JPS61271997A - 発酵法によるｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。

Ｌ−リジンは必須アミノ酸の１つであり、医薬品、飼料
添加物としてｉｔ要であり、その安価な製造方法が望ま
れている。

〈従来の技術〉 従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法としては、例え
ば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ア
ルスロバクタ−属、バチルス属、ミクロバクテリウム属
等の微生物にホモセリン（またはスレオニンとメチオニ
ン）要求性を附与するか、あるいはＬ−リジン代謝耗抗
物質耐性を附与してＬ　　ｌジンによる制御機構の解除
された菌株を取得し、Ｌれを利用する方法が知られてい
る（　Ｊ、　Ｇｅｎ、　ＡｐｐＬ−Ｍｉｃｒｏｉ）ｉｏ
ｌ。

Ｖａｔ、４　１２８〜１２９頁、同ＶＯ１，１６３７３
〜３９１頁）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、従来法においては、発酵法によるＬ−リ
ジン生産能を有する微生物として限られたものしか見出
されていなかった。

く問題県を解決するための手段および作用）そこで本発
明者等は従来の微生物とは異なった微生物であって、か
つＬ−りンン生産能を有する微生物を広く検索、研究し
た結果、プロビデンシア属に属する微生物によって通常
の炭素源を含有する栄養培地にＬ　−リジンを著量蓄積
せしめることができることを見い出し本発明に到達した
。本発明のプロビデンシア属に属した微生物が著量のＬ
−リジンを生産した事実は未だ知られていない。

すなわち、本発明はプロビデンシア属に属し、Ｌ−リジ
ン生産能を有する微生物を培養して、培地中にＬ−リジ
ンを生成蓄積せしめ、該培地中からＬ−リジンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ　−ＩＪリジン製造
法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属する
（バージ−のマニアル−ｔブ・シスチマテイック・バク
テリオロジー第１巻（１９８４））微生物であり、より
好ましくはリジン代謝１％抗物質に耐性を有する微生物
である。ここでリシン代謝拮抗物質としては、例えば、
Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン、リジンハイドロキ
サメート、４−ハイドロキシリジン等が挙げられ、好ま
しくはＳ−７ミノエチルーＬ−システィンが挙げられる
。かがる性質を有していれば、他の要求性、他の薬剤抵
抗性の性質をもつものでも本発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えばプロピデノシア壷レトゲリＴＰ４−１０５−３７　
（ＦＥＲＭ　　ｇ２．Ｉ’ｌ　　　）が挙げられる。

この変異株はプロピデンジ７・レトゲリＡＴＣＣ２１１
１８（Ｌ−イソロイシン要求性）から得られたα−アミ
ノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要
求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性のプロ
ビデンシア・レトゲ’ＪＴＰ３−１０５より誘導された
もので、リシン代１ｔＪ抗物質のうちＳ−アミノエチル
−Ｌ−システィンに耐性な変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
に取得できる。すなわち、リジン代謝Ｊ奮抗物質に耐性
を有する変異株を得るには、親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤（例、ｔ　ハＮ−メチルーＮ’−二
トローＮ−二ｌ−。

リグアニジン、エチルメタンスルホン酸等）で処理した
後、親株が生育できないような量のリジン代謝話抗物質
を含む固体培地で生育可能な菌株を採取すればよい。

本発明で使用するリジン代謝枯抗物質耐性株とは、リジ
ン代謝ａ抗物質の濃度が８　’Ｆ　／　ｍｌとなるよう
添加した培地で培養した時の１４時間後の生育度が無添
加の場合の７０９６以上のものをいう。ここで生育度は
、培養液の５５Ｑｎｍにおける吸光度を測定し、各菌株
のリジン代謝拮抗物質を添加していない培養液の吸光度
を１００％として表わした場合の相対吸光度で示す。耐
性を検定する場合のリジン代謝ｊ抗物質、例えば、Ｓ−
アミノエチル−Ｌ−システィン、リジンハイドロキサメ
ート等は、市販のものを用いればよい。

本発明におけるＬ−リジン生産用の培地は炭素源、窒：
Ａ源、無機イオンおよび必要に応じてその池の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉あ゛よりセルロースの
加水分解物、糖蜜等の糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸等の如き有機酸、グリセロールの如きアルコール
類等を２〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムの
如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムの如
き無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア７
Ｌ尿素Ｊを０．５〜４０９６、有ａ微量栄養素としては
、Ｌ−インロイシン等の被要求物質が０．００１〜０．
４％、または必要に応じてコーンステイープリカー、ペ
プトン、酵母エキス等Ｏ〜４％をそれぞれ適当量含有す
る培地が好適に用いられる。かかる培地にはこれらの他
にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水
和物、硫酸マンガン４〜６永和物等を少量添加するのが
通常である。

培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のｐＨ
は５〜９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２
０時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得ら
れる。

培養液からＬ−リジンを採取するには常法で行うことが
できる。例えば、培養終了液から菌体を除いた０液を０
．５　Ｍの緩衝液でＩ）　Ｈ７，０に調整した弱塩基性
陰イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＣ−５０に流して
Ｌ−リジンを吸着せしめ、樹脂塔を水洗した後０．１５
　Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−リジンを含む画分を減
圧濃縮する。濃縮液に塩酸を添加した後冷却し、Ｌ−リ
ジンをＬ−リジン塩酸項二水加物として析出させ結晶を
回収することができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ Ａ、（Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性変異株の
分離） プロビデンシア会レトゲリＴＰ３−１０５　　（α−ア
ミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン
要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性）の
菌体に、常法によりＮ−メチル−Ｎ’−二トローＮ−二
トロソグアニジン処理（３００μｆ／厘ｔ、３０℃で１
０分）した後、この細胞をＳ−アミノエチル−し−シス
ティン８１／１．Ｌ−スレオニン１０　ｆ／１．Ｌ−イ
ソロイシン１０１／１．Ｌ−メチオニン１０ｆ／ｌ添加
した寒天培地（グルコース０．５９６．硫安０．１％、
リン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．
７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１　％、Ｌ−ロ
イシンｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％を含む最少培地）に塗布した
。次に３０℃にて５〜７日培養し、生じた大きなコロニ
ーを釣菌分離して。

Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性株（プロビデン
シア・レトゲリＴＰ４−１０５−３７　）を取得した。

Ｂ、（Ｓ−アミノエチル−し−システィン耐性変異株の
耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３
０℃で１６時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生
理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液を、Ｓ−７ミノエ
チルーＬ−システィン０，２．５．５．７．５．１０１
／ｌの割合で含む最少培地（培地組成ニゲルコース０．
５％、硫安０．１％、リン酸第１カリウム０．３９６、
リン酸第２カリウム０．７９６．硫酸マグネシウム＋１
７水和物０．０１％、Ｌ−イソロイシンｏ、　ｏ　ｏ　
ｓ％、Ｌ−ロイシン０．００５％）５璽ｔに植菌して、
３０℃にて１４時間培養し、各菌株の生育度を調べた。

その結果は、第１表に示すとおりである。

本発明方法で使用するＳ−アミノエチル−し−システイ
ンに耐性な変異株（プロビデンシア・レトゲリＴＰ４−
１０５−３７　）では、親株のプロビデンシア・レトゲ
リＴＰ３−１０５と比較して、ａ［ＩｔのＳ−アミノエ
チル−Ｌ−システィンによって生育が阻害されず、強い
Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性をＷ１得してい
ることを示している。

第　　１　　表 Ｃ，（Ｌ−リジン生産菌の培養およびＬ−リジンの生産
） 下記組成の発酵用培地４０　ｗｌを１ｇ容エーレンマイ
ヤーフラスコに入れ、１２０℃で１０分間蒸気殺菌した
。これに、あらかじめ液体ブイヨン培地で３０℃、１６
時間振とり培養した第２表１こ示す各菌体の培養液４　
ｍｌを移し、３０℃で１５０回転／分、振幅３ｃ１１の
条件下、９０時間培養した・ 発酵用培地組成 グルコース　　　　８９６ （ＮＨａ）ｔｓＯ４２，５９６ ＩＧｂＰＯｎ　　　　　　　０．１９６ＭｇＳＯ４・７
市０　　　　０．０４　ｇ６Ｆｅ＋＋２１）Ｉ）ｍ Ｍｎ＋）２ｐｐｍ Ｌ−イソロイシン　０．００２５％ Ｌ−ロイシン　　　ｏ、　ｏ　８　＊ ＣａＣ０５（別減繭）　　　　　　　４％ｐＨ７，０（
ＫＯＨで中和） 培養終了後、菌体、炭酸力Ｊレシウムを除去した口銭中
のＬ−リジン濃度を２，４−ジニトロフルオロベンゼン
でラベル化し、高性能液体クロマトグラフィー（ウォー
ターズ　ＱＡＩ）で定量したところ□、第２表ζこ示す
ような結果を得ｔこ。

第　　２　　表 〈発明の効果〉 本発明によれば、従来の微生物とは異なった微生物を用
いて、通常の炭素源を含有する栄養培地にＬ−リジンを
著量蓄積せしめ、採取することが可能となり１発酵法に
よりＬ−リジンを有効に製造することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア属に属し、Ｌ−リジン生産能を有
   する微生物を培養して、培地中にＬ−リジンを生成蓄積
   せしめ、ついで該培地中よりＬ−リジンを採取すること
   を特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造法。
2. （２）微生物がリジン代謝拮抗物質に耐性をもつもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第一項記載の発酵
   法によるＬ−リジンの製造法。
3. （３）リジン代謝拮抗物質がＳ−アミノエチル−Ｌ−シ
   ステインである特許請求の範囲第二項記載の発酵法によ
   るＬ−リジンの製造法。