JPH01108993A - 発酵法によるｌ−ホモセリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法に関する
。

Ｌ−ホモセリンは生化学的には必須アミノ酸であるし一
スレオニン、Ｌ−メチオニンあるいはＬ−イソロイシン
の重要な生合成前駆物質であり、医学、栄養学、生化学
などの研究試薬として要望されている。のみならず、近
時は発酵法によりＬ−ホモセリンからし一スレオニンを
生産する方法も見出されており、工業薬品としての重要
性を有するに至っている。

〈従来の技術〉 従来、発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法としては、
コリネバクテリウム属に属しＬ−スレオニン要求性を付
与した変興株を用いる方法が知られている（特開昭４６
−２５７１０号公報）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、従来法においてはＬ−ホモセリンの生産
能力は低く、工業的に実用化するには不十分であった。

く問題点を解決するための手段および伴用〉そこで本発
明者らは、Ｌ−ホモセリン生産能を有する微生物を広く
検索、研究した結果、プロビデンシア属に属する微生物
によって通常の炭素源を含有する栄養培地にＬ−ホモセ
リンを著量蓄積せしめることができることを見出し本発
明に到達した。

すなわち、本発明はプロビデンシア属に属し、し−ホモ
セリン生産能を有する微生物を培養して、培地中にＬ−
ホモセリンを生成蓄積せしめ、該培地中からＬ−ホモセ
リンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−ホモ
セリンの製造法である。

プロビデンシア属に属する微生物が著量のＬ−ホモセリ
ンを生産した事実はまだ知られていない。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル・オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第１巻く１９８４、第４９５〜４９６頁に従
う）、Ｌ−ホモセリン生産能を有する微生物であれば特
に限定されない。好ましくはプロビデンシア属に属し、
し−ホモセリンに耐性を有する微生物を用いる。

かかる性質を有していれば、他の要求性またはｌ　ｅａ
ｋｙ型要求性、他の薬剤抵抗性の性質をもつものでも本
発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、た
とえば１０ビデンシア・レトゲリＨＲ１７（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−９５３９）、１０ビデンシア・レトゲリＯＨＲ２
２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９３４８）が挙げられる。

１０ビデンシア・レトゲリＨＲ１７は、プロビデンシア
・レトゲリＴＡ−１（Ｌ−インロイシン要求性、Ｌ−ス
レオニン要求性）を親株として、また、プロビデンシア
・レトゲリ０ＨＲ２２はプロビデンシア・レトゲリ０Ｔ
Ａ−１（Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオニ
ン耐性、チアイソロイシン耐性、オキシチアミン耐性、
Ｌ−スレオニン要求性）を親株として、通常の変異処理
方法によりＬ−ホモセリン耐性変異株として得られたも
のである。

し−ホモセリン耐性変異株を得るには、たとえば親株を
紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（たとえばＮ−
メチル−Ｎ−一二トローＮ−二トロソグアニシン、エチ
ルメタンスルホン酸など）で処理したのちＬ−ホモセリ
ン含有最少培地に塗布し、生育してきた株を釣菌分離す
ればよい。

本発明で使用する！、−ホモセリン耐性株とは、親株よ
りＬ−ホモセリンに強い耐性を有する変異株であり、好
ましくは、親株の相対生育度が３０％以下を示すＬ−ホ
モセリンの濃度範囲において６０％以上の相対生育度を
示す変異株のことである。

ここでたとえば生育度は、培養液の６６０ｎｍにおける
吸光度を測定し、各菌株のＬ−ホモセリンを添加してい
ない培養液の吸光度を１００％として表わした場合の相
対吸光度で示す。

本発明におけるＬ−ホモセリン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセ
ロールのごときアルコール類などを２〜１５％、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、
アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．５〜４
．０％、有８！微量栄簑索としては、Ｌ−イソロイシン
などの被要求物質が０゜００１〜０．４％、または必要
に応じてコーンステイープリカー、ペプトン、酵母エキ
スなど０〜４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に
用いられる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸第１鉄・７水和物、硫酸マンガン４−６水
和物などが微量成分として少量添加される。

培養は、好気的条件で行う。培養の間、培地のＰＨは５
から９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２０
時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られる
。

培養液よりＬ−ホモセリンを採取するには、通常の方法
を用いることができる。たとえば、菌体を除去した培養
ｒ液をｐＨ２に塩酸で調製したのち、強酸性カチオン交
換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、
脱アンモニア後濃縮する。これにアルコールを添加し、
冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−ホモセリンを得
ることができる。

また他のアミノ酸が多く混在している時にはたとえば特
公昭３８−２５の方法にしたがってＬ−ホモセリンを得
ることができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ Ａ、（Ｌ−ホモセリン耐性変異株の分離）プロビデンシ
ア・レトゲリＴＡ−１（Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−
スレオニン要求性）とプロビデンシア・レトゲリ０ＴＡ
−１（Ｌ−インロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、
し−スレオニン要求性、α−アミノ−β−ハイドロキシ
吉草酸耐性、チアイソロイシン耐性、オキシチアミン耐
性）の各菌体を常法によりＮ−メチル−Ｎ−一二トロー
Ｎ−二トロソグアニジン処理したのち、これらの細胞を
Ｌ−ホモセリン０１０５％添加した下記組成の合成寒天
培地に塗布した。

合成寒天培地 グルコース　　　　　　　　　０，５％ＫＨ２ＰＯ４０
，３％ に２ＨＰＯ４０，７％ （ＮＨ４）２　ＳＯ４０，１％ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０１％Ｌ−イソロイシ
ン　　　　０．００５％し一スレオニン　　　　　０．
００５％Ｌ−ロイシン　　　　　　０．００５％寒　　
　　天　　　　　　　　　　　　　１．５％次に３７°
Ｃで５〜７日培養し、生じたコロニーを釣菌分離してＬ
−ホモセリン耐性株（１０ビデンシア・レトゲリ）ＮＨ
１７およびプロビデンシア・レトゲリ０ＨＲ２２）を収
得した。

Ｂ、（Ｌ−ホモセリン耐性株の耐性度の検定）下記第１
表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で１
６時間振盪培養し、生育した菌体を集菌し、生理食塩水
で洗浄した。

この菌体懸濁液をＬ−ホモセリン０．３３．０．６７、
ｌｏｔ／１の割合で含む最少培地（培地組成ニゲルコー
ス０，５％、硫安０．１％、リン酸第１カリウム０．３
％、リン酸第２カリウム０．７％、硫酸マグネシウム・
７水和物０゜０１％、し−インロイシン０．００５％、
Ｌ−スレオニンＯ，ＯＯ５％、Ｌ−ロイシン０．００５
％）５山１に植菌して３０℃で４８時間培培養各菌株の
生育度を調べな、その結果を第１表に示す。

本発明で使用するＬ−ホモセリンに耐性を有する変異株
（１０ビデンシア・レトゲリＨＲＩ７およびプロビデン
シア・レトゲリ０ＨＲ２２）ではそれぞれの親株のプロ
ビデンシア・レトゲリＴＡ−１およびプロビデンシア・
レトゲリ０ＴＡ−１と比較して、高濃度のＬ−ホモセリ
ンによって生育が阻害されず、強いＬ−ホモセリン耐性
を獲得していることを示している。

第　　　１　　　表 ※）培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各菌
株のＬ−ホモセリンを添加していない培養液の吸光度を
１００％として表わした。

実施例２ （Ｌ−ホモセリン生産菌の培養およびＬ−ホモセリンの
生産 下記組成の発酵用培地４０ｍ１を１４容エーレンマイヤ
ーフラスコに入れ、１２０℃で１０分間蒸気殺菌した。

あらかじめ液体ブイヨン培地で３０℃、１６時間振盪培
養した第２表に示す各重体の培養液４　ｍｌを移し、３
０℃、１５０回転／分、振幅３ｃｎの条件下８８時間培
養した。

発酵用培地 グルコース　　　　　　　　　　８％ （ＮＨ４）２３０４　　　　　２．５％ＫＨ２ＰＯ４０
，１％ Ｍ　ｇ　Ｓ　０４・７　Ｈ２００，０４％Ｆｅ＋＋　　
　　　　　　　　２ρｐＨＭｕ＋＋２１）ＩｌｌＩ Ｌ−イソロイシン　　　　０．００５％Ｌ−スレオニン
　　　　　　０．０２％し一ロイシン　　　　　　　０
．０６％ＣａＣＯ３（別滅菌）　　　　　４％ ｐＨ７，０（ＫＯＨで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したｒ液中の
Ｌ−ホモセリン濃度を自動アミノ酸分析計く日本電子Ｊ
ＬＣ３００）で定ｌしたところ第２表に示す結果を得た
。

第　　　２　　　表 〈発明の効果〉 本発明によれば、通常の炭素源を含有する栄養培地にＬ
−ホモセリンを著量蓄積せしめ採取することが可能とな
り、発酵法によりＬ−ホモセリンを効率よく製造するこ
とができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア（Ｐｒｏｖｄｅｎｃｉａ）属に属
   し、Ｌ−ホモセリン生産能を有する微生物を培養して、
   培地中にＬ−ホモセリンを生成蓄積せしめ、該培地中よ
   りＬ−ホモセリンを採取することを特徴とする発酵法に
   よるＬ−ホモセリンの製造法。
2. （２）微生物がＬ−ホモセリンに対する耐性を有するも
   のである特許請求の範囲第１項記載の発酵法によるＬ−
   ホモセリンの製造法。