DE1807622B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosin durch Züchten von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen sind Mutantenstämme, welche Biotin zu ihrem Wachstum erfordern.

Inosin, ein Hypoxanthinribosid, ist eine bekannte wertvolle Verbindung, und es werden in der Technik ständig neue Wege zur wirtschaftlichen Herstellung derartiger Substanzen mittels großtechnischer Verfahren gesucht.

Es ist bekannt, zur Herstellung von Inosin Mikroorganismen der Gattungen Brevibacterium oder Corynebacterium in einem wäßrigen Nährmedium, welches Hypoxanthin enthält, bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und bei pH-Werten von 3 bis 9 zu züchten. Auch hat man bereits Biotin-auxotrophes Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 312 unter Anreicherung von Hypoxanthin gezüchtet.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Inosin durch ein biotechnisches Verfahren, ausgehend von Mikroorganismen der Gattungen Brevibacterium oder Corynebacterium, in industriellem Maßstab in einfacher Weise unter Erzielung hoher Produktausbeuten herzustellen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man als Brevibacterium Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 295 oder als Corynebacterium Corynebacterium glutamicum ATCC 21 296 einsetzt.

Diese erfindungsgemäß angewendeten Mikroorganismenstämme werden durch verschiedene künstliche Mutationsmethoden oder durch natürliche Mutation aus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 und Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 als Ausgangsstämme erhalten. Die als Ausgangsstämme verwendeten Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 und Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 wachsen natürlich in einem Mindestkulturmedium der im folgenden aufgeführten Zusammensetzung.

Mindestkulturmedium

20 g Glucose

Ig KH₂PO₄

3 g K₂HPO₄

0,3 g MgSO₄-7 H₂O
10 g CaCJ₂; · 2 H₂O

1 mg MnCl₂-4H₂O
10 mg Calciumpantothenat

mg Vitamin B₁
μ Biotin

g Harnstoff

g Ammoniumsulfat
5

Die oben aufgeführten Komponenten werden in 1 1 entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wird vor der Sterilisierung auf 7,2 eingestellt, und es wird Harnstoff, der getrennt von den anderen Komponenten sterilisiert wird, zugegeben.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutantenstämme wachsen ebenfalls in dem Mindestkulturmedium. Die Mutanten weisen ferner die spezifische Eigenschaft auf, daß deren Wachstum in einem Kulturmedium erheblich beschleunigt wird, das durch Zugabe der folgenden Aminosäuren zu dem Kulturmedium hergestellt wurde:

L-Alanin

L-Arginin

L-Asparaginsäure

L-Cystein

L-Cystin

L-Glutaminsäure

L-Glycin

L-Histidin

L-Isoleucin

L-Leucin

L-Lysin

L-Methionin

L-Phenylalanin

L-Prolin

L-Serin

L-Threonin

L-Tyrosin

L-Tryptophan

L.Valin

Diese Aminosäuren werden dem Kulturmedium in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Konzentration von jeweils 20 mg/1 darin erhalten wird. Sowohl dieses Gemisch von Aminosäuren als auch die Komponenten der Nucleinsäuren können einzeln oder im Gemisch zu dem Kulturmedium zugesetzt werden, um eine erhebliche Beschleunigung des Wachstums der Mutanten zu erreichen. Dieses Ergebnis ist aus den in der folgenden Tabelle wiedergegebenen Wachstumsversuchen klar ersichtlich.

Wachstumsausmaß getrockneter Zellkörper (mg/ml)

	Brevibacterium ammoniagenes	erfindungsgämäß	Adenin-,	Corynebacterium glutamicum	erfindungsgemäß	Adenin
		eingesetzte	erfordernder		eingesetzte	erfordernder
	Äusgangsstamm	Mutante	Stamm	Ausgangsstamm	Mutante	Stamm
	ATCC 6872	ATCC 21 295	ATCC 15187	ATCC 13 032	ATCC 21 296	ATCC14 305
		2,6	0		30	0
Mindestmedium	4,3			5,1
Mindestmedium
+ Gemisch aus		3,9	0		4,4	0
Aminosäuren	5,2			5,7
Mindestmedium		3,8	3,7		4,6	4,8
+ 20 mg/1 Adenin	4,1			5,3
Mindestmedium		3,6	0		4,5	0
+ 20mg/lGuanin ....	4,2	5,4

Die Wachstumsversuche werden für jeden Stamm so durchgeführt, daß 10 ml des Mindestkulturmediums oder des unter Zugabe der angegebenen Substanzen hergestellten Mediums jeweils in große Reagenzgläser gegeben werden und die Medien während 15 Minuten unter Druck bei 120⁰C sterilisiert werden und daß 0,2 ml einer durch vorherige Kultivierung jedes Stamms und Auswaschen hergestellten Zellsuspension zu jedem Reagenzglas zugesetzt werden und jeder Stamm während 48 Stunden unter aerobem Schütteln bei 30⁰C kultiviert wird. Die Menge an Mikroorganismenzellen, die nach der Kultivierung erhalten wird, wird dann gemessen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutantenstämme wachsen auch in einem Mindestkulturmedium, in dem die als Vergleichsmikroorganismen verwendeten Adenin erfordernden Stämme von Brevibacterium ammoniagenes und Corynebacterium glutamicum nicht wachsen können. Darüber hinaus wird, wie oben angegeben, das Wachstum der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten durch ein Gemisch von Aminosäuren, Adenin oder Guanin beschleunigt. Das Wachstum des obenerwähnten Adenin erfordernden Stamms ist jedoch nur bei Zugabe von Adenin festzustellen. Aus diesen Tatsachen ergibt sich klar, daß die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten in ihren Grundeigenschaften von dem Adenin erfordernden Stamm abweichen. Daher wurden die erfindungsgemäßen Mutantenstämme bei der American Type Culture Collection hinterlegt, und sie erhielten die folgenden Katalogbezeichnungen:

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 295
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 296

Sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches Nährmedium ist erfindungsgemäß geeignet, solange es die zum Wachstum der verwendeten Stämme wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Substanzen, wie z. B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von den verwendeten Mikroorganismen in entsprechenden Mengen gebraucht werden. Als eine Kohlenstoffquelle können beispielsweise Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse u. dgl., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure, Glutaminsäure u. dgl., genannt werden. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat u. dgl., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie beispielsweise Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, gelöste Fischsubstanz, Reiskleieextrakt, Ribonucleinsäure u. dgl., verwendet werden. Diese Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren eingesetzt werden. Zu anorganischen Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, gehören Mägnesiumsulfa^NatriumphosphatjKaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat u.dgl.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln 5 oder unter Belüften und Rühren bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 4,0 bis 9,0 durchgeführt.
Während der Züchtung ist es zweckmäßig, den pH-Wert des Nährmediums mit Neutralisierungsmitteln, wie z. B. Ammoniakwasser, Harnstofflösung, Natriumhydroxyd _ u. dgl., einzustellen. Nach etwa 2-bis 8tägiger Züchtung unter diesen Bedingungen haben sich beträchtliche Mengen an Inosin in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit und in den Mikroorganismenzellen angesammelt..

Nach Beendigung der Züchtung kann das Inosin durch Entfernen der Mikroorgänismenzellen aus der Fermentationsflüssigkeit und anschließende Behandlung der Flüssigkeit mit üblichen Mitteln, wie beispielsweise durch I onenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie od. dgl., gewonnen werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewichts-Volümprozent.

Beispiell

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 295 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Er wird in einem Nährmedium, das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,3% NaCl enthält, während 24 Stunden gezüchtet, wobei eine Impfkultur erhalten wird.

Die Impfkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium eingeimpft, das die folgende Zusammensetzung aufweist:

100	g	mg	mg	Glucose
6	g	0,1g	g	Harnstoff (getrennt sterilisiert)
10	g	1		KH2PO4 ,
10	g	10	mg	K2HPO4
10	g	30	MgSO4 · 7 H2O
0,01g	5	FeSO4 · 7 H2O
1	MnSO4-4 H2O
CaCl2-2 H2O
ZnSO4-7 H2O
Casaminosäure
Biotin
Vitamin B1

10 mg Calciumpantothenat

Die obigen Komponenten werden in 1 1 Wasser gelöst, und der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.

Wie bei der Herstellung der Impfkultur werden 20-ml-Anteile des Mediums jeweils in 250-ml-Erlenmeyerkolben gegossen und nach Sterilisierung verwendet. Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln bei 30° C durchgeführt.

Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung mit Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt. Nach HOstündiger Züchtung haben sich 18,4 mg/ml Inosin in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

B e i s ρ i e 1 2

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 296 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Eine Impfkultur

daraus wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium eingeimpft, das die folgenden Bestandteile pro Liter Wasser aufweist:

70 g Glucose

Ig KH₂PO₄

3 g K₂HPO₄

0,3 g MgSO₄ ■ 7 H₂O

5 g Fleischextrakt

6 g Harnstoff (getrennt sterilisiert)
30 μg Biotin

5 mg Vitamin B₁
10 mg Cajciumpantothenat

Der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.

Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß der pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung durch die Zugabe von Harnstofflösung auf etwa 7,0 gehalten wird. Nach 96stündiger Züchtung haben sich 12,7 mg/ml Inosin in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

B e i s ρ i e 1 3

m Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 295 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Die Ziichtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei die Zusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums wie folgt war:

Abfallmelassesäurehydrolysat (130 g,
als Glucose)

Ig KH₂PO₄

3 g K₂HPO₄

5 mg Vitamin B₁
10 mg Calciumpantothenat

Der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.

Nach 96stündiger Züchtung haben sich 15,9 mg/ml Inosin in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosin durch Züchten von Mikroorganismen der Gattungen Brevibacterium oder Corynebacterium bei hierfür üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in einem wäßrigen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brevibacterium Brevibacterium ammoniagenes ATCC

   21 295 oder als Corynebacterium Corynebacteriuni glutamicum ATCC 21 296 einsetzt.