Inc. verkauft wird.

Ein mit der Bezeichnung 17775-14 versehenes, gegen 4 g/1 Azaleucin resistentes Isolât produzierte in Isoleucin-Medium 5 4,56 g/1 Leucin. Leucin wurde mittels Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) bestimmt.

Zur Durchführung der HPLC-Analyse werden die Aminosäuren in ihre Dansyl-Derivate übergeführt (siehe unten), anschliessend getrennt und mittels standardisierter Verfahren einzeln quantitativ gemessen. Im folgenden wird die Derivati-sierung der Aminosäuren für die HPLC-Analyse beschrieben.

Prinzip

Dansylchlorid ( 1 -Dimethylaminonaphthalin-5-sulfochlo-rid) reagiert mit der Amingruppe von Aminosäuren. Die Dan-sylderivate können durch Flüssigchromatographie getrennt und durch Ultraviolettabsorption erkannt werden.

Die im oben erwähnten HPLC-Verfahren verwendeten Reagenzien waren:

1. Puffer: 2.956 g Lithiumcarbonat in einen 1-Liter-Kol-ben einwägen und bis zur Marke mit destilliertem Wasser verdünnen. pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 9,5 einstellen.

2. Dansylchlorid-Lösung: 75 mg Dansylchlorid in einen 25 ml Messkolben einwägen und bis zur Marke mit Acetoni-tril verdünnen.

3. Quencher: 5,0 g Methylaminhydrochlorid in einen 250 ml Messkolben einwägen und bis zur Marke mit destilliertem Wasser verdünnen.

4. Essigsäure

5. Aminosäurestandard H (Pierce Chemical Co., Katalog-Nr. 20088)

6. Triäthylamin

7. Lösungsmittelgemisch: 877 ml destilliertes Wasser, 100 ml Methanol, 14 ml Essigsäure, 20 ml Tetrahydrofuran, 1,7 1 Triäthylamin.

5

Vorgehen:

A. Herstellung der Standards

1. Unter Verwendung einer Mikrospritze 50,100 und 200 u.1 des Pierce Aminosäurestandards in 5 ml Messkolben brin-

10 gen.

2. Die 5 ml Messkolben in einem Exsiccator unter Vacuum setzen und zur Trockenheit eindampfen (üblicherweise über Nacht).

3.2,0 ml Puffer (Reagens Nr. 1, siehe oben) in jeden

15 Messkolben pipettieren.

4. 1,0 ml Dansylchlorid-Lösung (Reagens Nr. 2, siehe oben) in jeden Messkolben pipettieren.

5. Gut mischen und während 30 Minuten in ein 30 °C warmes Wasserbad stellen.

20 6. Jedem Messkolben 100 jj.1 Quencher (Reagens Nr. 3, siehe oben) zusetzen.

7. Gut mischen und während ungefähr 5 Minuten stehen lassen.

8. Zu jedem Messkolben 75 ul Essigsäure (Reagens Nr. 4)

25 zusetzen und mischen.

9. Bis zur Marke mit Lösungsmittelgemisch (Reagens Nr. 7) auffüllen und mischen.

Beachte: Standards bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahren.

30

B. Probenvorbereitung

Beachte: Alle zur Analyse erhaltenen Proben im Kühlschrank aufbewahren.

1. 50 ^1 von jeder Probe in einen 5 ml Messkolben füllen.

35 2. Derivatisierung ausgehend von Punkt A.3. (siehe oben) weiterführen.

Beachte: Derivatisierte Proben bis zur Analyse im Kühlschrank aufbewahren.

40 Beispiel 2

Zweite EMS Mutation und Resistenz gegen höhere Konzentrationen von Azaleucin

Die azaleucinresistente Mutante 17775-14, welche wie im Beispiel I beschrieben erhalten worden war, wurde nochmals

45 in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Äthyl-methansulfonat behandelt.

Nach EMS-Mutation und Übernachtinkubation bei 30 °C in Medium E wurden die Zellen einmal mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen und auf Azaleucin in Konzentrationen von

50 4 bis 20 g/1 (nach dem Autoklavieren zugesetzt) enthaltendem Medium E-Agar ausplattiert. Das pH des 12-20 g/1 Azaleucin enthaltenden Agars war vor dem Autoklavieren mit NaOH auf 9,6 eingestellt worden. Zusatz von 20 g/1 Azaleucin nach dem Autoklavieren senkte das pH auf 5,6.

55 Die Platten wurden während 3-7 Tagen bei 30 °C bebrütet. Resistente Isolate wurden auf frische Medium E-Agarplatten übertragen und von dort in Röhrchen mit Isoleucin-Medium 5 überimpft. Nach dreitägiger Inkubation bei 30 °C und 300 Umdrehungen pro Minute wurden die Kulturbrühen

60 gewonnen und mittels HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Ein mit der Bezeichnung 17775-14-7 versehenes, gegen 20 g/1 Azaleucin resistentes Isolât produzierte 8,0 g/1 Leucin.

G

Claims

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1. Araki, Kazumi, H. Ueda and S. Saigusa. Fermentative Production of L-Leucine with Auxotrophic Mutants of Corynebacterium glutamicum. Agr. Biol. Chem. 38 (3), 565-572 (1974).

1. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, welches die Kultivierung einer gegen ein Analoges von Leucin resistenten Mutante von Arthrobacter citreus unter aeroben Bedingungen zum Zwecke der Gewinnung einer Fermentationsbrühe,

sowie die Gewinnung des in der genannten Fermentationsbrühe angereicherten L-Leucins, umfasst.

2. Calvo, R.A., and J.M. Calvo. Lack of End-Product Inhibition and Repression on Leucine Synthesis in a Strain of Salmonella typhimurium. Science, 156, 1107-1109 (1967).

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 ist.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. Leucine Accumulations by Isoleucine Revenants of Serratia marces-cens Résistant to a-Aminobutyric Acid: Lack of Both Feedback Inhibition and Repression. J. Biochem., 73, 107-115 (1973).

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Kultivierung bei 25 bis 40 °C während 16 bis 176 Stunden durchgeführt wird.

4. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Cultural Conditions for L-Leucine Production by Strain No. 218, a Mutant of Brevibacterium lactofermen-tum 2256. Agr. Biol. Chem. 39 (5), 1149-1153 (1975).

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das pH des Wachstumsmediums während der Kultivierung zwischen 5 und 9 beträgt.

5. Tsuchida, T., and H. Momose. Genetic Changes of Regulatory Mechanisms Occurred in Leucine and Valine Pro-ducing Mutants Derived from Brevibacterium lactofermen-tum 2256. Agr. Biol. Chem. 39 (11) 2193-2198 (1975).

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 ist und die Kultivierung bei 25 bis 40 °C während 16 bis 176 Stunden und bei einem pH zwischen 5 und 8 durchgeführt wird.

6. Tsuchida, T., F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Production of L-Leucine by a Mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 38 (10), 1909-1911 (1974).

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Analoge eines der folgenden ist: a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, D-Leucin, ct-Aminoisoamylsulfonsäure, Norvalin, Norleucin, Methallylglycin, a-Amino-ß-chlorbuttersäure, Valin, a-Chlor-leucin, Isoleucin, ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin, 3-Cyclopenten-l-alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure, 5',5',5'-Trifluoroleucin, 4-Azaleucin.

7. Freundlich, M. and J.M, Trela. (1969). Control of isoleucine, valine, and leucine biosynthesis. J. of Bacteriology, 101-106.

7. Verfahren nach Anspruch 1,3,4 oder 6, bei welchem die Mutante eine Mutante von Arthrobacter citreus ATCC 39103 ist.

8. Izumi, Y., Y. Asano, Y. Tani and K., Ogata. (1977). Formation of valine and leucine by analog-resistant mutants of an obligate methylotroph, Methylomonas aminofaciens. J. Ferment. Techno!., 55,452-458.

8. Verfahren nach Anspruch 1,3,4 oder 6, bei welchem die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39106 ist.

Die fermentative Herstellung von L-Leucin, L-Valin und anderen Aminosäuren ist bereits eingehend erforscht worden. Zahlreiche Gattungen von Mikroorganismen sind zusammen mit verschiedenen Aminosäure-Analogen verwendet worden. Die US-Patentschrift 3 865 690 beschreibt die Herstellung von L-Leucin durch Kultivierung eines gegen einen Leucin-Anta-gonisten resistent gemachten Stamms von Brevibacterium oder Corynebacterium. Gemäss der US-Patentschrift 3 970 519 werden Stämme der gleichen Gattungen zur Produktion von L-Leucin in der Gegenwart von verschiedenen Aminosäuren kultiviert. Aus der US-Patentschrift 3 893 888 ist bekannt, dass L-Valin mit Mutanten von Brevibacterium, die resistent gegen a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV) sind, hergestellt werden kann. Die US-Patentschrift 3 668 073 beschreibt die Herstellung von L-Leucin mit Hilfe eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium in der Gegenwart eines «Promotors» für Isoleucin, Methionin, Phenylalanin oder Valin, z.B., Azaleucin oder AHV. Azaleucin ist auch als Analoges zur Herstellung von L-Leucin verwendet worden. Siehe Wang et al., «Fermentation and Enzyme Technology», John Wiley and Sons, Inc., 1979, S. 18-20. In der US-Patentschrift 3 759 789 werden Kulturen von Arthrobacter alkanicus, welche resistent gegen L-Threonin sind, verwendet. Vorstufen von L-Leucin und L-Isoleucin können zugesetzt werden, um die Ausbeute zu verbessern.

Die folgende Literatur ist relevant:

9. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. (1977), Pathway for isoleucine formation from pyruvate by leucine biosynthetic enzymes in leucine-accumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens. J. Biochem., 82,95-103.

10. Kisumi, M., J. Kato, S. Komatsubara, I. Chibata. (1973). Production of isoleucine, valine and leucine by regulatory mutants of Serratia marcescens. «Genetics of Industriai Microorganisms - Bacteria».

11. Rogerson, A., and M. Freundlich. (1969). Control of isoleucine, valine and leucine biosynthesis. VIII. Mechanism of growth inhibition by leucine in relaxed and stringent strains of Escherichia coli K-12. Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.

Ein allgemeiner Artikel über die biosynthetischen Stoffwechselwege für L-Leucin sowie andere Aminosäuren, ist ebenfalls veröffentlicht worden. Siehe:

12. Szentirmai, A. and I. Horvath. (1976). Regulation of branched-chain amino acid biosynthesis. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 23, 137-149.

13. Umbarger, H.E. (1974). The elements involved in the multivalent régulation of the isoleucine and valine biosynthetic enzymes of the Enterobacteriaceae. Proceedings of the Ist. Intersectional Congress of IAMS, 1, Tokyo.

14. Umbarger, H.E. (1973). Genetic and physiological régulation of the isoleucine, valine and leucine biosynthetic enzymes of the Entrobacteriaceae. From «Genetics of Industriai Microorganisms.»

15. Umbarger, H.E. (1978). Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation. Ann. Rev. Biochem., 47, 533-606, 563.